NGHIÊN cứu xây DỰNG mô HÌNH DOCKING và QSAR

Bơm ABCC2 (ATP Binding Cassette subfamily C member 2) thuộc họ bơm sử dụng năng lượng ATP để vận chuyển các chất qua màng. Bơm ABCC2 còn được gọi là MRP2 (Multidrug Resistance Protein 2) vì bơm góp phần gây ra tình trạng kháng thuốc ở các tế bào ung thư. Bơm phân bố ở tế bào biểu mô ống mật ở gan, tế bào ống lượn gần, tế bào biểu mô ruột do đó bơm ảnh hưởng đến sự hấp thu và đào thải các chất độc nội sinh và các thuốc sử dụng đường uống. Trong đề tài này, mô hình mô tả phân tử docking và mô hình 2DQSAR được xây dựng nhằm xác định tương tác của các chất ức chế với các acid amin tại khoang trung tâm và dự đoán các chất có khả năng ức chế hoạt tính bơm.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHAN THIỆN VY

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm Bào chế

Mã số: 60.72.04.02

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thầy hướng dẫn:PGS.TS Thái Khắc MinhPGS.TS Lê Minh Trí

Thành phố Hồ Chí Minh – 2016

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học – Năm học 2014 – 2016

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH DOCKING VÀ QSAR CỦA CÁC

CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC ABCC2/MRP2

Phan Thiện VyThầy hướng dẫn: PGS TS Thái Khắc Minh

PGS TS Lê Minh Trí

Mở đầu

Bơm ABCC2 (ATP Binding Cassette subfamily C member 2) thuộc họ bơm sử dụngnăng lượng ATP để vận chuyển các chất qua màng Bơm ABCC2 còn được gọi làMRP2 (Multidrug Resistance Protein 2) vì bơm góp phần gây ra tình trạng khángthuốc ở các tế bào ung thư Bơm phân bố ở tế bào biểu mô ống mật ở gan, tế bàoống lượn gần, tế bào biểu mô ruột do đó bơm ảnh hưởng đến sự hấp thu và đào thảicác chất độc nội sinh và các thuốc sử dụng đường uống Trong đề tài này, mô hình

mô tả phân tử docking và mô hình 2D-QSAR được xây dựng nhằm xác định tương

phân tử docking của 204 chất có hoạt tính ức chế bơm Cấu trúc homology của bơmABCC2 được xây dựng bằng server tự động I-TASSER Bảy mô hình phân loại và 2

mô hình hồi quy được xây dựng bằng phần mềm SONNIA 4.2, 2 mô hình hồi quyđược xây dựng bằng phần mềm MOE 2008.10 dựa trên cơ sở dữ liệu gồm 372 chấtđược thu thập từ 16 bài báo khoa học

Mô hình PLS-CDCF dự đoán IC50 của các chất ức chế bơm trên cơ chất CDCF cóRMSE = 0,30 và R2 = 0,67 Bốn mô hình này được ứng dụng để sàng lọc một thưviện 1661 chất, kết quả thu được 369 chất có khả năng ức chế bơm trên cả 2 cơ chất

EG và CDCF Kết quả docking tại khoang trung tâm trên bơm ABCC2 cho thấyArg943 là acid amin quan trọng tại khoang gắn kết, Arg943 tạo 2 liên kết hydro và 1tương tác kỵ nước với đa số các chất ức chế

Kết luận

Đề tài đã xây dựng được mô hình homology của bơm ABCC2 bằng server TASSER với chất lượng tốt và độ tin cậy khá cao Mô hình này tạo cơ sở cho việcdocking các chất ức chế vào khoang trung tâm nhằm tìm ra các aicd amin và cácliên kết quan trọng tại khoang gắn kết Hai mô hình hồi quy CPG-NN và hai môhình phân loại PLS có tính ứng dụng cao trong việc tìm kiếm những chất có khảnăng ức chế bơm ABCC2

I-Supervisor: Dr Khac-Minh Thai, Dr Minh-Tri Le

Introduction

ABCC2/MRP2 is a member of ATP-binding cassette family of transporters Thisefflux transporter is found in the apical membranes of polarized cells and isexpressed mainly in the liver, kidney and intestine ABCC2 involves in absorption,distribution and excretion of drugs and xenobiotics Overexpression of this pumpalso contributes to the drug resistance of cancer cells In this thesis, moleculardocking and pharmacophore models on ABCC2 inhibitors have been developed.These models are aimed to identify the residues making contact with ABCC2inhibitors and to establish a computational prediction model on ABCC2 inhibitors

Materials and Methods

FlexX tool integrated in Lead IT was used for molecular docking studies of 204ABCC2 inhibitors 3D structure of ABCC2 pump has been predicted by I-Tasseronline server Seven classification models and 2 regression models were built bySONNIA 4.2, 2 regression models were built by MOE 2008.10 based on datasetcontaining of 372 compounds collected from 16 scientific articles

Results and Discussion

A total of 2 CPG-NN classification models and 2 PLS regression models were builtwith good predicting results The CPG-C iABCC2 for classifying inhibitors ABCC2pump has total accuracy 0,88 and MCC = 0,75 The CPG-C iEG for classifyinginhibitors ABCC2 pump (substrate EG) has total accuracy 0,91 and MCC = 0,82.The regression model PLS EG for predicting inhibitors pump (substrate EG) wasresulted with RMSE = 0,26 and R2 = 0,72 The regression model PLS CDCF forpredicting inhibitors pump (substrate CDCF) was resulted with RMSE = 0,30 and

R2 = 0,67 Four 2D-QSAR models were applied on 1661 compounds, the results isobtaining of 369 compounds that had inhibitory activities in both of subtrates Formolecular docking, amino acid played an important roles in central cavity wasArg943, Arg943 was identified to bind with majority of ligands by 2 hydrogenbonds and 1 hydrophobic interaction

Conclusions

ABCC2 homology was successfully developed with good quality and highconfidence by I-Tasser server This 3D-structure homology was used to builtmolecular docking model at central cavity in order to find out important residuesand bonds Two classifying models CPG-NN and two regression models PLS arebuilt with high applicability in looking for inhibitory activities ABCC2 pump drugs

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực vàchưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

PHAN THIỆN VY

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2D-QSAR 2 Dimensions – QSAR

3D-QSAR 3 Dimensions – QSAR

ANN Artificial Neural Network (Mạng thần kinh nhân tạo)

ABCC2 ATP Binding Cassette sub-family C member 2

CDCF 5(6)-carboxy-2,'7'-dichlorofluorescein

Cmoat Major Canalicular Organic Aninon Transporter

CPG-C Counter-propagation Neural Network Classification (Phân loại

dựa vào mạng nơ-ron nhiều lớp ngược hướng)CPG-NN Counter-propagation Neural Network (Mạng nơ-ron nhiều lớp

ngược hướng)CPG-R Counter-propagation Neural Network Regression (Hồi quy dựa

vào mạng nơ-ron nhiều lớp ngược hướng)

EG β-estradiol 17-β-d-glucuronide

GH Goodness of Hit lists

IC50 50% inhibitory concentration (Nồng độ tối thiểu ức chế 50%)LOO Leave-one-out (Bỏ-ra-một)

MCC Matthews correlation coefficient (Hệ số tương quan Mathew)MOE Molecular Operating Environment

MRP2 Multidrug resistance associated protein 2

NBD Nucleotid Binding Domain

PLS Partial Least Squares (Bình phương tối thiểu từng phần)

QSAR Quatitative Structure Activity Relationship (Mối quan hệ định

lượng giữa cấu trúc và tác dụng)RMSE Root mean square error (Sai số bình phương trung bình)

UT Uptake Transport (Vận chuyển hấp thu)

VT Vesicular Transport (Vận chuyển qua màng túi)

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gời lời cảm ơn đến thầy PGS TS Thái Khắc Minh.Trong suốt quá trình làm luận văn, thầy đã luôn quan tâm động viên, theo sát và chỉbảo tận tình Thầy luôn sẵn sàng giải giảng và truyền đạt cho em những kiến thứcquý báu để em hiểu rõ và thực hiện tốt luận văn của mình Thầy đã dành rất nhiềuthời gian để góp ý và chỉnh sửa cho luận văn của em được đầy đủ và hoàn chỉnhhơn

MỞ ĐẦU

ABCC2 hay còn gọi là bơm ngược MRP2 (Multidrug resistance associated protein2) là bơm vận chuyển duy nhất của họ ABCC nằm ở màng đỉnh (màng đối mặt vớicác khoang của cơ thể) của tế bào phân cực đặc biệt ở gan, thận, ruột và nhau thai.Trong khi đó, MRP1 và những bơm MRP khác (MRP3, MRP6) chủ yếu nằm ởmàng đáy của tế bào (màng tiếp giáp mạch máu) (ngoại trừ MRP4 ở thận) Do vậy,bơm MRP2 có một vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đào thải thuốc và các chấtđộc nội sinh [12]

ABCC2 được xếp vào nhóm protein đa kháng thuốc trong các dòng ung thư khángcisplatin ABCC2 còn vận chuyển nhiều thuốc trị ung thư ra khỏi tế bào nhưvinblastin, vincristin, epirubicin và chlorambucil Vai trò sinh lý quan trọng đượcbiết đến hiện nay của ABCC2 là đào thải các anion hữu cơ và các chất chuyển hóakhác như leukotrien-C4, glutathion, bilirubin dạng mono hay bi-glucuronid,estradiol glucuronid và p-aminohippurat Có báo cáo cho thấy phần lớn các chất nềnABCC2 có yếu tố anion [41]

Các thuốc không biến đổi được bơm bởi ABCC2 bao gồm doxorubicin, các chất ứcchế HIV protease, nucleosid phosphonat, p-aminohippuric acid và các kháng sinhnhóm fluoroquinolon [42]

Hiện nay, tuy trên lâm sàng chưa có tương tác thuốc tác động đáng kể đến bơmABCC2, nhưng người ta tin rằng điều này có nguy cơ cao sẽ xảy ra [23] Khi hoạtđộng bơm ABCC2 bị suy giảm do di truyền hoặc bị ức chế do tương tác thuốc sẽlàm tăng lượng bilirubin liên hợp trong máu Tầm quan trọng của việc xem xét cácthuốc có khả năng ức chế ABCC2 dẫn đến tăng bilirubin liên hợp đã được Hiệp hộibơm vận chuyển quốc tế (International Transporter Consortium) nhấn mạnh [23].Các hợp chất này hoặc các chất chuyển hóa của chúng sẽ ức chế ABCC2, cũng nhưcác bơm vận chuyển khác như MRP3, MRP4 dẫn đến nhiễm độc gan [23] Tương

tự như vậy, ức chế ABCC2 có thể gây ra sự tích tụ các anion hữu cơ bên trong các

tế bào ống lượn gần gây suy thận, các anion hữu cơ còn gây ức chế tổng hợp DNA

ty thể dẫn đến hội chứng Fanconi [11] Trong bối cảnh đó, các chất ức chế mạnh

ABCC2 là mối quan tâm đáng kể trong nghiên cứu tương tác thuốc Ngoài ra, việcphát triển các thuốc có thể ức chế sự đào thải của ABCC2 cũng cần được xem xét

để cải thiện hiệu quả điều trị

Chính vì vậy, việc xây dựng mô hình QSAR – nhằm dự đoán mối liên hệ giữa cấutrúc và tác động ức chế ABCC2/MRP2 – để ứng dụng trong sàng lọc số lượng lớncác chất có sẵn trong ngân hàng dữ liệu, định hướng thiết kế và tổng hợp nhằm mụcđích giải thích cơ chế tác động cũng như tìm ra những chất ức chế ABCC2/MRP2 làrất cần thiết Bên cạnh đó, mô hình mô tả phân tử docking cũng được tiến hành dựavào cấu trúc bơm xây dựng từ kỹ thuật mô tả tính tương đồng (homology) nhằmkhảo sát khả năng gắn kết của các chất ức chế này vào đích tác động Mô hình này

có thể được ứng dụng để khảo sát một tập hợp hơn 1500 thuốc đã được sử dụngtrong thực tiễn lâm sàng nhằm tìm ra những chất có khả ức chế hoạt động của bơm,ảnh hưởng đến sinh khả dụng của các thuốc khác khi dùng chung

Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu xây dựng mô hình dự đoán các chất có khả năng ức chế bơmABCC2/MRP2 và nghiên cứu khả năng gắn kết của các chất ức chế với bơmABCC2/MRP2 nhằm thiết kế sàng lọc các chất có khả năng ức chế bơm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bơm vận chuyển ABCC2

1.1.1 Các bơm vận chuyển thuộc họ ABC

Bơm vận chuyển thuộc họ ABC là các protein xuyên màng, sử dụng năng lượngthủy phân nucleotid để vận chuyển cơ chất nội sinh qua màng tế bào Các bơmthuộc họ gia đình ABC gồm 49 gen được chia ra làm 7 phân họ từ ABCA tới ABCGdựa trên trình tự tương đồng Chức năng sinh lý chính của các bơm này là giải độc

và bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân hóa học có hại Tuy nhiên, bên cạnh các chất cóhại, các bơm này còn đẩy thuốc ra khỏi tế bào do đó ảnh hưởng đến sinh khả dụng

và sự đào thải thuốc [31]

1.1.2 Cấu trúc của bơm ABCC2

Protein ABCC2 có 1545 acid amin cấu tạo nên 2 phần gắn ATP là Nucleotidbiniding domain (NBD) và 17 xoắn xuyên màng là Membrane spanning domain(MSD) trong 3 vùng xuyên màng MSD 0, 1, 2 Hai MSD có chức năng chính làMSD 1 và 2, MSD0 chứa 200 acid amin gồm 5 xoắn xuyên màng chưa được xácđịnh rõ vai trò [12] Các loài chủ yếu khác nhau ở trình tự acid amin trong vùngMSD còn hai NBD có trình tự bảo tồn giữa các loài [9]

Hình 1.1. Cấu trúc bơm ngược ABCC2 [7]

Mỗi MSD gồm 6 xoắn xuyên màng Hai phần NBD nằm trên các vùng liên kết giữaMSD1, MSD2 và trên đầu C tận nội bào của MSD2 NBD1 và NBD2 của ABCC2

Vùng mang điện tích dương

Vùng mang điện tích âm

có thể có 2 vị trí gắn kết cơ chất (Hình 1.2.) Vị trí sơ cấp được tạo bởi 2 vị trí kỵnước và hai vị trí mang điện tích dương Trong khi đó, vị trí thứ cấp được cho là tạonên sự đa dạng cơ chất vận chuyển cho ABCC2 lại cấu tạo bởi hai vị trí tích điệndương và hai vị trí tích điện âm [19]

Hình 1.2. Vị trí gắn kết cơ chất của ABCC2 ở chuột [6]

1.1.3 Sự phân bố của bơm ABCC2 trong cơ thể

Sự phân bố của bơm ngược ABCC2 trong các mô và tế bào ảnh hưởng tới sự đàothải, hiệu quả và độc tính của thuốc ABCC2 phân bố chủ yếu tại gan, thận và ruột.Các bơm ngược này hiện diện ở màng tế bào vi ống ở gan, tế bào biểu mô túi mật,màng đỉnh (apical membrane) ống lượn gần, tế bào ung thư có nguồn gốc từ ống

1.2 Sàng lọc ảo

Vị trí gắn kết sơ cấp

Sàng lọc ảo (Virtual screening – VS) hay còn gọi là sàng lọc in silico, là một kỹ

thuật máy tính được sử dụng trong nghiên cứu thiết kế thuốc Walter và cộng sự đãđịnh nghĩa sàng lọc ảo là “việc tự động đánh giá các thư viện rất lớn của các hợpchất hóa học bằng cách sử dụng các chương trình máy tính” [40] Cụ thể, VS baogồm một loạt các mô hình tin học được khởi chạy tuần tự để dự đoán hoạt tính sinhhọc hay ái lực liên kết của các hợp chất trên mục tiêu tác động VS đã trở thành mộtphần không thể thiếu trong quá trình khám phá các thuốc mới

1.2.1 Các phương pháp sàng lọc ảo

Sàng lọc ảo có hai phương pháp chủ yếu là sàng lọc dựa vào các chất có hoạt tínhhay phối tử (ligand) và sàng lọc dựa vào cấu trúc mục tiêu [24]

1.2.2 Sàng lọc ảo dựa trên ligand

Nếu biết trước một tập hợp các ligand có cấu trúc đa dạng có khả năng gắn kết vớimục tiêu tác động thì các mô hình dự đoán hoạt tính trên mục tiêu đó có thể đượcxây dựng bằng cách khai thác các thông tin từ tập ligand đã biết Các mô hình này

có thể là mô hình pharmacophore hoặc mô hình 2D-QSAR, 3D-QSAR Sau khi các

mô hình đã được xây dựng, một ligand mới có thể được áp dụng lên mô hình để dựđoán khả năng gắn kết của nó lên mục tiêu tác động Quá trình này gọi là VS dựatrên các chất có hoạt tính

1.3 Docking

1.4.1 Định nghĩa

Docking là phương pháp thiết kế thuốc dựa vào mục tiêu nhằm dự đoán khuynhhướng và cấu dạng gắn kết của các hợp chất (ligand) vào điểm gắn kết (bindingsite)

Docking được chia làm ba bước chính: gắn các chất vào nơi gắn kết, chấm điểm,xếp hạng Đầu tiên, thuật toán docking được áp dụng để tìm cấu dạng gắn kết củacác phân tử nhỏ với đích tác động Bước mở đầu này xác định liệu một cấu dạng cóđịnh hướng đúng vào vị trí gắn kết không Tiếp theo các cấu dạng gắn kết đượcchấm điểm Điểm số gắn kết thường là thước đo mức độ gắn kết phù hợp của hợpchất đối với một đích tác động Sau đó, một số cấu dạng gắn kết tốt nhất được giữ

lại và được đánh giá lại lần nữa Bước xếp hạng được tiến hành nhằm xác định nănglượng tự do của sự gắn kết một cách chính xác nhất Bên cạnh các dạng năng lượng

đơn giản như lực tĩnh điện hay lực Van der Waals, quá trình này liên quan tới các

dạng năng lượng phức tạp hơn như entropy hay năng lượng solvat hóa [21]

Kết luận

Dựa vào tổng quan tài liệu và các phương tiện hiện có, nghiên cứu này tiến hànhxây dựng mô hình QSAR – nhằm dự đoán mối liên hệ giữa cấu trúc và tác động ứcchế ABCC2/MRP2 – để ứng dụng trong sàng lọc số lượng lớn các chất có sẵn trongngân hàng dữ liệu, định hướng thiết kế và tổng hợp nhằm mục đích giải thích cơ chếtác động cũng như tìm ra những chất ức chế ABCC2/MRP2 Bên cạnh đó, mô hình

mô tả phân tử docking cũng được tiến hành dựa vào cấu trúc bơm xây dựng từ kỹthuật mô tả tính tương đồng (homology) nhằm khảo sát khả năng gắn kết của cácchất ức chế này vào đích tác động

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Xây dựng mô hình homology của bơm ABCC2

2.1.2 Đánh giá mô hình

Cấu trúc homology được đánh giá dựa trên các thang điểm C-score, TM-score,RMSD và mật độ đám (Cluster density) C-score đánh giá mức độ tin cậy về chấtlượng của mô hình dự đoán Điểm số này được tính toán dựa trên sự gióng hàng vớicác cấu trúc mẫu tương tự và sự đồng quy của các thông số cấu trúc C-scorethường nằm trong khoảng [-5,2], trong đó, giá trị C-score càng cao chứng tỏ môhình có chất lượng càng tốt và ngược lại [34] TM-score và RMSD được dùng để đolường mức độ tương đồng giữa hai cấu trúc Các điểm số này thường được áp dụng

để đánh giá độ chính xác của mô hình khi có protein mẫu Khi không có proteinmẫu, các điểm số này được dùng để đánh giá chất lượng của mô hình cùng với C-score TM-score lớn hơn 0,5 chứng tỏ mô hình có dạng hình học đúng

và TM-score nhỏ hơn 0,17 chứng tỏ chỉ có một sự tương đồng ngẫu nhiên giữa haicấu trúc [22] Mật độ đám là số cấu trúc mồi tại một đơn vị không gian trong đámSPICKER Mật độ đám cao nghĩa là mô hình có chất lượng tốt [34]

2.2 Docking

Các protein một khi đã có cấu trúc tinh thể tia X thường có ligand đồng kết tinh đikèm trong cấu trúc Để dock một ligand mới vào mục tiêu, ligand đồng kết tinhtrong cấu trúc protein sẽ được loại bỏ Tuy nhiên, bơm ngược ABCC2 vẫn chưađược xác định cấu trúc tinh thể bằng tia X, mô hình sử dụng chỉ là mô hình đượcxây dựng bằng kỹ thuật mô phỏng tính tương đồng không chứa ligand đồng kết tinhnên để có thể tiến hành docking cần xác định vị trí gắn kết trên protein Công cụSite Finder trong MOE được sử dụng nhằm tìm ra các vị trí gắn kết có thể trên cấutrúc protein mục tiêu

2.2.1 Đánh giá kết quả

Điểm số docking (KJ/mol) được đánh giá dựa trên các liên kết tạo thành giữa ligand

và protein bao gồm liên kết ion, liên kết hydro, liên kết van der Waals, liên kết π- π ,

… Kết quả docking cho biết ái lực gắn kết của ligand với protein và tương tác giữaligand với các acid amin xung quanh Kết quả docking này được sử dụng để hỗ trợviệc tìm kiếm khoang gắn kết phù hợp nhất

2.3 Xây dựng mô hình phân loại và hồi quy dự đoán hoạt tính ức chế bơm ABCC2 bằng CPG-NN

Quy trình nghiên cứu được thực hiện như trình bày ở Hình 2.1