nghiên-cứu-điều-kiện-thủy-phân-chitin-thu-nhận-nacetyldglucosamine-sử-dụng-Tài-liệu-text (3)

11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Máy Sấy Cơng Nghiệp C.Cấp Máy Sấy Cơng Nghiệp 10­200 kg Giá Gốc, BH Chính Hãng, Úy Tín. slcvietnam.com/ nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng enzyme endochitinase và βhexosaminidase tái tổ hợp 48% OFF 24% OFF ­33% ­47% Giày sandal dễ thương đế cao 3cm g038 300,000₫ 199,000₫ Mua Ngay Sandal xỏ ngón clara 130,000₫ Mua Ngay Giày lười nam thời trang phong cách mới 2017 419,000₫ 219,000₫ Mua Ngay BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ­­­­­­­­­­­­oOo­­­­­­­­­­­­ GIANG TRUNG DŨNG NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN THU NHẬN N­ACETYL­D­GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME ENDOCHITINASE VÀ β­HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ­­­­­­­­­­­­oOo­­­­­­­­­­­­ GIANG TRUNG DŨNG NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN THU NHẬN N­ACETYL­D­GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME  Tải bản đầy đủ ENDOCHITINASE VÀ β­HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 1/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text CHUN NGÀNH : CƠNG NGHỆ SAU THU HOẠCH MàSỐ : 60­54­10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HỒNG ANH PGS.TS. LÊ THANH HÀ HÀ NỘI, NĂM 2014 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng Tơi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc Hà nội, ngày 25 tháng 9 năm 2014 Học viên Giang Trung Dũng  Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page i LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành luận văn tốt nghiệp này, ngồi sự cố gắng của bản thân, tơi cịn  nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các tổ chức và cá nhân Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo TS. Nguyễn Hồng Anh, Phó trưởng khoa Cơng nghệ Thực phẩm, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam và cơ giáo  PGS.TS Lê Thanh Hà, viện Sinh học và Cơng nghệ thực phẩm, trường ðại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tơi những kiến thức q báu trong lĩnh vực chun mơn của luận văn, động viên giúp đỡ tơi thực hiện và hồn thành cơng trình nghiên cứu khoa học của mình Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo TS. Hồng Hải Hà, khoa Cơng nghệ thực phẩm và bạn ðỗ Hải Quỳnh, học viên K22, Khoa Cơng nghệ sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.  Tơi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cơ giáo, cán bộ trong khoa Cơng nghệ Thực phẩm, khoa Cơng nghệ sinh học, phịng thí nghiệm Trung  tâm khoa Thú Y­ Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi  thực hiện đề tài tốt nghiệp Tơi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Huyện ủy – UBND huyện Mường  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   Khương, lãnh đạo và cơng chức phịng Nơng nghiệp và PTNT huyện Mường http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 2/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Khương, tỉnh Lào Cai đã tạo điều kiện, hỗ trợ giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu tại Học viện Nơng nghiệp Việt Nam.  Tơi xin trân trọng cảm ơn bạn bè đã ln bên, động viên và khuyến khích tơi trong q trình thực hiện đề tài nghiên cứu ðặc biệt, tơi xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất đến bố, mẹ và vợ của tơi cùng những người thân trong trong gia đình đã ln quan tâm động viên trong q trình học tập và nghiên cứu hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.  Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 25 tháng 9 năm 2014 Học viên Giang Trung Dũng  Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi Danh mục bảng Danh mục hình PHẦN 1 ðẶT VẤN ðỀ 1.1 ðặt vấn đề 1.2 Mục đích ­ u cầu 1.2.1 Mục đích  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 3/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 1.2.2 Yêu cầu PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tìm hiểu chung về chitin 2.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 2.1.2 Tính chất lý hóa của chitin 2.2 Tìm hiểu chung về GlcNAc 2.2.1 Cơng thức cấu tạo 2.2.2 Tính chất của GlcNAc 2.2.3 Vai trị của GlcNAc  2.2.4 Phương pháp sản xuất  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 4/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 2.3 Vi khuẩn Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis khả năng ứng  dụng để sản xuất enzyme 11  2.3.1 ðặc điểm hình thái Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis 11  2.3.2 ðặc ñiểm sinh lý Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis 11  2.3.3 Ứng dụng của Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis 12 2.4 Giới thiệu về enzyme endochitinase 14 2.4.1 Khối lượng phân tử và cơ chế xúc tác của endochitinase 14 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page iii 2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của endochitinase 15 2.4.3 Nguồn thu nhận endochitinase 15  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 5/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 2.5 Tìm hiểu về enzyme β­hexosaminidase 16 2.5.1 Cơ chế xúc tác của β­hexosaminidase 16 2.5.2 Một số đặc tính của β­hexosaminidase 17 2.5.3 Vai trò của β­hexosaminidase  18 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Vật liệu 19 3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 19 3.1.2 ðịa điểm nghiên cứu 19 3.1.3 Thời gian nghiên cứu 19 3.1.4 Dụng cụ, hóa chất 19  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 6/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Ni cấy thu sinh khối tế bào 23 3.3.2 Xác định mức độ biểu hiện gene mã hóa cho endochitinase và βhexosaminidase bằng phương pháp điện di SDS­ PAGE  24 3.3.3 Tinh sạch enzyme bằng hệ thống sắc ký lỏng FPLC  25 3.3.4 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng muối (NH4)2SO4 26 3.3.5 Phương pháp tạo cơ chất colloidal chitin 26 3.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính endochitinase 27 3.3.7 Phương pháp xác định hoạt tính của β­hexosaminidase 28 3.3.8  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 7/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 29 3.3.9 Xác định nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt của endochitinase và βhexosaminidase 29 3.3.10 Xác định pH tối thích và độ bền pH của endochitinase và βhexosaminidase 30 3.3.11 Xác định sản phẩm thủy phân bằng sắc ký bản mỏng TLC  30 3.4 31 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page iv PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 32 Ni cấy 02 chủng E.coli tái hợp và xác định mức độ biểu hiện của gen mã hóa cho endochitinase và β­hexosaminidase 32 4.1.1 Ni cấy chủng E.coli tái tổ hợp thu sinh khối 32 4.1.2 Xác định mức độ biểu hiện của gene mã hóa cho endochitinase và βhexosaminidase 32 4.2 Tinh sạch endochitinase và β­hexosaminidase  33  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 8/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 4.2.1 Tinh sạch endochitinase  33 4.2.2 Tinh sạch β­hexosaminidase  36 4.3 Xác định một số đặc tính thủy phân colloidal chitin của endochitinase và thủy phân pNP­GlcNAc của β­hexosaminidase 38 4.3.1 Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của endochitinase 38 4.3.2 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu và ñộ bền nhiệt của β­hexosaminidase 40 4.3.3 Xác ñịnh pH tối ưu và ñộ bền pH của endochitinase 42 4.3.4 Xác ñịnh pH tối ưu và ñộ bền pH của β­hexosaminidase 45 4.4 Phân tích thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm thủy phân 4.4.1 47 Xác định khả năng thủy phân colloidal chitin của endochitinase bằng 47 phương pháp TLC  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosamin… 9/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 4.4.2 Xác ñịnh khả năng thủy phân oligosaccharides của β­hexosaminidase bằng phương pháp TLC 4.5 48 Xây dựng quy trình thủy phân chitin thu GlcNAc bằng cách kết hợp hai enzyme 48 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp  Page v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNS Dinitrosaicylic acid GlcNAc N­acetyl­β­D­glucosamine FPLC Fast protein liquid chromatography LB Luria bertani RPM  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 10/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Revolutions per minute PAGE  Polyarylamide gel electrophoresis pNP­GlcNAc p­nitrophenyl N­acetyl­β­D­glucosaminide IPTG Isopropyl ­thio­β­D­galactopyranoside TEMED N,N,N’,N’­tetramethylethynediamine TLC Thin layer chromatography SDS Sodium Dodecyl Sulfate w/v Khối lượng/thể tích Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 3.2: Thành phần gel cơ và gel tách 24 Bảng 4.1: Hoạt tính của enzyme endochitinase tái tổ hợp thu được khi tinh sạch bằng sắc ký FPLC tính theo 1 lít dịch ni cấy 34 Bảng 4.2: Hoạt tính của endochitinase tái tổ hợp thu được khi tinh sạch ở các nồng độ muối amonisunfat khác nhau tính theo 1 lít dịch ni cấy 35 Bảng 4.3:Hoạt tính của β­hexosaminidase tái tổ hợp thu được khi tinh sạch bằng sắc ký FPLC tính cho 1 lít dịch ni cấy  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 11/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 36 Bảng 4.4: Hoạt tính của β­hexosaminidase tái tổ hợp thu được khi tinh sạch ở các nồng độ muối amonisunfat khác nhau tính cho 1 lít dịch ni cấy 37 Bảng phụ lục 1: Phản ứng DNS với các nồng ñộ GlcNAc khác nhau 58 Bảng phụ lục 2: Nồng ñộ dung dịch pNP 59 Bảng phụ lục 3.1: Phản ứng của CBB G­250 với abumin 60 Bảng phụ lục 3.2: ðường chuẩn protein 60 Bảng phụ lục 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của endochitinase 61 Bảng phụ lục 5: ðộ bền nhiệt của endochitinase ở 37 0C và 50 0C 61 Bảng phụ lục 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính β­hexosaminidase 62 Bảng phụ lục 7: ðộ bền nhiệt của β­hexosaminidase 62 Bảng phụ lục 8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của endochitinase 63 Bảng phụ lục 9: ðộ bền pH của endochitinase 64 Bảng phụ lục 10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính β­hexosaminidase 64 Bảng phụ lục 11: ðộ bền pH của β­hexosaminidase  65  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 12/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1:Cấu trúc của phân tử chitin [51] Hình 2.2: Cơng thức cấu tạo của GlcNAc [47] Hình 2.3: Vị trí phân thủy phân của endochitinase 15 Hình 2.4: Vị trí thủy phân liên kết của β­hexosaminidase 17 Hình 4.1: ðịnh tính khả năng sinh endochitinase của vi khuẩn tái Bacillus licheniformis DSM13 tổ hợp bằng điện di SDS­PAGE  32 Hình 4.2: ðịnh tính khả năng sinh β­hexosaminidase của vi khuẩn Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403 tái tổ hợp bằng điện di SDS­PAG  33 Hình 4.3: Sắc ký đồ tinh sạch endochitinase tái tổ hợp 34 Hình 4.4: Sắc ký đồ tinh sạch β­hexosaminidase tái tổ hợp 36 Hình 4.5: ðồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của endochitinase 39 o o Hình 4.6: ðộ bền của endochitinase ở 37 C và 50 C 40 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của β­hexosaminidase 41 Hình 4.8: ðồ thị xác định độ bền nhiệt của β­hexosaminidase ở 30oC và 37oC  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 13/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 42 Hình 4.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của endochitinase 43 Hình 4.10: ðồ thị biểu diễn độ bền pH của endochitinase 44 Hình 4.11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính β­hexosaminidase  45 Hình 4.12: ðồ thị biểu diễn độ bền pH của β­hexosaminidase 46 Hình 4.13: Sắc ký bản mỏng sản phẩm phân giải colloidal chitin 2% (A) và 20 % (B) bởi endochitinase ở các thời gian thủy phân khác nhau. M Hỗn hợp chitooligosaccharide chuẩn 47 Hình 4.14: Sắc ký bản mỏng sản phẩm phân giải 50 mM diacetyl chitobiose (A) và 50mM diacetyl chitotriose (B) bởi β­hexosaminiase 48 Hình 4.15: Quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin, sử dụng enzyme endochitinase và β­hexosaminidase tái tổ hợp 49 Hình phụ lục 1: ðồ thị đường chuẩn GlcNAc 58 Hình phụ lục 2: ðồ thị đường đường chuẩn pNP 59 Hình phụ lục 3: ðồ thị đường chuẩn protein 60 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page viii PHẦN 1. ðẶT VẤN ðỀ N­acetyl­β­D­glucosamine (GlcNAc) đã được biết đến là một hoạt chất sinh học q, có tác dụng chữa các loại bệnh về khớp, viêm ruột và ứng dụng sản xuất mỹ phẩm. ðã có nhiều nghiên cứu với những thử nghiệm lâm sàng chứng minh G l cN A c có tác dụng điều trị tận gốc bệnh thối hố khớp [27]. Hiện nay, các   Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 14/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text dược phẩm có GlcNAc đã được sản xuất và thương mại hóa với giá trị rất cao. Các sản phẩm có gốc glucosamine như glucosamine sunfat, glucosamine hydroclorid có tác dụng tương tự như GlcNAc, tuy nhiên khả năng cơ thể con người hấp thụ khó hơn GlcNAc. Nguồn ngun liệu chính để sản xuất GlcNAc là chitin. Với lợi thế chăn ni và chế biến thủy sản phát triển, Việt Nam có nguồn ngun liệu sản xuất  chitin rất dồi dào [1] Chitin chiếm từ 14­35% trọng lượng khơ của vỏ giáp xác [4]. Ở Việt Nam,  giáp xác chiếm trên 30% nguồn ngun liệu thủy sản. Trong cơng nghiệp chế  biến thủy sản xuất khẩu, lượng phế phụ phẩm từ chế biến giáp xác khoảng 70.000 tấn/năm [1]. Việc nghiên cứu, sản xuất GlcNAc từ nguồn cơ chất chitin này sẽ  góp phần làm tăng giá trị kinh tế ngành chế biến thủy sản và làm sạch mơi trường Ngày nay, GlcNAc có thể được sản xuất bằng phương pháp hóa học, hoặc  phương pháp sinh học sử dụng phức hệ enzyme endochitinase và β­hexosaminidase Tuy nhiên, phương pháp sử dụng enzyme thủy phân chitin thành GlcNAc đang  được quan tâm nghiên cứu do phương pháp này cho độ tinh khiết của sản phẩm cao, khơng gây ăn mịn thiết bị và thân thiện với mơi trường [19] Kỹ thuật DNA tái tổ hợp đóng vai trị then chốt của lĩnh vực Cơng nghệ sinh học. Kỹ thuật này góp phần cải thiện hoạt tính và khả năng sinh tổng hợp enzyme đang được ứng dụng rộng rãi. Enzyme tái tổ hợp sẽ hạn chế được nhược điểm của enzyme thu nhận từ các chủng vi sinh vật tự nhiên như: mức độ biểu hiện của enzyme tự nhiên thường thấp, hoạt tính khơng cao. ðến nay, trên thế giới đã có một  số nghiên cứu nhất định về ứng dụng chitinase để sản xuất GlcNAc. Tuy nhiên, ở  Việt Nam chưa có nghiên cứu nào ứng dụng endochitinase và β­hexosaminidase tái  tổ hợp để sản xuất GlcNAc. Chính vì lý do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 1 tài: “Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin, thu nhận N­acetyl­D­glucoamine sử dụng enzyme endochitinase và β­hexosaminidase tái tổ hợp” 1.1. ðặt vấn đề 1.2. Mục đích ­ u cầu 1.2.1. Mục đích Bước đầu xây dựng quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin sử dụng enzyme endochitinase và β­hexosaminidase tái tổ hợp 1.2.2. u cầu ­ Ni cấy 02 chủng E.coli tái tổ hợp và xác định được mức độ biểu hiện của gen mã hóa cho endochitinase và β­hexosaminidase ­ Tinh sạch và xác định được đặc tính thủy phân chitin của enzyme  endochitinase từ chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho endochitinase của Bacillus licheniformis DSM13 ­ Tinh sạch và xác định được đặc tính thủy phân pNP­N­acetylglucosaminide của chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho βhexosaminidase của Lactococus lactis ssp.lactis IL1403 ­ Phân tích được thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm thủy phân ­ Bước đầu xây dựng được quy trình thủy phân chitin thu GlcNAc bằng cách kết hợp hai enzyme Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tìm hiểu chung về chitin 2.1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 15/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Chitin được mơ tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên  cứu lồi nấm Agaricus volvacecus, ơng thu được sản phẩm và đặt tên là chitin Năm 1823, Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ơng gọi là chitin Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng cơng thức tương tự như cellulose [51] Chitin là một polysacharide phổ biến trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (nhiều thứ hai sau cellulose), là một polymer sinh học được tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng  của vỏ một số động vật khơng xương sống như: cơn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun trịn. Trong động vật bậc cao chitin là một thành phần chủ yếu trong mơ  da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật  chitin có ở thành tế bào nấm, sinh khối nấm mốc, một số loại tảo. Trong thủy  sản, hàm lượng chitin chiếm khá cao so với khối lượng chất khơ: mực 3 – 20%, tơm 33%, cua 70% [1] Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự  nhiên, hiếm khi chitin tồn tại ở trạng thái tự do mà ln liên kết dưới dạng phức hợp chitin – protein [4] 2.1.2. Tính chất lý hóa của chitin 2.1.2.1. Tính chất vật lý Chitin có màu trắng hoặc trắng ngà, vơ định hình. Chitin ở thể rắn, xốp nhẹ, khơng màu, khơng mùi, khơng vị. Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng từ 884­890 nm. Chitin khơng tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm lỗng, trong cồn và các dung mơi thơng thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vơ cơ đặc như HCl, H2SO4. Chitin tương đối ổn định với các chất oxi hóa khử như Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 3 thuốc tím (KMnO4), oxi già (H2O2), nước javen (NaOCl ­ NaCl)… do vậy người ta đã sử dụng các chất này để khử màu cho chitin [1] 2.1.2.2. Tính chất hóa học ­ Cấu trúc hóa học của chitin: Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n Tên gọi: Poly(1­4)­2acetamido­2deoxy­β­D­glucose; Poly(1­4)­2acetamido­2deoxy­β­D­glucopyranose Hình 2.1: Cấu trúc của phân tử chitin [51] Chitin có cấu trúc gần giống với cellulose, chỉ có vị trí của nhóm hydroxyl thứ hai trên ngun tử cacbon được thay thế bởi nhóm amino­acetyl. Chitin là polysaccharide có khối lượng phân tử lớn. Chitin có cơng thức phân tử: (C8H13NO5)n, được hình thành từ các đơn phân GlcNAc liên kết với nhau bằng liên kết β­1,4glycoside [4]. Trong đó: n thay đổi tùy theo nguồn thu nhận chitin, tơm thẻ  (n = 400­500), tơm hùm (n = 700­800), cua (n = 500 – 600) Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình là α, β, γ­chitin. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích trong mạch. Có thể biểu diễn mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ­ chitin được mơ tả như sau [2]: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 4  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 16/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text α chitin β chitin γ chitin α ­ chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngồi liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó cịn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt khơng gian và năng lượng. ðây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên [4] β, γ­chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β­chitin) và hai song song một ngược chiều (γ ­ chitin), giữa các lớp khơng có loại liên kết hydro Dạng β­chitin cũng có thể chuyển sang dạng α­chitin nhờ q trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn [4] ­ Một số tính chất hóa học điển hình: Thủy phân chitin bằng HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao cho sản phẩm gồm 88,5% D­glucosamine và 11,5% acid acetic, q trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở  liên kết glucoside, sau đó là loại bỏ nhóm acetyl (­CO­CH3) [1] Thủy phân chitin bằng dung dịch NaOH đậm đặc ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl, sản phẩm tạo thành là chitosan và muối CH3COONa [1] 2.2. Tìm hiểu chung về GlcNAc 2.2.1. Cơng thức cấu tạo Cơng thức cấu tạo phân tử của GlcNAc: C8H15NO6 Tên IUPAC: N­[(3R, 4R, 5S, 6R)­2,4,5­trihydroxy­6­(hydroxymethyl) oxan­3­yl]  Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo của GlcNAc [49] Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 5 2.2.2. Tính chất của GlcNAc GlcNAc là một dẫn xuất monosaccharide của glucose. Nó là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, khơng màu, khơng mùi, điểm nóng chảy 210 0C, khối lượng phân tử 221,21 g/mol, độ hịa tan nước 167 mg/ml, khơng tan trong ether và chloroform. Giống như glucose, GlcNAc cho phản ứng tráng bạc, phản ứng với Cu(OH)2 cho màu xanh nhạt [54] Các phân tử GlcNAc với dẫn xuất của chúng được sử dụng để bảo vệ mặt ngồi của tế bào hoặc trực tiếp tham gia vào tương tác tế bào, làm tăng độ đặc và lực tương tác giữa các tế bào [50] GlcNAc là một thành phần của polysaccharide khơng đồng nhất như murein (là một polysaccharide, thành phần cơ bản của tế bào vi khuẩn) và acid hyaluronic (là yếu tố chính ảnh hưởng tới sự hình thành mạch, sự vận động của sụn, khớp, độ bám dính và chữa lành vết thương) [14], [6] Ở người, GlcNAc thường thấy trong các glycoprotein như mơ plasinogen [42], tuyến giáp kích thích hocrmon, gonadotropin màng đệm ở người giúp cho khớp vận động dễ dàng hơn. Ở động vật, GlcNAc cũng thấy trong các lồi động vật có vú. Trong thực vật, GlcNAc đã thấy trong bromelin, ricin, agglutinin và abrus  agglutinin [27] Do những tác dụng của nó đối với sức khỏe con người, từ đầu thế kỷ XXI, GlcNAc được sử dụng trong thực phẩm chức năng và ứng dụng trong y học 2.2.3. Vai trị của GlcNAc  Nhiều nghiên cứu về GlcNAc được thực hiện trên động vật như thử nghiệm độc tính, cấp tính trên các tế bào tủy xương, nhiễm sắc thể tinh hồn chuột, thử  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 17/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text nghiệm lâm sàng trên người…[26] cho thấy GlcNAc là một chất an tồn, sử dụng để bổ sung dinh dưỡng, ứng dụng trong điều trị bệnh cho con người 2.2.3.1. GlcNAc điều trị các về bệnh khớp GlcNAc được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh thối hóa khớp, ngồi ra GlcNAc cịn được sử dụng như thực phẩm chức năng để cải thiện các triệu chứng do thối hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo sụn khớp, điều trị tận gốc ngun nhân gây bệnh Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 6 Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp GlcNAc của cơ thể bị giảm sút, dễ mắc các bệnh về viêm xương khớp, người ta đã bổ sung vào cơ thể GlcNAc dưới dạng thuốc, có tác dụng chống viêm và kích thích phát triển mơ sụn Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện để điều trị bệnh nhân rối loạn khớp bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn, tổn thương khớp, thối hóa khớp. Các kết quả thử nghiệm trên chỉ ra rằng GlcNAc có vai trị quan trọng trong việc phịng chống tổn thương khớp [28] 2.2.3.2. GlcNAc điều trị viêm ruột Bệnh viêm ruột (IBD) là bệnh mãn tính gây viêm ở một số phần của ruột. Các thành ruột trở nên sưng, viêm và phát triển gây lt, gây khó chịu và ảnh hưởng tới tiêu hóa. IBD là một phần chẩn đốn chung bao gồm một số bệnh về đường ruột như: viêm lt đại tràng, viêm niêm mạc trực tràng mãn tính và bệnh Crohn. Khi bệnh Crohn tấn cơng vào ruột non, cơ thể khó hấp thụ các chất dinh dưỡng. Kém hấp thụ và cảm giác chán ăn có thể dẫn đến suy dinh dưỡng [23] GlcNAc có khả năng tăng cường việc tiết acid mucopolysaccharides bởi các ngun bào sợi và khơi phục lại sự hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa. Ngồi ra, GlcNAc làm tăng tính đàn hồi của các mơ quanh mạch, dẫn đến sự gia tăng lưu lượng máu qua mao mạch động mạch. GlcNAc hoạt động như một tác nhân bảo vệ giúp khơi phục lại chức năng bình thường của niêm mạc ruột ở người [23] Một thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện để xác định hiệu quả điều trị bệnh IBD của GlcNAc. Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau  khi dùng GlcNAc qua đường uống hay hậu mơn. Trong 12 trẻ em tham gia thử  nghiệm có 8 trẻ em cải thiện rõ rệt khi được uống GlcNAc như là một liệu pháp song song với liệu pháp hiện hành, trong khi đó 4 trẻ cịn lại khơng thấy chuyển biến. Ngồi ra, 7 trẻ em bị IBD khác cũng dùng GlcNAc qua đường hậu mơn, kết quả cho thấy có 5 trẻ en cho thấy kết quả rõ rệt, cịn lại 2 trẻ cịn lại khơng thấy chuyển biến và điều đáng quan tâm là 2 trẻ em này trước đó đã đề kháng lại các liệu pháp điều trị khác [40] Từ những thử nghiệm trên, GlcNAc có triển vọng là một phương pháp điều trị rẻ tiền và khơng độc hại đối với bệnh IBD mãn tính Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 7 2.2.3.3. GlcNAc là ngun liệu sản xuất acid sialic Acid N­acetylneuraminic (Neu5Ac) là acid sialic phổ biến nhất tồn tại trong cấu trúc của các lồi động vật có vú và gia cầm. Neu5Ac là một phần tử quan trọng trong hệ thống nhận dạng sinh học, là thuốc thử dùng để chuẩn đốn bệnh virus cúm, chúng như là một phương thuốc hiệu quả trong việc điều trị bệnh cúm [29], [15]. Sản xuất Neu5Ac từ GlcNAc đơn giản, dễ thực hiện, thu được số lượng lớn Theo nghiên cứu của Maru và cộng sự (1998) từ 27 kg GlcNAc thu được 29 kg Neu5Ac [30]. Như vậy, GlcNAc là một ngun liệu quan trọng để sản xuất acid  Neu5Ac 2.2.3.4. GlcNAc là ngun liệu sản xuất mỹ phẩm  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 18/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Da người gồm hai lớp là lớp sừng (lớp ngồi cùng) và lớp hạ bì (lớp bên trong) để bảo vệ cơ thể khỏi các tác động khắc nghiệt của mơi trường. Tầng lớp sừng đóng một vai trị quan trọng trong việc duy trì độ ẩm, độ săn chắc cho da. Lớp hạ bì bao gồm collagen, elastin… được tạo ra bởi các ngun bào sợi giúp làm tăng khả năng phục hồi, độ bền, độ đàn hồi giúp da ln khỏe mạnh. Một trong những nhóm carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic và proteoglycan có khả năng giữ nước cao và là thành phần quan trọng trong việc duy trì độ ẩm cho da [9] Lượng carbonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và phục hồi của da giảm và do đó làm cho da khơ, xuất hiện các nếp nhăn. Bổ sung GlcNAc giúp tăng cường sự phát triển của collagen của ngun bào sợi, thúc đẩy sự gia tăng của tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất hiện các sắc tố da trên khn mặt, giảm nếp nhăn trên da [9]. Vì vậy GlcNAc được coi là một thành phần có giá trị trong mỹ phẩm, ngồi ra GlcNAc cịn được sử dụng trong việc giúp cho các vết thương nhanh hồi phục [13] 2.2.4. Phương pháp sản xuất 2.2.4.1. Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp hóa học GlcNAc trong lịch sử đã được thương mại thơng qua q trình thủy phân chitin thơ bằng acid mạnh như HCl. Nhiệt độ xử lý và nồng độ acid phải được lựa chọn cẩn thận. Các thơng số này phải đủ cao để thủy phân chitin nhưng khơng q cao để tránh các sản phẩm GlcNAc bị phá hủy. ðiều kiện phản ứng thích hợp gồm  Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 8 15­36% HCl, nhiệt độ 40 – 80 0C. Trong điều kiện này có thể sản xuất được 6,42  gam/lít GlcNAc trong 1 giờ [7] Ưu điểm của phương pháp này là kinh tế. Nhược điểm của phương pháp này là năng suất thấp dưới 65%, chất thải có tính acid, sản phẩm khơng được coi là tự nhiên và tinh khiết do có sự biến đổi hóa học [41]. Mặt khác, GlcNAc sản xuất hóa học thường có vị đắng do những chất cịn tồn dư như dung mơi, tributylamine Nhiều cơng trình đã được thực hiện để cải thiện độ tinh khiết của GlcNAc sản xuất bằng phương pháp hóa học. Ryosuke và cộng sự (2002) kết hợp q trình thủy phân acid của chitin và trao đổi ion màng để điều chế GlcNAc tự nhiên [39] Zhan (2007) đã kết tinh để điều chế GlcNAc với độ tinh khiết cao 99,95% [51]. Do đó, có thể nghiên cứu sử dụng kết hợp các phương pháp hóa học để sản xuất GlcNAc với giá rẻ trong tương lai 2.2.4.2. Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp chuyển hóa sinh học ðể tăng hiệu quả sản xuất GlcNAc phương pháp chuyển hóa sinh học đã được nghiên cứu và đề xuất. Một loại vi khuẩn thủy phân chitin là Chitinibacter tainanensis được phân lập từ mẫu đất ở miền nam ðài Loan đã được chứng minh để sản xuất GlcNAc [12]. Hiệu suất sản phẩm thu được là 75% khi sử dụng α­chitin và 98% khi sử dụng β­chitin. Hạn chế của phương pháp này là vi khuẩn có thể bị chết trong mơi trường acid GlcNAc được sản xuất bằng phương pháp biến đổi gene của vi sinh vật sử dụng cơ chất glucose. Theo Deng và cộng sự (2005), chủng E.coli biến đổi gene đã sử dụng glucose để tạo ra GlcNAc. Trong nghiên cứu này, đã thu được trên 120 g/l  GlcNAc sau khi lên men trong 60 giờ [12] Mặc dù hiệu quả sản xuất GlcNAc cao, tuy nhiên phương pháp chuyển hóa sinh học khơng sử dụng được nguồn phế liệu có sẵn trong tự nhiên, q trình tinh sạch từ các chủng khó khăn, chi phí rất cao [12] 2.2.4.3. Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp enzyme GlcNAc sản xuất bằng phương pháp hóa học và biến đổi sinh học khơng được thương mại rộng rãi khơng chỉ vì lý do kỹ thuật mà cịn ảnh hưởng tới mơi trường. Lượng lớn các chất thải hóa học sử dụng trong q trình sản xuất khơng Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp   Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 19/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text Page 9 thân thiện với mơi trường. Vì vậy, phương pháp sử dụng hệ enzyme chitinase của vi  sinh vật đã được quan tâm [19] Phương pháp này sử dụng endochitinase cắt các liên kết của chitin một cách ngẫu nhiên tạo ra các olygosaccharide, sau đó enzyme β­hexosaminidase tiếp tục thủy phân liên kết glucoside của các olygosaccharide tạo ra GlcNAc [19], [38]. Một số enzyme thơ được phân lập từ Tricoderma viride, Aspergillus niger, Carcica  papaya, Penicillium oxalicum và Aeromonium sản xuất GlcNAc hiệu quả cao [41] Theo Sashiwa và cộng sự (2002) nghiên cứu sản xuất GlcNAc từ α­chitin bởi các enzyme thơ từ Aeromonas hydrophila H2330 [43], hiệu suất GlcNAc thu được 77% trong thời gian 10 ngày. Một nghiên cứu khác của Pichangkura và cộng sự  (2002) sử dụng chitinase thơ từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis SK­1 thủy phân αchitin để sản xuất GlcNAc, hiệu suất thu sản phẩm GlcNAc đạt 41% [18] Một nghiên cứu của Kuk và cộng sự (2005) chủng vi khuẩn được phân lập từ đất ven biển là Aeromonas sp. GJ­18 có khả năng thủy phân chitin tạo GlcNAc Bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy ở điều kiện 45 0C sản phẩm chính của phản ứng thủy phân là GlcNAc và một lượng nhỏ (GlcNAc)2 và (GlcNAc)3, trên 500C sản phẩm chính là (GlcNAc)2. Tại nhiệt độ tối ưu 45 0C và pH 5 trong 9 ngày hiệu suất thủy phân của enzyme là 94,9% [11].  Theo nghiên cứu của Paramenswaran Binod và cộng sự (2007), sử dụng endochitinase và chitobiase từ nấm để sản xuất GlcNAc. Trong 15 chủng nấm được  lựa chọn, chủng Penicillium aceleatum NRRL 2129 cho endochitinase hoạt độ cao nhất, chủng Trichoderuma harzianum TUBF927 cho hoạt độ chitobiase cao nhất.  Sự kết hợp hai enzyme từ chủng nấm được lựa chọn, tạo ra sản phẩm GlcNAc với một lượng lớn [37] Tiếp theo nghiên cứu của Phakapob Settthaketset và cộng sự (2008), sử  dụng chitinase từ chủng nấm mốc Aspergillus sp. kết hợp với β­chitin từ vỏ mực để ứng dụng cho thu nhận GlcNAc. Sau 2 ngày thủy phân, pH4, nhiệt độ 45 0C lượng GlcNAc tạo ra là 65% [38] Phương pháp sử dụng hệ enzyme từ vi sinh vật trong sản xuất GlcNAc từ chitin ngày càng được sử dụng phổ biến và rộng rãi do có hiệu suất thu GlcNAc Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 10 cao, khắc phục được nhiều hạn chế của phương pháp hóa học và chuyển hóa sinh học [11], [37], [18].  2.3. Vi khuẩn Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis khả năng ứng dụng  để sản xuất enzyme 2.3.1. ðặc điểm hình thái Bacillus licheniformis và Lactoccus lactis 2.3.1.1. ðặc điểm hình thái Bacillus licheniformis Vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử hình ơ van  khơng phình, thuộc nhóm hai theo phân loại của Pries và cộng sự [52]. Các tế bào vi khuẩn này đứng riêng rẽ hoặc có thể sắp xếp với nhau tạo thành chuỗi. Tế bào vi khuẩn ngắn, nhỏ có thể thay đổi tùy theo chuỗi từ 1 – 5µm, đuờng kính từ 0.5 – 1µm 2.3.1.2. ðặc điểm hình thái Lactococcus lactis Theo phân loại của Bergay (1994) vi khuẩn lactococcus lactis: Lớp lactobacillaceae – Họ Streptococeae – Giống: Lactococcus – Lồi: Lactococcus lactis. Dưới lồi của Lactococcus lactis gồm: Lc.lactis ssp.cremoris, Lc lactis ssp.hordniae, Lc lactis ssp. lactis và Lc lactis ssp.Lactis biovar diacetylactis [17] Tế bào lactococcus lactis hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước 0,5­1,2 x 0,51,5µm. Trong mơi trường dịch thể, tế bào thường tồn tại ở dạng kết đơi hoặc chuỗi ngắn. Tế bào gram dương, khơng hình thành nội bào tử, khơng di động, khơng có vỏ bọc, hiếu khí, phản ứng catalase âm tính, phản ứng oxidase âm tính [17]  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 20/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text 2.3.2. ðặc điểm sinh lý Bacillus licheniformis và Lactococus lactis 2.3.2.1. ðặc điểm sinh lý Bacillus licheniformis Trong tự nhiên có thể phân lập Bacillus licheniformis ở khắp nơi từ đất,  nước, cây trồng. Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của nó là 50 0C, nhưng nó cũng có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn nhiều. Tuy nhiên, nhiệt độ tốt nhất để tiết một số enzyme  là 37 0C [52]. Khi điều kiện mơi trường khắc nghiệt nó sẽ chuyển sang dạng bào tử để chống chịu tốt hơn và quay về trạng thái sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi Hiện nay hầu hết các q trình lên men vi khuẩn đều được thực hiện bằng các phương pháp ni cấy chìm có sục khí, khả năng sinh sinh khối và sinh tổng hợp enzyme chitinase của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện mơi trường Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 11  2.3.2.2. ðặc điểm sinh lý Lactococcus lactis Lactococcus lactis lên men lactic một số nguồn carbon, tạo sản phẩm chủ yếu là L(+) lactic acid. Lactococcus lactis có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng cần nhiều nguồn cơ chất khác nhau trong mơi trường để sinh trưởng Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của Lactococcus lactis là 30 0C, có thể tồn tại ở 10 0C nhưng khơng sống được ở 45 0C. Ngồi ra, Lactococcus lactis có khả năng tăng trưởng trong mơi trường pH 3,5­ pH 9,2 nhưng chết ở pH 9,6 và tồn tại được trong mơi trường có nồng độ NaCl thấp hơn 6,5% Bộ gen của Lactococcus lactis có một nhiễm sắc thể vịng, kích thước từ 2,03,1Mbp. Hầu hết các chủng Lactococcus lactis đều có nhiều plasmid (số lượng từ 211), phổ biến là từ 4­7 plasmid trong tế bào [17].  2.3.3. Ứng dụng của Bacillus licheniformis và Lactococus lactis 2.3.3.1. Ứng dụng của Bacillus licheniformis Hiện nay, vi khuẩn này đang được chú ý và sử dụng cho mục đích cơng  nghiệp như sản xuất enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa. Nó có khả năng sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào có liên quan tới các chu trình dinh dưỡng trong tự nhiên Bacillus licheniformis cũng được ứng dụng là một thành phần quan trọng trong chất giặt tẩy. Do nó có khả năng phát triển trong mơi trường kiềm và sản sinh  ra một protease có thể tồn tại ở pH cao. Protease có pH tối ưu ở khoảng pH 9 và pH10, do vậy nó có thể loại bỏ protein bao gồm bụi bẩn trong quần áo [51] Bacillus licheniformis được sử dụng để sản xuất kháng sinh Bacitracin Bacitracin bao gồm một hỗn hợp của các polypeptide tuần hồn do Bacillus licheniformis tạo ra nhưng nó lại được tạo ra để ức chế sự tăng trưởng của Bacillus licheniformis. Ngồi ra, Bacillus licheniformis cũng được sử dụng để sản xuất penicillinase, pentosanases, proticin, citric acid Hiện nay đã có rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới thu nhận chitosanase từ Bacillus sp. như: Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus alvei,  và Bacillus licheniformis Theo Yasushi Uchida et al (1994), Bacillus licheniformis UTK được phân lập từ đất  Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 12 cho thấy khả năng sinh chitosanase ngoại bào. Sau khi ni cấy và thu dịch thơ enzyme, thực hiện các bước làm sạch đã thu được hai enzyme chitosanase C1, C2 có khối lượng khoảng 31 và 26kDa. Nhiệt độ tối ưu khoảng 40 ­ 450C và pH tối ưu 4.6 ­ 4.9 [43] Nghiên cứu gần đây của Ekowati và cộng sự (2006) cũng được thực hiện thu nhận chitosanase từ Bacillus licheniformis MB2 được phân lập từ suối nước nóng ở Manado, Indonesia. Cũng sau q trình làm sạch thu được hai enzyme chitosanase  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 21/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text chitosanase thứ hai thu được có khối lượng phân tử khoảng 75kDa, nhiệt độ hoạt động tối ưu là 700C và khoảng pH tối ưu là pH 6 – pH 7 [8] 2.3.3.2. Ứng dụng của Lactococcus lactis Trong mơi trường có nguồn carbonhydrate phong phú, Lactococcus lên men  carbonhydrate bằng cơ chế lên men lactic đồng hình, chủ yếu tạo ra L (+) ­lactic acid. Lactic acid được tạo ra làm giảm pH mơi trường, vì vậy ức chế sự tăng trưởng của nhiều vi khuẩn khác. Một số chủng Lc.lactis có khả năng đồng hóa các phân tử đường đơn giản thành các polysaccharide phức tạp, được xuất bào và kết hợp với bề mặt tế bào. Những hợp chất này cung cấp kết cấu vững chắc cho một số sản phẩm lên men và có thể đóng vai trị như những tác nhân ổn định [43], [52] Trong chủng dưới lồi Lc.lactis, chỉ Lc.lactis ssp. lactis biovar diacetylactis  có khả năng sử dụng citrate trong sữa. Sản phẩm tạo thành gồm diacetyl, acetoin, 2,3­butanediol, acetic acid và CO2, những hợp chất này góp phần tạo hương thơm trong các sản phẩm lên men [8] Enzyme lipase hoặc esterase của Lc.lactis có hoạt tính phân giải lipid thấp, chủ yếu đóng vai trị đảm bảo chức năng sinh lý của tế bào [43] Lc.lactis cần nhiều hợp chất protein, peptide, aminoacid để sinh trưởng Trong mơi trường sữa có các amino acid isoleucine, leucine, valine, histidine và  methionine, cần thiết cho sự sinh trưởng của Lactoccos. Những amino acid tự do này cung cấp nguồn nitơ cho tế bào. Casein, chứa khoảng 80% protein trong sữa sẽ trở thành nguồn nitơ chủ yếu cho tế bào sau khi nguồn nitơ khơng phải protein bị phân giải [52] Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 13 Lc.lactis là vi khuẩn vi hiếu khí, tế bào của chúng khơng có chu trình tricarboncylic acid và thiếu hệ thống vận chuyển điện tử. Tuy nhiên, chúng vẫn có  khả năng tồn tại khi có sự hiện diện của oxy nhờ các enzyme chuyển hóa oxy. Với  các enzyme oxidase và superoxide dismutase, tế bào Lc.lactis có thể chuyển O2 thành H2O2 hoặc nước. H2O2 được tạo ra, sẽ tích lũy trong mơi trường tăng trưởng do Lc.lactis khơng có enzyme catalase hoặc NADH peroxidase để loại bỏ nó. H2O2 tích lũy trong mơi trường có tác động ức chế những vi khuẩn khác vì vậy có hiệu quả bảo quản sản phẩm lên men [43] 2.4. Giới thiệu về enzyme endochitinase Chitinase (cịn gọi poly β­1,4­(2­acetamido­2­deoxy)­D­ glucosidglucanohydrolase) là hệ enzyme thủy phân chitin, có khả năng thủy giải liên kết β­1,4 glycoside giữa C1 và C4 của hai monomer N­acetyl­D­ glucosamine trong mạch chitin. Enzyme này có ở nhiều lồi sinh vật: vi khuẩn, ngun sinh động vật, nấm, thực vật và động vật [16] Dựa vào khả năng phân cắt, chitinase được chia thành  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 22/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text loại: endochitinase (mã số EC 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.30), chitobiosidase, và chitobiase [49] 2.4.1. Khối lượng phân tử và cơ chế xúc tác của endochitinase Endochitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa (kilodalton). Ở lồi thân mềm, chân đốt, động vật có xương sống, một số endochitinase có trọng lượng phân tử 40 – 90 kDa hoặc cao hơn là khoảng 120 kDa. Trọng lượng phân tử của endochitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có  khoảng biến động rộng, từ 30 đến 120 kDa [16] Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch phân tử chitin một cách ngẫu nhiên, tạo ra các đoạn oligosaccharides có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2. Cơ chế xúc tác của endochitinase đã được nghiên cứu từ dịch chiết nấm Trichoderma harzianum và Gliochadium  virens [49] Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 14 Hình 2.3: vị trí phân thủy phân của endochitinase 2.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của endochitinase Theo nhiều nghiên cứu, endochitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 – 50 C. Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho endochitinase ở sinh vật hoạt động là 400C, ngoại trừ Aspergillus niger tổng hợp endochitinase có nhiệt độ tối thích là 500C [49] Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà endochitinase có thể có những nhiệt độ tối thích khác nhau, endochitinase thu nhận từ Bacillus lichenifomis cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C. Theo Bendt (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của từ Vibrio sp. từ 30–40 0C, và endochitinase chịu nhiệt từ  chủng Bacillus sp. BG 11 có hoạt tính cao nhất ở 40­600C. Lorito (1998) đã khảo  sát hoạt tính endochitinase từ chủng Trichoderma harzianum nhận thấy enzyme này  có thể hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 20­60 0C, nhiệt độ tối thích là 40 0C Ngược lại, endochitinase từ cơn trùng thường khơng ổn định ở nhiệt độ 400C [21] Giá trị pH tối thích của endochitinase từ 4­9 đối với các endochitinase ở thực vật bậc cao và tảo; endochitinase ở động vật là từ 4,8­7,5 và ở vi sinh vật là từ 3­8,0 [49] 2.4.3. Nguồn thu nhận endochitinase Trong tự nhiên endochitinase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn sinh vật  khác nhau như vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật. Nguồn vi khuẩn chính để thu endochitinase là nhóm Streptomycetes, ngồi ra cịn có các nhóm khác như: Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio… Vi khuẩn tổng  hợp chitinase nhằm phân giải chitin trong mơi trường để tạo nguồn carbon cho vi Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp  Page 15 Tài liệu liên quan  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 23/24 11/7/2017 nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng ­ Tài liệu text nghiên cứu Điều kiện để phát triển du lịch nhằm thu hút khách và giải pháp phát triển du lịch đến năm 2020 trên địa bàn tỉnh Hải Dương.DOC Nghiên cứu điều kiện để phát triển loại hình du lịch chữa bệnh bằng nước khống (Tại một số điểm suối khống ở trung du & dun hải Bắc Bộ) Nghiên cứu điều kiện phân tích beta lactam bằng phương pháp điện di mao quản Nghiên cứu điều kiện phân tích các hợp chất cơ clo PCB trong mẫu mơi trường bằng phương pháp GC MS Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β – lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đốn bệnh ung thư bạch cầu Nghiên cứu điều kiện làm việc của người lái tàu bay của hãng hàng khơng Việt Nam nhằm đế xuất một số giải pháp, chế độ đảm bảo sức khỏe người lái, góp phần đảm bảo an tồn bay Nghiên cứu điều kiện làm việc của người lái tàu bay của hãng hàng khơng Việt Nam nhằm đế xuất một số giải pháp, chế độ đảm bảo sức khỏe người lái, góp phần đảm bảo an tồn bay potx Báo cáo " NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BÊ TƠNG CHẤT LƯỢNG SIÊU CAO SỬ DỤNG SILICA FUME VÀ XỈ LỊ CAO HẠT HĨA NGHIỀN MỊN Ở VIỆT NAM" pdf  Tải bản đầy đủ Thích Chia sẻ   http://text.123doc.org/document/3190450­nghien­cuu­dieu­kien­thuy­phan­chitin­thu­nhan­nacetyldglucosamine­su­dung­enzyme­endochitinase­va­hexosami… 24/24