1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong năm gần đây, với xu hướng đa dạng hố vật ni địa bàn sản xuất phạm vi nước, ngành chăn nuôi lợn có bước phát triển khơng ngừng Đến nay, sản phẩm từ thịt lợn đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng nước mà xuất thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân Tuy nhiên, giá thành thịt lợn sản xuất cao so với thị trường quốc tế khu vực Nguyên chi phí tiêu tốn thức ăn cịn lớn thiệt hại dịch bệnh xảy Thiệt hại lợn nuôi thịt, chủ yếu tập trung vào bệnh truyền nhiễm ký sinh trùng Đối với đàn nái sinh sản, phải kể đến bệnh tiêu chảy lợn con, đặc biệt giai đoạn theo mẹ Đến nay, hội chứng tiêu chảy lợn khẳng định thường xuyên xảy chiếm tỷ lệ cao bệnh đường tiêu hoá, xuất hình thức chăn ni Bảo vệ lợn khỏi tiêu chảy góp phần nâng cao hiệu chăn nuôi lợn sinh sản, đảm bảo cung cấp giống có chất lượng tốt cho chăn ni giai đoạn sau Vì mà nhà khoa học giới tập trung nhiều công sức nghiên cứu để tìm giải pháp khống chế bệnh hữu hiệu Trong đó, xu hướng sử dụng vắc xin chế phẩm sinh học đặc biệt khuyến khích áp dụng Khơng giới hạn mục đích phịng trị bệnh, mà cịn có nhiều ý nghĩa quan trọng khác môi trường sức khoẻ cộng đồng như: Để hạn chế tồn dư kháng sinh thực phẩm, giảm thiểu ô nhiễm môi trường chăn nuôi, hạn chế tính đa kháng thuốc vi sinh vật, đảm bảo ổn định trạng thái cân môi trường sinh thái Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn ngành chăn nuôi lợn sinh sản, sở kế thừa kết nghiên cứu tác giả trước nước, đồng thời vào khả sở nghiên cứu, điều kiện phịng thí nghiệm Việt Nam chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu, chế tạo vắc xin chỗ phòng bệnh phân trắng lợn số trại chăn nuôi lợn sinh sản tập trung Thái Nguyên Hà Tây” Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Kết phân lập, giám định serotype yếu tố gây bệnh vi khuẩn E.coli dẫn liệu khoa học bệnh phân trắng lợn - Vắc xin chế tạo có thành phần kháng nguyên nguồn gốc chỗ với yếu tố gây bệnh xác định, đảm bảo cho tính đặc hiệu kháng thể sản sinh tiêm phịng cho lợn nái thí nghiệm - Kết định lượng thành phần globulin miễn dịch sữa đầu lợn nái thí nghiệm sở khoa học khẳng định hiệu bảo hộ lợn khỏi tác động gây bệnh E.coli, đồng thời làm rõ đặc điểm truyền kháng thể thụ động từ mẹ sang qua sữa đầu, đặc biệt thành phần IgG - Vắc xin chỗ có tác dụng phòng bệnh phân trắng cho lợn theo mẹ, đảm bảo an toàn, giảm tỷ lệ lợn cịi cọc góp phần tăng trọng lợn cai sữa Mục tiêu nghiên cứu Đề tài thực với mục tiêu nghiên cứu sau: - Xác định số yếu tố gây bệnh chủ yếu vi khuẩn E.coli bệnh phân trắng lợn - Chế tạo, kiểm tra thử nghiệm lâm sàng vắc xin E.coli chỗ phòng bệnh phân trắng lợn - Đề xuất biện pháp phòng bệnh phân trắng lợn trại chăn ni lợn sinh sản theo hình thức tập trung Đối tượng địa điểm nghiên cứu đề tài 4.1 Đối tượng nghiên cứu Lợn nái có chửa lợn theo mẹ 4.2 Địa điểm nghiên cứu Phịng thí nghiệm thuộc Bộ môn vệ sinh gia súc, Viện nghiên cứu thú y Quốc gia; Phịng thí nghiệm Khoa Chăn ni Thú y; Trại lợn giống cấp I Thanh Hưng, Trại lợn giống cấp I Phú Lãm, Trại lợn giống cấp I Sơn Đồng Hà Tây; Trại lợn giống - Trung tâm Thực hành thực nghiệm Trường Đại học Nông Lâm Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Hội chứng tiêu chảy lợn Tiêu chảy triệu chứng chung, đặc trưng thường xuất bệnh đường tiêu hoá lợn Xuất phát từ nguyên nhân hay triệu chứng lâm sàng, vào đặc điểm, thời gian tính chất bệnh mà có cách gọi tên khác nhau: - Hội chứng tiêu chảy (Diarrheal syndrome) - Bệnh tiêu chảy không nhiễm trùng (Non infectious diarrhea) - Bệnh tiêu chảy lợn sơ sinh (Neonatal diarrhea of piglets) - Bệnh phân sữa (Lactating piglet scour) Đến nay, triệu chứng tiêu chảy lợn khẳng định xuất gắn liền với bệnh nhiễm trùng đường tiêu hoá; gây vi khuẩn, có: E.coli, Cl.perfringens, Salmonella spp, Treponema hyodysenteriae (Alexander T.J.L, 1994)[24], (Taylor D.J, 1992)[49], Wilcock B.P, Schwartz K.J, 1992)[51], (Waddilove J, 1996)[50]; gây bệnh virus, có: Rotavirus, Coronavirus (Paul P.S, Stevenson G.W, 1992)[139], Saif L.J, Wesley R.D, 1992)[43]; bệnh ký sinh trùng, có: cầu trùng Isospora suis, giun đũa, sán ruột (Lindsay D.S et al, 1992)[34], (Kaufmann J, 1996)[32] Với nguyên nhân gây bệnh triệu chứng tiêu chảy ln coi đặc điểm phổ biến dạng bệnh đường tiêu hoá, xảy nơi lúc, đặc biệt gia súc non với hậu quả: Tiêu chảy dẫn đến nước, thiếu hụt chất điện giải, suy kiệt thể, trầm trọng bị truỵ tim mạch chết (Fairbrother J.M, 1992)[30] Nagy B, Fekete Pzs (1999)[37] cho rằng: Bệnh tiêu chảy xảy gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn ni lợn Q trình bệnh thường xuất giai đoạn chính: - Giai đoạn sơ sinh vài ngày tuổi - Giai đoạn lợn theo mẹ - Giai đoạn lợn sau cai sữa Trong điều kiện nước ta nay, hầu hết sở chăn nuôi lợn chưa thể khống chế hiệu hội chứng tiêu chảy Lợn theo mẹ bị mắc bệnh quanh năm, đặc biệt vào vụ đơng xn thời tiết có thay đổi đột ngột hay vào giai đoạn chuyển mùa năm (Đoàn Thị Băng Tâm, 1987)[18], (Sử An Ninh, 1993)[11] Trong tháng mưa nhiều, nóng ẩm, số lợn bị tiêu chảy tăng lên rõ rệt, có đến 90 hay 100% /tổng đàn (Đào Trọng Đạt cs, 1996)[3] Theo thông báo Lê Văn Tạo (2006)[16], vài thập kỷ qua hội chứng tiêu chảy Việt Nam vấn đề thời sự, lợn nhiều địa phương bị mắc bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng Theo kết nghiên cứu Hồ Văn Nam cs (1997)[7], tỷ lệ mắc bệnh đường tiêu hoá lợn cao, viêm ruột tiêu chảy Trong thực tế, việc tìm giải pháp hữu hiệu để khống chế tiêu chảy vấn đề gặp nhiều khó khăn, hội chứng có liên quan đến nhiều yếu tố khác nhau: Dinh dưỡng, chăm sóc, điều kiện ngoại cảnh, mơi trường, khí hậu, ngun nhân vi khuẩn, virus, ký sinh trùng , có yếu tố xem nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố lại cho nguyên nhân kế phát Việc phân biệt cụ thể nguyên nhân khó, thường mang tính chất tương đối, nêu lên yếu tố chính, xuất trước, yếu tố phụ xuất sau, để từ áp dụng biện pháp phịng trị bệnh kịp thời, hiệu Trịnh Văn Thịnh (1964)[20] nhận định: Cho dù từ nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy, hậu gây viêm nhiễm tổn thương thực thể đường tiêu hố, với kết cục q trình nhiễm trùng Những nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy lợn nhiều tác giả khẳng định bao gồm: * Điều kiện ngoại cảnh môi trường sống bất lợi * Nguyên nhân sai sót q trình chăm sóc ni dưỡng * Ngun nhân vi khuẩn: E.coli, Cl.perfringens, Salmonella spp, Vibrio cholera số tác nhân vi khuẩn khác thuộc họ cầu khuẩn Streptococcus * Nguyên nhân virus: Rotavirus, Coronavirus * Nguyên nhân ký sinh trùng: Giun lươn, giun đũa, sán ruột * Nguyên nhân cầu trùng: Isospora suis Với tác nhân vi khuẩn, nhiều nhà nghiên cứu cho chế tác động gây tiêu chảy cho lợn trước hết tượng loạn khuẩn làm tăng số lượng vi khuẩn có hại, giảm tỷ lệ nhóm vi khuẩn có lợi Vi khuẩn có hại tiếp thu yếu tố gây bệnh di truyền dọc di truyền ngang, thực bám dính, xâm nhập vào lớp tế bào biểu mơ ruột non gây bệnh lý tổ chức, sản sinh độc tố gây tiêu chảy (Fairbrother J.M, 1992)[30] Theo Paul P.S, Stevenson G.W (1992)[39]: Rotavirus thường gây viêm dày, ruột lợn giai đoạn từ 7-42 ngày tuổi, xảy ngày, trung bình 19 ngày tuổi Cơ chế gây bệnh virus công vào bào tương tế bào biểu mô niêm mạc ruột non tế bào phủ mảng peyer's, gây rối loạn chức tàn phá lông nhung Lợn mắc bệnh bị tiêu chảy nặng kèm chứng viêm phổi phát triển số bệnh kế phát Saif L.J, Wesley R.D (1992)[43] cho biết: Bệnh viêm dày ruột truyền nhiễm (TGE) Coronavirus gây chủ yếu cho lợn tuần tuổi, triệu chứng đặc trưng bệnh nôn mửa, tiêu chảy nặng, tỷ lệ chết cao (100%) Đối với ký sinh trùng gây tiêu chảy lợn, theo Corwin R.M, Stewart T.B (1992)[28]: Ký sinh trùng tác động gây bệnh cho lợn lứa tuổi, song chủ yếu từ tháng trở lên Với lợn theo mẹ, bệnh thường giun lươn Strongyloides ransomi gây ra, chủ yếu lứa tuổi từ 11-17 ngày với triệu chứng cấp tính; tiêu chảy, nơn mửa Tại nơi cư trú, nội ký sinh trùng gây bệnh chủ yếu tác động học, tranh giành dưỡng chất vật chủ, gây rối loạn tiêu hoá hấp thu Khi xâm nhập di hành gây tác hại lớn: Ấu trùng xâm nhập qua da gây nhiễm trùng kế phát Erysipelas rhusiopathiae (Wood R.L, 1992)[52]; Đường qua biểu bì thành ruột gây viêm ruột; Khi di hành đến phổi làm thẩm xuất dịch, gây viêm phổi kế phát Pasteurella multocida (Pijoan C, 1992)[40] Với tác nhân gây tiêu chảy cầu trùng, Lindsay D.S et al (1992)[34] cho biết: Isospora suis gây bệnh cho lợn lứa tuổi từ 7-14 ngày, dễ nhận thấy lợn bị bệnh sử dụng kháng sinh điều trị kết quả, vật biểu gầy sút, lơng xù với dấu hiệu bị nước suy kiệt tiêu chảy nhiều ngày 1.2 Vai trß cđa E.coli bệnh phân trắng lợn Trùc khuÈn ruét giµ Escherichia coli có tên gọi khác Bacterium coli commune hay Bacillus coli commune Escherich ph©n lËp tõ ph©n trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 (Nguyễn Vĩnh Phớc, 1974) [13] Trong điều kiện bình thờng, E.coli ch khu trú phần ruột sau, có dày hay ruột non Gp điều kiện ngoại cảnh bất lợi làm sức đề kháng vật chủ giảm xuống, E.coli bội nhiễm trở thành nguyên nhân gây bệnh Colibacillosis tên gi dùng để bệnh E.coli g©y gia súc, gia cầm nói chung 1.2.1 Đặc điểm sinh học cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E.coli Đặc điểm hình thái sức đề khỏng E.coli trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thớc trung bỡnh t 0,3-0,6 x 2-3àm, thng đứng riêng lẻ, canh trùng già gặp nh÷ng trùc khuẩn dài 4-8àm E.coli di động có lông xung quanh thân, không sinh nha bào, cú giỏp mụ Vi khuẩn bắt màu Gram (-), thng bắt màu sẫm hai đầu Nh vi khuẩn không to nha bào khác, E.coli không chịu đợc nhiệt độ cao: Vi khuẩn bị vô hoạt 55oC vòng 1giờ, 60oC 30 phút, nhit sôi 100oC vi khuẩn chÕt C¸c ho¸ chÊt s¸t trïng th«ng th−êng: Axít phenic, formol, hydroperoxit 0,1% diƯt vi khn sau phút bên môi trờng, E.coli tồn đến tháng Cấu trúc kháng nguyên E.coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp Theo Quinn PJ et al (1994)[41], cÊu tróc nµy bao gåm: Kháng nguyên O (Somatic) hay thnh t bo, cú bn chất lipopolysaccharide; Kháng nguyên K (Capsular hay Microcapsular), chất polysaccharide; Kháng nguyên lông H (Flagellar) yếu tố bám dính F (Fimbria), protein Cho ®Õn nay, xác định có ớt nht 170 serotype kháng nguyên O, 70 serotype kháng nguyên K, 56 serotype kháng nguyên H phát triển cách nhanh chóng số lượng cỏc kháng nguyên F ó chớnh thc c ghi nhn 1.2.2 Các yếu tố gây bệnh vi khuẩn E.coli Theo Bertschinger H.U et al (1992)[25]: BÖnh viêm ruột tiêu chy E.coli gây chu tác động nhiều yếu tố khác nhau, chúng có vai trị tạo điều kiện mơi trường thích hợp cho vi khuẩn thay đổi từ dạng cộng sinh thường trc trở thành cờng độc gây bệnh Tc giỳp E.coli tip thu đợc nhiều yếu tố gây bệnh khác nhau, ú có yếu tố độc tố có yếu tố độc tố Nh cú c yếu tố ny mà chủng vi khuẩn E.coli cã khả gây bệnh trở thành tác nhân gây tiêu chảy, bệnh nhiễm trùng đường tiêu hoá gia súc gia cầm Do vậy, ng−êi ta vào yếu tố gây bệnh để chia E.coli vµo số nhãm như: Enterotoxigenic (ETEC), Enteropathogenic (EPEC), Enteroinvasive (EIEC), Enterohemorrhagic (EHEC) Attaching and Effacing E.coli (AEEC) E.coli gây tiêu chảy lợn theo mẹ thuộc nhóm ETEC (Nagy B, Fekete Pzs,1999)[37] Các nhóm E.coli độc thể bệnh mà chúng gây trình bày bảng 1.1 Qua phân chia cho thấy E.coli gây tiêu chảy lợn theo mẹ thường mang yếu tố gây bnh ch yu sau: Khả bám dính (adhesion) Đây yếu tố cú vai trũ đặc biệt quan trọng giúp vi khuẩn thực bớc trình gây bệnh Nh cú yu t bỏm dớnh, E.coli cố định vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột mà không bị rửa trôi nhu động đẩy theo phân Chủng E.coli gây bệnh bám dính lên niêm mạc ruột non nhờ vo yếu tố bám dính, tham gia gây tiêu chảy cho lợn theo mẹ có yếu tố bám dÝnh quan träng, là: F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41 F42, F18ab (F107), F18ac (Nagy B, Fekete Pzs, 1999)[37] C¸c u tè b¸m dÝnh có ảnh hng rt ln n thành công trình sinh bệnh học tiêu chảy S cú mt yếu tố b¸m dÝnh cïng víi Enterotoxin cđa E.coli tác nhân quan trng ch yu gây nên Enteric Colibacillosis lợn Khởi đầu ca quỏ trỡnh gõy bnh l tác ®éng b¸m dÝnh (được hiểu cố định) E.coli lên điểm tiếp nhận tơng ứng trờn tế bào lụng nhung niêm mạc ruột, sau ú xõm nhp, phát triển gây bnh bng Enterotoxin (c t ng rut) V bnh tớch vi th, E.coli gõy bnh không phá hủy cÊu tróc cđa lơng nhung ruột non (Fairbrother J.M, 1992)[30] 10 Bảng 1.1 Những yếu tố gây bệnh nhóm E.coli thể bệnh chúng gây lợn (Fairbrother J.M, 1992)[30] Nhóm Đặc điểm Nhóm serotype lâm sàng gây E.coli bệnh bệnh O8:KS16 Phân loại yếu tố độc lực Độc tố gây bệnh STa STb LT Yêú tố bám dính VT F4 F5 F6 + + + O9:K35 Tiêu chảy + + O9:K30 lợn sơ + + O9:K103 sinh O9(nhóm) lợn ETEC + + + + + + O20:K101 + (+) + + O64:KV142 + (+) + + O8:K4627 Tiªu chảy + + + O8(nhóm) lợn sơ + + + O157:KV17 sinh, lợn + + + O147:K89 cai sữa (+) + + O149:K91 Viªm ruét xh (+) + + O8(nhóm) Tiêu chảy + + O147:K1285 lợn con, + (+) O115:KV165 lợn cai sữa O138:K81 Tiêu chảy ETEC O139:K82 lợn sau O141:K85 cai sữa VTEC O45:KE65 (nh trªn) AEEC ETEC ETEC F41 (+) (+) + + (+) + (+) + + + (+) + + + + + + + (+) + (+) (+) Về mặt hình thỏi, yu t bám dính thờng thẳng, cú dạng ống, xoắn gần nh lông, có chất protein Nghiên cứu siêu cÊu tróc ph©n tư thấy chúng cố định bên màng ca tế bào vi khuÈn hầu hết di truyền qua plasmid (Smith H.R et al, 1985)[44] Danh pháp số đặc tính yếu tố bám dính tham gia gây tiêu chảy cho lợn theo mẹ trình bày bng 1.2 Các yu t bám dính có trng lợng phân tử khác nhau, dao động từ 1525 kDa, vi vị trí bám dính đợc cố định điểm cu trỳc ca chúng Khả ngng kết vi hồng cầu mt s loi vt ca yu t bám 53 Bảng 3.12 Kết thử khả bảo hộ lợn chống lại ETEC vắc xin thực địa Thời Số lợn thử Chủng Liều Số lợn Tỷ lệ điểm thử nghiệm E.coli uống gây mắc mắc chết chết nghiệm (con) gây nhiễm bệnh bệnh (con) (%) nhiễm (ml/con) (con) (%) (ngày Số lợn Tỷ lệ tuổi) ĐC E-NL6 3,0 100 16,6 TN E-NL6 3,0 16,6 0 ĐC E-TH8 3,2 100 33,3 TN E-TH8 3,2 16,6 0 ĐC E-SĐ9 3,5 83,3 0 TN E-SĐ9 3,5 0 0 Từ bảng 3.12, kết thu cho thấy: Lợn thí nghiệm giảm tỷ lệ mắc bệnh ETEC, chiếm từ đến 16,6% So với đối chứng, lợn mắc bệnh chiếm từ 83,3 đến 100% Lợn thí nghiệm khơng bị chết mắc bệnh (0%) so với lợn đối chứng, tỷ lệ chết chiếm từ 16,6 đến 33,3% Kết phù hợp với Svendsen J, Willson M.R (1971)[48] 3.13 Hiệu phòng bệnh lợn phân trắng thực địa vắc xin Vắc xin sau chế tạo đáp ứng yêu cầu theo quy định ngành phịng thí nghiệm, thử nghiệm lâm sàng bố trí thử nghiệm thực địa để đánh giá hiệu phòng bệnh cho lợn theo mẹ Kết thu trình bày bảng 3.13 54 Bảng 3.13 Kết đánh giá hiệu phòng bệnh lợn phân trắng vắc xin chỗ Vaccoli Địa điểm Lợn nái Số lợn Khối Lợn tiêu chảy từ 1- Tuổi Lợn chết mắc Khối lượng TB theo dõi theo dõi lượng sơ 21 ngày tuổi nhiễm bệnh cai sữa lúc 21 (con) (con) sinh TB (%) (kg/con) bệnh TB (%) (ngày) ngày tuổi (kg/con) Trại Thanh Hưng ĐC 12 129 1,20 45 34,8 3,6 8,8 5,43 Hà Tây TN 36 431 1,18 41 9,5 12,8 0 5,71 So sánh TN&ĐC P