CÁC QUÁ TRÌNH TÁCH TRONG sắc ký LỎNG

www.DaiHocThuDauMot.edu.vn CÁC QUÁ TRÌNH TÁCH TRONG SẮC KÝ LỎNG TS NGUYỄN BÁ HOÀI ANH www.DaiHocThuDauMot.edu.vn • Quá trình tách trình quan trọng phương pháp sắc ký nói chung sắc ký lỏng nói riêng • Hiệu trình phụ thuộc nhiều vào tương tác chất pha tĩnh pha động • Mục đích sắc ký tách định tính chất hỗn hợp chất phức tạp • Tuy nhiên thực tế lúc việc tách chất xảy hòan hảo tương tác phức tạp tương tác chất nằm riêng rẽ nằm hỗn hợp lại phần khác www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Một số lọai sắc ký ™ High Performance Liquid chromatography (HPLC) : sắc ký lỏng hiệu cao ™ Gas Chromatography (GC) : sắc ký khí ™ Thin-Layer Chromatography (TLC) : sắc ký lớp mỏng ™ Capillary Electrophoresis(CE) : sắc ký điện di mao quản www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Ưu điểm phương pháp sắc ký ™ Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất ™ Độ phân giải cao nhờ trình tách cột ™ Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò ™ Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100uL) www.DaiHocThuDauMot.edu.vn HPLC • High performance liquid chromatography • High pressure liquid chromatography • High price liquid chromatography • High problem liquid chromatography • High pleasure liquid chromatography www.DaiHocThuDauMot.edu.vn • Một số dạng HPLC – Pha thường (thuận) : Normal phase – Pha đảo : Reversed phase – Ghép cặp ion : Reversed phase ion pairing – Sắc ký ion : Ion exchange (IC) – Sắc ký gel : SEC (GPC/GFC) – Sắc ký tách đồng phân quang học : Chiral separation Cách phân chia phụ thuộc vào cột tách • Phân chia HPLC theo cấu tạo thiết bị – Hệ đẳng dòng (đẳng thành phần pha động) : Isocratic elution – Hệ thay đổi thành phần pha động : Gradient elution www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Hỗn hợp chất tách khỏi ? Hướng dòng chảy Pha tĩnh www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Tại lại có khác vậy? Mạnh Yếu Do lực tương tác khác www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Quá trình tách diễn • Quá trình tách diễn cột sắc ký column Vật liệu nhồi cột, 3-5um www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Tương tác chất phân tích vật liệu nhồi • Do tương tác khác chất phân tích vật liệu nhồi cột mà trình tách xảy sample A packing material sample B 10 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Tiêm mẫu thật • Để tính toán MW, cần phải có phần mềm GPC 51 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Tách Protein sử dụng cột GFC ‹Analytical Conditions ™Column : Asahipak GFA-50 ™Mobile phase : 0.1 M sodium phosphate 0.1 M NaCl (pH=7.0) ™Flow rate : 0.5 mL/min ™Temperature : ambient ™Detector : UV-280 nm ™Injection volume : 10 uL ‹Peaks glutamate dehydrogenase lactate dehydrogenase enolase adenylate kinase cytochrome C 52 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Sắc ký tách đồng phân quang học R C* H M ir ro r H *C COOH NH2 (L) form HOOC *Chiral Center R NH2 (R) form Tính chất vật lý chất giống hệt nhau, ngoại trừ quay cực 53 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Tách đồng phân quang học – cách Cho đồng phân tạo dẫn xuất với chất hữu triền để tạo chất lưỡng hình (L) + (R) (L)-(R) Chất lưỡng hình Chất đối hình (R) + (R) (R)-(R) Các sản phẩm tạo thành tách Sắc ký pha thuận pha đảo 54 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Tách đồng phân quang học – cách • Tách trực tiếp sử dụng cột Chiral - Pha tĩnh gắn đồng phân quang học biết (R) (R) (L) Tương tác mạnh Tương tác yếu (R) 55 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Cách lựa chọn loại sắc ký Loại sắc ký Dung môi sử dụng Chất phân tích Reverse Phase H2O/Buffer, ACN, MeOH Các chất trung hòa không ion hóa, tan hỗn hợp nước/dung môi hữu Ion-Pair RP Giống RP thêm chất tạo cặp ion Các chất dạng ion ion hóa Normal Phase Hexane, CH2Cl2 Hỗn hợp chất không tan hỗn hợp dung môi hữu – nước Ion Exchange H2O/Đệm Các ion vô cơ, protein, axit nucleic 56 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Cách lựa chọn loại sắc ký Lọai sắc ký Dung môi sử dụng Chất phân tích GPC/GFC H2O, THF, DMF, … Các chất có phân tử lượng lớn Chiral Hỗn hợp dung môi hữu – nước Các đồng phân quang học 57 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Các cách rửa giải HPLC • Rửa giải với chế độ Isocratic – Thành phần pha động không thay đổi suốt trình rửa giải • Rửa giải với chế độ Gradient – Pha động với thành phần thay đổi trình chạy 58 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Các cách rửa giải HPLC Time Gradient B concentration B concentration Isocratic Time 59 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Isocratic MeOH / H2O = / Thời gian phân tích dài Khả tách MeOH / H2O = / ( cột C18 ) 60 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Gradient 30% % MeOH 95% 61 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Ưu nhược điểm chế độ Isocratic • Ưu: – Thành phần pha động xác – Hệ thống phân tích đơn giản, rẻ tiền – Đường ổn định thành phần không đổi nên sử dụng tốt cho đầu dò thành phần ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu độ dẫn (CDD), đo số khúc xạ (RI)… – Thành phần pha động trộn trước tay trộn liên tục (nếu có gradient) 62 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Ưu nhược điểm chế độ Isocratic • Nhược: – Khả tách kém, đặc biệt mẫu phức tạp – Việc khảo sát thay đổi thành phần pha động cho phù hợp thành phần mẫu thực nhanh – Thời gian phân tích dài muốn tách tốt – Nếu trộn trước (khi gradient áp suất thấp) thành phần pha động thay đổi theo thời gian để lâu 63 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Ưu nhược điểm chế độ Gradient • Ưu: – Khả tách tốt – Thành phần pha động xác, đặc biệt với hệ gradient áp suất cao – Có thể thay đổi nhiều thành phần pha động Độ xác thành phần theo thời gian gần không đổi – Thời gian phân tích ngắn 64 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn Ưu nhược điểm chế độ Gradient • Nhược: – Thiết bị đắt tiền hơn, đặc biệt hệ gradient áp suất cao – Độ xác thành phần pha động hệ isocratic – Khi thành phần có tỉ lệ nhỏ, thành phần pha động xác không ổn định 65 ...www.DaiHocThuDauMot.edu.vn • Quá trình tách trình quan trọng phương pháp sắc ký nói chung sắc ký lỏng nói riêng • Hiệu trình phụ thuộc nhiều vào tương tác chất pha tĩnh pha động • Mục đích sắc ký tách định tính... chromatography (HPLC) : sắc ký lỏng hiệu cao ™ Gas Chromatography (GC) : sắc ký khí ™ Thin-Layer Chromatography (TLC) : sắc ký lớp mỏng ™ Capillary Electrophoresis(CE) : sắc ký điện di mao quản www.DaiHocThuDauMot.edu.vn... Reversed phase ion pairing – Sắc ký ion : Ion exchange (IC) – Sắc ký gel : SEC (GPC/GFC) – Sắc ký tách đồng phân quang học : Chiral separation Cách phân chia phụ thuộc vào cột tách • Phân chia HPLC