¾GFC Gel Filtration Chromatography : s ắc ký tinh lọc gel, thường sử dụng trong l ĩnh vực sinh hóa... M ối tương quan giữa trọng lượng phân t ử MW và thời gian lưu RT Gi ới hạn loại tr
Trang 1S ắc ký ion : Ion Exchange
N +
R
R R
Sample
SO 3 - + Sample
+
+
+ +
+ +
+
+
+ + +
+
L ực ion
Trang 2Ion Exchange
• S ử dụng trong lĩnh vực sinh học
(phân tích protein, peptide, amino acid)
• S ắc ký Ion : phân tích các hợp chất ion
Bao g ồm 2 loại cột:
– C ột trao đổi Cation
• Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3- )
• Weak Cation Exchange (WCX) (R-COO - )
– C ột trao đổi Anion
• Strong Anion Exchange (SAX) (R4N + )
• Weak Anion Exchange (WAX) (DEAE – diethyl aminoethyl)
Trang 3Phân tích Protein s ử dụng cột WCX
Analytical Conditions
Column : Shim-pack WCX-1
Mobile phase : [A] 20 mM phosphate buffer (pH=6.0) [B] A+0.25M sodium sulfate
[A] - [B] 30 min linear gradient
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : ambient
Detector : UV-280 nm
Injection volume : 10 uL
Peaks
1 albumin
2 myoglobin
3 α-chymotrypsinogen A
4 liponuclease A
5 lisozyme
Trang 4Nh ững điểm quan trọng cần lưu
ý trong s ắc ký ion
• pH c ủa dung dịch đệm
• N ồng độ của dung dịch đệm
• Phương pháp r ửa giải
– Đ ẳng dòng : Isocratic
– Gradient pH
– Gradient l ực ion
Trang 5S ắc ký gel SEC
• S ắ c gel (s ắ c ký size phân t ử ) (SEC)
thư ờ ng đư ợ c bi ế t dư ớ i tên :
¾GPC (Gel Permeation
chromatography) : s ắc ký thẩm thấu gel, thư ờng sử dụng trong lĩnh vực polymer.
¾GFC (Gel Filtration Chromatography) :
s ắc ký tinh lọc gel, thường sử dụng
trong l ĩnh vực sinh hóa.
Trang 6Nguyên lý c ủa SEC
• Không s ử d ụ ng hi ệ u ứ ng tương tác
• Tách d ự a trên s ự khác nhau v ề th ờ i gian di chuy ể n c ủ a ch ấ t.
Trang 7Th ứ tự rửa giải
SEC
Column
Trang 8M ục đích của GPC / GFC
• GPC
– S ử d ụ ng đ ể xác đ ị nh tr ọ ng lư ợ ng
phân t ử c ủ a polymer.
• GFC
– Tách các protein
Trang 9M ối tương quan giữa trọng lượng phân t ử (MW) và thời gian lưu RT
Gi ới hạn loại trừ
Gi ới hạn thẩm thấu
Time
Trang 10L ập đường chuẩn
• Tiêm t ừng dung dịch chuẩn polymer có
phân t ử lượng khác nhau để biết được mối quan h ệ giữa tr ọng lượng phân tử và thời gian lưu
No time(min) mol wet.
1 22.0 5500000
2 22.6 1800000
3 23.4 860000
4 25.0 400000
5 27.4 160000
6 31.0 50000
7 33.8 20000
8 38.4 4000
9 39.8 2000
10 42.8 600