Protein viral protein2 (VP2) là protein vỏ virus của virus gây hội chứng Taura ở tôm thẻ chân trắng. Protein sau khi tinh sạch được sử dụng làm nguồn kháng nguyên nhằm thu nhận kháng thể phục vụ cho các thử nghiệm ELISA. Đoạn gene VP2 được tổng hợp nhanh và đơn giản bằng phản ứng Assembly PCR (PCR ghép). Phản ứng này được thực hiện qua hai bước: bước thứ nhất chạy PCR với hỗn hợp 21 oligonucleotides, bước thứ hai chạy phản ứng PCR với hai mồi chuyên biệt TSV885FP và TSV855RP nhằm chèn trình tự nhận biết của hai enzyme BamHI và HindIII vào gene VP2. Quy trình được tối ưu hoá bằng cách sử dụng enzyme Pfu polymerase (Fermentas, CA, USA) với 20 chu kỳ cho phản ứng PCR lần 1 ở nhiệt độ bắt cặp là 55 oC và 30 chu kỳ cho phản ứng PCR lần 2. Sau đó tiến hành dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2 (Fermentas, CA, USA). Sáu clone được lựa chọn để tách plasmid và tiến hành giải trình tự, đánh giá tỉ lệ đột biến của phản ứng Assemby PCR. Trong thí nghiệm hoạt hoá đĩa ELISA bằng Selfassembly monolayers chúng tôi sử dụng hỗn hợp dung dịch 47% HNO3H2SO4 và APTES để biến đổi bề mặt polystyren với nhóm chức amin (NH2). Kháng thể bắt cũng được hoạt hóa nhóm carboxyl (COO) bằng EDCNHS trước khi gắn lên đĩa. Kết quả thu nhận được tín hiệu quang học (OD 595 nm) của phương pháp hấp phụ kháng thể bằng hóa bề mặt cao hơn phương pháp hấp phụ kháng thể bằng phương pháp vật lý thông thường, như vậy lượng kháng thể hấp phụ lên bề mặt đã được cải thiện đáng kể. Cũng bằng phương pháp hoạt hoá này chúng tôi thu nhận được giá trị OD đồng nhất và ổn định khi kiểm tra ELISA với mẫu kháng nguyên GST dạng sigma. Hai kỹ thuật này cho phép dòng hóa nhanh một đoạn gene hiếm, khó phân tách mRNA và đồng thời tăng hiệu quả củaphương pháp ELISA.
ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM oOo KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TỔNG HỢP GENE VIRAL PROTEIN-2 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG TAURA Ở TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG ASSEMBLY PCR VÀ TĂNG ĐỘ NHẠY, ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA ELISA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SELF-ASSEMBLY MONOLAYER TP.HCM, Tháng năm 2012 ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM TÓM TẮT Protein viral protein-2 (VP2) protein vỏ virus virus gây hội chứng Taura tôm thẻ chân trắng Protein sau tinh sử dụng làm nguồn kháng nguyên nhằm thu nhận kháng thể phục vụ cho thử nghiệm ELISA Đoạn gene VP2 tổng hợp nhanh đơn giản phản ứng Assembly PCR (PCR ghép) Phản ứng thực qua hai bước: bước thứ chạy PCR với hỗn hợp 21 oligonucleotides, bước thứ hai chạy phản ứng PCR với hai mồi chuyên biệt TSV885-FP TSV855-RP nhằm chèn trình tự nhận biết hai enzyme BamHI HindIII vào gene VP2 Quy trình tối ưu hoá cách sử dụng enzyme Pfu polymerase (Fermentas, CA, USA) với 20 chu kỳ cho phản ứng PCR lần nhiệt độ bắt cặp 55 oC 30 chu kỳ cho phản ứng PCR lần Sau tiến hành dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2 (Fermentas, CA, USA) Sáu clone lựa chọn để tách plasmid tiến hành giải trình tự, đánh giá tỉ lệ đột biến phản ứng Assemby PCR Trong thí nghiệm hoạt hoá đĩa ELISA Self-assembly monolayers sử dụng hỗn hợp dung dịch 47% HNO 3/H2SO4 APTES để biến đổi bề mặt polystyren với nhóm chức amin (-NH 2) Kháng thể bắt hoạt hóa nhóm carboxyl (-COO) EDC/NHS trước gắn lên đĩa Kết thu nhận tín hiệu quang học (OD 595 nm) phương pháp hấp phụ kháng thể hóa bề mặt cao phương pháp hấp phụ kháng thể phương pháp vật lý thông thường, lượng kháng thể hấp phụ lên bề mặt cải thiện đáng kể Cũng phương pháp hoạt hoá thu nhận giá trị OD đồng ổn định kiểm tra ELISA với mẫu kháng nguyên GST dạng sigma Hai kỹ thuật cho phép dòng hóa nhanh đoạn gene hiếm, khó phân tách mRNA đồng thời tăng hiệu củaphương pháp ELISA MỤC LỤC ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 2.1 Sơ đồ hoạt hoá bề mặt polystyren Hình 3.1 Cấu trúc vector pJET1.2 (Fermentas, Mỹ) Hình 3.2 Thang DNA 100 bp kb (Fermentas, Mỹ) Thang protein 10-250 kDa Hình 4.1 Kết phản ứng Assembly PCR Hìn 4.2 Kết colony PCR E.coli DH5α pJET1.2-VP2 Hình 4.3 Kết kiểm tra phản ứng cắt hạn chế vector pJET1.2-VP2 BamHI HindIII Hình 4.4 Kết BLAST trình tự NCBI Hình 4.5 Kết phân tích Rare codon công cụ Rare codon tool Hình 4.6 Biểu đồ độ hấp thụ kháng thể lên bề mặt đĩa sau hoạt hoá ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Hình 4.7 Kết gắn kháng thể với enzyme HRP Hình 4.8 Kết kiểm tra hoạt lực kháng thể sau gắn HRP độ pha loãng khác Hình 4.9 Biểu đồ kết ELISA bước sóng 415 nm Hình 4.10 Độ đồng tín hiệu OD 415 nm tiến hành gắn đĩa với kháng thể đa dòng thỏ kháng GST phương pháp khác DANH SÁCH BẢNG Bảng Bảng quy trình xây dựng đường chuẩn protein BSA mg/ml Bảng Bảng so sánh giá trị Query coverage Max identity sáu clone so với trình tự gốc (BLZ02TSV, Accession number: AY826052.1) sử dụng để khuếch đại gene VP2 phản ứng PCA Bảng Tỉ lệ đột biến clone so sánh với trình tự gốc BLZ02TSV ( Accession number: AY826052.1) NCBI ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AUC: The area under the curve CAI: Codon Adaptation Index ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay PCR: Polymerase Chain Reaction PCA: Polymerase Chain Assembly TSV: Taura Syndrome Virus ROC: Receiver operating characteristics SAMs: Self-Assembly Monolayers ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM CHƯƠNG MỞ ĐẦU Đặt vấn đề: Virus gây hội chứng Taura phát vào năm 1992 Ecuador (Jimenez et al.,1992) nhanh chóng truyền sang nước Châu Mỹ, châu Á gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm (Graindorge V.A et al., and Flegel et al.,1999) Virus Taura loại virus Picornavirus, thuộc họ Picornaviridae, có dạng hình cầu 20 mặt, kích thước khoảng 31- 32 nm Hệ thống gen mạch RNA Virus ký sinh tế bào biểu mô biểu mô đuôi Hội chứng Taura thường gặp tôm thẻ chân trắng (L.vannamei , Penaeus vannamei) giai đoạn nuôi từ 14-45 ngày tuổi, cỡ 0,05-7,0 g Bệnh TSV nhiễm tôm thương phẩm, tôm sú (P monodon), tôm he Nhật Bản (P japonicus) số loại tôm khác (Lightner D.V et al., 1996) Từ năm 1999 việc nhập nuôi tôm thẻ chân trắng vô tình đưa virus hội chứng Taura (TSV) vào Việt Nam Bệnh TSV tôm thẻ chân trắng thường khó phát ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM mắt thường đường kính bệnh phẩm nhỏ trôi môi trường nuôi Dịch bệnh TSV nguy hiểm, thời gian ủ bệnh cao, lan truyền nhanh, gây chết từ 50 - 80% tôm nuôi (Niti Chuchird et al., 2005) Bệnh chẩn đoán xét nghiệm lâm sàng, phương pháp mô học thử nghiệm ELISA, kiểm tra RTPCR Đây phương pháp giúp xác định nhanh xác tôm nhiễm bệnh Trong đó, phương pháp ELISA phương pháp có độ nhạy độ tin cậy cao, dễ dàng thực quy mô phòng thí nghiệm vừa nhỏ Thông thường để dòng hoá đoạn gene mục tiêu từ genome virus người ta tiến hành phân lập mRNA mục tiêu từ RNA tổng số virus vùng mô bị bệnh sau thực phản ứng RT-PCR để tổng hợp đoạn cDNA từ mRNA Tuy nhiên việc phân lập mRNA thường khó khăn lượng RNA mục tiêu mô bệnh dễ bị phân hủy Để giải vấn đề trên, sử dụng phương pháp Assembly PCR (PCR ghép) hay gọi PCA (Polymerase Chain Assembly) Phương pháp giúp tổng hợp nhanh đoạn gene VP2 mà không cần tách chiết mRNA Phản ứng PCA trải qua hai bước: bước thực phản ứng PCR ghép nối đoạn oligonucleotide với thông qua đoạn overlap để tổng hợp nên đoạn gene mục tiêu, bước thứ hai khuếch đại đoạn gene mục tiêu cặp mồi chuyên biệt Tuy nhiên phương pháp cho tỉ lệ đột biến cao Để xây dựng quy trình sản xuất kit ELISA, việc nắm vững kỹ thuật sản xuất protein tái tổ hợp kháng thể Kỹ thuật hóa protein phần thiết yếu để hoàn thiện việc gắn kháng nguyên hay kháng thể lên bề mặt đĩa, giúp tăng độ nhạy, độ đặc hiệu test ELISA Vì vậỵ, đề tài thực theo hai hướng Một hướng “ Tổng hợp gene VP2 phương pháp Assembly PCR” nhằm phục vụ cho thí nghiệm dòng hoá sau Hướng thứ hai “ Tăng độ nhạy ổn định phương pháp ELISA Self-assembly monolayer (SAMs)” để cải thiện tín hiệu phương pháp ELISA 1.2 - Mục tiêu đề tài: Tiếp cận hướng nhân dòng assembly PCR ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM - Kiểm tra dột biến phát sinh sử dụng assembly PCR - Tiếp cận hướng hoạt hoá bề mặt đĩa ELISA, tăng cường liên kết kháng thể lên bề mặt đĩa polystyren - Kiểm tra tính ổn định, độ đồng tín hiệu ELISA CHƯƠNG GIỚI THIỆU 2.1 Virus Taura đường gây bệnh: Virus Taura tác nhân gây Hội chứng Taura tôm thẻ chân trắng Phân tử TSV có đường kính 32 nm, hình khối 20 mặt (icosahedron ) (Bonami et al.,1997) Bộ gen TSV bao gồm chuỗi đơn RNA mạch thẳng gồm 10.205 nucleotide không bao gồm đuôi poly-A '3 Nó bao gồm hai khung đọc mở lớn (ORFs): ORF chứa trình tự protein phi cấu trúc helicase, protease RNA polymerase phụ thuộc RNA ORF chứa chuỗi protein cấu trúc TSV, bao gồm ba protein vỏ chuyên biệt VP1, VP2 VP3 (55, 40, 24 kDa) (Mari J et al.,2002) TSV lây nhiễm nhân đôi chủ yếu biểu mô (lớp da) lớp vỏ bên nói chung, ruột trước, đoạn cuối ruột phôi, mang, phần phụ thường mô liên kết, mô tạo máu, quan lymphoid (LO), tuyến râu (Lightner D.V et al., 1996) Các quan ruột (nội bì có nguồn gốc từ gan tụy, ruột manh tràng ruột, biểu mô niêm mạc ruột) trơn, tim, vân, dây thần kinh bụng, ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM nhánh hạch thường dấu hiệu mô học việc nhiễm trùng TSV thường biểu âm tính với TSV ISH (In Situ Hybridization) (Hasson K.W et al., 1999) 2.2 Phương pháp Assembly PCR: Việc tổng hợp gene VP2 virus Taura thực từ phản ứng phiên mã ngược (RT-PCR) RNA genome virus Tuy nhiên, sử dụng phương pháp Assembly PCR để tổng hợp gene VP2 làm kỹ thuật cho việc dòng hóa gene sinh tổng hợp kháng thể Đây phản ứng biến thể chuỗi phản ứng polymerase (PCR) dùng để tổng hợp nhân tạo trình tự gene dài cách thực phản ứng PCR với đoạn oligonucleotide (primers) có đoạn chồng chéo (overlap) với Phương pháp giúp tổng hợp nhanh hiệu đoạn gene VP2 mà không cần tách chiết RNA, đoạn gene mục tiêu lấy từ trình tự công bố NCBI với mã số AY826052.1 Hơn phương pháp giúp tổng hợp đoạn gene mục tiêu theo hướng thuận lợi cho trình tạo dòng biểu Nó cho phép đưa vào gene trình tự nhận biết enzyme cắt hạn chế, tín hiệu điều hòa tối ưu hóa codon sử dụng trình biểu protein mã hóa tế bào chủ khác loài Đoạn gene VP2 mục tiêu tổng hợp dựa trình tự gene VP2 (AY826052.1) tách chiết từ protein vỏ virus BLZ02TSV công bố trang NCBI Dựa trình tự đó, 21 đoạn oligonucleotide, đoạn gồm 60 nucleotide thiết kế để thực phản ứng Assembly PCR Oligo849-1: 5’ GCTAACCCAGTTGAAATTGATAATTTTGATACAACAACCAGTGGAGGACTAATTCCAGGA 3’ Oligo849-2: 5’ TCATCAAGATTGTGGAACCTTCACTGTTTGTAACGCTACCTCCTGGAATTAGTCCTCCAC 3’ Oligo849-3: 5' AGGTTCCACAATCTTGATGAATGATATCCCAATCACTAATCAGAATGTAGTGCTGTCTAA 3' Oligo849-4: 5' AGCTTGGTCCTGGACTTCAAACAGGTTATCTGTTACATTCTTAGACAGCACTACATTCTG 3' Oligo849-5: 5' TTGAAGTCCAGGACCAAGCTCTCATTGAATCTCTCTCTCGCGACGTTTTACTTCATAACG 3' Oligo849-6: 5' ATAGTTGTGCCAATTTCATCATCACTAGATGTCCAACTGTCGTTATGAAGTAAAACGTCG 3' Oligo849-7: 5' GATGAAATTGGCACAACTATGACACAGGAACAGCTTGCAACAGAATTCAATCAGCCACAC 3' Oligo849-8: 5' ATTTACGTACAATATCATCGGGTAGGGAAATTTCATATAAGTGTGGCTGATTGAATTCTG 3' Oligo849-9:5' CGATGATATTGTACGTAAATCACTGTTTATGTCTAATAAATTAGCGAATATTGCATATAT 3' ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Oligo849-10:5' CGTGGCTTGTACTCGTACAGTAACCTCGTAATCACATCGCATATATGCAATATTCGCTAA 3' Oligo849-11:5' CTGTACGAGTACAAGCCACGCCCTTTTTACAAGGAGCATTGTGGCTGTGGAATAAGATGA 3' Oligo849-12:5' TCTGTAAGAGTGCGTCGAATAATTGATGTCTGCTTAGCATTCATCTTATTCCACAGCCAC 3' Oligo849-13:5' ATTCGACGCACTCTTACAGAACACCTACGCTCTATTACATCATTTCCTGGCATTGAGATG 3' Oligo849-14:5' GAATCGAAAGAGTAATAGCTCGAGCTTCAGACTGCAAGTTCATCTCAATGCCAGGAAATG 3' Oligo849-15:5' AGCTATTACTCTTTCGATTCCTTATACTAGTGAGTTTCAGGTTTTTAACCCCAGAAATGT 3' Oligo849-16:5' TTGACTCAAAACGGAAAGCCGAATAGAATTTAGGTTATTCACATTTCTGGGGTTAAAAAC 3' Oligo849-17:5' GGCTTTCCGTTTTGAGTCAATTGCAAGGTCCTGAAGATGTAGAATCCGCATCTTATTCTA 3' Oligo849-18:5' GCATGCCCATATAGCTTGATGTTTTTCAACCTGCCATAAATAGAATAAGATGCGGATTCT 3' Oligo849-19:5' ATCAAGCTATATGGGCATGCCCCATCTGTTACATCTTCTGTATATCCGTCTACTCAGTCC 3' Oligo849-20:5' CAGTTCCCGCATGCACAATGGGATAATCGTCATCATATCCGGACTGAGTAGACGGATATA 3' Oligo849-21:5' CATTGTGCATGCGGGAACTGATGAGGAGTCTTCTAAACAGGGGATTGTC 3' Trong đó, oligo overlap với oligo 2, oligo overlap với oligo 3,…, oligo 20 overlap với oligo 21 đoạn 20 nucleotide Các oligo trộn lẫn với phản ứng PCR Qua chu trình bắt cặp kéo dài liên tục oligo kéo dài từ đầu 3’ hình thành nên đoạn gene ngắn, sau nhờ đoạn overlap mà chúng nối lại với Quá trình tiếp tục đoạn gene full-length VP2 hình thành Tuy nhiên, phản ứng Assembly PCR tỉ lệ lỗi tương đối lớn: 2-5 lỗi 1000bp (Smith et al.,2003) Lỗi phát sinh hoạt động DNA polymerase trình tổng hợp gene, thứ tự overlap hai đoạn oligonucleotide kề không đoạn oligonucleotide bị tượng hairpin (Marcus Bode et al., 2009) Chính mà phản ứng PCA tạo thành nhiều sản phẩm phụ Để giải vấn đề phản ứng PCA thực qua hai bước Bước thứ chạy PCR với hỗn hợp đoạn oligonucleotide, bước thứ hai dùng cặp mồi chuyên biệt để khuếch đại đoạn gene mục tiêu, mồi xuôi mồi ngược phản ứng PCR thứ hai thiết kế với hai đầu có trình tự nhận biết enzyme cắt hạn chế BamHI HindIII Các đoạn oligonucleotide thiết kế với nhiệt độ bắt cặp từ 52 oC đến 56 oC (Stemmer et al., 1995), tất đoạn oligonucleotide phải tinh sạch, tỉ lệ G + C nên xấp xỉ 50%, sử dụng enzyme Pfu để tổng hợp kéo dài đoạn DNA có độ xác cao ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Hình 4.6 Biểu đồ độ hấp phụ kháng thể lên bề mặt đĩa sau hoạt hoá Mẫu đối chứng (BSA) Kháng thể chưa hoạt hoá nhóm carboxyl Kháng thể hoạt hoá EDC/NHS Giá trị OD 595 nm trung bình đĩa xử lý bề mặt cao đĩa khác 350% Mật độ kháng thể phân bố đồng với phần Fab kháng thể xếp có trật tự định hướng lên bề mặt giếng đĩa Trong đĩa, hấp phụ vật lý trình tự kháng thể đuợc hấp phụ cách ngẫu nhiên, phân bố không đồng khả bám dính tiến hành rữa đĩa Mật độ OD595 nm cho biết hàm lượng kháng thể bám dính đĩa ELISA.Kết cho thấy độ hấp thụ kháng thể hoạt hoá EDC/NHS gắn lên bề mặt polystyren amin hoá cao nhiều so với kháng thể chưa hoạt hoá (OD ≈ 1.3) 4.5 Kết gắn mouse anti-GST monoclonal antibody với enzyme HRP: Kiểm tra kết gắn kháng thể chuột với HRP sau tinh qua cột sắc ký lọc gel điện di SDS-PAGE môi trường khử (có β-mercaptoethanol) không khử (không có β-mercaptoethanol) Kết thu sau: ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Hình 4.7 Kết gắn kháng thể với enzyme HRP M: Thang protein 1: Sản phẩm huyết chuột 2: Mẫu kháng thể liên hợp HRP môi trường không khử 3: Mẫu kháng thể liên hợp HRP môi trường khử 4: HRP dạng tự Khi tiến hành điện di SDS-PAGE môi trường khử có bổ sung βmercaptoethanol giúp bẻ gãy liên kết disulfide chuỗi polypeptide phân tử protein, tháo xoắn cấu trúc bậc ba bậc bốn protein Vì vậy, kháng thể chuột gắn với HRP bị phân tách thành chuỗi nặng chuỗi nhẹ Chuỗi nặng (55 kDa) có gắn với enzyme HRP (40-44 kDa) cho band có kích thước khoảng 95-100 kDa, chuỗi nhẹ cho band có kích thước 25 kDa Còn điện di môi trường không khử, kháng thể chuột liên hợp HRP không bị phân cắt cho band có kích thước khoảng 120-125 kDa Với kết thu trên, gắn thành công enzyme HRP vào kháng thể mouse anti-GST monoclonal antibody 4.6 Kết kiểm tra hoạt lực kháng thể sau gắn với HRP: Thực phản ứng ELISA để kiểm tra hoạt lực kháng thể sau gắn với HRP Kháng thể gắn với HRP pha loãng với nồng độ 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/5000 1/8000 blocking buffer Đo giá trị mật độ quang bước sóng 415 nm ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Chú thích: Giá trị OD không phân tích hồi quy Giá trị OD phân tích hồi quy với độ tin cậy 95% Giá trị OD phân tích hồi quy với độ tin cậy 90% Hình 4.8 Kết kiểm tra hoạt lực kháng thể sau gắn HRP độ pha loãng khác Kết cho thấy kháng thể gắn với HRP có hoạt lực cao pha loãng với nồng độ 1/1000 lần Kết pha loãng nồng độ khác cho tín hiệu OD thấp Vì sử dụng kháng thể liên hợp HRP với độ pha loãng 1/1000 để sử dụng phản ứng ELISA 4.7 Kết sandwhich ELISA: Sau dừng phản ứng ELISA 30 phút, tiến hành đo OD bước sóng 415 nm ta thu kết sau: ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Hình 4.9 Biểu đồ kết ELISA bước sóng 415 nm 1: Mẫu đối chứng (BSA) 2: Kháng thể bắt – GST dạng sigma – kháng thể mouse anti-GST liên hợp HRP 3: Kháng thể bắt + EDC/NHS – GST dạng sigma – kháng thể mouse anti-GST liên hợp HRP 4: Kháng thể bắt - GST dạng omega – kháng thể mouse anti-GST liên hợp HRP 5: Kháng thể bắt + EDC/NHS – GST dạng omega – kháng thể mouse anti-GST liên hợp HRP Tín hiệu OD 415 nm cho thấy lực kháng nguyên kháng thể, nồng độ kháng nguyên kháng thể đĩa phản ứng ELISA Sử dụng BSA (1) GST lớp omega (4) để làm phản ứng ELISA cạnh tranh, kết cho thấy tín hịệu thu nhận đuợc từ đĩa phủ với BSA (đối chứng) thấp Tín hiệu đĩa chứa kháng thể đuợc hấp phụ vật lý cho liên kết với kháng nguyên GST dạng sigma có độ biến thiên cao, không đồng (cột 2) Trong trường hợp đĩa họat hóa bề mặt, tín hiệu thu phân bố đồng nhất, giá trị OD thấp nên việc xác định giá trị ngưỡng OD 415 nm cho kết đáng tin cậy tiến hành kiểm tra lâm sàng Một vài vùng trình tự epitope trình tự GST dạng omega có lực thấp với kháng thể kháng GST dạng sigma (cột 4,5) nên phức hợp kháng thể với GST dạng sigma (cột 2, 3) cho giá trị OD cao phức hợp kháng thể với GST dạng omega (cột 4, 5) Ở đĩa ELISA hấp phụ vật lý, giá trị OD 415 nm thu từ kháng nguyên GST sigma kháng nguyên GST omega biến thiên cao giá trị OD không tăng lực GST omega với kháng thể GST sigma yếu chuẩn hóa rửa PBS-T 0.05% ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm 4.8 Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Kết độ đồng ổn định phương pháp ELISA: Để kiểm tra độ đồng phản ứng ELISA sau gắn kháng thể lên bề mặ đĩa hoạt hóa, thực thí nghiệm nhiều lần điều kiện, sau so sánh giá trị OD 415 nm đĩa với Kết thu sau: Hình 4.10 Độ đồng ổn định tín hiệu OD 415 nm tiến hành gắn đĩa với kháng thể đa dòng thỏ kháng GST phương pháp khác Kết cho thấy kháng thể đa dòng hấp thụ phương pháp vật lý (pGST Ab-phys) có độ đồng không cao không ổn định, tín hiệu OD 415 nm hai lần thí nghiệm không đồng nhất, độ biến thiên cao Tín hiệu OD thu thấp (OD < 0.5) Trong mẫu kháng thể hấp phụ phương pháp hóa bề mặt (pGST AbChe) cho tín hiệu OD 415 nm đồng hai lần thí nghiệm (Col 2,Col 6, Col 8: lặp lại thí nghiệm trên) Phương pháp cho tín hiệu có độ ổn định cao giá trị OD tốt ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM nằm khoảng từ 1.2 – 2.5 Như vậy, phương pháp hoạt hóa bề mặt cải thiện tín hiệu OD độ ổn định đồng phương pháp ELISA ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM CHƯƠNG THẢO LUẬN 5.1 Tổng hợp gene VP2 phương pháp Assembly PCR: Chúng sử dụng phương pháp Assembly PCR để tổng hợp gene VP2 Phương pháp giúp tổng hợp đoạn gene VP2 cách nhanh chóng đơn giản mà không cần phải tách chiết mRNA Sáu clone sau dòng hoá vào vector pJET1.2 đem giải trình tự, so sánh công cụ BLAST NCBI cho kết độ tương đồng 90%, clone số cho kết tốt với giá trị Query coverage 94% Max identity 99% Với kết thu tổng hợp thành công đoạn gene VP2 Tuy nhiên, phương pháp cho nhiều đột biến, tỉ lệ đột biến clone số 1, 2, 3, 4, 5, 1.02%, 2.21%, 4.31%, 0.7 %, 1.4% 0.6% So với kết tỉ lệ đột biến tổng hợp gene PCA McLain (1986 ) 0.32% Wosnick (1987) 0.19% tỉ lệ đột biến mà thu cao Nguyên nhân đột biến bắt cặp không xác đoạn oligonucleotide phản ứng PCR đầu tiên, đoạn oligo overlap với vài trình tự nối với dẫn đến việc tổng hợp đoạn gene mục tiêu không dẫn đến thay đổi trình tự nucleotide số điểm (thêm, thay vài trình tự nucleotide) Nguyên nhân thứ hai kể đến hoạt động enzyme Pfu polymerase Với tỉ lệ lỗi enzyme Pfu polymerase mà nhà sản xuất (Fermentas, USA) đưa 2.6.10 -6 chu kỳ PCR tỉ lệ đột biến tổng hợp đoạn gene giảm cách đáng kể Tuy nhiên, tùy vào điều kiện phản ứng mà tỉ lệ lỗi thay đổi Các lỗi xuất hoạt động enzyme Pfu polymerase thay thế, thêm, xóa nucleotide Chính mà đột biến phản ứng PCA tránh khỏi Các rare codon xuất trình tự nucleotide từ đột biến đoạn gene VP2 ảnh hưởng đến việc biểu protein đoạn gene Kết phân tích ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM công cụ Rare codon tool cho thấy rare codon làm giảm trình biểu protein cần tối ưu hóa 5.2 Phương pháp SAM tăng độ nhạy ổn định phương pháp ELISA: Trong phản ứng ELISA, thông thường kháng thể gắn lên bề mặt đĩa hấp thu vật lý dựa tương tác Van der Wal Bằng phương pháp kháng thể gắn bề mặt đĩa, nhiên tương tác Van der Wal tương tác yếu nên kháng thể bị rửa trôi tiến hành rửa đĩa PBS-T 1% Chính mà lượng kháng thể lại phủ lên bề mặt đĩa ít, kháng thể phân bố không đồng định hướng Điều dẫn đến việc tín hiệu OD thực ELISA thấp không ổn định Hơn trình hấp phụ vật lý cho hiệu không cao làm biến tính kháng thể gắn lên đĩa Bulter cộng (1992) báo cáo 90% kháng thể đa dòng 75% kháng thể đơn dòng bị biến tính hấp phụ phương pháp vật lý Chính mà trình hấp thụ protein lên bề mặt polystyren nghiên cứu cách rộng rãi để khắc phục vấn đề Các đặc điểm bề mặt cơ, điện tích bề mặt đồng hấp phụ chất thay đổi bề mặt yếu tố quan trọng cho hấp thụ protein, đặc biệt ổn định đặc hiệu kháng thể hấp phụ xét nghiệm miễn dịch Nó liên quan đến định hướng tính toàn vẹn cấu trúc kháng thể hấp phụ, liên quan đến hoạt động vị trí liên kết với kháng nguyên Đó yếu tố cần thiết cho xét nghiệm miễn dịch đáng tin cậy Ngoài số lượng kháng thể hấp phụ, định hướng cấu tạo kháng thể hấp phụ quan trọng việc thực khảo nghiệm Sự cố định chất sinh học lên bề mặt polystyren bị chi phối số yếu tố, nhiên trình cố định chất sinh học thực thành công phương pháp khác Trong đó, Self-Assembly Monolayers (SAMs) phương pháp áp dụng phổ biến cách gắn nhóm chức như: – OH, -NH2, -COOH, -SH… lên bề mặt polystyren Isosaki đồng nghiệp (1992) báo cáo việc sử dụng thành công methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymer cho gắn ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM kết protein Chandra đồng nghiệp (2010) thành công hoạt hóa bề mặt polystyren 3- amino propyltriethoxy silane (APTES) Bằng phương pháp SAMs, tiến hành amin hóa bề mặt polystyren đĩa ELISA hỗn hợp 47% HNO3/H2SO4 hoạt hoá nhóm carboxyl kháng thể EDC/NHS Cấu trúc kháng thể gồm hai hai chuỗi nặng (heavy chain) hai chuỗi nhẹ (light chain) liên kết với cầu nối disufit Chuỗi nặng chuỗi polypeptide cấu tạo 446 acid amin với đầu –COOH cuối mạch (chân chữ Y) Bằng cách hoạt hóa nhóm carboxyl kháng thể gắn cách có định hướng bề mặt đĩa ELISA amin hóa Chính mà phần Fab (chứa vị trí liên kết kháng nguyên) kháng thể xếp có trật tự đĩa, giúp cho tăng khả liên kết với kháng nguyên Với nhiệt độ ủ oC kháng thể phân bố cách đồng lên bề mặt đĩa Kết thu cho thấy lượng kháng thể hấp phụ lên bề mặt đĩa phương pháp hóa bề mặt lớn so với hấp phụ phương pháp vật lý độ hấp phụ OD 595 nm ≈ 1.3 Tiếp tục thực phản ứng ELISA để kiểm tra độ nhạy ổn định phương pháp Trước thực ELISA, tiến hành gắn kháng thể chuột kháng GST với enzyme HRP (Horseradish peroxidase) glutaraldehyde để sử dụng làm kháng thể phát Phương pháp giúp giảm chi phí cho quy trình phản ứng ELISA Kết thu cho thấy gắn thành công kháng thể với HRP Kháng thể có hoạt lực tốt pha loãng với nồng độ 1/1000 lần Tuy nhiên kháng thể sau gắn nhóm HRP bị thay đổi cấu trúc nên kiểm tra khả lực với hai mẫu kháng nguyên GST dạng sigma dạng omega Kết phản ứng ELISA với mẫu kháng nguyên GST dạng sigma omega cho thấy phức hợp GST dạng sigma-Antibody dạng sigma cho tín hiệu OD 415 nm cao phức hợp GST dạng omega-Antibody dạng sigma Tín hiệu OD đĩa GST dạng omega chứng tỏ kháng thể sau gắn HRP không bị biến đổi mặt cấu trúc Ở đĩa có mẫu kháng nguyên GST dạng omega có vài trình tự eptitope có lực yếu với kháng thể GST nên tín hiệu OD 415 nm yếu so với mẫu kháng nguyên GST dạng sigma ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Kết ELISA cho thấy, đĩa có kháng thể hấp phụ phương pháp hóa bề mặt cho kết ELISA có tín hiệu phân bố đồng nhất, độ biến thiên thấp đĩa mà kháng thể hấp phụ phương pháp vật lý lại cho kết không đồng nhất, có độ biến thiên cao Các phản ứng ELISA lặp lại nhiều lần để đánh giá độ ổn định đồng Kết cho thấy đĩa có kháng thể gắn phương pháp hóa bề mặt cho tín hiệu OD 415 nm ổn định đồng so với phương pháp hấp phụ kháng thể bằng phương pháp vật lý thông thường Các đĩa hấp phụ phương pháp vật lý cho tín hiệu OD thấp độ biến thiên cao Trong đó, đĩa hấp phụ phương pháp hóa học lại cho tín hiệu OD cao (1.2 - 2.5) độ biến thiên thấp Qua tăng độ nhạy phương pháp ELISA Chandra K.D đồng nghiệp (2010) sử dụng phương pháp hoạt hóa bề mặt polystyren APTES cho kết độ nhạy phương pháp sandwich ELISA tăng lên cách rõ rệt (39 pg/ml) Như phương pháp SAMs hoạt hóa bề mặt, độ nhạy độ ổn định phương pháp ELISA tăng lên đáng kể sử dụng phương pháp để phục vụ cho kiểm nghiệm lân sàng ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM TÀI LIỆU THAM KHẢO Abraham Ulman, 1996, Formation and Structure of Self-Assembled Monolayers, Chem Rev, volume 96, page: 153-1554 Antoinette Jeanson, Jean-Michel Cloes, Mireille Bouchet and Bernard Rentier, 1988, Comparison of conjugation procedures for the preparationof monoclonal antibodyenzyme conjugates, Journal of immunological methods, volume 111, page: 261-270 Barry Byrne, Edwina Stack, Niamh Gilmartin and Richard O’Kennedy, 2009, Antibody-Based Sensors: Principles, Problems and Potential for Detection of Pathogens and Associated Toxins, Sensors, page: 4407-4445 Bernard Masereel, Mustapha Dinguizli, Caroline Bouzin, Nicolas Moniotte, Olivier Feron, Bernard Gallez, Thierry Vander Borght, Carine Michiels, Ste´ phane Lucas, 2011, Antibody immobilization on gold nanoparticles coated layer-by-layer with polyelectrolytes, Journal of Nanoparticle Research, volume 13, page: 1573-1580 Chandra Kumar Dixit, Sandeep Kumar Vashist, Feidhlim T O’Neill, Brian O’Reilly, Brian D MacCraith, and Richard O’Kennedy, 2010, Development of a High Sensitivity Rapid Sandwich ELISA Procedure and Its Comparison with the Conventional Approach, Analytical Chemistry, volume 30 Chalermporn Ongvarrasopone, Pippop Saejia, Mayuree Chanasakulniyon, Sakol Panyin, 2011, Inhibition of Taura sydrome virus replication in Litopenaeus vannamei through sliencing the LvRab7 gene using double-stranded RNA, Arch Virol, volume 156, page: 1117-1123 D.V Lightner, 1996, Epizootiology, distribution and the impact on international trade of two penaeid shrimp virus in the Americas, Rev sci tech Off int Epiz, volume 15 (2), page: 579-601 ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Fazal Raheman, K Madhwani and A Mehendale, 1990, Receiver-operating characteristic (R-O-C) analysis of TB-ELISA as a diagnostic test for tuberculosis, Ind J Tub., volume 37, page: 79-83 Fereshteh Shamsipour, Amir Hassan Zarnani, Roya Ghods, Mahmood Chamankhah, Flora Forouzesh, Sedigheh Vafaei, Ali Ahmad Bayat, Mohammad Mehdi Akhondi, Mohammad Ali Oghabian, and Mahmood Jeddi-Tehrani, 2009, Conjugation of Monoclonal Antibodies to Super Paramagnetic Iron Oxide Nanoparticles for Detection of her2/neu Antigen on Breast Cancer Cell Lines, Avicenna J Med Biotech, volume 1, page: 27-31 10 Heidi S Erickson, Bonnie T Poulos, Kathy F J Tang, Deborah Bradley-Dunlop, Donald V Lightner, 2005, Taura syndrome virus from Belize represents a unique variant, Diease of aquatic organisms, volume 64, page: 91-98 11 Jasdeep Kaur &C Raman Suri, 2007, Direct hapten coated ELISA for immunosensing of low molecular weight analytes, Protocol Exchange 12 Janice Cline, Jeffery C Braman and Holly H Hogrefe, 1996, PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases, Nucleic Acids Research, volume 24 13 Jason Sun-hyung Park, 2006, Synthesis and error correction methods in gene farication, Massachusetts Institue of Technoloy 14 James A Hanley, Ph.D.Barbara McNeil, M.D., Ph.D., 1982, The Meaning and Use of the Area under a Receiver Operating Characteristic (ROC) Curvel, Raidiology, volume 143, page: 29-36 15 Jean-Robert Bonami, Kenneth W Hasson, Jocelyne Mari, Bonnie T Poulos and Donald V Lightner, 1997, Taura syndrome of marine penaeid shrimp: characterization of the viral agent, Journal of General Virology, volume 78, page: 313–319 ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM 16 Jocely Mari, Bonnie T.Poulos, Donald V Lightner and Iean-Robert Bonami, 2002, Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similitary with members of the genus Cricket paralysis-like, Journal of General Virology, volume 83, page: 915-926 17 Jocelyne Mari, Jean-Robert Bonami, Donald V Lightner, 1998, Taura syndrome of penaeid shrimp: cloning of viral genome fragments and development of specific gene probes, Diease aquatic organisms, volume 33, page: 11-17 18 John R Crowther, 2001, The ELISA guidebook, Methods in molecular biology, volume 149 19 Julia Lodge, Pete Lund & Steve Minchin, 2007, Gene cloning: Principles and Appicants, School of Biosciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, UK, volume 3, page: 35-45 20 Kanwar Narain, K Rekha Devi & J Mahanta, 2004, Development of enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of human paragonimiasis, Indian J Med Res, volume 121, page: 739-746 21 Marcus Bode, Samuel Khor, Hongye Ye, Mo-Huang Li and Jackie Y Ying, 2009, TmPrime: fast, flexible oligonucleotide design software for gene synthesis, Nucleic Acids Research, volume 37, page: 214-221 22 Mihaela Škulj, Veronika Okršlar, Špela Jalen, Simona Jevševar, Petra Slanc, Borut Štrukelj and Viktor Menart, 2008, Improved determination of plasmid copy number using quantitative real-time PCR for monitoring fermentation processes, Microbial Cell Factories, volume 23 Milan Mrksich and George M Whitesides, 1996, Using self-assembled monolayers to understand the made surfaces with proteins and cells interactions of man- made surfaces with proteins and cells, Annu Rev Biophys Biomol Struct., volume 25, page 55-78 ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM 24 M.J.B Wissink, R Beernink, J.S Pieper, A.A Poot, G.H.M Engbers, T Beugeling, W.G van Aken, J Feijen, 2000, Immobilization of heparin to EDC/NHS-crosslinked collagen Characterization and in vitro evaluation, Biomaterial 22, page: 151-163 25 Niti Chuchird and Chalor Limsuwan, 2005, The Viability of Taura Syndrome Virus in Low-salinity Water, Kasetsart J (Nat Sci.) 39, page: 406-410 26 Nirmalya K Chaki, M Aslam, Jadab Sharma And K Vijayamohanan, 2001, Applications of self-assembled monolayers in materials chemistry, Indian Academy of Sciences, volume 133, page: 659-670 27 Refugio Robles-Sikisaka, Kneneth W.Hasson, Denise K.Garcia, Katherine E.Brovont, Karyn D.Cleveland, Kurt R Klimper and Arun K.Dhar, 2002, Genetic variant and immunohistochemical difference among geography isolates of Taura syndrome virus of penaeid shrimp, Journal of General Virology, volume 83, page: 3123-3130 28 Seong Ho Park, MD Jin Mo Goo, MD Chan-Hee Jo, PhD, 2004, Receiver Operating Characteristic (ROC) Curve: Practical Review for Radiologists, Korean J Radiol, volume 5, page: 11-18 29 Soohyun Lee, Seyeon Weon, Sooncheol Lee and Changwon Kang, 2010, Relative codon Adaptation Index, a sensitive Measure of codon Usage Bias, Evolutionary Bioinformatics, volume 6, page: 47-55 30.S.Ray, N.Das and B Bishayi, 2012, Development of a simple method for a New immunoconjougate utilizing Laccase, Research Journal of Immunology 5, page: 1-16 31 Tarlan G Mamedov, Nisha V Padhye, Hendrik Viljoen, Anuradha Subramanian, 2007, Rationalde novogene synthesis by rapid polymerase chain assembly (PCA) and expression of endothelial protein-C and thrombin receptor genes, Journal of Biotechnology, volume 131, page: 379-387 ĐH Công nghiệp TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM 32 Thinnarat Srisuvan, Kathy F.J Tang, Donald V Lightnet, 2005, Experimental infection of Penaeus monodon with Taura syndrome virus (TSV), Diease of aquatic organisms, volume 67, page: 1-8 33 TUC., HUANG H.T., CHUANG S.H., HSU J.P., KUO S.T., LI N.J., HUS T.L., LI M.C & LIN S.Y ,1999, Taura syndrome in Pacific white shrimp Penaeus vannamei cultured in Taiwan, Dis Aquat Org., volume 38, page: 159–161 34 Walter F.M Stöcklein, Manuela Rohde, Gudrun Scharte, Olaf Behrsing, Axel Warsinke, Burkhard Micheel, Frieder W Scheller, 2000, Sensitive detection of triazine and phenylurea pesticides in pure organic solvent by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): stabilities, solubilities and sensitivities, Analytica Chimica Acta, volume 405, page: 255-265 35 Willem P.C Stemmer, Andreas Crameri, Kim D.Ha, Thomas M Brennan and Herbert L Heyneker, 1995, Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides, Gene, volume 164, page: 49-53 36 Yuanan Lu, Piera S Sun, 2005, Viral resistance in shrimp that express an antisense Taura syndrome virus coat protein gene, Antiviral Research, volume 67, page: 141-146 ... tổng hợp gene VP2 virus Taura thực từ phản ứng phiên mã ngược (RT-PCR) RNA genome virus Tuy nhiên, sử dụng phương pháp Assembly PCR để tổng hợp gene VP2 làm kỹ thuật cho việc dòng hóa gene sinh... TP.HCM Viện công nghệ sinh học thực phẩm 2.4 Khóa luận tốt nghiệp Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM Phương pháp dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2: Gene VP2 sau khuếch đại phản ứng Assembly PCR... 3.2.2 Phương pháp dòng hoá gene VP2 vào vector pJET1.2 (Fermentas, Mỹ): Sản phẩm PCA lần sau điện di tiến hành tinh gene VP2 từ gel kit MEGAquick spin (Intron, Hàn Quốc), đoạn gene VP2 sau thu nhận