đề cương

Câu 5: So sánh sắc ký lớp mỏng hiệu cao ( HPTLC) với SK lớp mỏng (TLC) SK lỏng hiệu cao ( HPLC) Pha tĩnh Bản chất pha tĩnh Pha động Cách triển khai pha động Hiệu tách Chuẩn bị mẫu phân tích mẫu Giá thành-thời gian phân tích HPTLC Được lưu giữ mỏng Tráng sẵn tối ưu hóa ( bè dày 100µm, cỡ hạt 48µm) Bắt buộc hoạt hóa trước Đa dạng: pha thuận, pha đảo c8, C18 Lỏng Tiêu tốn Khơng cần phải lọc va loại bọt khí Có thể sử dụng chất ăn mòn hấp thụ UV làm pha động Sắc ký khai triển Bão hòa dung mơi bng kín, dung mơi di chuyển lực mao quản Khai triển đẳng dịng, gradient, tự động hóa TLC Được lưu giữ mỏng Tự chuẩn bị tráng sẵn ( bề dày 250µm, cỡ hạt 520µm) Khơng cần hoạt hóa Silicagel, aumiana… Lỏng Tiêu tốn Khơng địi hỏi tiêu chuẩn cao, khơng cần lọc, loại bọt khí HPLC Được nhồi cột kích cỡ tùy loại Cỡ hạt d ≤ 10µm Cần có thời gian ổn định cột Sắc ký khai triển Bão hịa dung mơi bng kín, dung mơi di chuyển lực mao quản Khai triển đẳng dòng, thủ công Sắc ký rửa giải Dung môi di chuyển qua cột nhờ hệ thống bơm Khai triển đẳng dòng, gradient tự động hóa theo chương trình Cao Khơng bị nhiễm chéo từ kết phân tích trước Chuẩn bị mẫu đơn giản ( 0,1-0,5 µl) Phân tích đòng thời mẫu thử mẫu chuẩn Thấp Rất cao Có thẻ bị ảnh hưởng lần phân tích trước Chuẩn bị mẫu phức tạp ( 20µl) Phân tích riêng rẽ mẫu thử, mẫu chuẩn Chuẩn bị mẫu đơn giản ( 1-5µl) Phân tích địng thời mẫu thử mẫu chuẩn Thấp, u cầu bảo Thấp, khơng cần dưỡng bảo dưỡng Giảm thời gian khai Thời gian khai triển phân tích triển phân tích Đa dạng: pha thuận, pha đảo Lỏng Tiêu tốn nhiều Đòi hỏi tieu chuẩn cao, lọc, loại bọt khí Rất cao, cần bảo dưỡng thường xuyên Thời gian ngắn dài ứng dụng Định tính, định Định tính, bán định lượng, bán định lượng, thử tinh lượng, thử tinh khiết khiết Kết phân tích Phát mắt, Phát mắt detector Độ lặp lại Thu phân đoạn dễ dàng Độ lặp lại tốt Dễ tạo dẫn xuất sau phân tách Định tính, định lượng, thử tinh khiết Detector Cần có phận đặc biệt thu phân đoạn Độ lặp lại tốt khó tạo dẫn xuất sau phân tách CÂU 6: Cấu tạo nguyên lí hoạt động Hệ cung cấp pha động - Là bình thủy tinh màu, trung tính Dung mơi HPLC phải khơng chứa bụi bẩn vật thể lạ, trước sử dụng lọc qua màng lọc - 0,45 0,22 µm đuổi khí hịa tan ( siêu âm, sục khí trơ) Yêu cầu dm pha động: tinh khiết, độ nhơt thấp, trơ hóa học, giá thành rẻ, dễ kiếm, tương thích với detector, phải hịa tan mẫu phân tích Có cách rửa giải + rửa giải đẳng dịng: khơng thay đổi thành phần pha động trình rửa giải + rửa giải gradient: tỉ lệ thành phần pha động thay đổi trình rửa giải • • • Rút ngắn thời gian phân tích Giảm tượng kéo đi, cải thiện hình dạng pic Tăng độ nhạy phân tích - pH pha động: ảnh hưởng đến độ phân tách độ chọn lọc peak, thường sử dụng đệm để điều chỉnh pH pha động Hệ thống bơm - Vận chuyển pha động qua cột với tốc độ xác định - Bơm cần đáp ứng số yêu cầu: + có khả hoạt động áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên + bền với dung môi pha động + khoảng rộng tốc độ dịng lựa chọn dễ thay đổi tốc độ dòng + dễ thay đổi từ việc sử dụng dung môi đến loại dung môi khác + dễ bảo dưỡng sửa chữa Bộ phận tiêm mẫu - Sử dụng vòng tiêm mẫu + hay sử dụng tự động hóa + đưa mẫu phân tích vào cột van bơm với thể tích xác định + van bơm hoạt động áp suất cao + vòng chứa mẫu tích định nên thể tích mẫu đưa vào cột lúc định Hệ thống tiêm mẫu tự động + dễ dàng thay đổi thể tích tiêm + điều khiển phần mềm Cột sắc kí - Làm thép khơng gỉ hay thủy tinh đặc biệt chất dẻo, bề mặt - - nhẵn Chất nhồi cột: silicagen silicagen bao lớp mỏng hữu liên kết với bề - mặt, nhôm oxyd, polymer, nhựa trao đổi ion Bộ phận điều nhiệt Cột bảo vệ ( tiền cột ) cấu tao giống cột SK, bảo vệ cột, làm tăng tuổi thọ - cột Áp suất cột tách: lớn 200 lần áp suất khí quyển, thường sử dụng áp suất cột khoảng 20-100 bar Detector - Yêu cầu - + nhạy + tuyến tính + đáp ứng chọn lọc thông dụng + đáp ứng không bị tác động thay đổi điều kiện + thể tích chết thấp + khơng dễ bị phá hủy + rẻ tiền, đáng tin cậy dễ sử dụng Detector thường sử dụng +detector UV-Vis + huỳnh quang + số khúc xạ + tán xạ ánh sáng bay + điện hóa + khối phổ Bộ phận xử lí ghi tín hiệu: để ghi lại tín hiệu xử lý theo chương trình cài đặt Nguyên lý hoạt động: HPLC kĩ thuật tách chất phân tích di chuyển qua cột chứa hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác liên quan đến hệ số phân bố chúng hai pha tức liên quan đến lực tương đối chất với pha tĩnh pha động Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột điều chỉnh để rửa giải khỏi cột CÂU 7: Các phương pháp định lượng HPLC - - - - Nguyên tắc chung: dựa so sánh chiều cao diện tích pic mẫu thử với hay nhiều mẫu chuẩn  Phương pháp chuẩn ngoại Chuẩn ngoại điểm + chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử tiến hành SK mẫu thử mẫu chuẩn điều kiện Cx = Co Cx = Co Trong : Cx , Cs : nồng độ mẫu thử, chuẩn Sx ( Hx): diện tích ( chiều cao) pic mẫu thử S0 ( Ho): diện tích ( chiều cao) pic mẫu chuẩn Chuẩn ngoại nhiều điểm + Chuẩn bị dãy chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành sắc kí + thiết lập phương trình hồi quy vẽ đường biểu diễn phụ thuộc chiều cao hay diện tích pic theo đồng độ : y = aCx + b + tiến hành sắc kí mẫu thử : dựa vào pt hồi quy suy nồng độ mẫu thử  Phương pháp nội chuẩn Sử dụng kết phân tích khơng lặp lại áp dụng pp ngoại chuẩn Nguyên tắc + thêm chất chuẩn khác với chất cần định lượng vào mẫu chuẩn mẫu thử với lượng + tỷ số diện tích pic chất phân tích chất chuẩn nội thơng số - phân tích dùng để xây dựng đường chuẩn Yêu cầu chất chuẩn nội + chất chuẩn nội phải tách hoàn toàn có thời gian lưu gần với thời gian lưu chất cần phân tích mẫu thử + có cấu trúc hóa học tương tự mẫu thử - + có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử + ko phản ứng với thành phần mẫu thử + phải có độ tinh khiết cao dễ kiếm Xác định yếu tố hiệu chỉnh Fs chuẩn nội chất phân tích Fs = : Cs : nồng độ dung dich chuẩn ngoại Ci: ……………………………………chuẩn nội - - Si: …………………………………….chuẩn nội Sc: …………………………………….chuẩn ngoại Nồng độ Cx mẫu thử Cx =  Phương pháp thêm chuẩn Áp dụng có ảnh hưởng chất phụ Thêm lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử Nồng độ Cx mẫu thử có diện tích pic Sx Thêm ∆ C vào làm tăng ∆ S Cx =  Phương pháp định lượng khơng có chuẩn: chuẩn hóa diện tích pic - ( quy 100% diện tích pic ) Hay áp dụng để xác định độ tinh khiết hoạt chất Yêu cầu: + cấu tử hỗn hợp cần phân tích phải rửa giải, phát tách hoàn toàn + đáp ứng đầu dò cấu tử %X= % X: giá trị % cấu tử X hỗn hợp X, Y, Z Sx, Sy, Sz: diện tích pic cấu tử X, Y, Z CÂU 8: xu hướng phát triển HPLC  Khắc phục giãn pic: • Tạo pha tĩnh nhỏ cột mao quản: bao pha tĩnh măt • sử dụng cột sắc ký đường kính nhỏ làm giảm thể tích hệ thống, giảm thời gian phân tích, tăng độ nhạy • tăng nhiệt độ cột, làm giảm độ nhớt, giảm trình chuyển khối, bao cột mao quản lớp pha tĩnh mỏng • cải tiến công nghệ hạt nhồi: giảm chiều cao đĩa lý thuyết cụ thể, phát triển: -  Sắc kí lỏng siêu hiệu cao ( UHPLC) Vẫn HPLC cải tiến để nâng cao hiệu tách: tăng độ phân - giải, giảm thời gian SK, tăng độ nhạy cách giảm kích thước hạt Giảm phân tán hệ thống SK, tiết kiệm mẫu, giảm thời gian - phân tách  Sắc kí lỏng siêu hiệu ( UPLC ) Hiệu tách tốt UHPLC Gia tăng tính linh hoạt phù hợp mẫu có đặc tính khác nhau, tăng hiệu kinh tế lâu dài CÂU 9: Ứng dụng HPLC phân tích dược phẩm (8)  Giai đoạn phát minh thuốc - Trong giai đoạn có từ hàng trăm đến hàng ngàn hợp chất tạo - cần phải lọc thông lượng cao (HTS) LC-MS trở thành công cụ linh hoạt cho HTS trình phát triển thuốc, đặc biệt hỗ trợ tổng hợp hữu thử - nghiệm sinh học Vai trò hỗ trợ tổng hợp hữu HPLC bao gồm xác nhận tổng hợp - hợp chất mục tiêu, xác định độ tinh khiết tinh chế chúng HPLC hỗ trợ cho phân tích sinh học bao gồm định lượng chất phân tích mục tiêu sinh học nhằm hỗ trợ tối ưu hóa hướng đến nghiên cứu tiền lâm sàng ( hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ ) Các mẫu chất - lỏng sinh lý huyết tương, huyết thanh, dịch chiết xuất mơ nước tiểu Q trình làm mẫu ngày đơn giản, tự động, thời gian phân tích - rút ngắn Ngày thường sử dụng HPLC – MS/MS UPLC-MS/MS  định tính Xác nhận diện dược chất mẫu nguyên liệu thuốc - thuốc thành phẩm Trong hầu hết trường hợp, việc định tính tiến hành thử - nghiệm độc lập kết chắn, bao gồm tín hiệu thời gian lưu sắc kí đồ HPLC thử nghiệm quang phổ, chẳng hạn quang phổ tử ngoại quang phổ hồng ngoại, thường so sánh với chất chuẩn tham chiếu  Định lượng - Đối với thành phẩm nguyen liệu: đành giá hàm lựng HPLC  Đồng hàm lượng Sử dụng HPLC để đánh giá độ đồng hàm lượng trường hợp không sử dụng pp quang phổ ( vd: chế phẩm có hoạt chất, hoạt chất có hàm lượng nghi nhãn < 2mg % khối - lượng so với toàn viên đảm bảo tính lặp lại thời gian lưu  Detector Có nhóm : detector vạn detector chọn lọc Yêu cầu: + đáp ứng nhanh lặp lại với có mặt chất phân tích + giới hạn phát cao + khoảng tuyến tính rộng + vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng Một số loại detector phổ biến + dẫn nhiệt TCD + ion hóa lửa + nitro phospho NPD + cộng kết điện tử ECD + khối phổ MS Nguyen lý hoạt động: SKK, chất tan di chuyển theo pha động thể khí, dùng để tách chất bền nhiệt Q trình tách dựa vào tính bay chất tan- tức điểm sôi chúng Ái lực chất tan với pha tĩnh phụ thuộc vào áp suất hệ số hoạt độ pha tĩnh lỏng khác nhu => tách thường nhiệt độ trrong lị cột kiểm sốt, khí mang pha động mang theo chất tan di chuyển cột Do chất tan có áp suất khác phân bố pha tĩnh lỏng khác nên di chuyển khác => tách phát detector Các detector chuyển tín hiệu sang tín hiệu điện, tùy vào nồng độ mà pic xuất hiên cao hay thấp CÂU 13: ứng dụng SK khí phân tích dược phẩm  Định tính - So sánh thời gian lưu chất phân tích với chất chuẩn So sánh sắc kí đồ mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn Kết nối GC-IR GC-MS Chỉ số lưu Kovats  Định lượng Pp đương chuẩn Pp thêm chuẩn - Pp chuẩn nội Pp chuẩn hóa diện tích  Phân tích vết sản phẩm phân hủy  Nghiên cứu dược động học  Phân tích dung mơi tồn dư dược phẩm  Theo dõi điều trị  Khảo sát độc chất học  Tách hỗn hợp dễ bay hơi: đồng phân quang học barbiturat  Mỹ phẩm: xác định hợp chất bay mỹ phẩm  Xác định hợp chất tư nhiên chứa mẫu gồm nhiều thành phần tương tự CÂU 14: Khái niệm, đặc tính chất lỏng siêu tới hạn - Khái niệm: chất lỏng siêu tới hạn chất tồn điều kiện nhiệt độ áp suất điểm tới hạn nó, trạng thái đó, vừa lỏng vừa khí, có nghĩa vừa khuếch tán qua chất rắn chất khí, hịa tan vật - liệu chất lỏng Đặc tính: + có khả khuếch tán tốt độ nhớt thấp + tỉ trọng: 0,2-0,5 g/cm3 + hòa tan chất khơng bay hơi: CO2 hịa tan được: Alkan mạch thẳng 5-22, di n-alkylphtalat 4-16 C , hydrocarbon đa vòng thơm ( pyren, biphenyl ) + hệ số khuếch tán cao chất lỏng vài chục lần + nhiệt độ tới hạn chất lỏng dao động 30-200oC, số có nhiệt độ - tới hạn điều kiện vận hành thiết bị sắc ký lỏng CO2 dạng lỏng siêu tới hạn + điểm tới hạn: 304,1 K ( 31oC) ; 7,38 Mpa ( 73,8 bar ) + dung mơi tinh khiết hóa học, khơng phân cực + khơng độc, không cháy + dễ hàng loại khỏi phân đoạn + sản xuất thương mại + coi dung môi “xanh” giảm thiểu sử dụng lượng sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo CÂU 15: Cấu tạo nguyên lí hoạt động hệ thống sắc kí lỏng siêu tới hạn (SFC )  Máy SKLSTH tương tự HPLC ngoại rừ có them phận đo kiểm - - soát áp suất cột  Hệ thống cung cấp pha động Thường sử dụng pha động CO2, thêm khoảng 1% dung môi phân cực ACN, MeOH, Iso propanol để tăng khả hòa tan chất phân cực  Bơm Giữ cho tốc độ dịng ổn định, điều chỉnh dựa áp suất đầu  Bộ phận tiêm mẫu Thiết kế thích hợp cho loại cột + cột nhồi : sử dụng hệ tiêm mẫu hệ thống HPLC + cột mao quản: sử dụng hệ tiêm mẫu có chia dịng khơng chia - dịng ( thể tích tiêm 0,01-0,05 µL)  Cột lò cột Thường sử dụng cột mao quản GC, pha động phải ổn định Sử dụng cột nhồi HPLC phân tích đơn giản  Bộ phận điều chỉnh áp suất Duy trì áp suất mong muốn cột cách chỉnh áp suất, nhờ áp - suất cột khơng đổi có thay đổi tốc độ dòng Giữ pha động trạng thái siêu tới hạn trình phân tách gia - - nhiệt để tránh tắc nghẽn  Detector Việc chọn lựa detector phụ thuộc vào: + thành phần pha động + loại cột + tốc độ dòng - Có khả chịu áp cao SFC Phổ biến dùng detector ion hóa lửa FID Nguyen lý hoạt động: tương tự HPLC ( pha động qua cột áp lực cao làm phân tích chất cột tương tác khác thành phần chất phân tích với hai pha) có sử dụng chất lỏng siêu tới hạn, thay đổi tỉ trọng ( thay đổi áp suất) dẫn tới tăng sức rửa giải, giảm thời gian sắc ký Trong SFC hẹ bơm pha động cần đảm bảo tốc độ dòng, hạn chế tối đa thay đổi áp suất áp dụng chương trình gradient nhiệt đọ Câu 16 Khái niệm điện di mao quản, dòng điện thẩm, yếu tố ảnh hưởng EOF Điện di mao quản (CE – capillary electrophoresis) kỹ thuật tách chất dựa di chuyển khác tiểu phân (mang điện tích) cột mao quản ảnh hưởng điện trường tạo điện áp cao (15 – 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản Dòng điện thẩm Sự chuyển động khối dung dịch tác dụng lực điện trường gọi dòng điện thẩm (electroosmotic flow - EOF) Nguyên nhân gây dòng EOF lớp điện kép phát sinh bề mặt mao quản dung dịch điện giải Các yếu tố ảnh hưởng EOF - Thế áp vào hai đầu mao quản Tăng áp vào hau đầu mao quản lam tăng cường độ điện trường, làm tăng vận tốc di chuyển cation => tăng dòng EOF - pH dung dịch điện di pH tăng: Làm tăng phân ly H+ thành mao quản, làm tăng điện tích âm lớp silicagel, làm tăng lớp điện tích kép Chính tăng lớp điện kép làm tăng EOF, chất bị rửa giải nhanh chưa kịp tách pH thấp: thành mao quản mang điện tích âm hấp thụ cation nhờ lực tĩnh điện, gây khó khan cho protein base - Nồng độ chất dung dịch Nồng độ lớn làm tăng lực ion => giảm EOF ngược lại - Nhiệt độ điện di Nhiêt độ tăng làm giảm độ nhớt dung dịch điện di, làm tăng tốc độ di chuyển ion => tăng EOF ngược lại Câu 17 Trình bày điện di mao quản vùng, ứng dụng Khái niệm: Điện di mao quản vùng điện di dung dịch tự hay điện di mao quản dòng tự Đặc điểm: Trong điện di mao quản vùng, trình tách kiểm soát khác linh độ tương đối thành phần mẫu thử dung dịch thử Chúng tối ưu hóa cách kiểm sốt thành phần đệm, pH lực ion Thứ tự rửa giải : cation, phân tử trung hòa, anion Có thể thay đổi điều kiên CZE cho mục địch khác: đua chất hoạt động bề mặt cation để dổi chiều EOF ( kết hợp đổi cực điện di se tách anion nhanh hơn), đưa chất chọn lọc chiral cyclodextran để tách hỗn hợp racemic Ứng dụng: nhiều lĩnh vực: • Sinh học: phân tách peptid, protein, đặc biệt với glucoprotein • Xác định dược chất chất chuyển hóa chúng ( cefixim, cimetidine, kể nước tiểu) • Phân tích chất nhiễm mơi trường • Phân tích thực phẩm :gluose, fructose,maltose Câu 18: Trình bày sắc ký mixen điện động, ứng dụng Trình bày điện di mao quản gel, ứng dụng a/ Trình bày sắc ký mixen điện động, ứng dụng Sắc ký mixen điện động, gọi sắc ký điện động mixen (micellar electrokinetic chromatography - MEKC): Trong sắc ký mixen điện động, chất hoạt động bề mặt thêm vào dung dịch đệm làm việc nồng độ lớn nồng độ mixen tới hạn Các chất phân tích phân bố pha tĩnh giả mixen tạo thành Thay đổi pH nồng độ dung dịch điện di; thay đổi chất vật lý mixen, thay đổi nhiêt độ điện di ảnh hưởng tới phân bố dung dịch pha tĩnh giả Ứng dụng: • Kỹ thuật thường ứng dụng để tách chất trung tính ion, có đặc tính sơ nước thân thân nước acid amin, nucleotid, vitamin, hydrocacbon thơm • Với chế phẩm dược có thê dung MEKC để xác định hoạt chất loại viên, thuốc tiêm (β- lactam, sulfonamic, taxol…) • Phân tích thực phẩm: chất bảo quản, đường hóa học, chất chống oxh b/ Trình bày điện di mao quản gel, ứng dụng Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE): Điện di mao quản gel, tương tự lọc gel, sử dụng mao quản chứa gel để tách phân tử, dựa sở khác tương đối khối lượng phân tử hay kích thước phân tử Các gel có ưu điểm khử tượng đối lưu,làm giảm dòng EOF đồng thời làm giảm cách đáng kể hấp phụ protein thành phía mao quản, làm giảm đáng kể hiệu ứng bất đối pic Ứng dụng: • Kỹ thuật thường dùng chủ yếu để tách protein, đặc biết proein có phân tử lượng lớn, peptid oligomer • Tách phân đoan DNA, nucelotid, polymer Câu 19: Trình bày cấu tạo nguyên lý hoạt động máy điện di mao quản Cấu tạo: (vẽ đơn giản, không cần phải đẹp) Nguyên lý hoạt động máy điện di mao quản Điện di mao quản (CE – capillary electrophoresis) kỹ thuật tách chất dung dịch lỏng dựa di chuyển khác phân tử chất (mang điện tích) cột mao quản ảnh hưởng điện trường tạo điện áp cao đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa CE kỹ thuật tách thực mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển tách chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, tốn mẫu hoá chất khác phục vụ cho tách, số đĩa hiệu dụng (N) lớn, tách chất xãy nhanh hiệu cao Nguyên tắc tách: Dựa sở tính chất điện di phần tử chất phân tích mao quản (ɸ: 25 - 100 mm) dung dịch chất điện giải có chất đệm pH thích hợp, tác dụng từ trường điện E định cung cấp nguồn cao chiều (V: 10 - 30kV) đặt vào hai đầu mao quản Dưới tác dụng lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), phân tử chất tan di chuyển với tốc độ khác tách khỏi điện tích, kích thước độ linh động chúng khác Câu 20 Trình bày ứng dụng phương pháp điện di mao quản Phân tích dược phẩm dược liệu Dược phẩm dược liệu đối tượng phân tích phương pháp CE, thường sử dụng phương pháp MECC Ví dụ: β-lactam, Sunfonamides, Taxol (anticancer), Taxol (anticancer), Cimetidine, Salicylic acid Phân tích thực phẩm Phương pháp điện di mao quản nói chung phương pháp điện di mao quản điện động học mixen nói riêng góp phần phân tích nhiều loại tiêu thực phẩm Đó đường glucose, fructose, maltose…, aminoaxit, peptide, chất béo, vitamin, chất phụ gia, chất bảo quản: Dulcin, sorbic acid, benzoic acid…, chất màu thực phẩm: Green S, Briliant blue, Erythrosine B, Sunset yellow, Tatrazine…, chất chống oxi hóa: PG, TBHQ, BHA, BHT chất độc vi lượng vô hữu Nghiên cứu sinh học phân tử Với việc ứng dụng CGE y học lâm sáng, sinh học, tách protein có khối lượng phân tử lớn, phân đoạn DNA, nucleotid, peptide, polymer thực dễ dàng hiệu