Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ THU NGA ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN ISOFLAVONE SYNTHASE (IFS1) PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT26 và ĐT84 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ THU NGA ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN ISOFLAVONE SYNTHASE (IFS1) PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT26 và ĐT84 Chuyên ngành : Di truyền ho ̣c Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c : GS.TS Chu Hoàng Mâ ̣u Thái nguyên, 4- 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Mọi thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm kế t quả luận văn Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 Tác giả luận văn Hà Thu Nga i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS TS Chu Hồng Mậu đã tận tình bảo, hƣớng dẫn suốt thời gian nghiên cứu , thực và hoàn thành bản luận văn tha ̣c sỹ sinh ho ̣c Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bô ̣ môn Di truyề n &Sinh học hiê ̣n đa ̣i, Khoa Sinh ho ̣c , trƣờng Đại học sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thời gian học tập nhƣ thực đề tài luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán Phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tốt để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp bạn bè ln động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn tơi suốt q trình học tập nghiên cứu hồn thiện luận văn Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 Tác giả luận văn Hà Thu Nga ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHƢ̃ NG TƢ̀ VÀ CHƢ̃ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu .2 Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồ n gốc, phân loại học và đặc điểm sinh học đậu tƣơng 1.1.2 Thành phần hóa học hạt đậu tƣơng 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA ISOFLAVONE .11 1.2.1 Cấu trúc thành phần isoflavone 11 1.2.2 Cơ chế hoạt động chƣ́c của isoflavone .13 1.3 CHUYỂN HÓA ISOFLAVONE VÀ GEN MÃ HÓA ISOFLAVONE SYNTHASE 14 1.3.1 Chu triǹ h chuyể n hóa isoflavone hạt đậu tƣơng .14 1.3.2 Con đƣờng sinh tổng hợp isoflavone 15 1.3.3 Isoflavone synthase và gen mã hó a IFS 16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .19 2.1 VẬT LIỆU , HÓA CHẤT, THIẾT BI ̣VÀ ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CƢ́U .19 2.1.1 Vật liệu 19 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Thiết bị 21 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 21 iii 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 21 2.2.1 Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng isoflavone mẫu đậu tƣơng ĐT26, DT90, DT84 21 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số 22 2.2.3 Phƣơng pháp nhân bản đoạn mã hóa gen GmIFS1 23 2.2.4 Tách dòng phân tƣ̉ 25 2.2.5 Phƣơng pháp xác định phân tích trình tự nucleotide gen 28 2.2.6 Phân tić h và xƣ̉ lý dƣ̃ liê ̣u .28 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 HÀM LƢỢNG ISOFLAVONE TRONG HẠT NẢY MẦM CỦA BA GIỐNG ĐẬU TƢƠNGĐT26, ĐT90, ĐT84 .29 3.2 TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦ A GEN GmIFS TƢ̀ mRNA CỦA ĐẬU TƢƠNG 32 3.2.1 Thiết kế cặp mồi PCR và nhân gen GmIFS 32 3.2.2 Tách dòng phân tử đoạn mã hóa gen GmIFS E.coli 34 3.2.3 Trình tự gen GmIFS phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT26 ĐT84 35 3.3 SƢ̣ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TƢ̣ NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN GmIFS1 .42 3.3.1 Sƣ̣ đa da ̣ng về triǹ h tƣ̣ nucleotide của gen GmIFS1 42 3.3.2 Sƣ̣ đa da ̣ng về trình tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmIFS1 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ 47 Kế t luâ ̣n .47 Đề nghi 47 ̣ CÔNG TRÌ NH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 iv DANH MỤC NHƢ̃ NG TƢ̀ VÀ CHƢ̃ VIẾT TẮT cs : cộng bp : base pair (cặp bazơ) kb : kilo base kDa : kilo Dalton DEPC : diethyl pyrocarbonate DNA : deoxyribosenucleic acid dNTP : deoxynucleoside triphosphate cDNA : complementary DNA mRNA : messenger ribonucleic acid IFS : Isflavone synthase PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA : Ribonucleic acid TAE : Tris-acetate-EDTA X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside E coli : Escherichia coli iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .23 Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi PCR sƣ̉ du ̣ng nghiên cƣ́u 23 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 24 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối gen GmIFS1 vào vector pBT 26 Bảng 3.1 Hàm lƣợng daidzein , genistein và isoflavo ne ̣t nảy mầ m ngày tuổi giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT26, ĐT90 ĐT84 .31 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide gen GmIFS1 giƣ̃a các giống đậu tƣơng ĐT26, ĐT84 NM_001249093 39 Bảng 3.3 Các vị trí sai khác trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS1 giƣ̃a ba giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT26, ĐT84, NM_001249093 41 Bảng 3.4 Trình tự gen GmIFS1 giống đậu tƣơng ĐT26, ĐT84 trình tự có mã số Ngân hàng gen quốc tế đƣợc sử dụng phân tích 43 Bảng 3.5 Hê ̣ sớ tƣơng đờ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trình tự nucleotide gen GmIFS1 44 Bảng 3.6 Hê ̣ số tƣơng đồ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trình tự amino acid suy diễn gen GmIFS1 45 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học aglucone 12 Hình 1.2 Cấu trúc hố học ß-glucoside .12 Hình 1.3 Con đƣờng sinh tổ ng hơ ̣p isoflavone (Phản ứng xúc tác enzym IFS màu xanh dƣơng) [14] 16 Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 26 Hình 3.1 Hình ảnh hạt đậu tƣơngnảy mầm ngày tuổi đƣợc sử dụng chiết rút daidzein genistein A ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84 29 Hình 3.2 Sắ c ký đờ phân tić h daidzein , genistein tƣ̀ ̣t nảy mầ m ngày tuổi giống đậu tƣơng A: ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84 .30 Hình 3.3 Biể u đồ so sánh hàm lƣơ ̣ng daidzein và genistein ̣t nảy mầ m giƣ̃a ba giố ng đâ ̣u tƣơngĐT 26, ĐT90, ĐT84 (mg/100 g) Thanh đƣ́ng cột biểu đồ biểu thị sai số chuẩ n ( x S x ) 32 Hình 3.4 Kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân gen GmIFS tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT26 ĐT84 34 Hình 3.5 A: Kết điện di kiểm tra sản phẩm colony -PCR với că ̣p mồ i SoyIFS-NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R từ dòng khuẩn lạc có kiể u hình trắ ng đƣơ ̣c lƣ̣a cho ̣n ngẫu nhiên M: thang DNA kb; giế ng 1, 2: ĐT26; giế ng 3,4: ĐT84 35 Hình 3.6 Trình tự nucleotide gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT26 ĐT84 so với trình tƣ̣ gen IFS1 giống đậu tƣơng mang mã số NM_001249093 Ngân hàng Gen .37 Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT84 từ gen IFS phân lâ ̣p tƣ̀ hai mang mã số NM_001249093 Ngân hàng Gen 40 Hình 3.8 Vị trí gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26 ĐT84 .42 Hình 3.9 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ của mơ ̣t sớ giống đậu tƣơng dƣ̣a trình tự nucleotide của gen GmIFS1 44 Hình 3.10 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ của mơ ̣t sớ giống đậu tƣơng dƣ̣a trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 46 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tƣơng có tên khoa học Glycine max (L.) Merill, thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae) đƣơ ̣c trồ ng phổ biế n ở Viê ̣t Nam và thế giới Sản phẩm từ đâ ̣u tƣơng rấ t đa da ̣ng nhƣ dùng trực tiếp hạt thô chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu tƣơng, nƣớc tƣơng, làm bánh kẹo, sữa đậu tƣơng, okara đáp ứng nhu cầu đạm phần ăn hàng ngày ngƣời nhƣ gia súc [6] Hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng protein cao , từ 20-40%, dễ tan chứa hầu hết loại amino acid cần thiết cho thể ngƣời Cây đâ ̣u tƣơng ngày càng đƣơ ̣c quan tâm nhiề u thành phầ n có chƣ́a dƣơ ̣c chấ t isoflavone Đây là chấ t chố ng oxy hóa ma ̣nh , ngăn chă ̣n các gố c tƣ̣ , hỗ trơ ̣ miễn dich ̣ và giảm nguy mắ c bê ̣nh tim ma ̣ch ở ngƣời [26], [6] Đậu tƣơng không thực phẩm mà đƣợc nghiên cứu dƣới vai trò dƣợc phẩm Theo nghiên cứu cho thấy, hàm lƣợng protein lipid cao đậu tƣơng cịn chứa nhiều khống chất, vitamin đặc biệt hoá chất thảo mộc nhƣ: lecithin, saponin, trypsin inhibitor, lectin, phenolic acid, omega-3 fatty acid,… và isoflavone đƣợc quan tâm nhiều , isoflavone có cấu trúc tƣơng tự nhƣ hormone kích thích tố sinh dục phái nữ (female hormone estrogen) hoạt động giống nhƣ estrogen Isoflavone kiểm sốt q trình tƣơng tác vi sinh vật , điều chỉnh hormone , kích thích tố sản xuấ t estrogen , vâ ̣y có thể cải thiện hội chứng tiền mãn kinh chố ng loañ g xƣơng phụ nữ mãn kinh Isoflavone chất chống oxy hóa mạnh, làm giảm nguy ung thƣ cách ngăn chặn gốc tự , đó genistein chất chống oxy hóa mạnh số isoflavone, daidzein Isoflavone làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch ngƣời cách làm giảm nồng độ LDL -cholesterol huyết Isoflavone còn là chấ t hỗ trợ miễn dịch [25], [31], [33], [39] Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide gen GmIFS1 giƣ̃a các giống đậu tƣơng ĐT26, ĐT84 NM_001249093 STT Vị trí nucleotide NM 001249093 ĐT26 DT84 14 T T A 20 T A T 21 T A T 28 T A A 65 C C G 72 A A C 244 G C C 338 T A T 505 G G C 10 563 C G C 11 580 G C G 12 586 G C C 13 603 C A C 14 785 A A G 15 807 C G C 16 1221 G C C 17 1334 G G C 18 1349 C G C 19 1403 A A T 20 1534 A T A 21 1535 G C G 22 1540 G G C 23 1544 T A A 24 1553 A A T 25 1557 C G C 26 1559 T T A 39 Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT84 t ừ gen IFS mang mã số NM _001249093 Ngân hàng Gen Tuy nhiên giƣ̃a các triǹ h tƣ̣ amino acid của protein suy diễn IFS khác 21 vị trí amino acid (Bảng 3.3) 40 có Bảng 3.3 Các vị trí sai khác trình tự amino acid suy diễn tƣ̀ gen GmIFS1 giƣ̃a ba giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT84, NM_001249093 STT Vị trí amio acid Pr-NM001249093 Pr-ĐT26 Pr-DT84 L L H L Q L 10 F I I 22 P P R 82 V L L 113 L H L 169 A A P 188 S C S 194 E Q E 10 196 E Q Q 11 262 E E G 12 269 S R S 13 407 W C C 14 445 G G A 15 450 P R P 16 468 Q Q L 17 512 R S S 18 514 G G R 19 515 V D D 20 518 K K I 21 520 L L H Đậu tƣơng có 2n = 40, n = 20 họ gen GmIFS đậu tƣơng gồm hai gen GmIFS1 GmIFS2, đó gen GmIFS1 có vị trí LOC 106799383 nhiễm sắ c thể sớ 7, cịn gen GmIFS2 nằ m nhiễm sắ c thể sớ 13 (Hình 3.8A) Hai trình tƣ̣ gen GmIFS1 tƣ̀ mRNA của hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26 ĐT 84 mà 41 phân lâ ̣p đƣơ ̣c thuô ̣c nhiễm sắ c thể sớ 7, có vị trí khoảng từ 37260K đế n 37270K (Hình 3.8B) A B Hình 3.8 Vị trí gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26 ĐT84 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100037450] 3.3 SƢ̣ ĐA DẠNG VỀ TRÌ NH TƢ̣ NUCLEOTI DE VÀ AMINO ACID SUY DIỄN CỦ A GEN GmIFS1 3.3.1 Sƣ̣ đa da ̣ng về trin ̀ h tƣ̣ nucleotide của gen GmIFS1 Trình tự gen GmIFS1 hai giống đậu tƣơngĐT 26 ĐT84 13 trình tự gen IFS của đâ ̣u tƣơngđƣơ ̣c công bố Ngân hàng Gen (Bảng 3.4) đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng phân tić h tiń h đa da ̣ng trin ̀ h tƣ̣ nucleotide và trin ̀ h tƣ̣ amino acid suy diễn của gen IFS ở đâ ̣u tƣơng 42 Bảng 3.4 Trình tự gen GmIFS1 giống đậu tƣơng ĐT 26, ĐT84 trình tự có mã số Ngân hàng gen quốc tế đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng phân tích TT Giớ ng/ Mã sớ GenBank Năm công bố Tác giả IFS -ĐT26 2015 Chu và cs IFS-ĐT84 2015 Chu và cs NM_001249093 2015 Jung và cs KP843618 2015 Tripathi và cs JN133900 2013 Artigot và cs JQ934956 2013 Artigot và cs EU526830 2010 Xia và cs GU062790 2009 Sohn và cs EU391460 2008 Cheng và cs 10 EU391468 2008 Cheng và cs 11 EU391472 2008 Cheng và cs 12 EU391474 2008 Cheng và cs 13 EU391475 2008 Cheng và cs 14 DQ835285 2007 Chung và Nam 15 AF195798 2000 Jung và cs Tiến hành phân tích so sánh trình tự nucleotide và trình tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmIFS1 giống đậu tƣơng để xác định hệ số tƣơng đồng hệ số phân ly (Bảng 3.5), thiết lập sơ đồ hình về mớ i quan ̣ di trù n giƣ̃a các giớ ng đâ ̣u tƣơng (Hình 3.9) Kế t quả phân tić h ̣ số tƣơng đồ ng và ̣ số phân ly dƣ̣a triǹ h tƣ̣ nucleotide của gen GmIFS1 bảng 3.5 cho thấ y ̣ số tƣơng đồ ng dao ̣ng tƣ̀ 98,6% đến 100%, cịn hệ số phân ly từ 0,0% đến 1,4% Mố i quan ̣ di truyề n giƣ̃a các giố ng đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trình tƣ̣ nucleotide gen GmIFS1 đƣơ ̣c thể hiê ̣n ở sơ đồ hin ̀ h3.9 Dƣ̣a trin ̀ h tƣ̣ nucleotide của gen GmIFS1, sơ đồ hiǹ h cho thấy 15 giố ng đâ ̣u tƣơng chia làm hai nhánh chin ́ h, phân bớ nhóm Nhánh I có giống ĐT26, nhánh II gồm giống ĐT84 (nhánh phụ 43 II-1) 13 giố ng còn la ̣i phân bố nhóm nhánh phụ II -2 Khoảng cách di truyề n giƣ̃a giống ĐT84 giống khác 0,7% Bảng 3.5 Hê ̣ số tƣơng đồ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trình tự nucleotide gen GmIFS1 II-2 II II-1 I % Hình 3.9 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ của mô ̣t số giống đậu tƣơng dƣ̣a tr ên trình tự nucleotide của gen GmIFS1 3.3.2 Sƣ̣ đa da ̣ng về trin ̀ h tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmIFS1 Tiế p tu ̣c phân tích tính đa da ̣ng di truyề n dƣ̣a trình tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmIFS1, kế t quả phân tić h ̣ số tƣơng đ ồng hệ số phân ly giống đậu tƣơngdựa trình tự amino acid suy diễn gen thể hiê ̣n ở bảng 3.6 44 GmIFS1 đƣơ ̣c Bảng 3.6 Hê ̣ số tƣơng đồ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 Bảng 3.6 cho thấ y ̣ số tƣơng đồ ng giƣ̃a các giố ng đâ ̣u tƣơng tƣ̀ 97,3% đến 100% hệ số phân ly từ 0% đến 2,9% Mố i quan ̣ di truyề n giƣ̃a các giố ng đâ ̣u tƣơng dƣ̣a triǹ h tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmCHI đƣơ ̣c thể hiê ̣n ở sơ đờ hình 3.10 Trên hiǹ h 3.10, mƣời lăm giố ng đâ ̣u tƣơngphân bớ hai nhánh Nhánh thứ có giống ĐT 84 14 giớ ng còn la ̣i th ̣c nhánh thứ hai với khoảng cách di truyền lại chia làm hai nhánh phụ 1,5% Trong nhánh chính thƣ́ hai (II) (II-1 II -2) nhánh phụ II -1 có giống ĐT 26, nhánh phụ II -2 gồ m 13 giố ng còn la ̣i Nhƣ vâ ̣y sƣ̉ du ̣ng trin ̀ h tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmIFS1 để phân tích mớ i quan ̣ của 15 giố ng đâ ̣u tƣơngcho thấ y giố ng đâ ̣u tƣơngphân bớ ở nhóm, đó nhóm có giống ĐT 26 nhóm có giống ĐT 84 45 II-2 II-1 II I % Hình 3.10 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ của mơ ̣t sớ giống đậu tƣơng dƣ̣a trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 Kế t quả phân tích dƣ̣a trình tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmIFS1 sơ đồ hình 3.10 thấ y giố ng ĐT 26 ĐT 84 phân bố ở hai nhánh khác Điề u có liên quan đến khác biệt về hàm lƣơ ̣ng isoflavone giƣ̃a hai giố ng ĐT 26 ĐT84 vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ Kế t luâ ̣n 1.1 Hàm lƣợng daidzein, genistein ̣t nảy mầ m ngày tuổi ba giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT90 ĐT 84 dao đô ̣ng tƣ̀ 29,43% đến 64,27% Giớ ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26 có hàm lƣợng daidzein , genistein ̣t nảy mầ m ngày tuổi cao nhấ t và thấ p nhấ t ở giố ng ĐT 84 1.2 Gen mã hóa isoflavone synthase đã phân lâ ̣p thành công tƣ̀ mARN của giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT 26 ĐT84 Kích thƣớc gen GmIFS1 1566 nucleotide, mã hóa 521 amino acid Hê ̣ sớ tƣơng đờ ng về trình tƣ̣ nucleotide của gen GmIFS1 hai giống đậu tƣơng ĐT 26, ĐT84 98,7% tƣơng đồng với giống đậu tƣơng mang mã số NM_001249093 GenBank là 99,0% 1.3 Khoảng cách di truyền giống ĐT 26 ĐT 84 so với 13 giố ng đâ ̣u tƣơng có trình tự gen IFS GenBank dƣ̣a trình tƣ̣ nucleotide của GmIFS1 0,6% -0,7% dựa trình tự amino acid suy diễn là 1,35% -1,5% Đề nghi ̣ Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm mối liên quan khác biệt trình tự nucleotide trình tự amino acid với hàm lƣợng daidzein genistein Trình tự gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ giố ng đâ ̣u tƣơ ng ĐT 26 có hàm lƣợng daidzein, genistein cao (64,27 mg/100 g) đề nghị sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector chuyể n gen mu ̣c đić h nâng cao hàm lƣơ ̣ng isoflavone đâ ̣u tƣơng bằ ng kỹ thuâ ̣t chuyể n gen 47 CÔNG TRÌ NH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Hà Thu Nga , Lê Thi ̣Hồ ng Trang , Lê Đình Chắ c , Hoàng Phú Hiệp , Chu Hoàng Mậu (2016) Đặc điểm gen GmIFS phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơngkhác về hàm lƣơ ̣ng isoflavone Kỷ yếu Hội nghị Khoa học toàn quốc nghiên cứu giảng dạy sinh học ở Viê ̣t Nam Đà Nẵng 5-2016: 551 -559 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiế ng Viêṭ Vũ Đình Chính (2010), Cây đậu tương kỹ thuật trồng trọt, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Ý Đức (2000), Dinh dưỡng sức khỏe, Nxb Y học, TP Hồ Chí Minh Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Chu Hoàng Mâ ̣u (2008), Phƣơng pháp phân tích di truyề n hiê ̣n đa ̣i cho ̣n giố ng trồ ng Nxb Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên Phạm Văn Thiều, (2002), Cây đậu tương - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Tiế ng Anh AccorsiNeto A., Haidar M., Simoes R., Simoes M., Soares J., Baracat E (2009), “Effects of isoflavones on the skin of postmenopausal women: a pilot study”, Clinics (Sao Paulo), 64(6), 505-510 Anderson J.W., Johnstone B.M., Cook Newell M.E (1995), “Meta-analysis of effects of soy protein intake on serum lipids in humans”, New England Journal of Medicine, 333, 276-282 Bolanos R., Del Castillo A., Francia J (2010), “Soy isoflavones versus placebo in the treatment of climacteric vasomotor symptoms: systematic review and meta-analysis”, Menopause, 17(3), 660-666 10 Bong G.K., Song Y.K., Hee S.S., Chan L., Hor G.H., Su I.K., Joong H.A (2003), “Cloning and Expression of the Isoflavone Synthase Gene (IFS-Tp) fromTrifoliumpratense”, Mol Cells, 15(3), 301-306 11 Cheng H, Wang J, Chu S, Yan HL, Yu D, 2013 “Diversifying selection on flavanone 3-hydroxylase and isoflavone synthase genes in cultivated soybean and its wild progenitors” PLoS One ;8(1), 154 12 Dixon RA, Ferreira D (2002), “Genistein”, Phytochemistry 60(3):205-11 49 13 Eduardo F., Luis G., Gilda C., Elba L., Rodrigo M.C and Ivan P (2013), “Soybean - Bio-Active Compounds", Agricultural and Biological Sciences, 25(8), 521-545 14 Gutierrez-Gonzalez JJ, Guttikonda SK, Tran LS, Aldrich DL, Zhong R, Yu O, Nguyen HT, Sleper DA (2010), “Differential expression of isoflavone biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant cell physiol, 51(6) 15 Hao Chen, Yuegang Zuo, Yiwei Deng (2001) Separation and determination of flavonoids and other phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 913: 387-395 16 Ho S.C., Chan A.S., Ho Y.P (2007), “Effects of soy isoflavone supplementation on cognitive function in Chinese postmenopausal women: a double-blind, randomized, controlled trial”, Menopause, 14(3), 489-499 17 Jin-Ae Kim, Seung-Beom Hong, Woo-suk Jung, Chang-Yeon Yu, Kyung-Ho Ma, Jae-Goon Gwang, Ill-Min Chung, (2007) “Comparison of isoflavones composition in seed, embryo, cotyledon and seed coat of cooked-with-rice and vegetable soybean (Glycine max (L.)) varieties”, Food Chemistry, Volume 102, Isue 3, 738-744 18 Jung W, Yu O, Lau SM, Odell J, Fader G, McGonigle B, (2000), "Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes", Nature biotechnology, 18(2):208-212 19 Keshun L (2004), Soybeans as Functional Foods and Ingredients, University of Missouri Columbia, Missouri, AOCS Publishing 20 LinlsakovaP., RiecanskyI., Jagla F (2010), “The Physiological Actions of Isoflavone Phytoestrogens”, Physiol Res,59(1), 651-664 21 LIX, Qin JC, Wang QY, Wu X, Lang CY, Pan HY, Gruber MY, Gao MJ(2011), “Metabolic engineering of isoflavonegenistein in Brassica napus with soybean isoflavone synthase”, Plant Cell Rep.2011 Aug;30(8):14351442 50 22 Lyle Ralston,2 Senthil Subramanian, Michiyo Matsuno, Oliver Yu (2005), Partial Reconstruction of Flavonoid and Isoflavonoid Biosynthesis in Yeast Using Soybean Type I and Type II Chalcone Isomerases Plant Physiol 2005 Apr; 137(4): 1375-1388 23 Maria G.Campos, Miguel P.Matos, Maria T.Camara, Margarida M.Cunha; (2007) "The variability of isoflavones in soy seeds and the possibility of obtaining extracts for over the counter tablet preparations that can be standardized" Industrial Crops and Products, 26: 85-92 24 Matsura M., Akio O (2006) β-Glucosidases from Soybeans Hydrolyze Daidzin and Genistin”, Journal of Food Science, 58(1): 144 - 147 25 Messina M.J (2003), “Emerging evidence on the role of soy in reducing prostate cancer risk”, Nutr Rev, 61(4), 117-131 26 Oliver Y., Brian M.G.(2005) Metabolic engineering of isoflavone biosynthesis Advances in Agronomy 86: 147-190 27 Pendleton J M., Tan W.W., Anai S (2008), “Phase II trial of isoflavone in prostate-specific antigen recurrent prostate cancer after previous local therapy”, BMC Cancer, 8(1), 13 28 Redondo - Cuenca M.J.Villanueva - Suarez, M.D.Rodriguez - Sevilla, I.Mateos - Aparicio, (2006) “Chemical composition and dietary fibre of yellow and green commercial soybeans (Glycinemax)”, Food Chemistry 101: 1216-1222 29 Ribeiro M.L.L , J.M.G Mandarino, M.C Carrão-Panizzi, M.C.N de Oliveira, C.B.H Campo, A.L Nepomuceno, E.I Ida (2007), “Isoflavone content and β-glucosidase activity in soybean cultivars of different maturity groups” Journal of Food Composition and Analysis, 20(1): 19-24 30 Rimbach G, Boesch-Saadatmandi C, Frank J, Fuchs D, Wenzel U, Daniel H, Hall WL, Weinberg PD, (2008) “Dietary isoflavones in the prevention of cardiovascular diseasea molecular Apr;46(4):1308-1319 51 perspective”, Food ChemToxicol 31 Sacks F.M., Lichtenstein A., Van H.L., Harris W., Kris E.P., Winston M (2006), “Soy protein, isoflavones, and cardiovascular health: an American Heart Association Science Advisory for professionals from the Nutrition Committee”, American Circulation, 113(7), 1034-1044 32 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (2001), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 33 Setchell K.D., Brown N.M., Lydeking O.E (2002), “The clinical importance of the metabolite equol-a clue to the effectiveness of soy and its isoflavones”, Japanese Nutrition, 132(12), 3577-3584 34 Shuichi K (2006), “Fundamental concepts in the safety assessment of food containing soy isoflavones for the purpose of specified health use”, Food Safety Commission, Novel Foods Expert Committee, Japanese 35 Sohn SI, Kim YH, Kim SL, Lee JY, Oh YJ, Chung JH and Lee KR (2015) Glycine max isoflavone synthase (IFS1), mRNA GenBank, ACCESSION: NM_001249093 36 Sohn SI, Kim YH, Kim SL, LeeJY, Oh Yj, Chung JH, LeeKR (2014), “Genistein production in rice seed via transformation with soybean IFS genes”, Plant Sci 217-218: 27-35 doi: 10.1016/j.plantsci.2013.11.015 37 V S Sreevidya, C Srinivasa Rao, S B Sullia, Jagdish K Ladha and Pallavolu M Reddy, (2006) “Metabolic engineering of rice with soybean isoflavone synthase for promoting nodulation gene expression in rhizobia”, Journal of Experimental Botany, Vol 57, No, 1957-1969 38 Vantyghem S.A., Wilson S.M., Postenka C.O., Al-Katib W., Tuck A.B., Chambers A F (2005), “Dietary genistein reduces metastasis in a postsurgical orthotopic breast cancer model” Cancer Res,65(1), 3396-3403 39 Wang L.Q (2002), “Mammalian phytoestrogens: enterodiol and enterolactone”, J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci, 1(2), 289-309 40 Wei P., Liu M., Chen Y., Chen D.C (2012), “Systematic review of soy isoflavone supplements on osteoporosis in women”, Asian Pac J Trop Med, 5(3), 243-248 52 41 White L.R., Petrovitch H., Ross G.W., et al (2000), “Brain aging and midlife tofu consumption”, J Am Coll Nutr, 19(2), 242-255 42 Wiseman H., Casey K., Clarke B.D., Bowey E (2002), “isoflaoneaglycone and gluconjugate content of high and low soy UK foods used in nutritional studies”, J Agric Food Chem, 50 (1), 1404-1410 43 Woosuk Jung, Oliver Yu, Sze-Mei Cindy Lau, Daniel P O'Keefe, Joan Odell, Gary Fader & Brian McGonigle, “Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes”, Nature Biotechnology 18, 208 - 212 (2000) doi:10.1038/72671 44 Zhao L., Brinton R.D (2007), “WHI and WHIMS follow-up and human studies of soy isoflavones on cognition”, Expert Rev Neurother, 7(11), 15491564 III Trang web 45 http://text.123doc.org/document/23325-xay-dung-quy-trinh-chuyen-gen-gusvao-giong-dau-tuong-dt26-thong-qua-vi-khuan-agrobacterium-tumefaciens-vaquy-trinh-tai-sinh-cay.htm 46 http://www.hoasenlk.com/tin-tuc/dau-tuong-166.html 47 http://www.slideshare.net/TranDangLoc/10-isoflavones-tinh-cht-mm-u-nnhnovasoy 48 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001249093.1 53 ... bày bảng 3 .1 29 , hàm lƣợng daidzein mAU 260nm,4nm (1. 00) /10 .238 /16 93 514 700 600 500 /11 .344/278874 400 300 200 10 0 -10 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10 .0 12 .5 15 .0 17 .5 12 .5 15 .0 17 .5 12 .5 15 .0 17 .5 A mAU... (1. 00) 300 200 10 0 /11 .3 71/ 142634 /10 .264/7748 51 400 0.0 2.5 5.0 7.5 10 .0 B mAU 260nm,4nm (1. 00) 300 200 10 0 /11 .530 /17 1484 /10 .404/808 519 400 0.0 2.5 5.0 7.5 10 .0 C Hình 3.2 Sắ c ký đờ phân. .. E 10 19 6 E Q Q 11 262 E E G 12 269 S R S 13 407 W C C 14 445 G G A 15 450 P R P 16 468 Q Q L 17 512 R S S 18 514 G G R 19 515 V D D 20 518 K K I 21 520 L L H Đậu tƣơng có 2n = 40, n = 20 họ gen