Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa

I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN VNG THANH HNG NGHIấN CU S DNG VI KHUN Geobacillus stearothermophilus PHT HIN NHANH D LNG KHNG SINH TRONG SA LUN VN THC S KHOA HC H Ni - Nm 2017 I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN VNG THANH HNG NGHIấN CU S DNG VI KHUN Geobacillus stearothermophilus PHT HIN NHANH D LNG KHNG SINH TRONG SA Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc Mó s: 60420107 LUN VN THC S KHOA HC NGI HNG DN KHOA HC: TS MAI TH M LINH H Ni - Nm 2017 Lun thc s M U c phỏt hin ln u tiờn vo nm 1928 bi Alexander Flemming, cht khỏng sinh c coi l cụng c hu hiu vic iu tr bnh cho ngi v ng vt Cht khỏng sinh c s dng rng rói ngnh nụng nghip nh chn nuụi, trng trt, nuụi trung thy hi sn, cú tỏc dng rt ln l giỳp cho vt nuụi trng chng li bnh tt Vic s dng cht khỏng sinh chn nuụi ó c chng minh l lm tng kh nng hp thu dinh dng, kh nng thu nhn thc n ca vt nuụi khỏng li cỏc bnh tt Do hiu qu nhanh v mnh, cht khỏng sinh hin c s dng trn lan v ph bin chn nuụi m khụng c kim soỏt iu ny dn n mt thc trng l hin tng tn d cht khỏng sinh vt nuụi gõy nh hng ln n cht lng sn phm Ti Vit Nam, chn nuụi gia sỳc, gia cm hin ngi dõn s dng rt tựy tin cỏc loi thc n cú cha cht tng trng v thuc khỏng sinh nhm ngn nga, tr bnh cho vt nuụi v giỳp vt nuụi mau n chúng ln Hu qu l d lng cht kớch thớch v thuc khỏng sinh thc phm t vt nuụi ny vt ngng cho phộp gp nhiu ln Trong ngnh sn xut sa hin nay, vic s dng thuc khỏng sinh phũng v cha bnh cho bũ (ph bin l bnh viờm vỳ bũ) l nguyờn nhõn gõy s tn d thuc khỏng sinh mụ v sa ca bũ Khỏng sinh tn d sa bũ, dờ, cu gõy c ch vi khun c dựng quỏ trỡnh ch bin sa, c bit l quỏ trỡnh ch bin phomat, sa chua phi dựng vi khun lờn men ng thi s tn d lng khỏng sinh sa gõy nguy him cho tr em v ngi gi, l nhng i tng dựng sa nhiu Cỏc nc Chõu u ó ngng s dng khỏng sinh chn nuụi t nm 2006 M v Thỏi Lan s ngng s dng nm 2017 Quc t ó cú ro cn ca riờng mỡnh núi khụng vi thc phm cha khỏng sinh Vit Nam, kim tra v kim soỏt d lng khỏng sinh sa ang c quan tõm Trc ũi hi ngy cng cao v cht lng v an ton ca cỏc sn phm cú ngun gc t ng Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s vt ca ngi, ngoi vic tng cng qun lý cỏc cụng on sn xut thỡ vic xỏc nh nhanh hm lng khỏng sinh tn d thc phm l iu rt cn thit Cú rt nhiu phng phỏp phỏt hin nhanh d lng khỏng sinh sa nh phng phỏp sc ký, phng phỏp sc ký dch, phng phỏp ELISA, Cỏc phng phỏp ny hu ht cú nhy cao, kt qu khỏ chớnh xỏc Tuy nhiờn quy trỡnh thng phc tp, cn cú trang thit b i kốm v cn k thut viờn chuyờn nghip cao Hn na quỏ trỡnh kim nghim u phi ly mu v thc hin phũng thớ nghim Hin nay, cỏc phng phỏp phõn tớch bng vi sinh vt c s dng ph bin xỏc nh d lng khỏng sinh vỡ tớnh n gin, tin li ca nú Cú nhiu test vi sinh vt ó c nghiờn cu v ng dng xỏc nh khỏng sinh nhiu loi sn phm Geobacillus stearothermophilus l chng vi sinh vt a nhit, rt nhy cm vi khỏng sinh, c s dng ph bin cỏc test ca nc ngoi Tuy nhiờn cỏc test ny cú giỏ thnh rt cao, th tc nhp khu ũi hi thi gian, gõy tr ngi cho vic ỏp dng rng rói Vit Nam ch ng nghiờn cu cng nh ỏp ng nhu cu ca ngi tiờu dựng chỳng tụi tin hnh ti: Nghiờn cu s dng vi khun Geobacillus stearothermophilus phỏt hin nhanh d lng khỏng sinh sa Mc tiờu ca ti Xõy dng c quy trỡnh ch to test th t bo t vi khun Geobacillus stearothermophilus phỏt hin nhanh d lng khỏng sinh sa ti nguyờn liu Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s Chng - TNG QUAN 1.1 Tỡnh hỡnh sn xut sa ti Vit Nam: L quc gia ụng dõn vi mc tng trng dõn s cao, khong 1,2%/nm, Vit Nam c ỏnh giỏ l th trng tim nng cho cỏc hóng sn xut sa Vi t l tng trng GDP 6-8%/nm, thu nhp bỡnh quõn u ngi tng 14,2%/nm cựng vi xu hng ci thin sc khe v tm vúc ca ngi Vit khin nhu cu s dng cỏc loi sa v cỏc sn phm t sa luụn mc cao Theo d bỏo ca Hip hi Sa Vit Nam (VDA), lng sa tiờu th bỡnh quõn u ngi ti Vit Nam vo nm 2010 t 15 lớt/nm v s tng gn gp ụi, lờn mc 28 lớt/nm vo nm 2020 [15] Tng trng doanh thu ngnh sa ch yu l sa bt v sa nc, chim 74% tng giỏ tr th trng Tuy nhiờn, nng lc sn xut sa v cỏc sn phm t sa nc c d bỏo s khụng theo kp nhu cu tiờu th, c bit l lnh vc sn xut sa ti Lng sa ti nguyờn liu nc ch ỏp ng c 30% nhu cu s dng [15] Trong ú, cht lng sa thp, khụng n nh ngun cung cp ch yu t cỏc h chn nuụi nh, nng sut thp Nm bt c tim nng tng trng ca th trng, ngy cng cú nhiu doanh nghip tham gia vao ngnh ch bin sa Vit Nam c bit, a phn cỏc doanh nghip hin ang trung u t phỏt trin vựng nguyờn liu ca riờng mỡnh di nhiu hỡnh thc nhm gii quyt c nhc im ln nht ca ngnh sa Vit Nam l thiu ht nguyờn liu Mt nhng doanh nghip sa thnh cụng nht vi vic to lp vựng nguyờn liu phỏt trin sn phm l Cụng ty C phn sa TH (nhón hiu sa TH true milk) Cỏc doanh nghip khỏc cng khụng ng ngoi cuc ua phỏt trin vựng nguyờn liu nh Cụng ty c phn sa Vit Nam Vinamilk, Cụng ty c phn Thc phm dinh dng NutiFood Vit Nam, Sc hp dn ca th trng sa Vit Nam khụng ch kớch thớch cỏc doanh nghip ni a m rng sn xut m cũn thu hỳt nhiu nh u t nc ngoi b vo ngnh Vớ d, doanh nghip sa Friesland Campina Vit Nam (nhón hiu sa Cụ gỏi H Lan) ang xỳc tin y mnh phỏt trin vựng nguyờn liu ti tnh H Nam theo hỡnh thc hp tỏc Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s vi cỏc h nụng dõn, hỡnh thnh cỏc trang tri chn nuụi bũ sa quy mụ gia ỡnh (50 - 80 bũ sa/tri) khỏc vi mụ hỡnh tri ln 500 - 1000 bũ sa/tri ca cỏc doanh nghip khỏc [15] Cú rt nhiu doanh nghip tham gia vo ngnh ch bin sa h nm bt c tim nng tng trng ca th trng iu ny dn n s cnh tranh gay gt ca cỏc hóng sa vic a s la chn sn phm sa tt nht cho ngi tiờu dựng Vn cht lng v an ton v sinh thc phm ca cỏc sn phm ny c t lờn hng u Mt ang c quan tõm hin l xut hin s tn d ca cht khỏng sinh cỏc sn phm sa Nguyờn nhõn l ngi dõn s dng khỏng sinh ba bói chn nuụi, quy trỡnh s dng khụng c kim soỏt Do ú vic kim soỏt cht lng sa, c bit l d lng khỏng sinh sa ti ngun l ang c quan tõm v y mnh Hỡnh 1.1 Quy trỡnh kim soỏt cht lng sa u vo trc x lý Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s 1.2 Tỡnh hỡnh s dng cht khỏng sinh chn nuụi: 1.2.1 Trờn th gii: Khỏng sinh ó v ang úng vai trũ quan trng chn nuụi v nuụi trng thy sn, khụng ch phũng v tr bnh m cũn c dựng nh mt cht kớch thớch sinh trng liu thp (2,5 - 50 ppm) [8,52] Nhu cu v s dng khỏng sinh chn nuụi ng vt núi chung v nuụi bũ sa núi riờng l rt ln Vic s dng khỏng sinh thc n chn nuụi c ỏnh du bng mt thớ nghim ca Stokstad v Juke nm 1949 [65] cho gia cm n thc n cú b sung Chlortetracycline, nhn thy tc sinh trng v hiu qu s dng thc n ca gia cm tng rừ rt Vỡ th, ngi ta ó a vo thc n ca gia sỳc, gia cm nhiu loi thuc khỏng sinh nh Oxytetracycline, Aureomycine, Penicillin, Streptomycine M l nc u tiờn phỏt hin hiu qu s dng khỏng sinh lm cht kớch thớch sinh trng thc n chn nuụi M hng nm cú khong triu pao (xp x 2730 tn) khỏng sinh c dựng chn nuụi Theo thng kờ, xp x 80% s gia cm, 70% ln, 70% bũ sa v 60% bũ tht c nuụi dng bng thc n cú b sung khỏng sinh c tớnh c mi USD chi phớ cho khỏng sinh dựng thc n, ngi chn nuụi thu c li tc 2-4 USD [33] C quan qun lý Dc phm v Thc phm (FDA) M ó ban hnh cỏc quy nh v vic cho phộp s dng khỏng sinh kớch thớch tng trng t nm 1951 Theo Hi ng nghiờn cu Quc Gia Hoa K (NRC), 1998, M v Canada ó cho phộp s dng 17 loi khỏng sinh vo thc n cho ln, ú cú loi phi ngng s dng trc git m t 570 ngy Liu lng b sung thng rt thp tựy theo loi khỏng sinh, nhng nu s dng Chlotetracycline hay Zinbacitracilin thỡ hm lng ú l 30 n 40 ppm [33] Anh v Phỏp, trung bỡnh mt nm cú khong 75% s ng vt c dựng khỏng sinh iu tr v gn 60% ng vt c dựng khỏng sinh phũng bnh Anh, Tetracycline l nhúm khỏng sinh c s dng nhiu nht b sung vo thc n chn nuụi, chim hn 50% tng s khỏng sinh [52] Theo s liu ca Ghislain Follet, nm 1997 tng lng khỏng sinh dựng dõn y v chn nuụi cỏc nc chõu u l 10500 tn (quy theo mc 100% tinh khit ca cỏc thnh Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s phn hot tớnh), ú 52% s dng dõn y, 33% iu tr thỳ y v 15% nh cht b sung thc n chn nuụi Trong ú, t l cỏc loi khỏng sinh c s dng chn nuụi: Penicillin 9%; Tetracycline 66%; Macrolide 12%; Aminoglycoside 4%; Fluoroquinolone 1%; Trimethomprimsulfamid 2% v cỏc khỏng sinh khỏc 6% [10] Vic b sung khỏng sinh vi liu lng thp c xỏc nhn l ci thin v trng lng vt nuụi, gim lng thc n cho vt nuụi, giỳp vt nuụi chng li bnh tt Tuy nhiờn, vic lm dng, s dng bt hp phỏp hoc s dng sai nguyờn tc thuc thỳ y núi chung v khỏng sinh núi riờng chn nuụi v nuụi trng thy sn ó gõy hin tng khỏng thuc hoc tn d thuc sn phm, nh hng xu n sc khe cng ng, mụi trng cng nh hiu qu iu tr bnh [20,23] Chớnh vỡ vy, tng cng kim soỏt d lng thuc, cỏc nc phỏt trin ó cú nhng qui nh rt cht ch v kim soỏt nghiờm ngt Ngy 22/12/2009 EU ó ban hnh quyt nh s 37/2010 thay cho quyt nh s 2377/90 EC quy nh gii hn tn d thuc thỳ y cho phộp sn phm ng vt [34] Hoa K v Liờn minh Chõu u cho phộp d lng ti a ca khỏng sinh tht v ph tng ng vt l 100 àg/kg, ú, Nht Bn ch cho phộp 20 àg/kg v Hn Quc l 10 àg/kg [17,22,28] Do phỏt hin nhng c tớnh ca Chloramphenicol (CAP) lờn c quan to mỏu (cú th gõy thiu mỏu khụng tỏi to, khụng phc hi suy ty, gõy t vong) nờn t nm 1990 y ban Chõu u ó cm s dng CAP thỳ y [3] 1.2.2 Ti Vit Nam: Vit Nam khỏng sinh c s dng trn lan phũng bnh v tr bnh nờn tỡnh trng tn d khỏng sinh tht v sa l rt ph bin Cú ti 60-70% tng cỏc thuc ang dựng phũng tr bnh cho vt nuụi l thuc húa hc tr liu ú ch yu l thuc khỏng sinh [16] Theo Ló Vn Kớnh v cng s (2007), t l s dng khỏng sinh chn nuụi nc ta l rt cao: 100% cỏc c s chn nuụi cú s dng Oxytetracycline, 67% cỏc c s chn nuụi cú s dng Chloramphenicol Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s (mc dự thuc ny ó b cm khụng c dựng iu tr), 30% cú s dng Olaquindox, 77% cỏc c s chn nuụi cú s dng Dexamethasol [12,13] Cụng b nghiờn cu ca khoa Chn nuụi Thỳ y Trng i hc Nụng Lõm thnh ph H Chớ Minh cú 628 h chn nuụi ln, g cho thy a s ngi chn nuụi s dng khỏng sinh khụng hp lý nh liu cao, s dng liờn tc phũng nga bnh cho gia sỳc cho n no bỏn c Kt qu kho sỏt tỡnh hỡnh s dng khỏng sinh chn nuụi g trờn a bn tnh Bỡnh Dng cho thy cú 26 loi khỏng sinh ó c s dng Trong ú, loi c s dng nhiu nht l Chloramphenicol (chim 15,35%), Tylosin (15%), Colistin (13,24%), Norfloxacin (10%), Gentamycin (8,35%), nhúm Tetracycline (7,95%), Ampicillin (7,24%), cỏc c s s dng khỏng sinh khụng hp lý chim 17,22%, ch yu l sai v liu lng (12,57%) v liu trỡnh iu tr (3,09%) ng thi s c s khụng tuõn th cỏc quy nh v thi gian ngng thuc trc git m chim ti 40,13% [14,18] Kho sỏt tỡnh hỡnh s dng khỏng sinh cỏc h chn nuụi trờn a bn H Ni, kt qu nghiờn cu ca Lờ Th Ngc Dip cho thy khỏng sinh thuc hai nhúm Quinolones v Macrolides c s dng nhiu nht vi t l tng ng l 78,14% v 86,89% Cỏc nhúm khỏng sinh khỏc l Polipeptides (54,92%), Aminoglycosides (50,96%), -lactams (4,58%) v Tetracycline (46,58%) [5] T nm 2003 - 2006, kt qu phõn tớch lng tn d thuc kớch thớch tng trng 150 mu tht v gan ca gia cm, gia sỳc thu thp ti H Ni ca Khoa Thc phm v v sinh an ton thc phm, Vin dinh dng Quc gia cho thy: ó phỏt hin tn d thuc khỏng sinh nhúm Tetracycline 18 mu, chim t l 12% Cú 5,5% s mu 290 mu tht ln trờn th trng H Ni cú tn d khỏng sinh Tetracycline Ti cỏc khu vc chn nuụi nam cng nhn thy cú c s chim 22,2% cỏc mu tht g cú tn d cỏc loi khỏng sinh Tetracycline, Amoxyline, Erofloxacine vi hm lng cao gp t 1,4 30,9 ln so vi ngng cho phộp [14] Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s Cỏc bnh ca bũ thng c iu tr bng khỏng sinh nh bnh nhim khun nng, viờm vỳ, viờm t cung, viờm phi, viờm múng, khp, tiờu chy, Kt qu nghiờn cu ca Sa ỡnh Chin v Cng s [4] cho thy bnh viờm vỳ ang gõy thit hi ỏng k cho ngi chn nuụi T l viờm vỳ lõm sng ca bũ sa mi nhp vo a bn Mai Sn, Sn La l 27,46 %, viờm vỳ phi lõm sng l 48,16 % Cú nhiu nguyờn nhõn dn n phỏt sinh phỏt trin bnh viờm vỳ Khỏng sinh c s dng iu tr bnh viờm vỳ bũ sa l: Amoxilin, Lincomycin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Cefazolin, Neomycin, Tetracyclin, Gentamycin Hỡnh 1.2 Kho sỏt tỡnh hỡnh s dng khỏng sinh chn nuụi trờn a bn tnh Bỡnh Dng [18] 1.3 Tn d cht khỏng sinh thc phm: Theo tiờu chun Vit Nam s 7405:2004 [1] v sa ti nguyờn liu - yờu cu k thut cho phộp gii hn ti a d lng thuc thỳ y nh sau: Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s Nguyn Minh c (2006), Sc ký lng hiu nng cao v mt s ng dng vo nghiờn cu, kim nghim dc phm, dc liu v hp cht t nhiờn, nh xut bn Y hc, Thnh ph H Chớ Minh 10 Phm Khc Hiu (2009), Giỏo trỡnh dc lý hc thỳ y, nh xut bn B giỏo dc Vit Nam 11 Ló Th Huyn v cng s (2015), Bỏo cỏo tng kt ti: Nghiờn cu ch to v s dng b Kit phỏt hin khỏng sinh sa bng k thut nano, Vin Cụng ngh Sinh hc 12 Nguyn Vn Kớnh (2010), Phõn tớch thc trng s dng khỏng sinh v khỏng khỏng sinh Vit Nam, Nhúm nghiờn cu ca GARP-Vit Nam, tr.34 13 Ló Vn Kớnh v cng s (2007), Bỏo cỏo tng kt ti : Nghiờn cu sn xut tht ln an ton cht lng cao, B Nụng nghip v Phỏt trin nụng thụn 14 Dng Vn Nhim (2005), Phõn tớch bc u tn d Tetracycline tht ln trờn th trng H Ni, Lun thc s khoa hc thỳ y, Chieng Mai University Thailand & Freie Universitot Berlin Germany 15 ng Quang (2015), Th trng sa ti Vit Nam: tim nng cũn rng m, Tp Cụng thng, (18), tr.13-15 16 Bựi Th Tho (2003), Bi ging thuc khỏng sinh v nguyờn tc s dng chn nuụi, nh xut bn H Ni 17 Thụng t s 03/2012/TT-BNNPTNT, Danh mc thuc, húa cht, khỏng sinh cm s dng, hn ch s dng, B Nụng nghip v Phỏt trin nụng thụn 18 inh Thin Thut, Nguyn Ngc Tun, Vừ Th Tr An, Lờ Thanh Hin, Vừ Bỏ Lõn, Khng Th Ninh (2003), Bc u kho sỏt tỡnh hỡnh s dng khỏng sinh chn nuụi v d lng khỏng sinh tht v tht thng phm trờn a bn tnh Bỡnh Dng, Tp Khoa hc k thut Thỳ y, 1(1), tr.50-57 19 V Th Trang (2012), Phng phỏp sc ký lng ph (LC-MS/MS) xỏc nh d lng mt s khỏng sinh nhúm Sulfonamides tht gia sỳc gia cm, Lun thc s khoa hc, i hc Quc gia H Ni Hv: Vng Thanh Hng 71 Lp: K23-QH2014 Lun thc s II Ti liu ting Anh: 20 Alali, W Q., Scott, H M., Christian, K L., Fajt, V R., Harvey, R B., Lawhorn, D B (2009), Relationship between level of antibiotic use and resistance among Escherichia coli isolates from integrated multi-site cohorts of humans and swine, Prev Vet Med, 90, pp 160-167 21 Al-Rimawi F and Maher K (2011), Analysis of chloramphenicol and its related Compound 2- Amino-1-(4-nitrophenyl)propane-1,3-diol by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with UVDetection, Chromatography Research International, Vol 2011, Acticle ID 482308 22 Barbara Chiavarino (1998), Determination of sulfonamid antibiotics by gas chromatography coupled with atomic emission detection, Journal of Chromatography B, 706, pp 269-277 23 Bogaard van den A.E., and Stobberingh E.E (2000), Epidemiology of resistance to antibiotics Links between animals and humans, International journal of antimicrobial agents 14, 4(75), pp 327-335 24 Bogaerts, R and Wolf, F (1980), A standardized method for the detection of residues of antibacterial substances in fresh meat A report of the working group of the Scientific Veterinary Commission of the European Communities concerning a proposal for a common microbiological method, the so-called EEC fourplate method, Fleischwirtschaft, 60 pp 667-669 25 Chukwuenweniwe J E., Johnson S and Sunday A A (2003) An alternative colorimetric method for the determination of chloramphenicol, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2(2), pp 215-221 26 Chung HH., Lee JB., Chung YH and Lee KG (2009), Analysis of sulfonamide and quinolone antibiotic residues in Korean milk using microbial assays and high performance liquid chromatography, Analytical Methods, 113 (1), pp 297-301 Hv: Vng Thanh Hng 72 Lp: K23-QH2014 Lun thc s 27 Coorevits, A, Dinsdale, AE, Halket, G, Lebbe, L, De Vos, P, Van Landschoot, A, Logan, NA (2012), "Taxonomic revision of the genus Geobacillus: emendation of Geobacillus, G stearothermophilus, G jurassicus, G toebii, G thermodenitrificans and G thermoglucosidans (nom corrig., formerly 'thermoglucosidasius'); transfer of Bacillus thermantarcticus to the genus as G thermantarcticus comb nov.; proposal of Caldibacillus debilis gen nov., comb nov.; transfer of G tepidamans to Anoxybacillus as A tepidamans comb nov.; and proposal of Anoxybacillus caldiproteolyticus sp nov.", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62, pp 85-1470 28 Dal-Ho Kim, Dai Woon Lee (2003), Comparison of separation conditions and ionization methods for the liquid chromatographymass spectrometric determination of sulfonamid, Journal of Chromatography A, 984, pp 153-158 29 Dang, P K., Degand, G., Caroline, D., Ton, V D., Maghuin-Rosister, G &Scippo, M L (2011), Optimization of a new two-plate screening method for the detection of antibiotic residues in meat, International Journal of Food Science and Technology, 46, Issue 10, pp.20702076 30 Dang Pham Kim, Claude Saegerman, Caroline Douny, Ton Vu Dinh, Bo Ha Xuan, Binh Dang Vu, Ngan Pham Hong, Marie-Louise Scippo (2013), First Survey on the Use of Antibiotics in Pig and Poultry Production in the Red River Delta Region of Vietnam, Food and Public Health, 3(5), pp 247-256 31 De Brabander H.F., Noppe H., Verheyden, K et al (2009), Review Residue analysis: Future trends from a historical perspective, 1216, pp 79647976 32 DONK P.J (1920), A highly resistant thermophilic organism", Journal of Bacteriology , 5, pp 373-374 Hv: Vng Thanh Hng 73 Lp: K23-QH2014 Lun thc s 33 Ensminger M.E., Oldfield J.E., Heinemann W.W (1990), Feeds and Nutrition the Ensminger Publishing Company, USA, pp 593666 34 European Commission (2010), Commission Regulation No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin, Official Journal, 15, pp 1-72 35 Ferrini AM, Mannoni V, Aureli P (2006), Food Addit Contam, 23, pp:1624 36 Furukawaa, S., Watanabea, T., Koyamaa, T., Hirataa, J., Narisawaa, N., Ogiharaa, H., Yamasakib (2003), Inactivation of food poisoning bacteria and Geobacillus stearothermophilus spores by high pressure carbon dioxide treatment, Appl Environ Microbiol, 69(12) pp 7124-7129 37 Galesloot et al (1962), Neth Milk & Dairy J., 16, pp 89-95 38 Gaurav A, Gill JPS, Aulakh RS and Bedi JS (2014), ELISA based monitoring and analysis of tetracycline residues in cattle milk in Punjab, Veterinary World 7(1), pp 26-29 39 George Stubbings, Timothy Bigwood (2009), The development and validation of a multiclass liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC MS/MS) procedure for the determination of veterinary drug residues in animal tissue using a QuEChERS (QUick, Easy, CHeap, Effective, Rugged and Safe) approach, Analytica Chimica Acta, 637 , pp 68-78 40 Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C (2004), Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using 3m particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production working under current good manufacturing practice Journal of Chromatography A, pp 1036 41 Hela W et al (2003), Determination of sulfonamid in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC DAD for detection, Food Chemistry 83, pp 601608 Hv: Vng Thanh Hng 74 Lp: K23-QH2014 Lun thc s 42 Hua-Jin Zenga, RanYangb, BingLiub, Li-FangLeib, Jian-JunLib, Ling-BoQu (2012), Simple and sensitive determination of sparfloxacin in pharmaceuticals and biological samples by immunoassay, Journal of Pharmaceutical Analysis, 2(3), pp.214219 43 Hwang, Andy, Huang, Lihan (2009), Ready-to-Eat Foods: Microbial Concerns and Control Measures, CRC Press, pp 88 44 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2001), Notification that new names and new combinations have appeared in volume 50, part 2, of the IJSEM , 51, 795796 45 Jevinova P, Dudrikova E, Sokol J, Nagy J, Mate D, Pipova M, Cabadaj R (2003), Determination of oxytetracycline residues in milk with the use of HPLC method and two microbial inhibition methods Bull Vet Inst Pulawy ,47, pp.211-216 46 Jiang Jinqing, Zhang Haitang, An Zhixing, Xu Zhiyong, Yang Xuefeng, Huang Huaguo v Wang Ziliang (2012), Development of an Heterologous Immunoassay for Ciprofloxacin Residue in Milk, Physics Procedia, 25, pp.1829 - 1836 47 John G Holt, Noel R Krieg, Peter H.A Sneath, James T Staley, Stanley T Williams (1957), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th Ed, pp 613-693 48 Jones G.M (1999), On-farm tests for drug residues in milk, Virginia Coop erative Extension, pp 404-401 49 Kumar N, Thakur G, Raghu HV, Singh N, Sharma PK, et al (2013), Bacterial Spore Based Biosensor for Detection of Contaminants in Milk, J Food Process Technol, 4(11) 50 Lameris et a1 (1990), Method for determination of the presence of antibiotics, pp 1-7 Hv: Vng Thanh Hng 75 Lp: K23-QH2014 Lun thc s 51 Mariel G Pikkemaat (2009), Microbial screening methods for detection of antibiotic residues in slaughter animals, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 395(4), pp 893-905 52 MCEVOY, J D G (2002), Contamination of animal feedingstuffs as a cause of residues in food: a review of regulatory aspects, incidence and control, Analytica Chimica Acta, 473, pp 3-26 53 McGlinchey TA., Rafter PA., Regan F., McMahon GP (2008), A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matries, J Analytica chemica acta, 624, pp 1-15 54 Messer W, Leslie J, Houghtby G, Peeler J, Barnett J (1982), Bacillus stearothermophilus disc assay for detection of inhibitors in milk, J Assoc Official Anal Chem, 65 (5), pp 1208-1214 55 Mitchell JM, Griffiths MW, McEwen SA, McNab WB, Yee AJ (1998), J Food Prot ,61, pp.742756 56 Mol H et al (1969), Neth Milk & Dairy J., 23, pp 153-162 57 Myers RP (1964), Rev Environ Contam Toxicol, 7, pp 1136 58 Myllyniemi, A.L., Rintala, R., Backman, C., Niemi, A (1999), Microbiological and chemical identification of antimicrobial drugs in kidney and muscle samples of bovine cattle and pigs, Food additives & Contaminants, 16, pp 339-351 59 Nazina, T.N., Tourova, T.P., Poltaraus, A.B., Novikova, E.V., Grigoryan, A.A., Ivanova, A.E., Lysenko, A.M., Petrunyaka, V.V., Osipov, G.A., Belyaev, S.S., Ivanov, M.V (2001), Taxonomic study of aerobic thermophilic bacilli, Int J Syst Evol Microbiol, 51, pp 433-446 60 Nouws, J.F.M., Schothorst, M.v and ziv G (1979), A critical evaluation of several microbial test methods for residues of antimicrobial drugs in ruminants, Arch Lebensm Hyg, 30, pp.4-8 61 Reybroeck W (1995), Evaluation of screening tests for the detection of antimicrobial residues in milk, International Dairy Federation, Hv: Vng Thanh Hng 76 Lp: K23-QH2014 Lun thc s Symposium on residues of antimicrobial drugs and other inhibitors in milk Kiel, Germany, pp 182-186 62 Robert L T and Fischer L.J (1978), High Performance LiquidChromatographic Assay for Chloramphenicol in Biological Fluids, Clinical Chemistry, 24(5), pp 778-781 63 Rossi F., Kylian O., Hasiwa M (2006), Plasma Processes Polym, 3, pp 431 64 Samanidou VF., Tsochatzis ED., and Papadoyannis IN (2006), HPLC determination of cefotaxime and cephalexine residues in milk and cephalexine in veterinary formulation, Microchimica Acta, Vol.160 (4), pp 471-475 65 Stokstad, E.L.R and T.H Jukes (1949), Further observations on the animal protein factor, Proceedings of the Society of Biological and Experimental Medicine, 73, pp 523528 66 Suhren G, Beukers R (1998), Delvotest SP for detection of cloxacillin and sulfamethoxazole in milk: IDF interlaboratory study J Assoc Official Anal Chem, 81, pp.978-990 67 Todar Kenneth (2008), "Surface Structure of Bacillus", Textbook of Bacteriology 68 William A M and Raida HK (1995), Rapid Determination of Tetracycline Antibiotics in Milk and Tissues Using Ion-Pairing High-Performance Liquid Chromatography, 43 (4), pp 931-934 69 Yanbin Lu, Qing Shen, Zhiyuan Dai, Hong Zhanghai, Honghai Wang (2011), Development of an on-line matrix solid-phase dispersion/fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry system for the rapid and simultaneous determination of 13 Sulfonamid in grass carp tissue, Journal of Chromationgraphy A, 1218, pp 929-937 70 Zeigler, Daniel R (2001), "The Genus Geobacillus." , Bacillus Genetic Stock Center, 3, pp 7-11 Hv: Vng Thanh Hng 77 Lp: K23-QH2014 Lun thc s MC LC M U Chng - TNG QUAN 1.1 Tỡnh hỡnh sn xut sa ti Vit Nam: .3 1.2 Tỡnh hỡnh s dng cht khỏng sinh chn nuụi: .5 1.2.1 Trờn th gii: 1.2.2 Ti Vit Nam: 1.3 Tn d cht khỏng sinh thc phm: .8 1.3.1 Nguyờn nhõn: 1.3.2 Tỏc hi: 10 1.3.2.1 Nguy c i vi sc khe cng ng: .10 1.3.2.2 Nguy c i vi mụi trng: 11 1.3.2.3 Nguy c i vi cụng ngh ch bin bo qun thc phm: 11 1.4 Cỏc phng phỏp phỏt hin d lng khỏng sinh sa: 12 1.4.1 Phng phỏp khng nh (lý hoỏ) 12 1.4.1.1 Phng phỏp sc ký lng hiu nng cao (HPLC): 12 1.4.1.2 Phng phỏp sc ký lng ph (LC-MS/MS): 14 1.4.1.3 Phng phỏp sc ký lp mng (TLC) .15 1.4.2 Phng phỏp s dng k thut nano 16 1.4.3 Phng phỏp sng lc (screening method) 17 1.4.3.1 Phng phỏp sc ký dch .17 1.4.3.2 Phng phỏp ELISA: 18 1.4.3.3 Phng phỏp s dng vi sinh vt: 20 1.5 Vi khun Geobacillus stearothermophilus v ng dng vic phỏt hin nhanh d lng khỏng sinh sa: 23 1.5.1 Vi khun Geobacillus stearothermophilus: 23 1.5.1.1 Phõn loi: 23 1.5.1.2 c im ca Geobacillus stearothermophilus: .24 1.5.1.3 S hỡnh thnh bo t vi khun Geobacillus stearothermophilus:26 Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s 1.5.2 ng dng vi khun Geobacillus stearothermophilus vic phỏt hin nhanh d lng mt s khỏng sinh sa: 30 Chng - NGUYấN LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 32 2.1 Nguyờn liu: 32 2.1.1 Chng vi sinh vt: 32 2.1.2 Dng c v húa cht: .32 2.1.3 Thit b nghiờn cu: 32 2.1.4 Cỏc mụi trng nuụi cy: .33 2.1.5 Ni thc hin ti: .34 2.2 Phng phỏp nghiờn cu: 34 2.2.1 Phng phỏp b trớ thớ nghim v c kt qu: .34 2.2.1.1 Phng phỏp b trớ thớ nghim: 34 2.2.1.2 Phng phỏp c kt qu: 35 2.2.2 La chn mụi trng thớch hp cho vi khun sinh trng: 35 2.2.3 Phng phỏp nhum bo t Geobacillus stearothermophilus: .36 2.2.4 La chn mụi trng thớch hp cho quỏ trỡnh hỡnh thnh bo t vi khun Geobacillus stearothermophilus: 37 2.2.5 Phng phỏp thu nhn bo t Geobacillus stearothermophilus: 38 2.2.6 Phng phỏp xỏc nh mt bo t: 38 2.2.7 Quy trỡnh to test th nghim: 39 2.2.8 Nghiờn cu nh hng ca cỏc iu kin n cht lng test th: .40 2.2.8.1 nh hng ca thnh phn mụi trng: 40 2.2.8.2 nh hng ca nng bo t vi khun b sung vo test: 41 2.2.8.3 nh hng ca nhit v thi gian phỏt hin ca test: .41 2.2.9 Th nghim kh nng phỏt hin mt s khỏng sinh ph bin ca test th: 41 2.2.10 ng dng test th phỏt hin cht khỏng sinh tn d trờn cỏc mu sa t nhiờn: .42 Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s Chng - KT QU V THO LUN 43 3.1 La chn mụi trng nuụi cy thớch hp cho s sinh trng ca vi khun Geobacillus stearothermophilus: 43 3.2 Xõy dng quy trỡnh to thnh bo t vi khun: 45 3.2.1 La chn mụi trng thớch hp cho quỏ trỡnh hỡnh thnh bo t vi khun Geobacillus stearothermophilus: 45 3.2.2 Kt qu thu nhn v xỏc nh mt bo t ca vi khun Geobacillus stearothermophilus: 47 3.2.3 Xõy dng quy trỡnh hỡnh thnh bo t vi khun G stearothermophilus: 47 3.3 Nghiờn cu nh hng ca cỏc iu kin n cht lng test th: .48 3.3.1 nh hng ca thnh phn mụi trng: 49 3.3.1.1 Nghiờn cu nh hng ca nng Phytone peptone: 50 3.3.1.2 Nghiờn cu nh hng ca nng Peptone: 51 3.3.1.3 Nghiờn cu nh hng ca nng Glucose: 53 3.3.2 nh hng ca nng bo t vi khun n cht lng test th: 55 3.3.3 nh hng ca nhit v thi gian n cht lng ca test th: .57 3.4 Th nghim kh nng phỏt hin mt s loi khỏng sinh ca test th: 58 3.5 ng dng test th phỏt hin cht khỏng sinh tn d trờn cỏc mu sa t nhiờn: 64 KT LUN V KIN NGH 69 Kt lun: 69 Kin ngh: 69 TI LIU THAM KHO 70 Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s LờI CảM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh, tận tình bảo hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho trình thực luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô Khoa Sinh, Bộ môn Vi sinh vật học tận tình truyền đạt cho kiến thức quý báu trình học tập nghiên cứu thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo Phòng Lãnh đạo Viện H57 - Tổng cục - Bộ Công an tạo điều kiện phần lớn thời gian thực đề tài phòng thí nghiệm Công nghệ Gen Vi sinh trực thuộc Viện Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến đồng nghiệp, bạn bè gia đình ủng hộ, tạo điều kiện giúp dành thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 01 năm 2017 V-ơng Thanh H-ơng Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s BNG Kí HIU CC CH VIT TT ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic CFU/ml S n v khun lc 1ml mu EU European Union (Liờn minh Chõu u) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FDA Food and Drug Administration (Cc qun lý Thc phm v Dc phm Hoa K) GDP Gross Domestic Product (Tng sn phm ni a) IU International Units LOQ Limit of quantitation (Gii hn nh lng) m/z Khi lng/in tớch NRC National Research Council (Hi ng nghiờn cu Quc gia Hoa K) OD Optical Density (Tr s mt quang) ppb Parts per billion (Mt phn t) ppm Parts per million (Mt phn triu) TCVN Tiờu chun Vit Nam USD United States Dollar (ụla M) Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s DANH MC CC HèNH S hỡnh Tờn hỡnh Trang Hỡnh 1.1 Quy trỡnh kim soỏt cht lng sa u vo trc x lý Hỡnh 1.2 04 Kho sỏt tỡnh hỡnh s dng khỏng sinh trờn a bn tnh Bỡnh Dng 08 Hỡnh 1.3 H thng sc ký lng hiu nng cao HPLC 13 Hỡnh 1.4 H thng sc ký lng ph LC-MS/MS 15 Hỡnh 1.5 Mt s loi que th sc ký dch 18 Hỡnh 1.6 H thng phõn tớch ELISA 20 Hỡnh 1.7 Test thn B s dng chng vi khun Bacillus subtilis 21 Hỡnh 1.8 Cõy phỏt sinh da trờn s sp xp gen 16S rRNA 24 Hỡnh 1.9 Vi khun Geobacillus stearothermophilus trờn mụi trng thch 26 Hỡnh 1.10 Bo t vi khun Geobacillus stearothermophilus 26 Hỡnh 1.11 Cu to bo t vi khun 27 Hỡnh 1.12 Quỏ trỡnh hỡnh thnh bo t 28 Hỡnh 1.13 Test th d lng khỏng sinh sa ca hóng Delvotest 30 Hỡnh 2.1 Bng mu c kt qu 35 Hỡnh 2.2 Quy trỡnh nhum bo t theo phng phỏp Schaeffer-Fulton 37 Hỡnh 3.1 Sinh trng ca vi khun G stearothermophilus trờn cỏc mụi trng dinh dng Hỡnh 3.2 44 Kt qu to bo t vi khun Geobacillus stearothermophilus trờn mụi trng M1 46 Hỡnh 3.3 Sinh trng ca bo t thnh khun lc nng 10-6 47 Hỡnh 3.4 Quy trỡnh to thnh bo t vi khun Geobacillus stearothermophilus 48 Hỡnh 3.5 Nguyờn tc ca test cú s dng vi khun G stearothermophilus 49 Hỡnh 3.6 ng test cha mụi trng cn nghiờn cu 49 Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s Hỡnh 3.7 Sinh trng ca vi khun ti cỏc nng Phytone peptone 51 Hỡnh 3.8 Sinh trng ca vi khun ti cỏc nng Peptone 52 Hỡnh 3.9 Sinh trng ca vi khun ti cỏc nng Glucose 54 Hỡnh 3.10 Kt qu th nghim nng bo t trờn mu sa khụng cú khỏng sinh 56 Hỡnh 3.11 Kt qu th nghim nng bo t trờn mu sa cú khỏng sinh 56 Hỡnh 3.12 Kt qu th nghim test cỏc nhit khỏc 3,5 gi 58 Hỡnh 3.13 Kt qu th nghim trờn khỏng sinh Penicillin G 60 Hỡnh 3.14 Kt qu th nghim trờn khỏng sinh Gentamycin 61 Hỡnh 3.15 Kt qu th nghim trờn khỏng sinh Tetracycline 63 Hỡnh 3.16 Kt qu th nghim trờn cỏc mu sa t nhiờn 66 Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 Lun thc s DANH MC CC BNG BIU S bng Tờn bng Trang Bng 1.1 Gii hn ti a d lng khỏng sinh cho phộp sa 09 Bng 2.1 Cỏc loi mụi trng nuụi cy 33 Bng 3.1 Kt qu o OD trờn cỏc mụi trng dinh dng khỏc Bng 3.2 Kt qu to bo t ca vi khun nuụi cy trờn cỏc mụi trng Bng 3.3 53 nh hng ca nng bo t vi khun n cht lng ca test th Bng 3.7 52 nh hng ca nng Glucose n sinh trng ca vi khun test th Bng 3.6 50 nh hng ca nng Peptone n sinh trng ca vi khun test th Bng 3.5 45 nh hng ca nng Phytone peptone n sinh trng ca vi khun test th Bng 3.4 43 55 nh hng ca nhit v thi gian n cht lng ca test th 57 Bng 3.8 Kt qu pha loóng khỏng sinh th nghim 59 Bng 3.9 Th nghim test trờn mu sa cú khỏng sinh nhúm -lactam 59 Bng 3.10 Th nghim test trờn mu sa cú khỏng sinh Gentamycin 61 Bng 3.11 Th nghim test trờn mu sa cú khỏng sinh Tetracycline 62 Bng 3.12 So sỏnh gii hn phỏt hin ca test nghiờn cu vi cỏc test ca nc ngoi 64 Bng 3.13 Kt qu thu mu sa ti cỏc a im H Ni 65 Bng 3.14 Kt qu th nghim trờn cỏc mu sa t nhiờn 65 Hv: Vng Thanh Hng Lp: K23-QH2014 ... cho vi c áp dụng rộng rãi Vi t Nam Để chủ động nghiên cứu đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng tiến hành đề tài: Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để phát nhanh dư lượng kháng. .. dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh: Đề kháng kháng sinh vấn đề toàn cầu vòng 15 - 20 năm trở lại chưa có kháng sinh kiểu phát kháng sinh không bị kháng sử dụng sản phẩm động vật có tồn dư kháng sinh. .. NHIÊN VƢƠNG THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN