Xây dựng hệ thống PCR ứng dụng trong nghiên cứu các cảm biến y sinh micro-nano

Xây dựng hệ thống PCR ứng dụng nghiên cứu cảm biến y sinh micro-nano Đoàn Ngọc Sơn Trường Đại học Công nghệ Luận văn Thạc sĩ ngành: Vật liệu Linh kiện Nano Người hướng dẫn: TS.Nguyễn Thăng Long Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan công nghệ y sinh; hệ thống PCR; hệ thống vi lưu hệ thống vi lưu PCR Nghiên cứu sở lý thuyết: Kỹ thuật PCR; hiệu ứng nhiệt điện; cấu tạo nguyên lý hoạt động Pin Peltier; hình thức truyền nhiệt; phương pháp điều khiển nhiệt độ Đưa thực nghiệm: Thiết kế hệ thống; xây dựng hệ thống; thử nghiệm hệ thống kết Keywords: Linh kiện nano; Công nghệ y sinh; Hệ thống vi lưu; Truyền nhiệt Content Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan công nghệ y sinh Công nghệ Y - Sinh học (Biomedical Technology – Công nghệ y sinh) lĩnh vực đa ngành, kết hợp kiến thức khoa học Kỹ thuật, Sinh học Y học Công nghệ y sinh học lĩnh vực liên ngành, ứng dụng nguyên tắc thiết kế, giải vấn đề kỹ thuật ngành vật lý, toán học, tin học vào y học khoa học sống để giúp cho vấn đề chăm sóc sức khỏe bệnh nhân tốt tăng cường chất lượng sức khỏe người 1.2 Tổng quan hệ thống PCR PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction, dịch vài sách Phản ứng chuỗi trùng hợp có sách gọi "phản ứng khuếch đại gen" PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống E coli hay nấm men PCR sử dụng nghiên cứu sinh học y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, xác định huyết thống 1.3 Tổng quan hệ thống vi lƣu Hệ thống vi lưu lĩnh vực thú vị khoa học kỹ thuật cho phép phân tích kiểm soát quy mô nhỏ thiết bị nhỏ gọn, tiết kiệm chi phí, hiệu mạnh hệ thống thông thường khác Công nghệ vi lưu đòi hỏi kết hợp ngành Kỹ thuật, Vật lý, Hóa học, Công nghệ vi chế tạo Công nghệ sinh học Công nghệ bước trở thành công nghệ mũi nhọn cho phép chế tạo vi hệ thống sử dụng vi thể tích chất lỏng Trong thời kỳ khủng hoảng nhiên liệu giới việc nghiên cứu phát triển ngành công nghệ vi lưu trở nên có ý nghĩa Các hệ thống vi lưu thường có kích thước nhỏ, việc chế tạo chúng sử dụng nhiên liệu hơn, rẻ dễ dàng chế tạo hàng loạt Thêm kênh dẫn thiết bị vi lưu tích vài nanolit, mẫu thử trở nên nhỏ, lượng thuốc thử sử dụng ít, mà việc phân tích kết thí nghiệm trở nên dễ dàng hơn, tiết kiệm nguyên liệu Cũng phải ngạc nhiên tương lai ngành công nghệ vi lưu tạo bước tiến nhảy vọt cho ngành khoa học khác, đặc biệt lĩnh vực y sinh 1.4 Tổng quan hệ thống vi lƣu PCR 1.4.1 Hệ thống vi lƣu PCR Việc thu nhỏ kích thước sinh học hóa học phân tích thiết bị công nghệ vi-điện-cơ-hệ thống (MEMS) đặt ảnh hưởng quan trọng lĩnh vực chẩn đoán y tế, phát vi sinh vật sinh học phân tích khác Trong số nhiều thiết bị thu nhỏ phân tích, chuỗi phản ứng polymerase vi mạch (PCR) / microdevices nghiên cứu rộng rãi, tiến lớn thực khía cạnh vi gia chip (chế tạo, liên kết đóng dấu), lựa chọn vật liệu bề mặt, hóa học bề mặt kiến trúc buồng phản ứng, xử lý mẫu chất lỏng cần thiết, kiểm soát ba thermocycling nhiệt độ hai bước, phát sản phẩm khuếch đại acid nucleic, tích hợp với đơn vị phân tích chức chẳng hạn chuẩn bị mẫu, điện mao dẫn (CE), lai tạo DNA microarray, vv… Mỗi chu kỳ nhiệt độ tăng gấp đôi DNA, 20-35 chu kỳ tạo hàng triệu DNA Tuy nhiên, dụng cụ PCR thông thường, để phân tích PCR hoàn chỉnh cần khoảng 1-2 h Tất loại công nghệ PCR vi lỏng tạo điều kiện khuếch đại DNA với tỷ lệ nhanh nhiều kết tốc độ truyền nhiệt lớn Việc ứng dụng thiết bị thu nhỏ PCR đạt nhiều cải tiến, chủ yếu bao gồm giảm chi phí chế tạo sử dụng; tiết kiệm thời gian khuếch đại DNA; lượng mẫu tiêu thụ ít; giảm việc sinh sản phẩm PCR không đặc hiệu khác; tăng tính di động hội nhập thiết bị PCR Ngoài ra, thực số lượng lớn phân tích khuếch đại song song chip vi lưu PCR 1.4.2 Lab-on-chip chip sinh học Lab-on-chip Đây thuật ngữ nhiều phép phân tích xử lý mẫu DNA, tiến hành song song thực chip Về bản: chip DNA sensor DNA thu nhỏ, phân tích đồng thời nhiều thông số (massive parallel analysis) tức thời song song Chip sinh học Một thiết bị siêu nhỏ, chứa đoạn DNA vật liệu sinh học khác (protein, tế bào) cho phép thực song song hàng chục nghìn phản ứng phân tử miếng vật liệu có diện tích khoảng 1cm Chƣơng CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1 Kỹ thuật PCR Thực nghiệm PCR PCR dùng để khuếch đại đoạn DNA ngắn, xác định phần Đó gen đơn, hay phần gen Trái với sinh vật sống, quy trình PCR copy mảnh DNA ngắn, lên đến 10kb (kb = kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base) DNA sợi đôi, đo với DNA bổ sung … gọi cặp base Một vài phương pháp copy mảnh kích thuớc lên đến 40kb nhiều so với nhiễm sắc thể DNA tế bào eukaryote – ví dụ tế bào người chứa tỉ cặp base Như thực hành nay, PCR cần nhiều thành phần Những thành phần là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu kết thúc vùng cần khuếch đại - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên DNA - Nucleotides (ví dụ dNTP) nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA - Polymerase Phản ứng PCR thực chu kỳ nhiệt Đây máy đun nóng làm nguội ống phản ứng nhiệt độ xác cho phản ứng Tóm tắt quy trình PCR Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm bước: (1) Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA (2) Sau sợi DNA tách ra, nhiệt độ hạ thấp xuống để mồi gắn vào sợi DNA đơn (3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi DNA Thời gian bước phụ thuộc vào DNA-polymerase chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại theo quy tắc 1000bp/ phút 2.2 Hiệu ứng nhiệt điện Hiệu ứng nhiệt điện hiệu ứng chuyển đổi trực tiếp chênh lệch nhiệt độ thành điện áp ngược lại Một thiết bị nhiệt-điện tạo điện áp có chênh lệch nhiệt độ hai mặt thiết bị Ngược lại, điện áp đưa vào hai điện cực thiết bị tạo chênh lệch nhiệt độ hai mặt thiết bị Thuật ngữ "hiệu ứng nhiệt điện" bao gồm ba hiệu ứng riêng biệt là: hiệu ứng Seebeck, hiệu ứng Peltier hiệu ứng Thomson Việc tách biệt hiệu ứng xuất phát từ khám phá độc lập nhà vật lý người Pháp Jean Charles Athanase Peltier nhà vật lý người Đức Thomas Johann Seebeck Hiệu ứng Seebeck Hiệu ứng Seebeck hiệu ứng chuyển đổi chênh lệch nhiệt độ trực tiếp thành điện tên hiệu ứng đặt theo tên nhà vật lý người Đức - Johann Thomas Seebeck Điện áp tạo hiệu ứng vào khoảng vài micro vôn với nhiệt độ chênh lệch độ kenvin Khi kết hợp kim loại Đồng Constantan (Hợp kim Đồng-Niken), Seebeck tạo điện áp 41 micro vôn/kenvin nhiệt độ phòng Hiệu ứng Seebeck sử dụng cặp nhiệt điện sử dụng để đo chênh lệch nhiệt độ, đo nhiệt độ tuyệt đối biết nhiệt độ áp dụng lên cực cặp nhiệt điện Các cặp nhiệt điện ghép nối tiếp để tạo thành pin nhiệt điện để tăng điện áp đầu Cũng tạo máy phát điện nhiệt điện từ việc khai thác hiệu ứng Hiệu ứng Peltier Hiệu ứng Peltier xuất nhiệt độ tiếp điểm hai vật liệu kim loại khác Hiệu ứng phát ta năm 1834 đặt tên theo tên nhà vật lý người Pháp Jean-Charles Peltier Hiệu ứng Thomson Hiệu ứng Thomson dự đoán chứng minh nhà vật lý học Lord Kelvin vào năm 1851 Hiệu ứng giải thích nóng lên lạnh vật dẫn có dòng điện chạy qua với gradient nhiệt độ Bất kỳ vật dẫn có dòng điện chạy qua (bao gồm vật liệu siêu dẫn) áp dụng chênh lệch nhiệt độ hai điểm hấp thụ phát nhiệt tùy thuộc vào vật liệu vật dẫn 2.3 Cấu tạo nguyên lý hoạt động Pin Peltier Hình mô tả hiệu ứng Peltier cấu trúc đơn giản vật liệu bán dẫn phần tử nhỏ (pellet) N P, hai đầu phần tử hàn chất dẫn điện khác loại đồng để nối với nguồn: Một đặc điểm quan trọng nhiệt độ truyền (hay bơm) theo chiều hạt mang điện chạy mạch – hạt chuyển tải nhiệt Ví dụ hình trên, nhiệt truyền theo chiều electron (hạt mang điện bán dẫn loại N) từ lên Ở hình dưới, nhiệt truyền theo chiều lỗ trống (hạt mang điện chủ yếu bán dẫn loại P) từ xuống Như vậy, nhiệt chuyển tải hai loại bán dẫn theo hai chiều ngược Trên thực tế, muốn tăng khả chuyển tải nhiệt ta cần kết hợp nhiều phần tử nhỏ (pellets) theo cách mắc song song nối tiếp Tuy nhiên, dòng qua phần tử tương đối lớn ta đặt điện nhỏ hai đầu Ví dụ, cần nối với 60mV dòng qua hai phần tử thiết bị TE (Thermoelectric - nhiệt điện) lên tới 5A Vì theo cách mắc song song, ta mắc 10 phần tử với 60mV dòng tổng qua thiết bị 50A, 100 phần tử dòng khoảng 500A, điều không Có hai cách khắc phục việc mắc nối tiếp phần tử loại khác loại hình dây: Cách thứ nhất: mắc nối tiếp phần tử loại Cách mặt lý thuyết hoạt động, thực tế yêu cầu mặt làm nóng hay lạnh phía mà cách nối dây phần tử giảm đáng kể hiệu chuyển tải nhiệt thiết bị Vì vậy, người ta dùng cách mắc thứ hai Cách thứ hai: mắc nối tiếp phần tử khác loại Với cách nối khoảng 254 phần tử N-P (hình 11) trên, chịu tải 4-5A với hiệu điện đầu vào từ 12-16V Để giữ phần tử cố định người ta thường gắn phần tử mặt sứ vật liệu cách điện dẫn nhiệt tốt Hình cấu tạo chung thiết bị nhiệt điện Peltier thực tế, bên cạnh người ta thường lắp thêm quạt tản nhiệt, kim loại dẫn nhiệt khác Và sử dụng thiết bị cho mục đích điều khiển nhiệt độ Với cách mắc phần tử P-N trên, thiết bị TE hoạt động không giống với diode Đối với diode, miền phân cực hình thành lớp tiếp giáp PN Khi diode phân cực thuận miền phân cực cho dòng chạy qua hiệu điện lớn ngưỡng (khoảng 0.6-0.7V), diode dẫn điện Khi diode phân cực ngược, miền phân cực không cho dòng chạy qua, diode cách điện Nhưng với tiếp giáp kim loại hai vật liệu bán dẫn PN thiết bị PE, vùng phân cực tạo ra, không phân cực, dòng điện chạy qua thiết bị theo hai chiều thuận nghịch Ưu điểm thiết bị TE: - Có thể điều khiểu nhiệt độ theo hai chiều làm nóng làm lạnh nhờ việc thay đổi chiều dòng điện - Điều chỉnh nhiệt độ dễ dàng cách thay đổi dòng - Tốc độ gia nhiệt nhanh 4-5oC/s lớn - Nhỏ gọn, dễ dàng vận chuyển thay - Độ bền cao, tắt bật nhiều lần tần số cao Thời gian hoạt động ổn định lớn 100.000 - Có tính chất hai chiều tức chuyển lượng điện thành lượng nhiệt theo hiệu ứng Peltier, ngược lại có khả chuyển chênh lệch nhiệt độ thành lượng điện theo hiệu ứng Seebeck 2.4 Các hình thức truyền nhiệt Sự truyền nhiệt diễn hình thức: Dẫn nhiệt, Đối lưu nhiệt Bức xạ nhiệt (Tia hồng ngoại) Trong đó, xạ nhiệt hình thức truyền nhiệt chủ yếu; dẫn nhiệt đối lưu nhiệt đóng vai trò thứ yếu trình truyền nhiệt Hướng truyền nhiệt yếu tố quan trọng cần xem xét Nhiệt lượng xạ truyền dẫn theo hướng, nhiên đối lưu nhiệt chủ yếu từ thấp lên cao Biểu đồ bên cạnh thể hình thức truyền nhiệt nhà dân dụng công nghiệp Trong tất trường hợp, Bức xạ nhiệt hình thức truyền nhiệt định DẪN NHIỆT (CONDUCTION) Là truyền nhiệt bên vật thể thông qua tiếp xúc trực tiếp bề mặt Lượng nhiệt truyền qua hình thức dẫn nhiệt tính toán theo định luật Fourier Nhiệt lượng tỷ lệ thuận với hệ số dẫn nhiệt k tỷ lệ nghịch với độ dày d loại vật liệu Nhìn chung, vật liệu có tỷ trọng cao dẫn nhiệt tốt Chất rắn, thủy tinh nhôm vật liệu dẫn nhiệt tốt ĐỐI LƢU NHIỆT (CONVECTION) Là truyền nhiệt sinh chuyển động chất lỏng chất khí Trong nhà, khí nóng di chuyển lên trên, phần sang bên Quy trình gọi đối lưu tự nhiên BỨC XẠ NHIỆT (RADIATION) Là truyền nhiệt (năng lượng nhiệt) dạng sóng điện từ (tia hồng ngoại - Infrared rays) xuyên qua khoảng không Sóng xạ, giống sóng radio nằm sóng ánh sáng sóng radar (có quang phổ từ 3-15 micron) Vì vậy, nói đến sóng xạ, ta đề cập đến tia hồng ngoại Mọi bề mặt phát xạ, chẳng hạn dàn nóng máy lạnh, bếp, mái sàn, vách vật liệu cách nhiệt thông thường, phát xạ cấp độ khác Nhiệt xạ không nhìn thấy nhiệt độ, thực chất dạng truyền lượng Chỉ tia xạ đập vào bề mặt, lượng xạ sinh nhiệt làm cho bề mặt nóng lên 2.5 Các phƣơng pháp điều khiển nhiệt độ Lý thuyết điều khiển cho ta hai phương pháp điều khiển điều khiển vòng hở điều khiển vòng kín Điều khiển vòng hở dựa mối quan hệ nhiệt độ cần đạt đầu thông số điều khiển lối vào hiệu điện hay dòng điện Tuy nhiên, việc thiết lập biểu thức quan hệ khó không xác có tổn hao nhiệt môi trường xung quanh mà môi trường ta chưa biết trước Vì vậy, ta sử dụng phương pháp điều khiển vòng kín thiết bị nhiệt điện TE (thermoelectric) sử dụng vòng phản hồi cảm biến nhiệt độ Có hai cách để điều khiển nhiệt độ theo vòng kín là: điều khiển nhiệt tĩnh (thermostatic control) điều khiển trạng thái ổn định (steady-state control) Chúng ta tìm hiểu hai cách điều khiển cách cụ thể Điều khiển nhiệt tĩnh – Thermostatic control (hay điều khiển tắt mở - On-Off control) Đối với điều khiển nhiệt tĩnh, nhiệt độ tải trì hai mức giới hạn Khi nhiệt độ cao mức nhiệt độ giới hạn điều khiển ngừng cung cấp lượng, nhiệt độ thấp giới hạn điều khiển tiếp tục cấp lượng để làm nóng tải Nhiệt độ chênh lệch hai mức giới hạn gọi độ trễ hệ thống (system‟s „hysteresis‟) Ưu điểm phương pháp đơn giản, thiết kế vài linh kiện bản, mạch không phức tạp Đối với ứng dụng không cần độ xác cao phương pháp hoàn toàn đáp ứng yêu cầu Phương pháp áp dụng hầu hết thiết bị gia đình Điều khiển trạng thái ổn định – Steady state control (PID – proportional-integralderivative control) Bộ điều khiển trạng trái ổn định thiết kế để liên tục trì tải nhiệt độ yêu cầu với mức chênh lệch nhỏ xung quanh nhiệt độ đặt trước Khi trạng thái ổn định bị phá vỡ thay đổi đột ngột môi trường xung quanh điều khiển nhanh chóng đưa tải trở lại với trạng thái ổn định ta cung cấp đầy đủ khả làm nóng hay làm lạnh tải hệ thống Để đạt hiệu điều khiển trạng thái ổn định lượng cung cấp cho tải phải phụ thuộc vào yếu tố tồn tức thời điều môi trường xung quanh nhiệt độ tải Chƣơng THỰC NGHIỆM 3.1 Chế tạo kênh dẫn vi lƣu PCR 3.1.1 Vật liệu PMMA Thủy tinh hữu (PMMA) tên hóa học (poly methyl methacrylate) (poly methyl 2-methylpropenoate) trùng hợp từ methyl methacrylate, thường gọi đơn giản Acrylic Công thức hóa học (C5O2H8)n Thủy tinh hữu có tính chất đặc biệt, suốt thủy tinh lại có tính mềm dẻo, dễ uốn nung nóng, đặc biệt làm lạnh giữ độ cứng hình dạng bị uốn Dùng laser để gia công vật liệu thủy tin hữu dễ dàng Tia laser sử dụng không cần có công suất lớn Thủy tinh hữu bay thành dạng hỗn hợp khí tác dụng tia laser, vết khắc cắt đẹp Đây điểm bật thủy tinh hữu so với vật liệu PE hay PC 3.1.2 Chế tạo kênh dẫn vi lƣu PCR dùng công nghê ̣ Laser Máy Laser VersalLASER Máy VersalLASER đặt phòng thí nghiệm – E4 – Trường ĐH Công Nghệ (ĐHQGHN) Máy bao gồm phận như: Bộ chỉnh vị trí sử dụng laser diode phát ánh sáng đỏ, nằm quang trục laser CO2 dùng để chỉnh xác vị trí tia laser quét lên mẫu Bộ lái tia phận quan trọng hệ Cấu tạo lái tia gồm có: giãn chùm tia hoạt động nguyên tắc Galilê; hai gương phản xạ điều khiển góc tới động Galvanic; thấu kính hội tụ F – theta để tập trung lượng chùm tia xuống mẫu Quy trình chế tạo kênh đơn giản, không đòi hỏi tới phương pháp chế tạo phức tạp quang khắc, ăn mòn… nhóm nghiên cứu khác giới sử dụng chế tạo kênh dẫn vi lưu, tiết kiệm tối đa chi phí mà đạt cấu mong muốn Bên cạnh đó, phương pháp linh động việc điều chỉnh kích thước kênh Các bước chế tạo sau:  Sử dụng laser CO2 gia công vật liệu PMMA để tạo phần khác kênh 10  Các phần khác kênh sau xử lý bề mặt, đưa quy trình ép nhiệt để tạo hình kênh dẫn  Gắn ống dẫn chất lỏng Polyethylene lối vào lối kênh để thu kênh dẫn hoàn thiện Chế tạo kênh dẫn vật liệu PMMA không dễ dàng, kênh dẫn có tính thẫm mỹ cao… mà thuận tiện việc quan sát tượng xảy kênh dẫn vi lưu nhờ vào tính chất quý báu loại vật liệu PMMA Gia công vật liệu PMMA laser CO2 Laser CO2 sử dụng loại khí đóng kín, kích thích dòng điện chiều, công suất tối đa 60W Laser làm lạnh hệ thống nước luân chuyển nhiệt độ phòng Nguồn cao áp để sử dụng cho laser có điện áp chiều tối đa 30 kV, dòng tối đa 15 mA Điện áp đặt tín hiệu tương tự biên độ tối đa 5V Cấu trúc mặt cắt ngang kênh dẫn gồm có hai lớp có kích thước nhau, từ xuống là: 1) Lớp mặt nạ trên, miếng PMMA hình chữ nhật, khoan lỗ tròn xác vị trí lối vào lối kênh dẫn Có hai tác dụng, để che kín mặt kênh dẫn, đồng thời lỗ khoan cho phép dẫn chất lỏng vào lòng kênh đẩy sản phẩm sau trình tương tác kênh Các phần lại khắc lõm để chứa sensor đo nhiệt độ, dây cấp nguồn cho sensor, dây tín hiệu cổng kết nối với thiết bị thu thập liệu (Phần màu xanh nước biển cổng kết nối, phần màu đen khe chứa dây dẫn, phần màu vàng khắc sâu cỡ 1mm-1.2mm để chứa sensor nhiệt độ, phần màu xanh khắc mặt lại không khắc dùng để định vị chuông chứa chất lỏng hay gọi buồng phản ứng kênh) 2) Lớp tạo hình kênh dưới, phần cốt lõi kênh dẫn Cấu tạo hình da ̣ng kênh khắ c bằ ng Laser , để cho gắn lớp mặt nạ, tạo thành hốc kín với (hoặc hai) lối vào, lối chuông phản ứng, tạo thành kênh dẫn vi lưu PCR Ép nhiệt tạo hình kênh Ép nhiệt tên gọi mang tính chất thực nghiệm, phương pháp đặt tên cách đầy đủ “phương pháp tạo hình kênh dẫn vi lưu dựa tượng khuếch tán vật liệu PMMA” 11 Nguyên lý phương pháp đơn giản, phân tử vật liệu PMMA loại vật liệu khác luôn có xu hướng dao động xung quanh vị trí cân nó, nhiệt độ cao, dao động lớn Khi đó, ta đặt sát hai vật liệu PMMA với nhau, bề mặt tiếp xúc hai tấm, phân tử PMMA khuếch tán sang PMMA kia, ngược lại Khi hạ thấp nhiệt độ, khuếch tán lẫn nên hai PMMA gắn liền vào với Biểu đồ xây dựng dựa tính chất vật liệu PMMA nhiều lần tiến hành thực nghiệm Ta biết vật liệu PMMA hóa dẻo 240-250oC, nhiệt độ ép trì 220oC kết hợp với tác dụng áp lực lên kênh giúp cho kênh sau ép có chất lượng tốt, kênh hoàn toàn không bị biến dạng (do nhiệt độ ép thấp nhiệt độ hóa dẻo) mà đảm bảo ba lớp kênh ép khuếch tán vào thành khối (do áp lực dao động nhiệt phân tử PMMA đủ lớn) Các bước nhiệt độ trung gian có ý nghĩa làm ổn định cấu trúc kênh ép, giảm tượng bọt khí xuất mặt tiếp xúc lớp kênh Bước cuối việc chế tạo kênh dẫn gắn ống dẫn chất lỏng polyethylene cứng xác lối vào chất lỏng Các ống có tác dụng kết nối với hệ thống bơm chất lỏng thông qua đường dẫn polyethylene mềm dẻo thường sử dụng y tế Chính hệ thống kênh dẫn sau có tính động cao, gọn nhẹ thuận tiện cho bảo quản xử lý kênh sau sử dụng, bên cạnh kênh dẫn thẩm mỹ so với số cấu hình kênh dẫn nhóm nghiên cứu khác chế tạo, sử dụng trực tiếp ống polyethylene mềm làm đường dẫn chất lỏng vào kênh 3.2 Xây dựng mạch điện mạch điều khiển cho hệ thống PCR 3.2.1 Thiết bị gia nhiệt Hệ gia nhiệt áp dụng TEC1-12704 Thermoelectric Cooler Peltier, sử dụng điện áp 15V, dòng 4A để đốt nóng làm lạnh 3.2.2 Thiết bị đo nhiệt độ Để điều khiển nhiệt độ hệ, nhiệt độ phản hồi qua IC LM35, điện áp tăng 10mV ứng với oC * Thông số kĩ thuật: + Dải nhiệt độ biến đổi: 0oC đến 100oC + Nhiệt độ thẳng thang đo Celcius nghĩa 25oC điện áp 0.25V 12 + Tương ứng 10mV/oC + Đảm bảo độ xác 0.1oC nhiệt độ 25oC + Làm việc với nguồn nuôi 4VDC đến 30VDC + Trở kháng thấp 0.1 ohm với tải 1mA + Khả tự làm nóng thấp, 0.08oC không khí Khảo sát sensor nhiệt độ LM35 Tiến hành đưa sensor nhiệt kế vào cốc nước nóng, để nước nguội từ từ tiến hành ghi lại số nhiệt kế tín hiệu điện áp sau biến đổi ADC vi điều khiển vào phần mềm Microsoft Excel Khi nước nguội đến nhiệt độ phòng ta sử dụng kết đo vẽ đồ thị hàm đáp ứng nhiệt độ thực giá trị điện áp sensor nhiệt độ sau: Ta thấy hàm phụ thuộc nhiệt độ thực tế giá trị ADC hàm số tương đối tuyến tính Giá trị vi điều khiển sử dụng để tính toán đáp ứng đầu cho hệ thống PCR 3.2.3 Mạch điều khiển chức cho hệ thống PCR Sơ đồ nguyên lý mạch điện điều khiển nhiệt độ, nhiệt độ kênh vi lưu IC LM35 đo, hiển thị truyền thông tin điều khiển, dsPIC30F4013 điều khiển nhiệt độ mong muốn Mạch điều khiển chức có nhiệm vụ thu thập liệu nhiệt độ từ mạch đo nhiệt độ tích hợp kênh vi lưu PCR tính toán để đưa tín hiệu điều khiển thích hợp tới mạch điều khiển công suất để ổn định nhiệt độ cho kênh vi lưu PCR Đảm bảo trình PCR diễn quy trình lập sẵn Để đảm bảo ổn định mức cao nhất, mạch điều khiển chức sử dụng thuật toán điều khiển kinh điển thuật toán PID 3.2.4 Mạch điều khiển công suất cho hệ thống PCR Do hệ thống điều khiển nhiệt độ cần tăng giảm nhiệt độ tức thời công suất gia nhiệt tương đối lớn nên mạch điều khiển công suất cho hệ thống PCR cần sử dụng cầu H nhằm thay đổi chiều dòng điện cách thuận tiện nhanh chóng Để điều khiển công suất lớn cầu H cần tạo thành từ thành phần có khả tải công suất lớn, điển hình loại MOSFET kênh N kênh P MOSFET viết tắt cụm Meta Oxide Semiconductor Field-Effect Transistor tức Transisor hiệu ứng trường có dùng kim loại oxit bán dẫn 13 3.2.5 Xây dựng hệ thống PCR thử nghiệm Hệ thống PCR cuối kết hợp từ thành phần đo đạc, điều khiển chức năng, điều khiển công suất hiển thị Tiến hành khảo sát hệ thống PCR xây dựng với chu trình nhiệt chuẩn kĩ thuật PCR sau: Chu trình nhiệt phản ứng PCR trải qua giai đoạn, ban đầu nhiệt độ PCR đưa lên 95oC 1-2 phút để tháo xoắn DNA, nhiệt độ hạ xuống 62oC để gắn mồi, cuối nhiệt độ đưa lên 75 oC để kéo dài chuỗi DNA, kết thúc chu trình nhiệt Một phản ứng PCR yêu cầu từ 25-30 chu trình Kết thu truyền máy tính dùng chương trình Microsoft Excel vẽ thành đồ thị theo thời gian 3.3 Thực khảo sát mẫu DNA hệ thống PCR xây dựng đƣợc Phản ứng PCR diễn với kết hợp hóa chất đặc hiệu, DNA thay đổ nhiệt độ phù hợp với phản ứng nhân DNA Mục đích thực nghiệm PCR nghiên cứu nhằm tạo quy trình chuẩn kèm theo hóa chất vật liệu DNA chuẩn sử dụng cho hệ vi lưu PCR Kết phản ứng PCR theo kỹ thuật thông thường sử dụng để đối chiếu với kết hệ vi lưu PCR Dung dịch đưa vào kênh vi lưu gồm có: Template 1.0 µl, Primer F 0.5 µl, Primer R 0.5 µl, dNTPs 2.5 µl, MgCl2 2.5 µl, NH4+ 2.5 µl, Taq 0.5 µl, dH2O 15 µl Tiến hành khảo sát hệ thống theo chu trình nhiệt đặt trước Sản phẩm cuối khảo sát máy điện di mao quản Chu trình nhiệt để tiến hành PCR nhân DNA bao gồm: 94 oC - phút, sau thực 30 chu kỳ bao gồm 94oC – 45 giây, 52oC - 45 giây, 72oC - phút, kết thúc kéo dài mạch 72oC phút kết thúc phản ứng 4oC 14 Chƣơng KẾT LUẬN Bước đầu xây dựng thành công hệ thống PCR bao gồm: hệ điều khiển nhiệt độ hoạt động ổn định theo chu trình đặt trước, kênh vi lưu vi trộn có chất lượng tương đối tốt sử dụng công nghệ laser chế tạo, khảo sát ban đầu mẫu DNA sau nhân khả quan, có khả đưa vào ứng dụng để nghiên cứu hay chế tạo loại cảm biến y sinh micro-nano Nghiên cứu xây dựng hệ thống PCR từ vi trộn gia công vật liệu thủy tinh hưu PMMA Nghiên cứu xây dựng hệ thống điều khiển nhiệt độ theo chu trình sử dụng pin Peltier ứng dụng hiệu ứng Peltier Sử dụng hệ thống xây dựng vào thực nghiệm nhân DNA Tiến hành khảo sát với mẫu gene khác chu trình nhiệt độ khác nhằm mục đích tìm chu trình chuẩn, vật liệu hóa chất chuẩn sử dụng hệ vi lưu PCR Các kết thu tạo tiền đề cho không cho việc nghiên cứu chế tạo cảm biến mà hướng đến nghiên cứu sâu lab-on-chip Những hướng nghiên cứu tiếp theo: Sử dụng DNA nhân để nghiên cứu chế tạo cảm biến y sinh micro-nano ứng dụng thực tiễn nhận dạng vân tay, xác định huyết thống… References Tiếng Việt Nguyễn Đại Hưng, Vật lí kĩ thuật laser, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2002, Chương Tiếng Anh ChristopherJ Campbell and BartoszA Grzybowski, Microfluidic mixers from microfabricated to self-assembling devices Chunsun Zhang, Jinliang Xu, Wenli Mauer, Wenling Zheng, “PCR microluidic devices for DNA amplification”, Biotechnology Advances 24, 2006, pp 243-284 Giovanni Egidi, Development of microfluidic devices for chemical analysis and fluid handling, 2004, p9-p18 Hakan Jonsson, Microfluidics for lab-on-a-chip applications, 2004, p1-p9 15 Henrik Bruus, Theoretical Microfluidics, Oxford master series in condensed matter physics, 2007, pp 1-6, pp 197-211 Janak Singh, Mayang Ekaputri, “PCR thermal management in an integrated Lab on Chip”, Journal of Physics: Conference Series 34, 2006, pp 222-227 Jin-Woo Choi, Chong H Ahn, Gregory Beaucage, members of IEEE, “Disposable smart Lab on a chip for point-of-Care Clinical diagnostics”, Proceedings of the IEEE, Vol 92, No 1, 2004, pp 154-173 John Wiley & Sons, Kutz, Myer, Handbook of Materials Selection, 2002, Acrylic glass - PPMA 10 Khan lab, Microfluidics for Chemical and Nanomaterials Synthesis 11 Michael A Stroscio, Mitra Dutta, Biological Nanostrustures and Application of Nanostructures in Biology, University of Illionis at Chicago, Chicago, Illionis, 2004, pp 8285 12 Manz & Becker, Microsystem Technology in Chemistry and Life Sciences, 1999 13 Nguyen Nam Trung, Fabrication Techniques for Microfluidics, Chapter 14 Nguyen, N T.; S T Wereley, Fundamentals and Application of Microfluidic, 2nd ed, Artech House, 2006, pp 1-10 15 Photolithography at University of Glasgow, United Kingdom 16 Resonetics CO., Laser Micromachining Seminar 17 S Kim, H A Stone, “Microfluidics: Basic issues, Applications, and Challenges”, AIChE Journal No 6, 2001, pp 1250-1254 18 Tabeling, P, Introduction to Microfluidics, Oxford University Press, 2006 19 Tuan Vo-Dinh, Guy Griffin, David L Stokes, Alan Wintenberg, “Multi-functional biochip for medical diagnostics and pathogen detection”, Sensor and Actuators B 90, 2003, pp 104-111 20 W B J Zimmerman, University of Sheffield, UK, Microfluidics History, Theory and Applications, 13-17/9/2004 21 Wei-Cheng Tian, Erin Finehout, Microfluidics for Biological Applications, Library of Congress Control Number: 2008930844, Springer Science+Business Media, LLC, 2008, pp 229 16 22 Yi Sun, M.V.D Satyanarayan, Nam Trung Nguyen, Yien Chian Kwok, “Continuous flow polymerase chain reaction using a hybrid PMMA-PC microchip with improved heat tolerance”, Sensor and Actuators B 130, 2008, pp 836-841 23 ZhigangWu and Nam-Trung Nguyen, Convective–diffusive transport in parallel lamination micromixers, 9-2004 Zhang, T.; K Chakrabarty, R B Fair, Microelectrofluidic Systems: Modeling and Simulation, 2002 17