Xác định hàm lượng ethanol, methanol, aldehyde trong một số mẫu rượu nếp chưng cất tại kim sơn, ninh bình

Trong rượu không chỉ có ethanol mà còn có thể chứa một lượng lớn methanol, aldehyde, và các chất độc hại khác, gây độc mạnh hơn ethanol, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến bộ máy tuần hoàn,

MẪU RƯỢU NẾP CHƯNG CẤT TẠI KIM SƠN, NINH BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC

Hà Nội – 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC

Người hướng dẫn: ThS Dương Hải Thuận

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Dương Hải Thuận, người đã trực tiếp

hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức quan trọng cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại Khoa Y-Dược Đại học Quốc gia Hà Nội

Xin trân trọng cảm ơn các giảng viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc,

Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm Khoa Y- Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo cùng các thầy cô Khoa Y-Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại Khoa

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, quan tâm chăm sóc và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học

Trong quá trình thực hiện đề tài, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng vẫn không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi kính mong nhận được những ý kiến chỉ bảo và phê bình của quý thầy cô

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên Phan Thị Hương

MEOS Hệ thống oxy hóa ethanol thuộc hạt lưới nội bào

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Quy trình sản xuất bánh men rượu 5

Hình 2: Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 6

Hình 3: Quá trình chuyển hóa methanol trong cơ thể 12

Hình 4: Sơ đồ hoạt động máy sắc ký khí 13

Hình 5: Phản ứng màu giữa aldehyde và thuốc thử fuchine-sulfite 18

Hình 6: Quy trình xác định hàm lượng ethanol 20

Hình 7: Quy trình so màu xác định hàm lượng methanol trong rượu 22

Hình 8: Kết quả so màu methanol của 12 mẫu rượu chưng cất Kim Sơn 23

Hình 9: Quy trình so màu xác định hàm lượng aldehyde trong rượu 25

Hình 10: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 10 mg/l 29

Hình 11: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 50 mg/l 29

Hình 12: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 100 mg/l 29

Hình 13: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 150 mg/l 30

Hình 14: Sắc ký đồ của chuẩn acetaldehyde 200 mg/l 30

Hình 15: Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc giữa chiều cao pic hàm lượng acetaldehyde 31

Hình 16: Sắc ký đồ thu được của 12 mẫu rượu 34

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các mẫu rượu được khảo sát 16

Bảng 2: Hàm lượng ethanol trong 12 mẫu rượu chưng cất Kim Sơn 21

Bảng 3: Kết quả phương pháp so màu xác định hàm lượng methanol trong 12 mẫu rượu Kim Sơn 24

Bảng 4 : Pha dãy dung dịch chuẩn acetaldehyde 25

Bảng 5: Kết quả hàm lượng aldehyde trong 12 mẫu rượu Kim Sơn bằng phương pháp so màu 26

Bảng 6: Kết quả sắc ký khí với acetaldehyde chuẩn 100 mg/l thực hiện 6 lần 28

Bảng 7: Sự phụ thuộc chiều cao pic theo nồng độ acetaldehyde 30

Bảng 8: Kết quả hàm lượng acetaldehyde trong 12 mẫu rượu Kim Sơn bằng 35

phương pháp sắc ký khí 35

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về quá trình chưng cất và rượu chưng cất 2

1.1.1 Quá trình chưng cất rượu 2

1.1.2 Phân loại rượu chưng cất (rượu trắng chưng cất) 2

1.2 Giới thiệu bánh men thuốc bắc và quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 4

1.2.1 Giới thiệu bánh men thuốc bắc 4

1.2.2 Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn 5

1.3 Ethanol và những tạp chất có liên quan trong quá trình chưng cất 8

1.3.1 Ethanol 8

1.3.2 Hợp chất cacbonyl 9

1.3.3 Alcohol 11

1.3.4 Furfural 12

1.4 Sơ lược về sắc ký khí 13

1.4.1 Khái niệm 13

1.4.2 Ứng dụng của sắc ký khí 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất 16

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 16

2.2.2 Hóa chất 17

2.3 Một số phương pháp xác định hàm lượng ethanol, methanol và aldehyde trong rượu chưng cất 17

2.3.1 Xác định hàm lượng ethanol 17

2.3.2 Xác định hàm lượng methanol 17

2.3.3 Xác định hàm lượng aldehyde 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Xác định hàm lượng ethanol 20

3.2 Xác định hàm lượng methanol 21

3.2.1 Phương pháp sắc ký khí 21

3.2.2 Phương pháp so màu 21

3.3 Hàm lượng aldehyde 24

3.3.1 Phương pháp so màu 24

3.3.2 Phương pháp sắc ký khí 27

3.4 Bàn luận 36

Kết luận 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

Phụ lục A: Quy định kỹ thuật về rượu trắng trong TCVN 7043:2013 41

Phụ lục B: Bảng quy đổi độ rượu ở các nhiệt độ khác nhau về 20 oC 42

Phụ lục C: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn acetaldehyde 100 mg/l qua 6 lần thử 45

Tài liệu tham khảo

MỞ ĐẦU

Rượu từ lâu đã là một thức uống quen thuộc, gắn liền với đời sống văn hoá người

Việt Nam nhưng có một điều không thể phủ nhận rằng tác hại của rượu vô cùng ghê

gớm Đặc biệt trong thời gian qua, tình trạng lạm dụng rượu và ngộ độc rượu có xu

hướng tăng nhanh và phức tạp Mỗi năm vẫn còn nhiều ca phải nhập viện, thậm chí tử

vong vì ngộ độc rượu Nhiều trường hợp là do uống rượu liên tục trong một thời gian

ngắn nhưng nhiều trường hợp đáng tiếc lại do sử dụng rượu không rõ nguồn gốc, chất

lượng kém, các nạn nhân phần lớn lại là người nghèo, sinh viên, người trẻ tuổi chưa đủ

nhận thức Đặc biệt từ đầu năm 2017 đến nay số vụ ngộ độc rượu đã tăng đột biến Có

thể thấy các vụ tai nạn giao thông hiện nay phần lớn là do tác động của rượu bia, khi

nồng độ cồn trong máu cao thì ta không thể kiểm soát được bản thân Ngoài ra rượu còn

gây ức chế thần kinh cũng như hoạt động của các cơ quan tim mạch trong cơ thể Trong

rượu không chỉ có ethanol mà còn có thể chứa một lượng lớn methanol, aldehyde, và các

chất độc hại khác, gây độc mạnh hơn ethanol, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến bộ máy

tuần hoàn, hô hấp và thần kinh của con người [18, 28] Việt Nam là một trong số ít những

quốc gia đang có xu hướng tăng nhanh về mức tiêu thụ đồ uống có cồn, đặc biệt là rượu

Theo thống kê của Bộ Y tế, từ đầu năm 2007 đến hết tháng 3-2017, toàn quốc đã ghi

nhận 58 vụ ngộ độc rượu do sử dụng rượu không an toàn làm 382 người mắc và 98 người

chết Hầu hết các loại rượu đã sử dụng trong các vụ ngộ độc đều không rõ nguồn gốc,

không được cấp Giấy chứng nhận công bố tiêu chuẩn sản phẩm, được kinh doanh nhỏ lẻ

hoặc sản phẩm do người tiêu dùng tự pha chế và nấu sẵn Rượu chưng cất ở Việt Nam

(chủ yếu là rượu trắng) đa số được sản xuất tự do tại các địa phương và hầu hết đều nấu

bằng phương pháp thủ công Nhiều người nấu, nhiều cách nấu và nguyên liệu mỗi nơi

môi khác nên chất lượng rượu không đồng đều Trong đó, rượu nếp chưng cất Kim Sơn

là một loại rượu có thương hiệu, được đề cử kỷ lục “Top 10 đặc sản rượu nổi tiếng nhất

Việt Nam” Rượu được sản xuất từ các làng nghề truyền thống thuộc huyện miền biển

Kim Sơn, Ninh Bình [8] Nhưng cho đến nay vẫn chưa có báo cáo chính thức nào về

chất lượng rượu ở đây Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm xác định hàm lượng ethanol,

methanol, aldehyde trong sản phẩm rượu chưng cất Kim Sơn, Ninh Bình

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Rượu là loại thức uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men, là sản phẩm của sự chưng cất hoặc không chưng cất ngũ cốc khoai, củ, hoa quả,… chứa glucid, lêm men rượu Về cơ bản, rượu được chia thành các loại như sau: rượu lên men qua chưng cất (rượu trắng, rượu lúa mới,…), rượu lên men không qua chưng cất (rượu vang, rượu táo, rượu bia,…) [11, 16]

1.1 Tổng quan về quá trình chưng cất và rượu chưng cất

1.1.1 Quá trình chưng cất rượu

Quá trình chưng cất dựa trên sự khác nhau về nhiệt độ sôi của các cấu tử trong hỗn hợp ở một áp suất nhất định Người ta dùng nhiệt để chuyển hỗn hợp lỏng sang pha hơi và thu chất lỏng ở khoảng nhiệt độ thích hợp bằng cách cho hơi ngưng tụ [13] Trong chưng cất rượu, quá trình chưng cất được tiến hành bằng cách đun sôi hỗn hợp lên men, hỗn hợp hơi bay lên được qua hệ thống làm lạnh và ngưng tụ thành rượu Rượu được chưng cất nhằm loại bỏ một số tạp chất độc hại được sinh ra trong quá trình lên men và làm tăng độ cồn [26]

1.1.2 Phân loại rượu chưng cất (rượu trắng chưng cất)

Rượu trắng chưng cất là loại đồ uống có cồn được chưng cất từ dịch lên men có nguồn gốc tinh bột hoặc các loại đường [2] Đa số rượu chưng cất đều có độ cồn từ 20% V/V trở lên (vodka (40-45% V/V) brandy (40-60% V/V)), số ít rượu chưng cất được sản xuất ở Đức có độ cồn thấp hơn 15% V/V [33]

1.1.2.1 Rượu tinh cất

Rượu tinh cất là rượu được chưng cất liên tục đến độ cồn bằng hoặc trên 95% V/V và được tinh chế lại nhằm loại bỏ mùi vị và màu sắc của rượu sau khi chưng cất Rượu tinh cất được dùng để pha chế các loại rượu khác thấp độ cồn hơn như vodka, GNS… Volka (40-45% V) là rượu tinh cất được chưng cất từ sản phẩm lên men của khoai tây, ngũ cốc rỉ mật,… và được xử lý sau chưng cất bằng than hoạt tính [31, 33]

1.1.2.2 Whisky

Whisky được chưng cất từ dịch ngâm lên men của nhiều loại ngũ cốc khác nhau như ngô, lúa mạch, lúa mạch đen, lúa mì,… đến độ cồn thấp hơn 95% V/V và độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [33]

Có nhiều loại Whisky được sản xuất trên thế giới khác nhau chủ yếu ở nguyên liệu lên men và quá trình sản xuất Bốn loại nguyên liệu lên men chính là mạch nha, lúa mạch, lúa mạch đen và ngô Các loại ngũ cốc có thể sử dụng đơn lẻ hoặc phối hợp với nhau để lên men

1.1.2.3 Gin

Gin được chưng cất từ các loại ngũ cốc lên men (chủ yếu là lúa mạch đen) và có mùi thơm đặc trưng của quả bách xù (juniper) hay một số loại thảo mộc khác, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [33]

1.1.2.4 Brandy

Brandy được chưng cất từ các loại trái cây lên men (thường là nho) đến độ cồn thấp hơn 95% V/V, có mùi vị và tính chất đặc trưng, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên

40% V/V Brandy gồm 3 loại chính là brandy nho (làm từ nước ép quả nho như Cognac,

Armagnac, pisco, metaxa, ), brandy táo (làm từ các phần còn lại của quả nho như pomace/marc, grapa, Calvados,…) và brandy trái cây (làm từ các loại quả khác nho như

kirschwasser, slivovitz, raisin, lees,…) [26, 33]

sử lên men từ agave và 49% đường từ nguồn khác) Tequila có mùi vị và tính chất đặc

trưng, độ cồn đóng chai bằng hoặc trên 40% V/V [26, 33]

1.1.2.7 Mescal

Mescal là loại rượu có nguồn gốc từ Mexico, được chưng cất từ dịch ngâm lên

men cây maguey (Agave americana L.), có mùi vị và tính chất đặc trưng, độ cồn đóng

chai bằng hoặc trên 40% V/V [33]

1.2 Giới thiệu bánh men thuốc bắc và quy trình sản xuất rượu Kim Sơn

1.2.1 Giới thiệu bánh men thuốc bắc

Bánh men thuốc bắc là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt nam Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có phương pháp sản xuất riêng Men rượu nếp chưng cất Kim Sơn là loại men 36 vị thuốc bắc, điều này đã làm nên sự khác biệt của sản phẩm này Trong chế phẩm bánh men thuốc bắc chứa nhiều giống vi sinh vật thuộc vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Thực chất, men thuốc bắc là canh trường không thuần khiết của

hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng hệ enzym, đường hóa men rượu Ngoài ra, đa số các vị thuốc bắc đều có mùi thơm Các hợp chất này có thể phản ứng với nhau và với những hợp chất khác, tạo ra những hợp chất mới Kết quả tạo ra mùi vị rất đặc trưng cho rượu cổ truyền [7] Thực tế, trong sản xuất người ta thường dùng kết hợp nhiều vị thuốc khác nhau nhưng thông thường, chỉ sử dụng 8- 10 vị Đặc biệt men rượu nếp Kim Sơn

có sự kết hợp của 36 vị thuốc bắc tạo nên mùi vị đặc trưng của rượu

Qua khảo sát, các vị thuốc chính được thấy bao gồm: Nhục đậu khấu, Bạch truật, Nhục quế, Thảo quả, Cam thảo, Bạc hà, Tế tân, Uất kim, Tiểu hồi, Khung cùng, Phòng phong, Thạch cao, Tân lang, Mộc hương, Đinh hương, Thiên niên kiện, Trần bì, Bạch chỉ, Hoàng bá, Hoàng liên,… Các vị thuốc được kết hợp với nhau theo một tỷ lệ nhất

định theo kinh nghiệm để lại của người dân Nguyên liệu chính để sản xuât bánh men thuốc bắc là: bột gạo, men giống và các vị thuốc bắc Quy trình sản xuất như sau:

Hình 1: Quy trình sản xuất bánh men rượu Bánh men sử dụng trong sản xuất rượu truyền thống là bột gạo ẩm trộn với bánh men giống giã nhỏ Để tránh sự nhiễm các vi sinh vật là không mong muốn, người ta bổ

sung các vị thuốc bắc thu được men thuốc bắc Mỗi vị thuốc bắc chứa nhiều chất khác

nhau, có tác dụng khác nhau như: nhóm chất có giá trị dinh dưỡng với vi sinh vật (protein, glucid, lipid, vitamin, chất khoáng,…); nhóm chất có tác dụng dược lý sát trùng (các tinh chất nhựa, alcaloid và các glucozid) Chính nhóm chất này giúp hạn chế các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài trong quá trình lên men; và nhóm chất xơ, chất màu,… [7, 9] Do đó thuốc bắc vừa có tính kháng khuẩn vừa giảm sự tạp nhiễm các loài

vi sinh vật có hại, đồng thời có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của hệ vi sinh vật chính trong bánh men

1.2.2 Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn

Nước

Làm sạch

Xay thành bột Ngâm nước

Nghiền mịn Trộn men

Để ráo

Hong khô

Ủ Tạo hình Làm ẩm Nghiền mịn

Bánh men rượu

Quy trình sản xuất rượu nếp trắng Kim Sơn được trình bày trong sơ đồ sau:

Hình 2: Quy trình sản xuất rượu Kim Sơn

Chọn gạo nếp chiêm

Cùng một quy trình nấu rượu nhưng khi nấu rượu với các loại gạo khác nhau sẽ

cho ra chất lượng rượu khác nhau Điển hình như khi nấu gạo tẻ, rượu sẽ không thơm và

ngọt bằng rượu nếp nhưng đổi lại giá thành rẻ hơn Người dân Kim Sơn thường chỉ nấu

bằng gạo nếp, ở đây có hai loại nếp là nếp mùa và nếp chiêm nhưng theo kinh nghiệm

từ xưa để lại thì gạo nếp chiêm sẽ cho ra rượu thơm ngon hơn

Gạo nếp đem nấu thành cơm

Mục đích của quá trình nấu nguyên liệu là nhằm phá vỡ màng tế bào của bột,

chuyển tinh bột thành trạng thái hòa tan trong dung dịch – hồ hóa tinh bột Khi đun

nguyên liệu với nước, sẽ xảy ra hiện tượng trương nở, hòa tan các kết dính giữa các tế

bào (pectin, tinh bột, pentozan…), dẫn đến làm giảm độ bền cơ học của nguyên liệu Ở

Trộn men Lên men ẩm

Chưng cất Lên men lỏng

Nấu

Nghiền mịn

Bánh men

Rượu trắng Nước

Gạo nếp

nhiệt độ khoảng 140 - 150 ºC thành tế bào sẽ bị phá vỡ, các hạt tinh bột sẽ tách ra và hòa tan trong dung dịch

Để cơm nguội và rắc men thuốc bắc

Để cơm nhanh nguội, người ta thường trải cơm ra một cái nong thật to, đan từ tre Sau đó chờ đến khi nhiệt độ cơm còn khoảng 25 - 30 độ thì tiến hành rắc men thuốc bắc

36 vị và trộn đều Tỷ lệ trộn men thường chiếm khoảng 3% so với tổng khối lượng cơm

ºC trong 3- 4 ngày tùy thuộc thời tiết và nhiệt độ Mục đích của quá trình này là để tạo điều kiện cho nấm mốc và vi khuẩn phát triển, tiết ra emzym đường hóa tinh bột Cũng trong giai đoạn này, nấm men cũng bắt đầu phát triển và chuyển hóa một ít đường thành rượu

Lên men lỏng

Lên men lỏng là quá trình nấm men sử dụng đường tạo ra để lên men rượu Khi cơm rượu có mùi thơm nhẹ của rượu, ăn thấy ngọt, có hơi cay vị của rượu thì chuyển sang ủ trong chum vại kín với nước sạch theo tỷ lệ: 1 phần gạo/ 2 - 3 phần nước Thời gian ủ lỏng kéo dài khoảng 2 - 3 ngày Cơm rượu ủ trong điều kiện kín, nấm mốc ngừng phát triển nhưng enzym tạo thành vẫn tiếp tục thủy phân tinh bột Trong giai đoạn này, nấm men phát triển mạnh nhờ lượng oxy hòa tan trong nước và lượng đường tạo thành, sau đó chuyển sang lên men rượu

Chưng cất

Khi quá trình lên men kết thúc, tiến hành trưng cất để thu rượu thành phẩm Quá trình chưng cất rượu nhằm tách hỗn hợp rượu và nước có nhiệt độ sôi khác nhau Ở áp suất thông thường, rượu sôi và bốc hơi ở nhiệt độ 78,5 ºC, nước sôi ở 100ºC nên rượu được tách ra khỏi nước nhờ nhiệt độ sôi thấp hơn Dụng cụ để nấu rượu gồm một nồi

lớn, không cần vung Bên trên nồi này là một thùng tròn đóng bằng gỗ như cái trống, có đặt máng và ống dẫn rượu ra ngoài, trên cùng thường là một chậu lớn đặt nghiêng Trong chậu này đựng nước thường xuyên được thay để giữ lạnh Hơi rượu bốc lên từ nồi dưới, gặp lạnh ở đáy chậu đựng nước lạnh phía trên, sẽ hóa lỏng mà theo máng chảy ra ngoài rồi được hứng vào chai

Lúc bỏ cơm rượu vào để nấu, người ta pha thêm nước theo liều lượng, dùng đất sét trám thật kỹ giữa hai nồi, cùng chung quanh ống dẫn rượu để hơi rượu không bị bay thoát Rượu thu được có màu trong, có mùi thơm đặc trưng và nồng độ rượu sẽ giảm dần theo thời gian chưng cất

Kết thúc quá trình lên men lỏng, cơm rượu được đêm chưng cất, thu được rượu trắng truyền thống Kim Sơn, Ninh Bình Thông thường với 10 kg gạo nếp thường cất được 3 - 5 lít rượu Tùy theo nồng độ rượu mong muốn mà người ta tiến hành pha trộn các loại rượu ở các khoảng thời gian chưng cất khác nhau

1.3 Ethanol và những tạp chất có liên quan trong quá trình chưng cất

1.3.1 Ethanol

Ethanol là thành phần chính có trong hầu hết thức uống có cồn có nguồn gốc từ quá trình lên men carbohydrate với nấm men [25] Ethanol là chất lỏng không màu trong suốt, dễ bay hơi, có mùi đặc trưng và vị cay [14]:

- Công thức cấu tạo: C2H5OH

- Nhiệt độ sôi: 78,5 º C

- Nhiệt độ nóng chảy: -114,1 º C

- Tỷ trọng: d=0,789 g/mL

Khi uống vào cơ thể, khoảng 20% ethanol được hấp thu ở dạ dày và 80% hấp thu

ở ruột non Rượu được hấp thu từ ruột sẽ theo tĩnh mạch cửa đến gan Tại đây, 90% ethanol được chuyển hóa, một phần nhỏ được bài tiết nguyên dạng qua mồ hôi, hơi thở

và nước tiểu Ethanol được chuyển hóa chủ yếu bởi ADH ở bào tương của tế bào gan tạo thành acetaldehyde Khi nồng độ ethanol trong máu đạt 100 mg/mL, ethanol được chuyển hóa qua hệ MEOS (ở những người nghiện rượu) Acetaldehyde được hình thành

nhanh chóng bị oxy hóa thành acetate Acetate được chuyển hóa thành acetyl-CoA vào chu trình Crebs giải phóng CO2 và H2O [18, 22, 28]

Ethanol gây độc trên hầu hết các hệ cơ quan, một số triệu chứng nhiễm độc có liên quan đến tác dụng của chất chuyển hóa acetaldehyde Ethanol tác động lên một số protein màng tham gia vào con đường truyền tín hiệu bao gồm các receptor dẫn truyền thần kinh Tác động chính của ethanol liên quan đến sự gia tăng ức chế GABA tại receptor GABA và ức chế receptor NMDA (N–methyl–D-aspartate), receptor của glutamate [18, 22] Uống rượu vừa phải (khoảng 10 - 20g ethanol nguyên chất mỗi ngày)

có tác dụng tốt trên hệ tim mạch Ngược lại, việc lạm dụng rượu có khả năng gây tổn thương các cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là gan, dạ dày, thực quản, ruột, tuyến tụy và não bộ, làm tăng khả năng ung thư trên các bộphận [18]

1.3.2 Hợp chất cacbonyl

1.3.2.1 Acid cacboxylic

Acid cacboxylic là những hợp chất hữu cơ trong phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon hay hydrogen bằng liên kết cộng hóa trị [14]

Carboxylic acid trong rượu chưng cất có nguồn gốc từ quá trình lên men chủ yếu

là các acid đơn chức mạch hở từ C1 đến C18 (đa số là mạch nhánh) và một phần nhỏ là các acid thơm Acid acetic chiếm phần lớn trong tổng số acid, theo sau là acid decanoic, acid octanoic và acid dodecanoic [25]

Các acid được hình thành trong quá trình sinh tổng hợp hoặc quá trình phân hủy các acid béo và sự phân hủy các amino acid ở Saccharomyces trong điều kiện kỵ khí, số lượng tùy thuộc vào mỗi dòng nấm men Điều kiện lên men không tối ưu cũng là nguyên nhân hình thành các acid, đặc biệt là acid acetic (do vi khuẩn acetic acid) Các acid thơm lẫn trong rượu có nguồn gốc từ những thùng sồi dùng để bảo quản, chủ yếu là benzoic acid, o-/p-hydrobenzoic acid, gallic acid, cinamic acid, ferulic acid, coumaric acid, syringic acid, vanillic acid, góp phần vào hương vị của rượu [25, 32]

Trong rượu chưng cất, các acid có nhiệt độ sôi cao hơn ethanol nên ra sau, quá trình chưng cất diễn ra càng dài tương ứng với hàm lượng acid càng cao Hàm lượng

acid cao trong rượu không đảm bảo chất lượng sản phẩm, acid acetic nhiều làm cho rượu

có vị chua, sự hiện diện của các acid béo mạch ngắn tạo mùi vị khó chịu cho rượu,… TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng acid trong rượu chưng cất [2]

1.3.2.2 Este

Este là sản phẩm của phản ứng giữa các acid (hữu cơ hoặc vô cơ) với alcohol Este hữu cơ là dẫn xuất của carboxylic acid khi thay thế nhóm hydroxyl ở nhóm carboxyl bằng nhóm OR [14] Este trong rượu là sản phẩm của sự tổ hợp các acid cacboxylic và alcohol, chủ yếu là các ethyl este [26]

RCOOH + R’OH ↔ RCOOR’ + H2O Các este trong rượu chưng cất bao gồm este của carboxylic acid mạch hở từ C2 đến C18 và este của các acid thơm Ethyl acetate chiếm hơn 50% trong tổng số este Ethyl formate tạo nên mùi thơm đặc trưng cho rum với hàm lượng dao động 5-35 mg/L Este của acid thơm hiện diện ít nhất trong rượu chưng cất, chủ yếu là benzoate và ethyl phenylacetate [25]

Sự hình thành este giảm bớt một số độc tính trong rượu gây nên bởi acid và alcohol độc hại Este cũng được xem là nguồn dự trữ các acid và alcohol trong rượu Sự

có mặt của este tạo nên mùi hương đặc trưng cho sản phẩm [26] TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng este trong rượu chưng cất [2]

1.3.2.3 Aldehyde

Aldehyde là những hợp chất hữu cơ mang nhóm chức –CHO liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon hoặc hydrogen bằng liên kết cộng hóa trị [14] Trong rượu chưng cất, aldehyde tổng số được tính bằng tổng của aldehyde dạng tự do và aldehyde dạng bảo vệ (hemiacetal và acetal)-sản phẩm của phản ứng thuận nghịch giữa aldehyde liên kết với alcohol trong rượu với hệ số bằng khoảng 0,9 Do đó, tương ứng với rượu mạnh có độ cồn từ 40% đến 50% V/V sẽ có 15-20% lượng aldehyde liên kết với ethanol [25]

Ở hầu hết các loại rượu chưng cất acetaldehyde chiếm hơn 90% tổng số aldehyde, ngoài ra, còn các aldehyde mạch hở khác từ C1 đến C12 (bão hòa hoặc không bão hòa)

và các aldehyde thơm [25]

Các aldehyde được sinh ra trong quá trình lên men, bay hơi trước ethanol và nằm trong dịch cất đầu của quá trình chưng cất Sự có mặt của aldehyde trong rượu sẽ làm tăng độc tính cho sản phẩm Khi vào cơ thể, aldehyde có khả năng gắn kết với các protein

và DNA của tế bào gan gây tổn thương Acetaldehyde cùng các cytokine và các gốc tự

do kích thích quá trình hoạt hóa các tế bào ở trạng thái không hoạt động Các tế bào này

sẽ biệt hóa thành các nguyên bào sợi cơ có khả năng sản xuất một lượng lớn collagen, proteoglycan và các glycoprotein như fibronectin và laminin lắng đọng bên ngoài tế bào làm tăng quá trình tạo xơ và dẫn tới xơ gan [18, 26]

Aldehyde là tạp chất luôn có mặt trong các sản phẩm rượu và có thể điều chỉnh được trong quá trình chế biến [26] TCVN 7043:2013 cho phép tự công bố hàm lượng aldehyde trong rượu trắng chưng cất [2]

1.3.2.4 Keton

Keton hay alkanone là những hợp chất hữu cơ có cấu trúc RC(=O)R’, với R và R’ là những nhóm thế chứa cacbon có thể giống hoặc khác nhau [14] Keton trong rượu chưng cất gồm các monoketon và diketon mạch hở từ C3 đến C14, đa số là acetone

Ngoài ra, còn có các keton khác như butaone, 2-pentanone, 3-penten-2-one,

(E)-6-nonen-2-one, diacetyl, 2,3-pentanedione… [25]

Các keton được hình thành chủ yếu do sự oxy hóa các alcohol bậc hai được sinh

ra trong quá trình lên men [26] Sự tạo thành keton làm giảm một số độc tính cho rượu gây nên bởi các alcohol tương ứng [26] TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng keton trong rượu chưng cất [2]

1.3.3 Alcohol

1.3.3.1 Methanol

Methanol là alcohol đơn giản nhất có công thức CH3OH [14] Trong rượu chưng cất, methanol có nguồn gốc từ sự phân giải các đại phân tử trong quá trình lên men như hemicelllulose, pectin, lignin và xylan Chủ yếu là sự phân giải pectin bởi pectin

methylestease [21]

Methanol là một chất được sinh ra trong quá trình lên men, bản thân methanol ít độc nhưng các chất chuyển hóa của nó lại rất độc Khi vào cơ thể, methanol được chuyển

hóa bởi ADH tạo ra formaldehyde (độc gấp 33 lần methanol) gây ra các triệu chứng lâm sàng Formaldehyde sau đó nhanh chóng chuyển hóa thành formic acid (độc gấp 6 lần methanol) bởi formaldehyde dehydrogenase, ức chế cytochrome oxidase trong thần kinh thị giác làm xáo trộn dẫn truyền sợi trục Ngoài ra, formic acid còn liên quan đến mức

độ toan máu và mức độ gia tăng khoảng trống anion Cuối cùng, formic acid được chuyển hóa thành CO2 và nước Methanol ảnh hưởng chủ yếu lên hệ thần kinh trung ương với các triệu chứng say rượu, ngủ gà, sững sờ, co giật hay hôn mê [18, 21]

Hình 3: Quá trình chuyển hóa methanol trong cơ thể

Hàm lượng methanol vượt quá chỉ tiêu cho phép có thể dẫn đến ngộ độc cho người

sử dụng [18] TCVN 7043:2013 quy định hàm lượng methanol có trong 1 L ethanol 100º không lớn hơn 2000 mg [2]

1.3.3.2 Alcohol bậc cao

Alcohol bậc cao là những alcohol từ C3 trở lên lẫn trong thức uống có cồn [26] Rượu bậc cao trong rượu chưng cất thường là 1-propanol, 2-methylpropanol, 2-methylbutanol, 3-methylbutanol và phenethyl alcohol được sinh ra trong quá trình lên men bởi các phản ứng sinh hóa biến đổi cacbohydrate và các amino acid [25]

Khi vào cơ thể, rượu bậc cao được chuyển hóa bởi ADH tạo thành các aldehyde

và keton tương ứng, độc tính (dựa trên giá trị LD50) tùy thuộc vào chất chuyển hóa Chất chuyển hóa của isobutanol là 2-methyl propanal có giá trị LD50 nhỏ hơn (độ độc cao hơn) nên hàm lượng rượu bậc cao được tính theo isobutanol [27]

TCVN 7043:2013 không quy định hàm lượng rượu bậc cao, tính theo metyl-2 propanol-1, mg/l ethanol 100o trong rượu trắng chưng cất [2]

1.3.4 Furfural

Furfural là hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, lõi ngô, vỏ trấu, thân lau sậy, mùn cưa, Furfural là một aldehyde dị vòng thơm, ở trạng

thái lỏng dạng dầu, không màu, có mùi hạnh nhân Furfural trong rượu được tạo ra từ quá trình dehydrate các pentose, chủ yếu là xylose khi lên men (xylose là sản phẩm phân hủy của hemicellulose, xylan,…và là sản phẩm chuyển hóa của glucose qua nhiều bước) [15]

Nhiệt độ sôi của furfural là 161,7ºC, cao gấp đôi ethanol nên furfural ít gặp trong rượu chưng cất Sự hiện diện của furfural trong rượu chưng cất có thể do dịch lên men

có hàm lượng furfural cao, quá trình chưng cất diễn ra dài, nhiệt độ chưng cất cao,… [34]

1.4 Sơ lược về sắc ký khí

1.4.1 Khái niệm

Sắc ký khí là kỹ thuật tách các chất dựa vào sự phân bố các chát giữa hai pha, pha động là chất khí và thường là khí trơ, pha tĩnh có thể là chất rắn (sắc ký khí rắn) hoặc chất lỏng (sắc ký khí lỏng) Thực chất trong sắc ký khí, pha động chỉ đóng vai trò làm chức năng vận chuyển chứ không tương tác với pha tĩnh [17, 24]

Hình 4: Sơ đồ hoạt động máy sắc ký khí Mẫu được bơm vào buồng pha động theo dòng khí mang đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu khi đi qua cột này sẽ được hấp phụ lên pha tĩnh Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài và được ghi nhận bởi đầu dò Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ Các chất được xác định nhờ giá

trị thời gian lưu trên sắc ký đồ Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản như sau [17, 23]:

- Nguồn cung cấp khí mang: bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ, phải đảm bảo yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với từng loại detector Một số loại khí mang thường dùng là heli, nitơ, hydro, argon,… Đi kèm với bình cấp khí mang còn có van giảm áp, đồng hồ kiểm tra lưu lượng khí

- Buồng tiêm mẫu: mẫu phân tích được tiêm nhanh vào dòng pha động với một hàm lượng vừa đủ bằng kỹ thuật bơm tay hoặc bơm tự động Mẫu được tiêm qua đệm silicon chịu nhiệt vào buồng hóa hơi, buồng này được đốt nóng tới nhiệt độ thích hợp và nối với cột tách Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau Trong sắc ký mao quản, lượng mẫu rất ít (cỡ nanogram) và lưu lượng dòng khí cũng rất nhỏ (0,5-5 ml/phút) nên mẫu

có thể được đưa vào cột theo các hình thức:

- Kỹ thuật tiêm chia dòng (split)

- Kỹ thuật tiêm không chia dòng (splitness)

- Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on-column)

- Cột và lò cột: chương trình nhiệt độ cột của sắc ký khí là thông số rất quan trọng cần kiểm soát chính xác và lò cột đảm nhiệm nhiệm cụ này Trong sắc ký khí có hai loại cột là cột nhồi và cột mao quản Ngày nay do nhiều ưu điểm nên cột mao quản thường được sử dụng phổ biến

- Đầu dò: dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phân tích

Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích như đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID), đầu dò dẫn nhiệt (TCD), đầu dò cộng kết điện tử (ECD), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD), đầu dò Nitro- photpho (NPD), đầu dò khối phổ

- Bộ phận ghi nhận tín hiệu: ghi nhận tín hiệu do đầu dò phát hiện

* Các loại pha tĩnh trong sắc ký khí: trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong việc tách các chất khỏi nhau Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích mà chọn pha tĩnh thích hợp Các loại pha tĩnh có thể được xếp vào 4 nhóm chính dựa vào tính

phân cực của nó, bao gồm: nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm phân cực trung bình và nhóm phân cực cao [17, 30]

1.4.2 Ứng dụng của sắc ký khí

1.4.2.1 Phân tích định tính

Phương pháp định tính các chất được tách ra bằng sắc ký khí có thể thực hiện theo

3 cách sau [1]:

- So sánh tR của chất phân tích với tR củachất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký

- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu

- Kết nối máy sắc ký khí với máy quang phổ IR hoặc khối phổ

1.4.2.2 Phân tích định lượng

Phân tích định lượng các hợp chất dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của nó [6]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số mẫu rượu nếp chưng cất tại huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

Bảng 1: Các mẫu rượu được khảo sát

Ký hiệu mẫu

MR 1 Nguyễn Thị C, xã Chất Bình, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 2 Tạ Lan T, trị trấn Phát Diệm, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 3 Đoàn Văn Q, chợ Kim Sơn, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 4 Lê Thị V, xã Cách Tâm, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 5 Lê Văn S, thị trấn Phát Diệm, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 6 Trần Quân L, xã Kim Định, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 7 Trần Lê B, xã Ân Hòa, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 8 Vũ Văn T, xã Hùng Tiến, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 9 Phạm Văn L, xã Cồn Thoi, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 10 Lê Anh V, xã Kim Trung, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 11 Trần Văn H, xã Chất Bình, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

MR 12 Vũ Thị T, xã Kim Đông, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình

2.2 Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký khí Agilent được trang bị detector ion hóa ngọn lửa (nguồn gốc: Mỹ)

- Cột sắc ký Supelcowax TM 10

- Khí heli tinh khiết 99,999%

- Cân phân thích AW 220 (SHIMAZU)

- Cồn kế

- Nhiệt kế

- Một số dụng cụ thủy tinh thông thường: buret, pipet, bình định mức,…

Tất cả các hóa chất đều thuộc hóa chất tinh khiết phân tích

2.3 Một số phương pháp xác định hàm lượng ethanol, methanol và aldehyde trong rượu chưng cất

2.3.1 Xác định hàm lượng ethanol

2.3.1.1 Phương pháp đo tỷ trọng

Dựa trên nguyên lý tỷ trọng của dung dịch ethanol trong nước càng thấp khi hàm

lượng ethanol trong nước càng cao, do đó đo tỉ trọng dung dịch sẽ suy ra được hàm lượng ethanol [3]

2.3.1.2 Phương pháp sử dụng cồn kế

Về bản chất đây là phương pháp đo tỉ trọng, độ chìm của cồn kế trong dung dịch

sẽ cho biết hàm lượng ethanol [3]

2.3.2 Xác định hàm lượng methanol

2.3.2.1 Phương pháp sắc ký khí

Hàm lượng methanol trong rượu xác định theo phương pháp sắc ký khí sử dụng chuẩn nội n-butanol: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của n-butanol tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Từ dữ kiện về chiều cao (hoặc diện tích) pic và nồng độ của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng methanol trong mẫu rượu [5, 6]

2.3.2.2 Phương pháp so màu

Nguyên tắc

Oxy hóa methanol trong rượu thử bằng KMnO4 trong môi trường acid H2SO4 tạo

ra formaldehyde [19]:

5CH3OH + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 5HCHO + 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O

Cho phần mẫu thử tác dụng với thuốc thử fucsin sulfit sau khi đã oxi hóa methanol thành aldehyd focmic So màu của dung dịch thu được với màu của dung dịch chuẩn [5]

2.3.3.2 Phương pháp so màu

Nguyên tắc

Lượng nhỏ aldehyde được định lượng theo phương pháp so màu dựa trên phản ứng của aldehyde với fucshin và NaHSO3 tạo ra hợp chất màu hồng [12] Cho thuốc thử fuchsine–bazơ tác dụng với rượu thử và rượu có hàm lượng aldehyde đúng tiêu chuẩn, màu của dung dịch rượu thử không được đậm hơn màu của dung dịch aldehyde tiêu

chuẩn [4]

Hình 5: Phản ứng màu giữa aldehyde và thuốc thử fuchine-sulfite

Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ của các mẫu rượu cần phân tích và pha dãy các dung dịch acetaldehyde chuẩn có dải nồng độ bao trùm nồng độ của các mẫu