Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên

Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Việt Thùy xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên” công trình nghiên cứu sáng tạo thực dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Lan Hƣơng Số liệu, kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực chƣa công bố công trình khoa học khác Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên LỜI CẢM ƠN Tôi Nguyễn Việt Thùy xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS.Nguyễn Lan Hƣơng – Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội hƣớng dẫn bảo tận tình suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, cán phòng thí nghiệm công nghệ sinh học C10 giúp đỡ dạy bảo thời gian làm việc phòng thí nghiệm Bên cạnh ngƣời thân bạn bè động lực, nguồn động viên đặc biệt anh chị bạn làm việc Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học C10 giúp đỡ nhiều suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Chân thành! Nguyễn Việt Thùy Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên MỤC LỤC CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu ngành sản xuất cao su thiên nhiên .2 1.1.1 Cây cao su 1.1.2 Mủ cao su .2 1.1.3 Tình hình sản xuất cao su giới Việt Nam 1.1.4 Công nghệ sơ chế mủ cao su thiên nhiên 1.2 Vi sinh vật có khả phân hủy mủ cao su thiên nhiên 1.2.1 Sự phân hủy cao su vi khuẩn xạ khuẩn 1.2.2 Sự phân hủy cao su nấm 10 1.2.3 Sự phân hủy cao su tập hợp vi sinh vật 11 1.3 Con đƣờng phân hủy sinh học cao su thiên nhiên 11 1.4 Các phƣơng pháp đánh giá khả phân hủy cao su vi sinh vật 12 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Nguồn vi sinh vật .17 2.1.2 Vật liệu thử khả phân hủy cao su vi sinh vật 17 2.1.3 Thiết bị .17 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 18 2.1.5 Hóa chất .19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu .20 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 21 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên 3.1 Lựa chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy cao su 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái chủng 26 3.1.2 Bƣớc đầu đánh giá KNPH cao su giảm khối lƣợng 28 3.1.3 Đánh giá khả phân hủy cao su tổng hợp GPC 30 3.2 Nghiên cứu điều kiện sinh trƣởng chủng lựa chọn .31 3.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 31 3.2.2 Ảnh hƣởng pH ban đầu .33 3.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ .35 3.2.4 Ảnh hƣởng nồng độ giống 38 3.3 Khảo sát khả phân hủy cao su hỗn hợp chủng lựa chọn 41 3.3.1 Sự giảm khối lƣợng điều kiện tĩnh 41 3.3.2 Sự giảm khối lƣợng miếng cao su nuôi lắc 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 51 Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Danh mục chữ viết tắt KNPH Khả phân hủy GPC Sắc ký lọc gel SEM Kính hiển vi điện tử quét DRC Hàm lƣợng cao su khô mủ Cộng hƣởng từ hạt nhân HNMR TLC Sắc ký mỏng HPLC Sắc lý lỏng cao áp HPLC-MS Sắc ký lỏng cao áp- khối phổ MSM Môi trƣờng muối khoáng LB Luria – Bertani Broth PAB Penassay broth for bacillus species NGS Kỹ thuật giải trình tự gen hệ Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Danh mục bảng Bảng 1.1 Thành phần hóa học mủ nƣớc Bảng 2.1 Môi trƣờng muối khoáng MSM 18 Bảng 2.2 Môi trƣờng hoạt hóa LB 18 Bảng 2.3 Môi trƣờng hoạt hóa PAB 19 Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu làm giàu 26 Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Danh mục hình Hình 1.1 Cấu tạo cao su thiên nhiên Hình 1.2 Thị phần sản xuất cao su thiên nhiên Hình 1.3 Sản lƣợng cao su toàn cầu hàng năm Hình 1.4 Sản lƣợng suất cao su thiên nhiên Việt Nam Hình 1.5 Quy trình công nghệ sơ chế mủ cao su thiên nhiên Hình 1.6 Con đƣờng phân hủy mủ cao su 11 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 20 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc, tế bào khả bắt màu thuốc nhuộm schiff chủng E2 H2DA3 27 Hình 3.2 Sự biến đổi mẫu Enrichment theo thời gian 28 Hình 3.3 Khảo sát giảm khối lƣợng miếng cao su chủng đơn mẫu làm giàu 29 Hình 3.4 Kết chạy GPC nuôi cấy chủng E2 môi trƣờng MSM với nguồn cacbon cao su tổng hợp sau 35 ngày 30 Hình 3.5 Kết chạy GPC nuôi cấy chủng H2DA3 môi trƣờng MSM với nguồn cacbon cao su tổng hợp sau 15, 20, 30 ngày 30 Hình 3.6 Sự phát triển chủng E1 môi trƣờng nuôi cấy 32 Hình 3.7 Sự phát triển chủng E2 môi trƣờng nuôi cấy 32 Hình 3.8 Sự phát triển chủng H2DA3 môi trƣờng nuôi cấy 33 Hình 3.9 Ảnh hƣởng pH ban đầu đến phát triển chủng E1 34 Hình 3.10 Ảnh hƣởng pH ban đầu đến phát triển chủng E2 34 Hình 3.11 Ảnh hƣởng pH ban đầu đến phát triển chủng H2DA3 35 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E1 36 Hình 3.13 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E2 37 Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Hình 3.14 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng H2DA3 38 Hình 3.15 Ảnh hƣởng nồng độ giống tới phát triển chủng E1 39 Hình 3.16 Ảnh hƣởng nồng độ giống tới phát triển chủng E2 40 Hình 3.17 Ảnh hƣởng nồng độ giống tới phát triển chủng H2DA3 40 Hình 3.18 Khảo sát giảm khối lƣợng miếng cao su tập hợp chủng lựa chọn mẫu làm giàu 42 Hình 3.19 Khả phân hủy cao su màng theo thời gian tập hợp chủng 43 Hình 3.20 Hình ảnh miếng cao su sau thời gian bị phân hủy tập hợp chủng 43 Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên MỞ ĐẦU Cây cao su công nghiệp quan trọng đóng góp tỷ trọng không nhỏ kinh tế Việt Nam Theo báo cáo hiệp hội chế biến cao su Việt Nam năm 2014 vừa qua Việt Nam vƣơn lên trở thành nƣớc sản xuất cao su thiên nhiên đứng thứ giới sau Thái Lan Indonesia [3] Bên cạnh triển vọng phát triển ngành chế biến cao su thiên nhiên gặp phải khó khăn việc tải hệ thống xử lý chất thải rắn, nƣớc thải Tại nhà máy sơ chế cao su thiên nhiên hàng ngày thải lƣợng nƣớc thải lớn với nồng độ chất hữu dễ bị phân hủy cao nhƣ acid acetic, đƣờng, protein, …hàm lƣợng COD, BOD cao Mặt khác nƣớc thải cao su có chứa hạt cao su lơ lửng dẫn đến tắc đƣờng ống làm hệ thống xử lý hiệu Chính nƣớc thải vào hệ thống xử lý thƣờng phải tách hạt cao su phƣơng pháp tuyển Phần hạt cao su thải đƣợc đƣa tái chế xử lý Một hƣớng xử lý đƣợc hƣớng đến thời điểm xử lý sinh học bên cạnh cách xử lý thông thƣờng chôn lấp đốt Hiện có nghiên cứu giới việc sử dụng vi sinh vật để phân hủy cao su thiên nhiên Tuy nhiên việc nghiên cứu dừng lại phân lập vi sinh vật có khả phân hủy cao su, định tên vi sinh vật, nghiên cứu gen liên quan đến đƣờng phân hủy cao su thiên nhiên Trong tự nhiên sử dụng chủng vi sinh vật đơn lẻ để phân hủy cao su hiệu việc sử dụng tập hợp đƣờng thúc đẩy trình phân hủy diễn nhanh, hiệu cao Chính lý tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên” Trong đề tài này, vấn đề cần giải bao gồm: Lựa chọn chủng có khả phân hủy cao su Nghiên cứu điều kiện sinh trƣởng chủng lựa chọn Đánh giá khả phân hủy mủ cao su tập hợp lựa chọn Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu ngành sản xuất cao su thiên nhiên 1.1.1 Cây cao su Cây cao su (Hevea brasiliensis), có nguồn gốc từ lƣu vực sông Amazon (Nam Mỹ), đƣợc du nhập thành công vào Việt Nam từ năm 1897 Trải qua kỷ định hình phát triển, đến đầu năm 2012 tổng diện tích cao su nƣớc đạt khoảng 830.000 ha, trải dài từ Đông Nam Bộ lên Tây Nguyên xuống Duyên Hải miền Trung vƣơn tới vùng miền núi phía Bắc [4] Cây cao su cao 30m Nhựa mủ màu trắng hay vàng có mạch nhựa mủ vỏ Các mạch tạo thành xoắn ốc theo thân theo hƣớng tay phải, tạo thành góc khoảng 30 độ với mặt phẳng Khi đạt độ tuổi 5-6 năm ngƣời ta bắt đầu thu hoạch nhựa mủ Các vết rạch vuông góc với mạch nhựa mủ, độ sâu vừa phải cho làm nhựa mủ chảy mà không gây tổn hại cho phát triển cây, nhựa mủ đƣợc thu thập thùng nhỏ Quá trình gọi cạo mủ cao su Các già cho nhiều nhựa mủ hơn, nhƣng chúng ngừng sản xuất nhựa mủ đạt độ tuổi 26-30 năm [2] 1.1.2 Mủ cao su Mủ cao su (latex) mủ chảy từ có màu trắng đục hay vàng Nó huyền phù thể keo gồm hạt cao su nhỏ lơ lửng dung dịch mà phần lớn nƣớc Các hạt cao su có dạng hình cầu Về cấu trúc latex gồm hai phần bản: phần lỏng phần rắn Phần lỏng chủ yếu nƣớc số hóa chất hòa tan nƣớc gọi serum Phần rắn bao gồm hạt cao su nguyên chất, chất không tan nƣớc cấu thành hạt huyền phù lơ lửng serum Các hạt huyền phù đƣợc cấu tạo gồm lớp: lớp bên gồm cao su nguyên chất, lớp bên gồm protein, lipid,… làm cho hạt không dính vào lơ lửng serum Khi lớp bị phá hủy gây nên tƣợng đông tụ Tỷ trọng mủ nƣớc khoảng 0,8 – 0,975 g/ml Tỷ trọng cao su 0,914 g/ml, tỷ trọng serum 1,02 g/ml [2] Nguyễn Việt Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên 3.3.2 Sự giảm khối lƣợng miếng cao su nuôi lắc Tập hợp E1+H2DA3; E2+H2DA3 Enrichment tiến hành khảo sát giảm khối lƣợng miếng cao su điều kiện nuôi lắc với định kỳ 15 ngày xác định giảm khối lƣợng lần, sau 105 ngày cho kết nhƣ sau: Hình 3.19 Khả phân hủy cao su màng theo thời gian tập hợp chủng Hình ảnh miếng cao su thay đổi sau thời gian nuôi cấy đƣợc thể nhƣ hình dƣới đây: KC 15 ngày Enrichment 15 ngày E2+H2DA3 15 ngày E1+H2DA3 15 ngày KC 105 ngày Enrichment 105 ngày E2+H2DA3 105 ngày E1+H2DA3 105 ngày Hình 3.20 Hình ảnh miếng cao su sau thời gian bị phân hủy tập hợp chủng Năm 2013 Bùi Thị Trang cộng nghiên cứu phân hủy miếng cao su chủng đơn kết giảm khối lƣợng miếng cao su kích thƣớc 1x1 cm đạt đƣợc lớn 4,28 ±0,32 % sau 30 ngày [27] Trong nghiên cứu chúng Nguyễn Việt Thùy 43 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên giảm khối lƣợng miếng cao su chủng phân lập từ mẫu làm giàu sau 30 ngày đạt đƣợc từ 3,64 ± 0,02 % đến 12,42 ± 0,87% Khi phối hợp tạo thành tập hợp chủng giảm khối lƣợng miếng cao su sau thời gian 30 ngày đạt giá trị thấp 21,96±0,28 % giá trị cao 37,80±0,85% Cho thấy chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu làm giàu phân hủy cao su tốt chủng xạ khuẩn nhƣ công bố Bùi Thị Trang cộng Đồng thời phối hợp thành tập hợp chủng hiệu xử lý cao nhiều lần, rút ngắn đƣợc thời gian xử lý Kết hình 3.19 cho thấy so với điều kiện tĩnh khảo sát với điều kiện nuôi lắc nhiệt độ 370C, tốc độ lắc 170 – 185 vòng giảm khối lƣợng miếng cao su diễn nhanh hơn, phần trăm giảm khối lƣợng miếng cao su nhiều Sau 15 ngày tập hợp chủng E1 + H2DA3 giảm khối lƣợng miếng cao su 18,07±0,44%, Enrichment giảm khối lƣợng miếng cao su 24,58±0,98%, E2 + H2DA3 giảm khối lƣợng miếng cao su 22,14±1,71% Cho thấy 15 ngày đầu tập hợp chủng Enrichment tập hợp chủng E2 + H2DA3 phân hủy miếng cao su nhanh hiệu cao Sau 30 ngày giảm khối lƣợng miếng cao su tƣơng tự nhƣ sau 15 ngày Tuy nhiên sau 45 ngày tập hợp E2 + H2DA3 có khả phân hủy miếng cao su tốt tập hợp lại, thể giảm khối lƣợng miếng cao su 43,39±1,84% Tiếp tục theo dõi kết sau 60 ngày tập hợp E2 + H2DA3 Enrichment có phát triển trội tập hợp chủng E1 + H2DA3 Sau 105 ngày hiệu xử lý miếng cao su tập hợp Enrichment E2 + H2DA3 tiếp tục tăng với chủng E1 + H2DA3 có chuyển biến không đáng kể với giảm khối lƣợng lần lƣợt E1 + H2DA3 (66,38±0,69%), Enrichment (72,39±0,40%), E2 + H2DA3 (72,18±0,64%) Tính từ ngày thứ 15 đến ngày thứ 30 giảm khối lƣợng miếng cao su tập hợp Enrichment E2 + H2DA3 đạt 13% E1 + H2DA3 giảm đƣợc gần 4% Trong 15 ngày từ ngày thứ 30 đến ngày thứ 45 tập hợp E1 + H2DA3 giảm khối lƣợng miếng cao su đƣợc 19,43% tập hợp lại giảm đƣợc 3,76% với Enrichment 7,86% với E2 + H2DA3 Từ ngày thứ Nguyễn Việt Thùy 44 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên 31 đến ngày thứ 45 tập hợp E2 + H2DA3 có giảm khối lƣợng miếng cao su 18,11% tập hợp lại giảm khối lƣợng từ 8-14% Sự biến động diễn thời điểm khảo sát kế tiếp, nhiên nhận thấy tập hợp Enrichment E2 + H2DA3 có ƣu trình khảo sát Nguyễn Việt Thùy 45 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã lựa chọn chủng E1, E2, H2DA3 mẫu Enrichment có khả phân hủy cao su tốt Đã khảo sát đƣợc điều kiện sinh trƣởng chủng lựa chọn - Chủng E1 phát triển tạo sinh khối lớn môi trƣờng LB, pH = - 8, nhiệt độ 30 - 420C, nồng độ giống bổ sung ban đầu - 8% - Chủng E2 phát triển tạo sinh khối lớn môi trƣờng LB, pH = - 8, nhiệt độ 30 - 420C, nồng độ giống bổ sung ban đầu - 6% - Chủng H2DA3 phát triển tạo sinh khối lớn môi trƣờng PAB, pH = 7, nhiệt độ 370C, nồng độ giống bổ sung ban đầu 8% Đã lựa chọn tập hợp E2+H2DA3 tập hợp có khả phân hủy cao su tốt tập hợp nghiên cứu Kiến nghị: Tiếp tục phân lập chủng có khả phân hủy cao su tốt Cần có thử nghiệm phân hủy cao su tập hợp quy mô lớn hơn, thời gian dài Nguyễn Việt Thùy 46 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên TÀI LIỆU THAM KHẢO Ngô Phú Trù (1995) Kỹ thuật gia công chế biến cao su Nguyễn Hữu Trí (2008) Công nghệ cao su thiên nhiên Sacombank - SBS (11/2014), Báo cáo cập nhật ngành cao su thiên nhiên Quy trình kỹ thuật cao su (11/2012), Tập đoàn cao su Việt Nam Đào Việt Linh (2013) Luận văn thạc sĩ, Nagaoka university of Technology Arenskotter M., Baumeister D., Berakaa M.M., Potter G., Kroppenstedt R M., Linos A., and Steinbuchel A (2001), "Taxonomic characterization of two rubber degrading bacteria belong to the spoeces Gordonia polyisoprenivorants and analysis of hapervariable regions of 16S rDNA sequence", FEMS Microbiol.Lett, 205, p 277-282 Arenskotter.M, Broker.D, and Steinbuchel.A (2004), "Biology of metabolically diverse genus Gordonia", A E.Microbiol, (70), p 31953204 Bode H.B., Kerkhoff K., and Jendrossek (2001), "Bacterial degradation of natural and synthetic rubber", Biomacromolecules 2, p 295-303 Bode HB., Zeeck, Pluckhahn K., and Jendrossek K (2000), "Physiological and chemical investtigation into microbial degradation of synthetic poly(cis-1,4-isoprene)", A E Microbiol, (66), p 3680-3685 10 Borel M., Kergomard A., and Renard M.F (1982), "Degradation of natural rubber by fungi imperfecti", Agric.Biol.Chem, 46, p 877-881 11 Braaz R., Armbruster W., and Jendrossek D (2005), "Heme-dependent rubber oxygenase RoxA of Xanthomonas sp cleaves the carbon backbone of poly(cis-1,4-isoprene) by a dioxygenase mechanism", A E Microbiol, (71), p 2473-2478 12 Braaz R., Fischer P., and Jendrossek D (2004), "Novel type of hemedependent oxygenase catalyzes oxidative cleavage of rubber (poly-cis-1,4isoprene)", A E Microbiol, (70), p 7388-7395 Nguyễn Việt Thùy 47 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên 13 Broker D., Arenskotter M., Legatzki A., Nies DH., and Steinbuchel A (2004), "Characterization of the 101-kilobase-pair megaplasmid pKB1, isolated from the rubber - degrading bacterium Gordonia westfalica Kb1.", J.Bacteriol, (186), p 212-225 14 Broker D., Dietz D., Arenskotter M., and Steinbuchel A (2008), "The genomes of the non-clearing- zone- forming and natural rubber degrading species Godornia polyisopreneivorans and Gordonia westfalica harbor genes expressing Lcp activity in Streptomyces strains", A E Microbiol, (74), p 2288-2297 15 Bui Thi Trang, Dao Viet Linh, Nguyen Lan Huong, To Kim Anh, Phan Trung Nghia, and Fukuda Masao (2013), “Screening of Natural Rubber – Degrading Microorganisms from Rubber Processing Factory Waste in Vietnam”, International Journal of Waste Resources, 3, p – 12 16 Claudia Gallert (2000), "Degradation of latex and of natural rubber by Streptomyces strain La 7", Syst Appl Microbiol, 23, p 433-441 17 Ibrahim E.M., Arenskotter M., Lufmann H., and Steinbuchel A (2006), "Identification of poly (cis-1,4-isoprene) degradation intermediates during growth of moderately thermophilic actinomycetes on rubber and cloning of a functional lcp homologue from Nocardia farcinia strains E1", A E Microbiol, (72), p 3375-3382 18 Imai Shunsuke, Ichikawa Kazuya, Muramatsu Yuki, Kasai Daisuke, Masai Eiji, and Fukuda Masao (2011), "Isolation and characterization of Streptomyces, Actinoplanes, and Methylibium strains that are involved in degradation of natural rubber and synthetic poly(cis-1,4-isoprene)", Enzyme and Microbial Technology, 49, p 82751-82756 19 Jendrossek D and Reinhardt S (2003), "Sequence analysis of a gene product synthesized by Xanthomonas sp during growth on natural rubber latex", FEMS Microbiol Lett, (224), p 61-65 Nguyễn Việt Thùy 48 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên 20 Jendrossek D., Tomasi G., and Kroppenstedt R.M (1997), "Bacterial degradation of natural rubber: a privilege of actinomycetes?", FEMS Microbiol lett, (150), p 179-188 21 Kwiatkowska D., Zyska B.J., and Zankowicz L.P (1980), " Microbial deterioration of natural rubber sheets by soil microorganisms.", Biodeterioration, 4, p 135-141 22 Linos A., Berekaa M., Steinbuchel A., Kim K K., Sproer C., and Kroppenstedt R M (2002), "Gordonia westfalica sp nov., a novel rubberdegrading actinomycete", Int J Syst Evol Microbiol, 52,(Pt 4), p 1133-9 23 Linos A., Berekaa M.M, Reichelt R., Keller U., Schmitt J., Flemming H.C., and et al (2000), "Biodegradation of poly (cis-1,4-polyisoprene) rubbers by distinct actinomycetes: microbial strategies and detailed surface amlysis", A.E Microbiol, (66), p 1639-1645 24 Linos A., Reichelt R., Keller.U, and Steinbuchel A (2000), "A Grambegative bacterium, identified as Pseudomonas aeruginosa AL98, is a potent degrader ò natural rubber and synthetic cis-1,4- polyisoprene" FEMS Microbiol Lett (182), p 155-161 25 Rose K and Steinbuchel K (2002), "Construction and intergeneric conjugative transfer of a pSG5-based cosmid vector from Escheriachia coli to the polyisoprene rubber degrading strain Micromonospora aurantiaca W2b" FEMS Microbiol Lett, (211), p 129-132 26 Rose K., Tenberge K.B., and Steinbuchel A (2005), "Identification and characterization of genes from Streptomyces sp strain K30 reponsible for clear zone formation on natural rubber latex and poly (cis-1,4-isoprene) rubber degradation",Biomacro molecules, (6), p 180-188 27 Sirimaporn Watcharakul, Kamontam Umsakul, Brian Hodgson, Wannapa Chumeka, and Varaporn Tanrattanakul (2012), "Biodegradation of a blended starch/natural rubber foam biopolymer and rubber gloves by Nguyễn Việt Thùy 49 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Streptomyces coelicolor CH13", Electronic Journal of Biotechnology 15, p 0717-3458 28 Spence D and Van Niel C.B (1936), " Bacteriol decomposition of the rubber in Hevea latex", Ind.Eng.Chem, 28, p 847-850 29 Tsuchii A., Kiyoshi Takeda, Tomoo Suzuki, and Yutaka Tokiwa (1996), "Colonization and degradation of rubber pieces by Nocardia sp", Biodegradation, 7, p 41-48 30 Tsuchii A and Takeda K (1990), "Rubber- degrading enzyme from a bacterial culture", A E Microbiol, (56), p 269-274 31 Tsuchii A., Suzuki T., and Takeda K (1985), "Microbial degradation of natural rubber vulcanizates", A E Microbiol, (50), p 965-970 32 Warneke S., Arenskötter M., Tenberge K.B., and Steinbüchel A (2007), "Bacterial degradation of poly(trans-1,4-isoprene) (gutta percha)", Microbiology, 153, p 347-356 33 Williams G.R (1982), " The Breakdown of rubber polymers by microorganisms.", Int.Biodeterior.Bull., 18, p 31-36 34 Yikmis M., Arenskotter M., Rose K., Lange N., Wernsman H., Wiefel L., and et al (2008), "Secretion and transcriptional regulation of the latexclear protein, Lcp, by the rubber degrading bacterium Streptomyces sp strain K30", A E.Microbiol, (74), p 5373-5382 Nguyễn Việt Thùy 50 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh miếng cao su màng Phụ lục Hình ảnh cao su thải Phụ lục Sự giảm khối lượng miếng cao su chủng đơn mẫu làm giàu Chủng % giảm khối lƣợng 15 ngày % giảm khối lƣợng 30 ngày E1 5,40±0,00 7,68±0,44 E2 8,07±0,00 11,29±0,12 E3 2,31±0,01 3,64±0,02 E4 6,80±0,03 7,04±0,26 H2DA1 2,19±0,00 6,48±0,46 H2DA3 7,96±0,00 12,42±0,87 Enrichment 6,91±0,00 8,51±0,00 Kiểm chứng 1,73±0,00 1,95±0,35 Nguyễn Việt Thùy 51 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Phụ lục Bảng ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phát triển chủng E1 Thời gian (h) Môi trƣờng PAB LB 12 24 36 48 0,32±0,13 0,58±0,05 2,13±0,38 2,66±0,18 2,45±0,45 3,90±0,30 2,04±0,42 4,20±0,43 1,91±0,46 3,01±0,35 Phụ lục Bảng ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phát triển chủng E2 Thời gian (h) Môi trƣờng PAB LB 0,44±0,08 0,39±0,05 12 24 36 2,14±0,23 3,13±0,23 1,37±0,11 3,99±0,29 48 3,83±0,12 3,93±0,16 60 3,56±0,27 3,21±0,18 3,79±0,17 Phụ lục Bảng ảnh hưởng pH ban đầu đến phát triển chủng E1 pH Thời gian (h) 12 24 36 0,46±0,05 0,62±0,09 0,80±0,04 0,33±0,02 0,45±0,08 0,60±0,07 2,30±0,18 1,89±0,07 0,44±0,09 2,64±0,13 4,08±0,18 3,33±0,31 0,45±0,07 2,56±0,17 3,24±0,24 2,99±0,36 0,49±0,02 2,31±0,17 3,07±0,18 2,88±0,26 Phụ lục Bảng ảnh hưởng pH ban đầu đến phát triển chủng E2 pH Thời gian 12 24 36 Nguyễn Việt Thùy 0,47±0,05 0,68±0,08 0,81±0,04 0,65±0,07 0,46±0,06 1,01±0,01 2,35±0,09 2,09±0,06 52 0,45±0,09 1,93±0,15 4,39±0,13 3,37±0,23 0,47±0,06 3,03±0,19 3,64±0,10 3,42±0,21 0,46±0,08 1,80±0,13 2,95±0,13 2,78±0,21 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Phụ lục Bảng ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E1 Nhiệt độ Thời gian (h) 12 24 36 20 30 37 42 50 0,44±0,09 0,62±0,13 0,78±0,14 1,27±0,26 0,47±0,05 4,45±0,30 3,84±0,16 3,13±0,20 0,45±0,08 2,51±0,31 3,79±0,05 3,31±0,34 0,47±0,04 3,42±0,24 3,09±0,17 2,91±0,20 0,41±0,14 0,28±0,08 0,19±0,03 0,16±0,09 Phụ lục Bảng ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến phát triển chủng E2 Nhiệt độ Thời gian 12 24 36 20 30 37 42 50 0,49±0,028 0,88±0,08 1,39±0,08 1,90±0,05 0,48±0,06 4,61±0,21 3,97±0,20 3,35±0,15 0,45±0,09 1,96±0,12 3,91±0,24 3,42±0,18 0,51±0,01 3,79±0,03 3,05±0,01 3,02±0,03 0,50±0,01 0,81±0,03 0,27±0,05 0,20±0,01 Phụ lục 10 Bảng ảnh hưởng nồng độ giống ban đầu đến phát triển chủng E1 Thời gian Nđộ giống (%) 10 Nguyễn Việt Thùy 0h 0,14±0,01 0,20±0,01 0,38±0,01 0,41±0,01 0,44±0,02 0,56±0,03 0,72±0,01 0,83±0,01 12h 1,71±0,07 2,03±0,03 2,24±0,05 2,33±0,06 4,19±0,09 4,71±0,07 4,05±0,09 3,83±0,13 53 24h 2,85±0,06 2,96±0,06 3,01±0,01 3,09±0,07 3,71±0,03 3,75±0,01 3,52±0,03 3,52±0,20 36h 2,84±0,15 2,74±0,26 2,50±0,14 2,57±0,30 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Phụ lục 11 Bảng ảnh hưởng nồng độ giống ban đầu đến phát triển chủng E2 Nđộ giống (%) Thời gian 12 0h 0,15±0,01 0,26±0,01 0,38±0,01 0,44±0,01 0,49±0,01 0,53±0,01 0,62±0,02 0,77±0,01 6h 0,35±0,06 0,80±0,04 1,02±0,01 1,39±0,08 1,11±0,02 1,46±0,04 1,79±0,01 1,85±0,03 12h 3,59±0,24 3,19±0,05 4,07±0,18 4,11±0,08 4,28±0,14 4,82±0,04 3,58±0,05 3,48±0,09 24h 3,13±0,06 2,79±0,04 3,61±0,10 4,02±0,06 3,71±0,13 3,65±0,08 3,25±0,18 3,19±0,23 Phụ lục 12 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên phát triển chủng H2DA3 Môi trƣờng Lƣợng sinh khối khô g/l LB/5 0,117±0,012 PAB 0,241±0,010 LB 0,168±0,010 Phụ lục 13 Ảnh hưởng pH ban đầu lên phát triển chủng H2DA3 pH Lƣợng sinh khối khô g/l 0,020±0,014 0,043±0,024 0,100±0,014 0,242±0,005 0,141±0,008 Phụ lục 14 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên phát triển chủng H2DA3 Nhiệt độ Lƣợng sinh khối khô g/l 30 0,126 37 0,249 42 0,012 Phụ lục 15 Ảnh hưởng nồng độ giống ban đầu lên phát triển chủng H2DA3 Nồng độ 1% 3% giống Lƣợng sinh 0,100±0,004 0,102±0,010 khối khô g/l Nguyễn Việt Thùy 5% 0,139±0,010 54 8% 10% 0,251±0,004 0,128±0,037 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Phụ lục 16 Khả phân hủy cao su tập hợp lựa chọn điều kiện tĩnh Chủng % giảm khối lƣợng 15 ngày % giảm khối lƣợng 30 ngày E1 5,40±0,00 7,68±0,44 E2 8,07±0,00 11,29±0,12 H2DA3 7,96±0,00 12,42±0,87 E1+E2 7,08±0,00 11,92±0,51 E1+H2DA3 6,69±0,00 13,33±1,17 H2DA3+E2 7,38±0,00 13,18±1,23 E1+E2+H2DA3 7,33±0,00 11,18±1,21 Enrichment 6,91±0,00 8,51±0,00 Kiểm chứng 1,73±0,00 1,95±0,35 Phụ lục 17 Khả phân hủy cao su tập hợp lựa chọn điều kiện nuôi lắc Chủng E1 + H2DA3 Enrichment E2 + H2DA3 KC 15 ngày 18,07±0,44 24,58±0,98 22,14±1,71 1,04±0,01 30 ngày 21,96±0,28 37,80±0,85 35,54±0,87 1,67±0,02 45 ngày 41,39±1,63 41,56±3,44 43,39±1,84 1,91±0,70 60 ngày 50,38±1,02 55,31±0,44 61,50±1,24 1,70±0,35 90 ngày 65,27±1,20 60,96±0,46 67,26±0,50 1,87±0,47 105 ngày 66,38±0,69 72,39±0,40 72,18±0,64 1,81±0,43 Thời gian Nguyễn Việt Thùy 55 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Phụ lục 18 Hình ảnh miếng cao su sau thời gian bị phân hủy tập hợp vi sinh vật lựa chọn Nguyễn Việt Thùy 56 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Nguyễn Việt Thùy 57 CNSH2012B ... Lựa chọn chủng có khả phân hủy cao su Nghiên cứu điều kiện sinh trƣởng chủng lựa chọn Đánh giá khả phân hủy mủ cao su tập hợp lựa chọn Nguyễn Vi t Thùy CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng. .. ngày gia tăng sinh khối [33] Nguyễn Vi t Thùy 10 CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên 1.2.3 Sự phân hủy cao su tập hợp vi sinh vật Trên giới... CNSH2012B Nghiên cứu lựa chọn tập hợp chủng vi sinh vật phân hủy mủ cao su thiên nhiên Vi sinh vật sinh trƣởng phát triển tốt môi trƣờng nguồn cacbon cao su chứng tỏ vi sinh vật có khả đồng hóa cao su