Nghiên cứu lên men 1,3 propanediol từ glycerol thô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đề tài Nghiên cứu lên men 1,3 propanediol từ glycerol thô Họ tên học viên: Nguyễn Thu Quỳnh Lớp : CNSH 2009 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Hà Nội – Năm 2011 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: Nghiên cứu lên men 1,3 propanediol từ glycerol thô Tác giả luận văn: Nguyễn Thu Quỳnh Khóa: CNSH 2009 Người hướng dẫn: GS Madalena Alves PGS.TS Tô Kim Anh Nội dung tóm tắt: a) Lý chọn đề tài Hai thập niên vừa qua chứng kiến phát triển mạnh mẽ kinh tế giới, lúc phát triển mạnh mẽ dẫn đến nhu cầu sử dụng lượng mạnh mẽ chưa có Việc đảm bảo nguồn lượng dài hạn thay lượng hoá thạch ngày trở nên cấp thiết, dầu mỏ cạn dần trở nên đắt đỏ Hiện biodiesel nguồn nhiên liệu triển vọng, có khả thay hoàn toàn cho nguồn dầu mỏ hóa thạch, 100% biodiesel sử dụng động diesel mà gần không cần phải sửa đổi động cơ, hệ thống nhiên liệu có chút ảnh hưởng đến hiệu suất động Quá trình sản xuất biodiesel trình đơn giản, sử dụng phản ứng hóa học điều kiện nhiệt độ áp suất vừa phải, sản xuất từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật khác Tuy nhiên vấn đề đặt liên quan đến sản xuất biodiesel, glycerol- sản phẩm phụ coi “luồng chất thải” tốn chi phí cho trình xử lý vứt bỏ sản xuất biodiesel Cứ 100 lít biodiesel sản xuất nhờ trình chuyển hóa dầu thực vật hay mỡ động vật sinh 10 lít glycerol thô (10%) Đã có vài chiến lược đưa dựa chuyển hóa hóa học sinh học để biến đổi glycerol thô thành sản phẩm có giá trị Đó lý cho hình thành đề tài b) Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu Mục đích đề tài sử dụng vi sinh vật có bùn hoạt tính từ nước thải nhà máy bia hay hỗn hợp bùn hoạt tính Clostridium pasteurianum, phương pháp lên men gián đoạn lên men liên tục để kiểm tra khả chuyển hóa glycerol thô thành hợp chất hóa học có giá trị 1,3 propanediol, butanol c) Tóm tắt cô đọng nội dung đóng góp tác giả - Khảo sát khả chuyển hóa glycerol bùn hoạt tính chủng C.pasteurianum ATCC - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới khả chuyển hóa glycerol bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC - so sánh khả chuyển hóa kỹ thuật lên men gián đoạn liên tục d) Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp lên men gián đoạn lên men liên tục để khảo sát khả chuyển hóa glycerol hỗn hợp bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013, phân tích sản phẩm tạo thành sử dụng phương pháp sắc kí lỏng cao áp, sắc kí khí Kiểm tra có mặt chủng hoạt động nhờ kĩ thuật PCR DGGE, e) Kết luận Đề tài rút số kết luận sau: Các vi sinh vật có bùn từ nước thải nhà máy bia có khả chuyển hóa hoàn toàn glycerol thô lên đến nồng độ 25g/l thành sản phẩm có giá trị butanol, 1,3 propanediol phương pháp lên men gián đoạn lên men liên tục Lượng 1,3 propanediol thu hai phương pháp lên men gián đoạn liên tục khoảng 10g/l hay 0,45 g/ g glycerol Bổ sung axit butyric vào môi trường lên men có ảnh hưởng đến trình chuyển hóa bùn hoạt tính lượng butanol sinh tăng lên lần so với môi trường lên men không bổ sung axit butyric C.pasteurianum ATCC 6013 có khả chuyển hóa hoàn toàn glycerol thô lên đến nồng độ 25g/l phương pháp lên men gián đoạn Hỗn hợp gồm hệ bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 có khả chuyển hóa 25g/l glycerol thô thành sản phẩm có giá trị butanol, 1,3 propanediol Trong có lượng đáng kể butanol sinh so sánh với lên men có bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 Ethanol butanol xuất thiết bị lên men liên tục gồm hệ bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013, biến theo thời gian thu axit n-butyric, khoảng sản lượng khoảng g/l hai thiết bị lên men liên tục Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2011 Người hướng dẫn PGS.TS Tô Kim Anh Mục lục Trang phụ bìa Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG - DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ - LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I - TỔNG QUAN I.1 Nhiên liệu sinh học nhu cầu phát triển - I.2 Glycerol thô, phụ phẩm trình sản xuất biodiesel - 10 I.3 1,3 propanediol ứng dụng 12 I.4 Chuyển hóa glycerol thành 1,3 propanediol nhờ vi sinh vật 13 I.5 Con đƣờng chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO Clostridia. - 15 I.6 Các phƣơng pháp khác sản xuất 1,3 propanediol - 17 I.7 Ảnh hƣởng điều kiện trình tới lên men 1,3 PDO Clostridia 20 PHẦN II 24 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 II.1.Vật liệu 24 II.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 II.2.1 Chuẩn bị vật liệu cấy - 25 II.2.2 Khảo sát khả chuyển hóa glycerol sử dụng bùn hoạt tính lên men gián đoạn 25 II.2.3 Khảo sát khả chuyển hóa glycerol sử dụng bùn hoạt tính lên men liên tục thiết bị Expanded Granular Sludge Blanket (EGSB) 27 II.3 Phƣơng pháp phân tích - 28 II.3.1 Phân tích sản phẩm lên men. 28 II.3.2 Kiểm tra có mặt chủng ATCC 6013 hệ bùn 29 PHẦN III - 32 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 32 III.1 Khảo sát điều kiện chuyển hóa glycerol nhờ bùn hoạt tính lên men gián đoạn 32 III.2 Khảo sát điều kiện chuyển hóa glycerol nhờ canh trƣờng hỗn hợp bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 lên men gián đoạn. - 35 III.3 Khảo sát khả chuyển hóa glycerol nhờ trình lên men liên tục - 39 III.4 Kiểm tra có mặt C pasteurianum ATCC 6013 hệ bùn lên men liên tục 41 PHẦN IV - 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 44 IV.1.Kết luận 44 IV.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 49 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài tốt nghiệp, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới giáo sƣ Madalena Alves, nghiên cứu sinh Roberto Andres Gallardo Marusich, phòng thí nghiệm Ứng dụng công nghệ sinh học cho môi trƣờng, Khoa Công nghệ sinh học, trƣờng đại học Minho, Bồ Đào Nha hƣớng dẫn giúp đỡ suốt trình nghiên cứu Tôi xin c ảm ơn PGS.TS Tô Kim Anh, phòng Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm, trƣờng đại học Bách Khoa Hà Nội đóng góp viết luận văn Bên cạnh đó, xin cảm ơn thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm giúp đỡ dạy bảo nhiều trình học tập Cuối xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời thân gia đình bạn bè khuyến khích động viên tối suốt trình học tập nhƣ thời gian thực đề tài Hà nội ngày 15 tháng năm 2011 Học viên Nguyễn Thu Quynh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung t hực, kết quả, số liệu tính toán đƣợc hoàn toàn xác chƣa đƣợc công bố công trình nghiên cứu khác DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT STT Kí hiệu Tên đầy đủ 01 DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis 02 DHA dihydroxyacetone 03 DNA Deoxyribonucleic acid 04 dNTP Deoxyonucleotit triposphat 05 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 06 EGSB Expanded Granular Sludge Blanket 07 GC Gas chromatography 08 HLPC High performance liquid chromatography 09 Kb Kilo bazo (1kb= 100 bp) 10 PDO Propanediol 11 PEP Phosphoenolpyruvate 12 PBS Phosphate buffered saline 13 TBE Tris- boric acid- EDTA DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các chủng có khả lên men 1,3 propanediol từ glycerol Bảng Môi trƣờng lên men Tƣơng tự nhƣ kết thu đƣợc với hệ bùn hoạt tính, sản phẩm thu đƣợc từ canh trƣờng lên men ethanol, butanol, 1-3 PDO axit acetate, isobutyrate n-butyrate Hình III.4a cho thấy canh trƣờng có khả chuyển hóa hoàn toàn lƣợng glycerol thô 25g/l sau khoảng ngày nuôi, canh trƣờng hỗn hợp bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 chuyển hóa glycerol nhanh so với hai canh trƣờng lại Lƣợng ethanol sinh canh trƣờng tƣơng tự nhau, ethanol bắt đầu sinh khoảng ngày thứ trình lên men, cuối giai đoạn lên men, lƣợng ethanol thu đƣợc canh trƣờng khoảng 0,4g/l (Hình III.4b) Trái ngƣợc với xu hƣớng ethanol, nhận thấy khác biệt rõ ràng lƣợng butanol sinh canh trƣờng lên men (hình III.4c) Với canh trƣờng hệ bùn hoạt tính, gần nhƣ chuyển hóa glycerol thành butanol, C.pasteurianum ATCC 6013 có khả chuyển hóa glycerol thành lƣợng butanol đáng kể, khoảng 1,4 g/l Lƣợng butanol thu đƣợc canh trƣờng hỗn hợp bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 khoảng 1,6 g/l, cho thấy C.pasteurianum ATCC 6013 có khả ảnh hƣởng đến hỗn hợp vi sinh vật có bùn, làm tăng s ản lƣợng butanol sinh ra, so với môi trƣờng lên men có bùn hoạt tính Hình III.4d lƣợng 1,3 propanediol thu đƣợc canh trƣờng Lƣợng 1,3 propanediol lớn quan sát đƣợc cuối giai đoạn lên men canh trƣờng nuôi cấy bùn hoạt tính khoảng gần 10 g/l, tiếp C.pasteurianum ATCC 6013 8g/l hỗn hợp bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 g/l Hàm lƣợng tăng lên 1,3 DPO canh trƣờng bùn hoạt tính giải thích mặt buthanol canh trƣờng phân tích trƣớc Điều cho thấy xu hƣớng chuyển hóa tiếp tục buthanol tạo thành canh trƣờng thành 1,3 DPO sau 200h lên men nhờ hệ bùn Thí nghiệm chƣa thể khẳng 36 định chủng C.pasteurianum ATCC 6013 khả chuyển hóa tiếp buthanol thành 1,3 DPO, cần tổ chức thí nghiệm thời gian dài Một lƣợng nhỏ axit acetic, khoảng 0,5g /l thu đƣợc canh trƣờng lên men bùn canh trƣờng lên men C.pasteurianum ATCC 6013, canh trƣờng hỗn hợp bùn C.pasteurianum ATCC 6013 lƣợng axit acetic thu đƣợc khoảng 1,2 g/l Ở canh trƣờng lƣợng iso- butyric thu đƣợc khoảng 0,5 g/l n- butyric 1,5g/l Các canh trƣờng lên men sinh khí CO2 nhiên không 25 20 0,8 Con.Ethanol (g/l) Con.Glycerol (g/l) thể đo đƣợc 15 10 0,6 0,4 0,2 0 50 100 150 200 250 50 100 sludge co-culture sludge C.pasteurianum 200 250 C.pasteurianum co-culture b 10 Con 1,3propanediol (g/l) Con Butanol (g/l) a 150 Time (h) Time (h) 1,5 0,5 0 50 100 150 200 250 0 50 100 Tim e (h) slud g e C.p ast eurianum 150 200 Time (h) co -cult ure sludge c C.pasteurianum co-culture d Hình III.4 Sản phẩm dung môi chuyển hóa glycerol nhờ canh trƣờng bùn- C.pasteurianum ATCC 6013 a Hàm lƣợng glycerol sau trình chuyển hóa; sản phẩm tạo thành (b.Ethanol; c Buthanol; d 1,3 PDO) 37 250 Hình III.5 sản lƣợng axit thu đƣợc ba canh trƣờng Nhìn chung axit isobutyric xuất ba canh trƣờng với lƣợng không đáng kể, lƣợng axit n- butyric cao canh trƣờng có bùn hoạt tính, khoảng 3g/l (Hình III.5a), axit butyric đƣợc bổ sung ban đầu sinh không đƣợc chuyển hóa thành butanol, nên tích t ụ lại cuối trình lên men Kết canh trƣờng C.pasteurianum ATCC 6013 canh trƣờng hỗn hợp bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 lƣợng axit n- butyric sinh tƣơng tự nhau, khoảng 1,2 g/l đến cuối giai đoạn lên men Ngƣợc với lƣợng axit acetic sinh canh trƣờng bùn hoạt tính không đáng kể khoảng 0,5 g/l hai canh trƣờng lại, lƣợng axit acetic sinh tăng cao vào ngày lên men thứ giảm dần, đến cuối giai đoạn lên men lƣợng axit acetic canh trƣờng gần nhƣ nhau, lƣợng axit acetic thu đƣợc C.pasteurianum canh trƣờng hỗn hợp bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 tƣơng ứng 0,7 g/l 0,5 g/l C.pasteurianum sludge 15 10 25 20 15 10 0 50 100 150 200 50 iso-but yric acid Glycerol AcetTicime acid (h) iso-but yric n-but yric b 150 Glycerol T im e ( h) co-culture Con.Glycerol (g/l) a 100 25 20 15 10 0 Glycerol 50 100 Tim e Acet ic acid c 38 150 200 (g/l) Iso-but yric acid Con Acids (g/l) 0 250 250 n-but yric acid 200 Acet ic acid Con Acids (g/l) 20 Con.Glycerol (g/l) Con Acids (g/l) Con.Glycerol (g/l) 25 250 n-but yric acid Hình III.5 Sản phẩm axit chuyển hóa glycerol nhờ canh trƣờng bùn- C.pasteurianum ATCC 6013 a) Canh trƣờng bùn b) Canh trƣờng C.pasteurianum ATCC 6013 c) Canh trƣờng bùn C.pasteurianum ATCC 6013 Kết thu đƣợc hỗn hợp gồm hệ bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 có khả chuyển hóa 25g/l glycerol thô nhờ phƣơng pháp lên men gián đoạn thành sản phẩm có giá trị nhƣ butanol, 1,3 PDO, lƣợng butanol thu đƣợc cao so với phƣơng pháp lên men có bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013, vậy, bùn hoạt tính cho hàm lƣợng 1,3 DPO tích lũy cao thí nghiệm III.3 Khảo sát khả chuyển hóa glycerol nhờ trình lên men liên tục Hai thiết bị lên men liên tục EGSB, thiết bị EGSB (R1) gồm 50 ml bùn hoạt tính (47,6 mg VSS/g) 200 ml C.pasteurianum ATCC 6013 (OD =1), thiết bị EGSB (R2) 50 ml bùn hoạt tính (47,6 mg VSS/g) đƣợc thiết lập song song, với điều kiện lên men nhƣ nồng độ glycerol thô ban đ ầu 25 g/l, môi trƣờng lên men, nhiệt độ lên men, tốc độ pha loãng để xem xét ảnh hƣởng chế độ lên men tới phổ sản phẩm thu đƣợc canh trƣờng Hai thiết bị lên men đƣợc vận hành lên men gián đoạn ngày để loại bỏ khả C pasteurianum bị rửa trôi khỏi thiết bị R1 Trong ngày lên men gián đoạn, 10 ml môi trƣờng với nồng độ glycerol cuối 25 g/l đƣợc bổ sung hàng ngày vào hai thiết bị để loại bỏ trƣờng hợp hết nguồn cacbon, vi khuẩn thoái hóa chuyển dạng bào tử, phổ biến Clostridia Sau đó, hai thiết bị đƣợc vận hành điều kiện lên men liên tục đến sản phẩm thu đƣợc ổn định.Kết đƣợc trình bày nhƣ hình III.5 Tƣơng tự nhƣ lên men mẻ, thiết bị R1 gồm bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 chuyển hóa glycerol nhanh thiết bị R2 có bùn hoạt tính (Hình III.6a) 39 Trong điều kiện lên men liên tục, quan sát đƣợc thiết bị R1 gồm bùn C.pasteurianum ATCC 6013 sinh ethanol khoảng 0,05 g/l lƣợng đáng kể butanol, khoảng 0,3g /l, nhiên lƣợng butanol giảm dần hoàn toàn từ ngày thứ trình lên men, từ bắt đầu vận hành thiết bị điều kiện lên men liên tục (Hình III.6b) Từ hình III.6c, nhận thấy lƣợng 1,3 PDO thu đƣợc từ thiết bị tƣơng tự nhau, khoảng 12 g/l Sản lƣợng 1,3 PDO / glycerol thiết bị 0,42 g/g thiết bị 0,44 g/g, tƣơng tự nhƣ kết thu đƣợc từ lên men gián đoạn Tuy nhiên, thu đƣợc axit n-butyric điều kiện lên men liên tục,là khoảng 6g/l hai thiết bị Tuy nhiên để chắn khẳng định điều cần phân tích hàm lƣợng sản phẩm pha khí thiết bị lên men Trong nghiên cứu này, chƣa thực đƣợc phân tích a b c d Hình III.6 Sản phẩm chuyển hóa glycerol nhờ trình lên men liên tục 40 a Hàm lƣợng glycerol sau trình chuyển hóa; sản phẩm tạo thành (b.Ethanol butanol; c 1,3 PDO; d Axit n-butyric) Từ kết quan sát đƣợc trình lên men gián đoạn lên men liên tục, nhận thây hệ bùn hoạt tính C.pasteurianum có khả chuyển hóa glycerol thô với nồng độ 25g/l thành lƣợng đáng kể 1,3 PDO với sản lƣợng 0,4 g/g tƣơng đƣơng với lƣợng 1,3 PDO thu đƣợc trình lên men gián đoạn III.4 Kiểm tra có mặt C pasteurianum ATCC 6013 hệ bùn lên men liên tục Bùn hoạt tính, C pasteurianum trƣớc sử dụng cho thí nghiệm lên men mẫu bùn đƣợc lấy từ hai thiết bị trƣớc sau đƣợc vận hành điều kiện lên men liên tục Các mẫu bùn thu đƣợc đƣợc rửa lần với đệm PBS để loại bỏ vi khuẩn không bám dính vào hệ bùn, sử dụng cho tách chiết DNA Mẫu bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 trƣớc sử dụng đƣợc coi nhƣ mẫu kiểm chứng DNA thu đƣợc từ mẫu đƣợc kiểm tra điện di (Hình III.7) 100 kb Bùn R 1,1 R1,2 R2,1 R 2,2 Hình III.7 Hình ảnh điện di gel agarose mẫu từ hai thiết bị R1 R2 R 1,1: Mẫu từ thiết bị R1 trƣớc vận hành lên men liên tục 41 R 1,2: Mẫu từ thiết bị R1 sau vận hành lên men liên tục R 2,1: Mẫu từ thiết bị R2 trƣớc vận hành lên men liên tục R 2,2: Mẫu từ thiết bị R2 sau vận hành lên men liên tục Kết điện di gel agarose cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc đủ chất lƣợng để sử dụng cho kĩ thuật DGGE Tiến hành phản ứng DGGE với điều kiện nêu nhƣ phần II để kiểm tra có mặt C.pasteurianum ATCC 6013 hệ bùn thu đƣợc sau lên men liên tục từ hai thiết bị lên men EGSB Cp S R1,1 R2,1 R1,2 R2,2 Cp Hình III.7 Kết DGGE thu đƣợc từ mẫu Cp : C.pasteurianum, S : Bùn R 1,1: Mẫu từ thiết bị trƣớc vận hành lên men liên tục R 1,2: Mẫu từ thiết bị sau vận hành lên men liên tục R 2,1: Mẫu từ thiết bị trƣớc vận hành lên men liên tục R 2,2: Mẫu từ thiết bị sau vận hành lên men liên tục 42 Từ hình ảnh scan kết DGGE, không nhận thấy khác biệt mẫu từ hai thiết bị trƣớc sau vận hành điều kiện lên men liên tục Điều đƣa kết luận C pasteurianum khả xâm nhập vào bùn Nhƣ vậy, cần có thời gian dài kiểm tra lại gắn kết chủng vào bùn với hy vọng cải tạo đƣợc đặc điểm lên men hệ bùn 43 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ IV.1.Kết luận Với mục đích tìm hiểu trình lên men chuyển hóa glycerol thô- sản phẩm phụ ngành công nghiệp biodiesel vi sinh vật có bùn hoạt tính thành sản phẩm có giá trị nhƣ 1,3 propanediol hay butanol để từ phát triển quy mô công nghiệp, giúp tận dụng nguồn phụ phẩm glycerol bùn thải có ý nghĩa cho môi trƣờng, đồng thời có ý nghĩa ngành công nghiệp khác nhƣ sản xuất nhiên liệu sinh học Đề tài rút đƣợc số kết luận nhƣ sau: Các vi sinh vật có bùn từ nƣớc thải nhà máy bia có khả chuyển hóa hoàn toàn glycerol thô lên đến nồng độ 25g/l thành sản phẩm có giá trị nhƣ butanol, 1,3 propanediol phƣơng pháp lên men gián đoạn lên men liên tục Lƣợng 1,3 propanediol thu đƣợc hai phƣơng pháp lên men gián đoạn liên tục nhƣ nhau, khoảng 10g/l hay 0,45 g/g glycerol Bổ sung axit butyric vào môi trƣờng lên men có ảnh hƣởng đến trình chuyển hóa bùn hoạt tính lƣợng butanol sinh tăng lên lần so với môi trƣờng lên men không đƣợc bổ sung axit butyric C.pasteurianum ATCC 6013 có khả chuyển hóa hoàn toàn glycerol thô lên đến nồng độ 25g/l phƣơng pháp lên men gián đoạn Hỗn hợp gồm hệ bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 có khả chuyển hóa 25g/l glycerol thô thành sản phẩm có giá trị nhƣ butanol, 1,3 propanediol Trong có lƣợng đáng kể butanol sinh so sánh với lên men có bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 Ethanol butanol xuất thiết bị lên men liên tục gồm hệ bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013, biến theo thời gian thu đƣợc axit n-butyric, khoảng sản lƣợng khoảng g/l hai thiết bị lên men liên tục 44 IV.2 Kiến nghị Do thời gian có hạn nên đề tài dừng lại việc tìm hiểu trình chuyển hóa glycerol thô với nồng độ 25 g/l phƣơng pháp lên men gián đoạn liên tục bùn hoạt tính C.pasteurianum ATCC 6013 Các nghiên cứu cần thực hiện: Tìm hiểu trình chuyển hóa glycerol thô với nồng độ cao vi sinh vật có bùn hoạt tính Tìm hiểu trình chuyển hóa glycerol thô với nồng độ cao C.pasteurianum ATCC 6013 Thay đổi tỉ lệ C.pasteurianum ATCC 6013 bùn thiết bị lên men liên tục EGSB Thay đổi tốc độ dòng vào để quan sát lƣợng 1,3 propanediol sản phẩm tạo thành lý butanol giảm dần theo thời gian Tìm kiếm cặp mồi đặc hiệu với C.pasteurianum ATCC 6013 cho phản ứng PCR- DGGE 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bahl, H., W Andersch, K Braun, and G Gottschalk: Effect of pH and butyrate concentration on the production of acetone and butanol by Clostridium acetobutylicum grown in continuous culture Eur J Appl Microbiol Biotechnol 1982, 14: 17- 20 Biebl H: Fermentation of glycerol by Clostridium pasteurianum- batch and continuous culture studies J Ind Microbiol Biotechnol 2001, 27: 18 - 26 Booth I: Glycerol and methylglyoxal metabolism In Escherichiacoli and Salmonella: cellular and molecular biology (web edition) Edited by Neidhardt FC, Ingraham JL, Lin ECC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M, Umbarger HE Washington DC: ASM Press, 2005 Boties A, Himmi E, Jauregui JJA, Pelayo- Ortiz C, Gonzales VA: Glycerol fermentation with Propiobacteria and optimisation of the production of propionic acid Sci Aliments 2004, 24: 121- 135 Bouvet OM, Lenormand P, Ageron E, Grimont PA: Taxanomic diversity of anaerobic glycerol dissimilation in the Enterobacteriaceae Res Microbiol 1995, 146: 279- 290 Dharmadi Y, Murarka A, Gonzalez R: Anaerobic fermentation of glycerol by Escherichia coli: a new platform for metabolic engineering Biotechnol Bioeng 2006, 94: 821- 829 Dürre, P Fermentative Butanol Production : Annals of the New York Academy of Sciences 2008 , 353-362 Gee, P.T and Goh, S.H: Chiral and dietary diacylglycerols, Malaysian Oil Science and Technology 2001, 10: 49- 50 Gonzalez- Pajuelo M, Andrade JC, Vasconcelos I: Production of 1-3 propanediol by Clostridium butyricum VPI 3266 using a synthetic medium and raw glycerol J Ind Microbiol Biotechnol 2004, 31: 442- 446 10 Gonzalez- Pajuelo M, Meynial- Salles I, Mendes F, Soucaille P, Vasconcelos I: Microbial conversion of glycerol to 1,3- propanediol: physiological 46 comparison of a natural producer, Clostridium butyricum VPI 3266, and an engineered strain, Clostridium acetobutylicum DG1 (pSPD5) App Environ Microbiol 2006, 72: 96-101 11 Hedtke, D Glycerine processing New York Wiley 1996, 5: 275- 308 12 Kirschner, M: Chemical profile Acrylic acid Chemical Market Reporter 2005, 267, 16- 50 13 Lee PC, Lee WG, Lee SY, Chang HN: Succinic acid production with reduced by- product formation in the fermentation of Anaerobiospirillum succiniciproducens using glycerol as a carbon source Biotechnol Bioeng 2001, 72: 41- 48 14 Lin RH, Liu HJ, Hao J, Cheng K, Liu DH: Enhancement of 1,3 propanediol production by Klebsiella pneumoniae with fumarate addition Biotechnol Lett 2005, 27: 1755- 1759 15 Long, S., D.T: Jones, and D.R Woods: Initiation of solvent production, clostridial stage and endospore formation in Clostridium acetobutylicum P262 Appl Microbiol Biotechnol 1984, 20: 256- 261 16 Michael H W Husemann, Eleftherios T Papoutsakis: Effects of propionate and acetate additions on solvent production in batch cultures of Clostridium acetobutylicum Appl Microbiol Biotechnol 1990, 5:1497- 1500 17 Nielsen J, Villadsen J, Linden G: Bioreaction Engineering Principles New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003 18 R.K Saxena, Pinki Anand, Saurabh Saran, Jasmine Isar: Microbial production of 1,3 propanediol: Recent developments and emerging opportunities Biotechnology Advances 2009, 27: 895- 913 19 Tashiro, Y., K Takeda, G Kobayashi, K Sonomoto, A Ishizaki and S Yoshino: High butanol production by C saccharoperbutylacetonicum N1-4 in fed- batch culuture with pH- start continous butyric acid and glucose feeding method J Biosci Bioeng.2004, 98: 263- 268 20 Zhang YP, Li Y, Du CY, Liu M, Cao Z: Inactivation of aldehyde dehydrogenase: a key factor for engineering 1,3 propanediol production by Klebsiella pneumoniae Metab Eng 2006, 8: 578- 586 47 21 Zheng P, Wereath K, Sun JB, van den Heuvel J, Zeng AP: Overexpression of genes of the dha regulon and its effects on cell growth, glycerol fermentation to 1,3 propanediol and plasmid stability in Klebsiella pneumoniae Process Biochem 2006, 41: 2106- 2169 22 Yang G, Tian JS, Li JL: Fermentation of 1,3 propanediol by a lactate deficient mutant of Klebsialla oxytoca under microaerobic conditions Appl Microbiol Biotechnol 2007, 73: 1017- 1024 48 PHỤ LỤC Dung dịch Nồng độ Thành phần HCl 1,8 g/l H3BO3 61,8 mg/l MnCl2 61,3 mg/l CoCl2 64,5 mg/l NiCl2 12,9 mg/l ZnCl2 67,7 mg/l Dung dịch Thành phần Nồng độ NaOH 0,4 g/l Na2SeO3 17,3 mg/l Na2WO4 29,4 mg/l Na2MoO4 20,5 mg/l 10% Ammonium persulfate (APS) - g ammonium persulfate - 10 ml nƣớc cất Dung dịch cố định Cairn 8X - 200 ml ethanol 96% - 10 ml axit acetic - 40 ml nƣớc cất Dung dịch nhuộm bạc - 0,4 AgNO3 - 200 ml dung dich cố định Cairn 49 Dung dịch tráng phim - 10 mg NaBH4 - 250 ml dung dịch NaOH 1,5% - 750 µ formaldehyde Dung dịch bảo quản Cairn - 250 ml ethanol 96% - 100 ml glycerol - 650 ml nƣớc cất 50 ... pháp lên men hai giai đoạn kết hợp chủng vi sinh vật khác nhau, chuyển hóa glucose thành glycerol sau chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO Đồng lên men Phƣơng pháp đồng lên men lên men hỗn hợp glycerol. .. nhận có khả lên men glycerol theo kiểu 1,3- PDO phụ trợ Điều cần thiết để thực theo đƣờng hƣớng 1,3- PDO trạng thái khử cao cacbon glycerol Một vài nghiên cứu trình lên men chuyển hóa glycerol xảy... trình lên men Các nghiên cứu trƣớc pH môi trƣờng lên men đóng vai trò quan trọng trình lên men Aceton- Ethanol- Butanol (Huang cộng 2004, Tashiro cộng 2004) Nhƣ đề cập trên, trình lên men 1,3 PDO