Nghiên cứu kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme tạo pectic oligosaccharide (POS)

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM – Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, định hướng tận tình hướng dẫn, truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học – Đại học Lâm nghiệp, người bảo hướng dẫn suốt trình thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khuyến khích giúp vượt qua khó khăn suốt trình nghiên cứu Hà Nôi, ngày tháng 10 năm 2015 Nguyễn Thị Thu Hương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu, tính toán hoàn toàn xác chưa công bố công trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2015 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Pectin 1.2 Pectic oligosaccharide 1.3 Enzyme thủy phân pectin 1.3.1 Phân loại enzyme thủy phân pectin 1.3.2 Các chế phẩm pectinase ứng dụng 12 1.4 Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin enzyme thu POS 13 1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân giới hạn pectin .13 1.4.1 Kỹ thuật thủy phân gián đoạn bình phản ứng 15 1.4.2 Thủy phân hệ thống có tích hợp màng lọc .16 CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Vật liệu .20 2.1.2 Hóa chất enzym 20 2.1.3 Dung dịch sử dụng 20 2.1.4 Thiết bị .20 2.1.5 Màng lọc 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .23 2.2.1 Phương pháp hóa học .23 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 23 2.2.3 Phương pháp toán học 26 CHƢƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình thủy phân pectin tạo POS 33 3.1.1 Chế phẩm enzyme 33 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ chất .35 3.1.3 Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp .36 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 37 3.1.5 Ảnh hưởng pH 38 3.1.6 Ảnh hưởng tốc độ khuấy 40 3.1.7 Ảnh hưởng thời gian thủy phân 41 3.1.8 Các thông số động học Vm, Km Ki enzyme Pectinex Ultra SP-L 42 3.2 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân pectin tạo POS .46 3.3 Xây dựng quy trình thủy phân pectin tạo POS có tích hợp màng lọc 50 3.3.1 Đề xuất mô hình thực nghiệm 50 3.3.2 Lựa chọn kích thước màng lọc 51 3.3.3 Xác định thông số hoạt động cho hệ thống thủy phân pectin tạo POS có tích hợp màng lọc .57 3.3.4 So sánh kỹ thuật thủy phân gián đoạn kỹ thuật thủy phân có tích hợp màng lọc .60 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích 2Me-Fuc 2-O-methylL-fucose 2Me-Xyl 2-O-methylD-xylose Api D-apisose CFF Cross flow filtration (Lọc dòng ngang) DE Degree of esterification (Mức độ ester hóa) Dha 2-keto-3-deoxy-D-lyxo-heptulosaric acid DM Degree of methylation (Mức độ methyl hóa) DP Degree of polymerization (Mức độ trùng hợp) Endo-PG Endo-polygalacturonase Endo-PMG Endo- polymethylgalacturonase Exo-PG Exo-polygalacturonase Exo-PMG Exo-polymethylgalacturonase FEMR A free enzyme membrane reactor (Bình phản ứng lọc màng với enzyme tự do) FOS Fructo oligosaccharide G1 Monogalacturonic acid G2 Digalacturonic acid G3 Trigalacturonic acid GalA D-galacturonic acid GalOS Galacto oligosaccharide HG Homogalacturonan HM High methyl ester (Pectin có mức độ methyl hóa cao) HPAEC-PAD High performance anion exchange chromatography (HPAEC) with pulsed amperometric detection (PAD) (Sắc kí trao đổi anion hiệu cao với detector điện hóa) kDa kilo Dalton Ký hiệu Chú thích Kdo 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid kPa kilo Pascan L-aceric acid 3-carboxy-5-deoxy-L-xylose L-Gal L-galactose LM Low methyl este (Pectin có mức độ methyl hóa thấp) MWCO Molecular weight cutoff NMWL Nominal molecular weight limit (Giới hạn khối lượng phân tử đại diện) PAE Pectin acetyl esterase PE Pectinstease PG Polygalacturonase PME Pectin methyl esterase PMG Polymethylgalacturonase PMGL Polymethylgalacturonate lyase PL Pectin lyase POS Pectic Oligosaccharide RG I, II Rhamnogalacturonan I, II TLC Thin layer chromatography (Sắc ký mỏng) v/v volume/volume (Thể tích/thể tích) v/v/v volume/volume/volume (Thể tích/thể tích/thể tích) w/v weight/volume (Khối lượng/thể tích) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thông số kỹ thuật màng 100 kDa 21 Bảng 2.2 Thông số kỹ thuật màng 50 kDa 21 Bảng 2.3 Thông số kỹ thuật màng 10 kDa 22 Bảng 2.4 Thông số kỹ thuật màng kDa 22 Bảng 2.5 Điều kiện xác định Vm, Km enzyme Pectinex Ultra SP-L 27 Bảng 2.6 Điều kiện xác định Ki enzyme Pectinex Ultra SP-L 28 Bảng 2.7 Các biến số khoảng chạy chúng 28 Bảng 2.8 Ma trận thực nghiệm 29 Bảng 2.9 Thí nghiệm khảo sát kích thước màng 30 Bảng 2.10 Bố trí thí nghiệm xác định số thông số cho hệ thống thủy phân .32 Bảng 3.1 Hoạt độ đặc tính chế phẩm pectinase 33 Bảng 3.2 Kết vận tốc phản ứng Pectinex Utral-SPL nồng độ chất pectin khác 43 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ chất kìm hãm GalA tới vận tốc phản ứng thủy phân pectin 45 Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm trình thủy phân pectin tạo POS .47 Bảng 3.5 Kết phân tích phương sai ANOVA mô hình .48 Bảng 3.6 Kết khảo sát kích thước màng 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử pectin .3 Hình 1.2 Pectin có mức độ methyl hóa cao (HM) .5 Hình 1.3 Pectin có mức độ methyl hóa thấp (LM) Hình 1.4 Cấu tạo D-galacturonic acid Pectic oligosaccharide .5 Hình 1.5 Phân loại pectinase .9 Hình 1.6 Cơ chế xúc tác PE 10 Hình 1.7 Cơ chế xúc tác PGs 11 Hình 1.8 Cơ chế xúc tác PLs .12 Hình 1.9 Sơ đồ mô hình phản ứng thủy phân có tích hợp phận lọc dòng ngang 17 Hình 2.1 Mô hình hệ thống thủy phân tích hợp màng lọc đề xuất 31 Hình 3.1 Sản phẩm thủy phân giới hạn pectin chanh leo 1% chế phẩm Pectinase 34 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ pectin đến hàm lượng POS phổ sản phẩm dịch thủy phân pectin chanh leo 35 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lượng POS phổ sản phẩm dịch thủy phân pectin chanh leo 37 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng POS phổ sản phẩm (trong dịch thủy phân pectin chanh leo 38 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng POS phổ sản phẩm dịch thủy phân pectin chanh leo 39 Hình 3.6 Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến hàm lượng POS phổ sản phẩm dịch thủy phân pectin chanh leo 40 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng POS phổ sản phẩm dịch thủy phân pectin chanh leo 42 Hình 3.8 Quá trình thủy phân pectin nồng độ khác Pectinex UltraSPL 43 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ chất kìm hãm (GalA) bổ sung tới trình thủy phân pectin 44 Hình 3.10 Đồ thị thực nghiệm Linewear-Burk 45 Hình 3.11 Bề mặt đáp ứng hàm lượng POS .49 Hình 3.12 Điều kiện thủy phân tối ưu để tạo POS sản phẩm thủy phân giới hạn pectin tạo POS sau tối ưu 50 Hình 3.13 Mô hình quy trình thủy phân pectin tạo POS có tích hợp màng lọc .51 Hình 3.14 Thành phần dịch thủy phân trước sau qua màng 100 kDa 53 Hình 3.15 Thành phần dịch thủy phân trước sau qua màng 50 kDa 54 Hình 3.16 Khả phân tách enzyme Pectinex Ultra SPL qua màng 50 kDa 55 Hình 3.17 Phổ sản phẩm thủy phân sau lọc qua màng kDa 56 Hình 3.18 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lượng POS tạo thành 57 Hình 3.19 Phổ sản phẩm dịch thủy phân thí nghiệm lựa chọn tỷ lệ enzyme/cơ chất 58 Hình 3.20 Ảnh hưởng thời gian lưu dịch thủy phân bình đến hàm lượng POS tạo thành 59 Hình 3.21 Phổ sản phẩm dịch thủy phân thí nghiệm lựa chọn thời gian lưu dịch thủy phân bình 60 MỞ ĐẦU Cuộc sống đại mang lại cho nhiều tiện nghi, thoải mái hệ lụy mang lại không nhỏ Ngành Y học phải gồng mình, sức chữa trị bệnh thời đại Sở dĩ gọi số thống kê cho thấy bệnh máu nhiễm mỡ, động mạch vành, bệnh trĩ, ung thư xuất ngày nhiều sống đại Nhận thức nguy từ sống đại ngày nay, người ngày quan tâm đến sức khỏe mình, đặc biệt việc phòng chống bệnh tật Xu hướng nhu cầu sử dụng thực phẩm chức để bổ sung dưỡng chất cho thể đồng thời giúp phòng chống bệnh ngày phổ biến Nắm bắt thực tiễn đó, nhà sản xuất tích cực đẩy mạnh sản xuất nghiên cứu dòng thực phẩm chức hệ mới, có prebiotic Pectic oligosaccharide (POS) dòng prebiotic xuất khoảng chục năm trở lại POS hợp chất carbohydrate, bao gồm từ ÷ 10 đơn phân D-galacturonic acid nối với liên kết α-(1-4)-glucoside có nhiều lợi ích quý Là oligosaccharide acid galacturonic nên POS có tính acid Các nghiên cứu cho thấy POS có hoạt tính prebiotic, POS vi sinh vật có đường ruột sử dụng sản phẩm trình lên men có ảnh hưởng tích cực thể vật chủ POS chứng minh thúc đẩy trình tự chết apoptosis tế bào ung thư ruột người [53]; có khả bảo vệ tim mạch [39], làm giảm tổn thương thể tác dụng kim loại nặng, chống béo phì, chống nhiễm trùng, chống nhiễm khuẩn chống oxy hóa Từ lợi ích thiết thực trên, oligosaccharides prebiotics nói chung POS nói riêng có tiềm làm thực phẩm bổ sung công nghệ chế biến sản phẩm thực phẩm Hiện POS sản xuất số phương pháp tổng hợp hóa học, phân cắt pectin chiếu xạ sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin Trong đó, hướng nghiên cứu sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin quan tâm Kết sắc kí đồ (hình 3.19) cho biết phổ sản phẩm dịch thủy phân Với tỷ lệ E/S 24 U/g, phổ sản phẩm cải thiện dịch thủy phân qua màng màng (đường chạy 1, 7) Tuy nhiên, lượng enzyme nên sản phẩm cuối thấy lượng pectin có khối lượng phân tử lớn lượng POS thu (đường chạy 7) Với tỷ lệ E/S 36 U/g, dịch thủy phân sau qua màng lọc gần chuyển hóa thành oligosaccharide, lượng pectin khối lượng phân tử lớn (đường chạy 5) Phổ sản phẩm sau màng (đường chạy 8) chiếm chủ yếu thành phần POS (độ trùng hợp DP từ ÷ 10) Với tỷ lệ E/S 48 U/g, phổ sản phẩm thu trường hợp cải thiện từ màng đến màng phổ sản phẩm cuối chiếm chủ yếu oligosaccharide có mức độ trùng hợp DP từ ÷ (đường chạy 9) gần giống với trường hợp (đường chạy 8) Từ kết thu nhận trên, tỷ lệ enzyme/cơ chất lựa chọn cho thí nghiệm 36 U/g G1 G2 G3 M Hình 3.19 Phổ sản phẩm dịch thủy phân M: oligosaccharide chuẩn, G1, G2, G3: mono, di, trigalacturonic acid 58 Giếng 1, 4, 7: dịch thủy phân bình 1, bình bình tỷ lệ E/S 24 U/g Giếng 2, 5, 8: dịch thủy phân bình 1, bình bình tỷ lệ E/S 36 U/g Giếng 3, 6, 9: dịch thủy phân bình 1, bình bình tỷ lệ E/S 48 U/g 3.3.3.2 Thí nghiệm lựa chọn thời gian lưu dịch thủy phân bình 2- T2 Tiến hành thủy phân pectin chanh leo với nồng độ pectin 1% (w/v) đệm citrate pH 4,0 có bổ sung Pectinex Ultra SP-L tỷ lệ enzyme/cơ chất 36 U/g pectin, nhiệt độ thủy phân 42°C, tốc độ khuấy 225 vòng/phút Thời gian tiền thủy phân bình 1- t1 90 phút Vận tốc dòng màng 50 kDa kDa mL/phút Thời gian lưu dịch thủy phân bình 1- T1 30 phút, bình 2-T2 30, 45 60 phút Sản phẩm thủy phân bình xác định kit thử D-galacturonic acid (hình 3.20) Dịch thủy phân bình 1, bình bình xác định phổ sản phẩm kĩ thuật sắc kí mỏng (TLC) (Hình 3.21) 8.288 Hàm lƣợng POS (mg/mL) 5.85 5.189 30 45 60 Thời gian lƣu dịch thủy phân bình T (phút) Hình 3.20 Ảnh hưởng thời gian lưu dịch thủy phân bình 2-T2 đến hàm lượng POS tạo thành Với thời gian lưu dịch thủy phân 30 phút bình 2, phổ sản phẩm không cải thiện sau qua màng (đường chạy 5) Sau qua màng 2, lượng pectin có khối lượng phân tử lớn nhiều (đường chạy 9) lượng POS thu hạn chế (5,189 mg/mL) Với thời gian lưu dịch thủy phân 45 phút 59 bình 2, phổ sản phẩm sau qua màng (đường chạy 10) gần tương tự với trường hợp (đường chạy 9) Lượng POS thu tăng không đáng kể, 5,85 mg/mL Với thời gian lưu dịch thủy phân 60 phút bình 2, dịch thủy phân sau qua màng gần chuyển hóa thành POS (đường chạy 7) Phổ sản phẩm sau màng chiếm chủ yếu oligosaccharide có độ trùng hợp DP từ ÷ (đường chạy 11) lượng POS thu phương án đạt cao 8,288 mg/mL Từ kết trên, phương án thời gian lưu dịch thủy phân bình 60 phút cho kết tốt G1 G2 G3 Hình 3.21 Phổ sản phẩm dịch thủy phân Giếng 8: oligosaccharide chuẩn, G1, G2, G3: mono, di, trigalacturonic acid 60 Giếng 1, 5, 9: dịch thủy phân bình 1, với thời gian lưu T2 30 phút Giếng 2, 6, 10: dịch thủy phân bình 1, với thời gian lưu T2 45 phút Giếng 3, 9, 11: dịch thủy phân bình 1, với thời gian lưu T2 60 phút Lặp lại thí nghiệm điều kiện nhiệt độ 42°C, tỷ lệ enzyme/cơ chất 36 U/g, tốc độ khuấy 225 vòng/phút, thời gian tiền thủy phân ban đầu bình 90 phút, thời gian lưu dịch thủy phân bình 30 phút, thời gian lưu dịch thủy phân bình 60 phút, vận tốc dòng màng 50 kDavà kDa mL/phút, lượng POS thu 8,468 mg/mL (hiệu suất thu hồi POS đạt 84,68%) 3.3.4 So sánh kỹ thuật thủy phân gián đoạn kỹ thuật thủy phân có tích hợp màng lọc Dựa thí nghiệm tiến hành, kết cho thấy kỹ thuật thủy phân pectin tạo POS sử dụng hệ thống tích hợp màng lọc có nhiều lợi so với kỹ thuật thủy phân gián đoạn Hiệu suất thu hồi POS kỹ thuật thủy phân có tích hợp màng lọc đạt 84,68% cao so với kỹ thuật thủy phân gián đoạn (81,83%) sản phẩm có kích thước nhỏ phân riêng hệ thống, từ làm giảm tối đa việc chất bị thủy phân sâu thành monogalacturonic acid gây tượng kìm hãm sản phẩm Hơn nữa, với kỹ thuật thủy phân có tích hợp màng lọc, phổ sản phẩm thủy phân thu đa dạng hơn, gồm pectic oligo có mức độ trùng hợp DP từ ÷ lượng monogalacturonic acid thu ít, so với phổ sản phẩm thủy phân kỹ thuật thủy phân gián đoạn chủ yếu di, tri oligosaccharide lượng monogalacturonic acid nhiều Ngoài ra, ưu điểm bật kỹ thuật thủy phân pectin tạo POS có tích hợp màng lọc khả thu hồi enzyme – điều mà kỹ thuật thủy phân gián đoạn không làm Hiệu suất thu hồi enzyme đạt 47,55% (hoạt độ enzyme tổng ban đầu 2065,4 U/100 mL; hoạt độ enzyme tổng sau phản ứng 982,2 U/30 mL) Tuy nhiên, bên cạnh lợi trên, phương án sử dụng kỹ thuật thủy phân có tích hợp màng lọc hạn chế vốn đầu tư trang thiết bị tốn với hệ thống máy bơm màng lọc; phương thức vận hành phức tạp kỹ thuật thủy phân gián đoạn, đòi hỏi phải theo dõi 61 thông số hệ thống áp suất đầu vào, áp suất đầu ra, vận tốc bơm, lưu lượng dòng hồi lưu… 62 KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đưa số kết luận sau: Đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới trình thủy phân pectin chanh leo chế phẩm enzyme thương mại Pectinex Ultra SP-L thu pectic oligosaccharide (POS) Các thông số động học Km, Vmax tương ứng 8,73 g/L 0,18 g/L/phút Quá trình thủy phân pectin bị ức chế sản phẩm với giá trị Ki = 0,9051 g/L Đã xác định điều kiện tối ưu thủy phân pectin bình phản ứng thu POS sau: - Nồng độ chất pectin chanh leo: 3% (w/v) - Tỷ lệ enzyme/cơ chất: 44 U/g - pH: 4,0 - Nhiệt độ: 53°C - Tốc độ khuấy: 270 vòng/phút - Thời gian thủy phân: - Hiệu suất thu hồi POS: 81,83% - Phổ sản phẩm thu chủ yếu: mono, di trigalacturonic acid Thiết lập hệ thống thủy phân pectin có tích hợp màng lọc cho thu nhận POS Hệ thống thiết kế với bình phản ứng 1, tích hợp tương ứng với màng lọc (50 kDa) màng lọc (1 kDa) với điều kiện phản ứng thông số vận hành hệ thống sau: - Nồng độ chất pectin: 1% (w/v) - Tỷ lệ enzyme/cơ chất: 36 U/g - pH: 4,0 - Nhiệt độ: 42˚C - Tốc độ khuấy: 225 vòng/phút 63 - Thời gian tiền thủy phân chất (bình 1): 90 phút - Thời gian lưu dịch hệ thống: 30 phút (bình 1) 60 phút (bình 2) - Vận tốc dòng vdòng= mL/min - Hiệu suất thu hồi POS: 84,68% - Hiệu suất thu hồi enzyme: 47,55% - Phổ sản phẩm thu chủ yếu: di, tri tetragalacturonic acid KIẾN NGHỊ Nghiên cứu quy trình thủy phân liên tục pectin tạo POS có tích hợp màng lọc 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Ngô Xuân Mạnh, Trần Thị Lan Hương, Ứng dụng chế phẩm enzyme Pectinex để nâng cao hiệu suất trích ly chất lượng nước dứa (Ananas Comosus) tự nhiên TIẾNG ANH Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo, Dorothée Goffin, Bernard Wathelet, Michel oligosaccharides Paquot (2012), Enzymatic from polygalacturonic acid production with of commercial pectic pectinase preparations, Food and bioproducts processing 90, pp 588–596 A Lama-Munoz, G Rodriguez-Gutierrez, and F Rubio-Senent (2012), Production, characterization and isolation of neutral and pectic oligosaccharides with low molecular weights from olive by-products thermally treated, Food Hydrocolloids, 28, pp 92-104 Alberto Gallifuoco, Francesco Alfani, Maria Cantarella, and Paolo Viparelli (2001), Studying Enzyme-Catalyzed Depolymerizations in Continuous Reactors, Ind Eng Chem Res., 40, 5184-5190 Alkorta I, Gabirsu C, Lhama MJ, Serra JL (1998), Industrial applications of pectic enzymes: a review, Proc Biochem; 33: 21-8 Belén Gómez, Remedios Yáñez, Juan Carlos Parajó and José Luis Alonso (2014)., Production of pectin-derived oligosaccharides from lemon peels by extraction, enzymatic hydrolysis and membrane filtration, J Chem Technol Biotechnol B Gullón, B Gosmez, M Martínez-Sabajanes, R Yáñez, J.C Parajó and J.L Alonso (2013), Pectic oligosaccharides: Manufacture and functional properties, Trends in Food Science & Technology, 30, 153-161 Bodera P (2008), Influence of prebiotics on the human immune system (GALT), Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov 2:19–153 65 Canadian Intellectual Property Office (2002), Method for producing pectin hydrolysis products, CA 428 473 10 Carpita, N C.; Gibeaut, D M (1993), Plant J., 3, 11 Concha Olmos J., Zúñiga Hansen M.E (2012), Enzymatic depolymerization of sugar beet pulp: Production and characterization of pectin and pectic-oligosaccharides as a potential source for functional carbohydrates, Chemical Engineering Journal 192, 29–36 12 C Sieiro, B Fraga, J López-Seijas, A.Silva, T.G Villa (2012), Microbial Pectic Enzymes in the Food and Wine Industry, Food Industrial Processes – Methods and Equipment, pp 201-218 13 Delattre C, Michaud P, Courtois B, Courtois J (2005), Oligosaccharides engineering from plants and algae applications in biotechnology and therapeutics, Minerva Biotechnol, 17:107-117 14 D H Hendges, Q Montanari, E Malvessi, M.M Silveira (2011), Prodution and characterization of endo polygalacturonase from Aspergillus niger in solid-state fermentation in double-surface bioreactor Brazilian Archives of Biology and Technology 54(2), pp 253 – 258 15 Donald J.Huber, Yasar Karakurt, Jiwon Jeong (2001), Pectin degradation in ripening and wounded fruits, R Bras Fisiol Veg., 13(2) 224-241 16 E Olano-Martin, K.C Mountzouris, G.R Gibson, Andr A Rastall (2001), Continuous Production of Pectic Oligosaccharides in an Enzyme Membrane Reactor, Journal of Food Science- Vol 88, No 7, 966-971 17 E Olano-Martin, G.R Gibson and R.A Rastall (2002), Comparison of the in vitro bifidogenic properties of pectins and pectic-oligosaccharides, Journal of Applied Microbiology, 93, 505-511 18 E.R Pinheiro, I.M.D.A Silva, L.V Gonzaga, E.R Amante, R.F.Teofilo, M.M.C Ferreira, and R.D.M.C Amboni (2008), Optimization of extraction of highester pectin from passion fruitpeel (Passiflora edulisflavicarpa) with citric acid by usingresponse surface methodology, Bioresource Technology, 99, pp 5561 – 5566 66 19 Garthoff, J A., Heemskerk, S., Hempenius, R A., Lina, B A R., Krul, C A M., Koeman, J H., et al (2010), Safety evaluation of pectinderived acidic oligosaccharides (pAOS): genotoxicity and sub-chronic studies, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 57(1), 31-42 20 Gerhard Dongowski, Angelika Lorenz and Jürgen Proll (2002), The Degree of Methylation Influences the Degradation of Pectin in the Intestinal Tract of Rats and In Vitro, The Journal of Nutrition, 132(7): 1935-44 21 G.L Miler (1959), Use of dinitro-salicylic acid reagent for dertermination of reducing sugar, Anal Chem., 31, pp 426 - 428 22 Guggenbichler, J P., Bettignies-Dutz, A., Meissner, P., Schellmoser, S., &Jurenitsch, J (1997), Acidic oligosaccharides from natural sources block adherence of Escherichia coli on uroepithelial cells, Pharmaceutical and Pharmacological Letters, 7(1), 35-38 23 H Abbasi, M H Fazaelipoor (2010), Continuous production of Polygalacturonase (PGaes) using Aspergillus niger in a surface culture bioreactor and modeling the process, Biotechnology and Bioprocess Engineering 15, pp 308 – 313 24 Hess JR, Birkett AM, Thomas W, Slavin JL (2011), Effects of short-chain fructooligosaccharides on satiety responses in healthy men and women, Appetite, 56:128–134 25 Ho Jin Kang, Joong Ho Kwon, Dong Uk Ahn, Ju Woon Lee, Wan Kyu Lee, Cheorun Jo (2009), Effect of citrus pectin oligosaccharide prepared by irradiation on high cholesterol diet B6.KOR-ApoE mice, Food Sci Biotechnol Vol 18 (4), 884-888 26 Hotchkiss, A T., Manderson, K., Olano-Martin, E., Grace, W E., Gibson, G R., & Rastall, R A (2004), Orange peel pectic oligosaccharide prebiotics with food and feed applications, In Abstracts of papers, 228th ACS National Meeting, Philadelphia, PA, United States, August, 22-26 67 27 Hotchkiss, A T., Manderson, K., Tuohy, K M., Widmer, W W., Nunez, A., Gibson, G R., et al (2007), Bioactive properties of pectic oligosaccharides from sugar beet and Valencia oranges, In Abstracts of papers, 233rd ACS National Meeting, Chicago, IL, United States, March 25-29 28 J.C.C Esquivel, and C.E Voget (2004), Purification and partial characterization of an acidic polygalacturonase from Aspergillus kawachii, Journal of Biotechnology, 110, pp 21 - 28 29 J Holck, K Hjernø, A Lorentzen, L.K Vigsnæs, L Hemmingsen, T.R Licht, J.D Mikkelsen, and A.S Meyer (2011), Tailored enzymatic production of oligosaccharides from sugar beet pectin and evidence of differential effects of a single DP chain length difference on human faecal microbiota composition after in vitro fermentation Proc Biochem., 46, pp 1039–1049 30 Jonh R Whitaker, Alphons G J Voragen, Dominic W.S Wong (2003), Handbook of food enzymology Chapter 69 31 Jose´ M Rodriguez-Nogalesa, Natividad Ortega, Manuel Perez-Mateos, María D Busto (2008), Pectin hydrolysis in a free enzyme membrane reactor: An approach to the wine and juice clarification, Food Chemistry 107, 112–119 32 Josiane Courtois (2009), Oligosaccharides from land plants and algae: production and applications in therapeutics and biotechnology, Current Opinion in Microbiology,12:261–273 33 Kashyap DR, Vohra PK, Tewari R (2001), Application of pectinases in the commercial sector: a review, Bioresour Technol; 77: 215-227 34 K Be´lafi-Bako´, M Eszterle, K Kiss, N Nemesto´thy, L Gubicza (2007), Hydrolysis of pectin by Aspergillus niger polygalacturonase in a membrane bioreactor, Journal of Food Engineering 78, 438-442 35 K Iwasaki, and Y Matsubara (2000), Purification of pectate oligosaccharides showing root-growth-promoting activity in lettuce using ultrafiltration and nanofiltration membranes, Journal of Bioscience and Bioengineering, 89(5), pp 495-497 68 36 K Kiss, N Nemestothy, L Gubicza, K Bélafí-Bakó (2009), Vacuum assisted membrane bioreactor for enzymatic hydrolysis of pectin from various agrowastes, Desalination 241, 29-33 37 K Manderson, M Pinart, K.M Tuohy, W.E Grace, A.T Hotchkiss, W Widmer, M.P Yadhav, G.R Gibson, and R.A Rastall (2005), In Vitro Determination of Prebiotic Properties of Oligosaccharides Derived from an Orange Juice Manufacturing By-Product Stream, Applied and environmental microbiology, 71(12), pp 8383–8389 38 KLAUS D.Kulbe, Astrid Heinzler and Gisela Knopki (1987), Enzymatic Synthesis of L-Ascorbic Acid via D-Uronic Acids; Membrane-Reactor Integrated Recovery of D-Galacturonic Acid from Pectin Hydrolysates, Annals of the New York Academy of Sciences, 506, 543-551 39 Li, T., Li, S., Du, L., Wang, N., Guo, M., Zhang, J., et al (2010), Effects of haw pectic oligosaccharide on lipid metabolism and oxidative stress in experimental hyperlipidemia mice induced by high-fat diet, Food Chemistry, 121(4), 1010-1013 40 Li Yu, Xu Zhang, Shanshan Li, Xiaoyu Liu, Lin Sun, Haibo Liu, Jeff Iteku, Yifa Zhou, Guihua Tai (2010), Rhamnogalacturonan I domains from ginseng pectin, Carbohydrate Polymers 79, pp 811–817 41 Mads H Clausen (2002), Synthesis and Application of Pectic Oligosaccharides, Ph.D Thesis, Technical University of Danmark 42 Malcolm A O’Neill, Tadashi Ishii, Peter Albersheim, and Alan G Darvill (2004), Rhamnogalacturonan II: Structure and Function of a Borate Cross-Linked Cell Wall Pectic Polysaccharide, Annu, Rev, Plant Biol, 55, 109–39 43 Manel Pinelo, Gunnar Jonsson, Anne S Meyer (2009), Membrane technology for purification of enzymatically produced oligosaccharides: Molecular and operational features affecting performance, Separation and Purification Technology 70, 1-11 69 44 Markwart Kunz, Mohammad Munir, Manfred Vogel (2002), Patent WO2002042484 A2 Method for producing pectin hydrolysis products 45 Maria Helene Giovanetti Canteri, Alessandro Nogueira, Carmen Lúcia de Oliveira Petkowicz and Gilvan Wosiacki (2012), Characterization of apple pectina chromatographic approach, Chromatogaphy - The most versatile of chemical analysis, chapter 14 46 Martina Martínez Sabajanes, Remedios Yáñez, José L Alonso, Juan C Parajó (2012), Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis, International Journal of Food Science & Technology, Vol 47 (4), 747–754 47 McCann, M C.; Bush, M.; Milioni, D.; Sado, P.; Stacey, N J.; Catchpole, G.; Derfernez, M.; Carpita, N C.; Hofte, H.; Ulvskov, P.; Wilson, R H.; Roberts, K (2001), Phytochemistry, 57, 811 48 Milos V Nikolic’, Ljiljana Mojovic (2007), Hydrolysis of apple pectin by the coordinated activity of pectic enzyme, Food Chemistry 101, 1–9 49 M Martınez, B gullon, R Yanez, J.L Alonso, J.C Parajo (2009), Direct enzymatic production of oligosaccharide mixtures from sugar beet pulp: experimental evaluation and mathematical modeling, J Agric Food Chem., 57(12), pp 5510-5517 50 M.M Bradford (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem., 72, pp 248 - 254 51 Muhd Nazrul Hisham Zainal Alam (2010), Continuous Membrane Microbioreactor for Development of Integrated Pectin Modification and Separation Processes, PhD Thesis, Technical University of Denmark 52 Nilay Demir *, Jale Acar, Kemal Sarõo_glu, Mehmet Mutlu (2001), The use of commercial pectinase in fruit juice industry Part 3: Immobilized pectinase for mash treatment, In Journal of Food Engineering, 47: 275-280 70 53 Olano-Martin, E., Rimbach, G H., Gibson, G R., & Rastall, R A (2003), Pectin and pectic-oligosaccharides induce apoptosis in vitro human colonic adenocarcinoma cells, Anticancer Research, 23(1A), 341-346 54 Olano-Martin, E., Williams, M R., Gibson, G R., & Rastall, R A (2003), Pectins and pectic-oligosaccharides inhibit Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29, FEMS Microbiology Letters, 218(1), 101-105 55 O’Neill M, Albersheim P, Darvill A, et al (1990), The pectic polysaccharides of primary cell walls, In: Dey PM, ed Methods in plant biochemistry 2nd ed London: Academic Press, 415–41 56 Peng Yuan, Kun Meng, Huoqing Huang, Pengjun Shi, Huiying Luo, Peilong Yang, Bin Yao (2011), A novel acidic and low-temperature-active endopolygalacturonase from Penicillium sp CGMCC 1669 with potential for application in apple juice clarification, Food Chemistry 129, 1369–1375 57 P Palanivelu (2006), Polygalacturonase: Active site analyses and mechanism of action, Indian Journal of Biotechnology, 5: 148-162 58 Radoi F, Kishida M, Kawasaki H (2005), Endo-polygalacturonase in Saccharomyces wine yeasts: effect of carbon source on enzyme production, FEMS Yeast Res.; 5(6-7):663-8 59 Ralet M.-C., E Bonnin, and J.-F Thibault (2003), Pectins, In A Steinbu¨chel (ed.), Biopolymers Wiley-VCH Verlag Gmbh, Weinheim, Germany, 345–380 60 Ranveer Singh Jayani, Shivalika Saxena, Reena Gupta (2005), Microbial pectinolytic enzymes: A review, Process Biochemistry 40, 2931–2944 61 R C Fontana, S Salvador, M M Silveira (2005) Influence of pectin and glucose on growth and polygalacturonase production by Aspergillus niger in solidstate cultivation, J Ind Microbial Biotechnol 32, pp 371 – 377 71 62 Sakai T, Sakamoto T, Hallaert J, Vandamme E (1993), Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties and applications, Adv Appl Microbiol; 39: 213-94 63 Shevchik VE, Hugouvieux-Cotte-Pattat N (1997), Identification of a bacterial pectin acetyl esterase in Erwinia chysanthemi 3937, Mol Microbiol; 24(6): 1285-301 64 S.G Kulkarni, and P Vijayanand (2010), Effect of extraction conditions on the quality characteristics of pectin from pasion fruit peel (Passiflora edulis f.flavicarpa L.), LWT-Food Science and Technology, 43, pp 1026 - 1031 65 S Li, T Li, Y Jia, R Zhu, N Wang, S Jin, and M Guo (2011), Fractionation and structural characterization of haw pectin oligosaccharides, Eur Food Res Technol., 233, pp 731-734 66 Thakur, B.R., Signh, R.K., Handa, A.K (1997), Chemistry and uses of pectin - a reviews, Crit Rev Food Sci, 37, 47-73 67 Vos, A P., van Esch, B C., Stahl, B., M’Rabet, L., Folkerts, G., Nijkamp, F P., et al (2007), Dietary supplementation with specific oligosaccharide mixtures decreases parameters of allergic asthma in mice, International Immunopharmacology, 7(12), 1582-1587 68 Yapo BM, Lerouge P, Thibault JF, et al (2007), Pectins from citrus peel cell walls contain homogalacturonans homogenous with respect to molar mass, rhamnogalacturonan I and rhamnogalacturonan II, Carbohydr Polym, 69, 426–35 WEBSITE 69 http://www.gelifesciences.com Cross flow filtration method handbook (2014) 70 http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/materials/enzymes/viscozyme.html 72 ... kỹ thuật Xuất phát từ lí tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin enzyme tạo pectic oligosaccharide (POS)" Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình thủy phân giới hạn. .. 1.4 Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin enzyme thu POS 13 1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân giới hạn pectin .13 1.4.1 Kỹ thuật thủy phân gián đoạn bình phản ứng 15 1.4.2 Thủy. .. hai kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin enzyme thu POS: thủy phân gián đoạn bình phản ứng thủy phân hệ thống có tích hợp màng lọc 1.4.1 Kỹ thuật thủy phân gián đoạn bình phản ứng Với trình thủy phân