Nghiên cứu điều kiện khử protein phế liệu tôm bằng phương pháp enzyme và vi sinh vật

Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu điều kiện khử protein phế liệu tôm phương pháp enzyme vi sinh vật” LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THANH HÀ Hà Nội - Năm 2011 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 10 PHẦN I TỔNG QUAN 12 I TỔNG QUAN VỀ CHITIN 12 1.1 Nguồn gốc tồn chitin tự nhiên 12 1.2 Thành phần hóa học vỏ tôm 13 1.3 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý chitin 14 1.3.1 Cấu trúc hóa học chitin [5, 9, 16] 14 1.3.2 Tính chất chitin [6, 11, 21] 16 1.4 Các phương pháp thu nhận chitin 16 1.4.1 Phương pháp hóa học 17 1.4.2 Phương pháp sinh học 19 1.4.3 Phương pháp hóa học kết hợp sinh học 23 1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin – chitosan giới Việt Nam 25 1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan giới 25 1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan Việt Nam 25 1.5.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin – chitosan vào thực tế 26 II CHẾ PHẨM ENZYME PROTEAZA VÀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 29 2.1 Nhóm enzyme proteaza [4] 29 2.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis 31 2.3.1 Đặc điểm hình thái B subtilis [6] 31 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng B subtilis 31 2.3.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein phế liệu tôm 33 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 I VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35 1.1 Đối tượng nghiên cứu 35 1.2 Môi trường sử dụng cho nghiên cứu 35 1.3 Dụng cụ thiết bị dùng nghiên cứu 35 1.3.1 Các thiết bị dùng nghiên cứu 35 1.3.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 36 II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Quá trình khử protein 37 2.2 Quá trình khử khoáng 38 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học 2.3 Công thức thực nghiệm 38 III CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 38 3.1 Phương pháp vi sinh 38 3.1.1 Hoạt hoá, cấy truyền giữ giống 38 3.1.2 Xác định số lượng sinh khối tạo thành 39 3.1.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào (Phương pháp nhuộm Gram) 39 3.2 Phương pháp hoá sinh 39 3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein phương pháp Biuret 39 3.2.2 Phương pháp tách chiết protein NaOH 40 3.2.3 Phương pháp phân tích thành phần rỉ đường 40 3.2.4 Xác định pH dịch nuôi cấy 42 3.2.5 Xác định hàm ẩm nguyên liệu 42 3.2.6 Xác định hàm lượng tro 42 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 I XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC BAN ĐẦU CỦA PLT 43 II TUYỂN CHỌN CHỦNG SINH TỔNG HỢP PROTEIN CAO 43 2.1 Định tính phương pháp đo đường kính vòng thủy phân 43 2.2 Định lượng phương pháp đo hoạt lực proteaza tạo thành theo phương pháp Anson cải tiến 44 III NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐỊNH TÊN CHỦNG DT2 45 3.1 Đặc điểm hình thái chủng DT2 45 3.2 Định tên vi sinh vật 46 IV KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ PROTEIN VÀ KHỬ KHOÁNG TRONG PLT CỦA CHỦNG DT2 46 4.1 Động học sinh trưởng chủng DT2 46 4.2 Khảo sát ảnh hưởng pH dịch lên men tới khả khử protein khử khoáng phế liệu tôm chủng DT2 47 4.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường tới khả khử protein khử khoáng phế liệu tôm chủng DT2 49 4.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tới khả khử protein khử khoáng phế liệu tôm chủng DT2 50 4.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men tới khả khử protein khử khoáng phế liệu tôm chủng DT2 51 V KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ PROTEIN TRONG PLT CỦA ENZYME NEUTRAZA 52 5.1 Lựa chọn yếu tố miền khảo sát 52 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học 5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân tới trình khử protein enzyme neutraza 53 5.3 Ảnh hưởng pH dịch thủy phân tới trình khử protein enzyme neutraza 54 5.4 Ảnh hưởng thời gian thủy phân tới trình khử protein enzyme Neutraza 55 5.5 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme tới trình khử protein enzyme neutraza 56 5.6 Kết kết hợp điều kiện khuấy liên tục trình thủy phân 58 VI NGHIÊN CỨU KẾT HỢP ENZYME NEUTRAZA VÀ VI KHUẨN B SUBTILLIS ĐỂ KHỬ PROTEIN PLT 59 6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng pH tới hiệu khử protein khử khoáng DT2 59 6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men tới hiệu khử protein khử khoáng DT2 61 6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tới hiệu khử protein khử khoáng DT2 62 6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường tới hiệu khử protein khử khoáng DT2 64 VII QUÁ TRÌNH LOẠI KHOÁNG SỬ DỤNG AXIT LACTIC 65 VIII ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU CHITIN 66 8.1 Quy trình thu chitin sử dụng lên men vi khuẩn B Subtillis kết hợp phương pháp hóa học 67 8.2 Quy trình thu chitin sử dụng enzyme neutraza kết hợp phương pháp hóa học 67 8.3 Quy trình thu chitin kết hợp enzyme neutraza lên men vi khuẩn B Subtillis 68 8.4 So sánh quy trình thu nhận chitin 68 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 71 I KẾT LUẬN 71 II MỘT SỐ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 71 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu, tính toán hoàn toàn xác chưa công bố công trình nghiên cứu Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Hàm lượng chitin phế liệu vỏ 12 Bảng 1.2: Thành phần hóa học phế liệu tôm 13 Bảng 1.3: Tính chất chitin thu 33 Bảng 2.1: Thành phần rỉ đường 40 Bảng 3.1: Thành phần hóa học nguyên liệu……………… .42 Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân 43 Bảng 3.3 Hoạt độ proteaza chủng nghiên cứu 44 Bảng 3.4: Ảnh hưởng pH tới hiệu khử protein khử khoáng 47 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ rỉ đường tới hiệu khử protein khử khoáng .48 Bảng 3.6: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tới hiệu suất khử protein khử khoáng .49 Bảng 3.7: Ảnh hưởng thời gian lên men tới hiệu suất khử protein khử khoáng .50 Bảng 3.8: Thành phần vỏ tôm sau lên men DT2 51 Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ tới DP (%) hàm lượng protein lại (%) 52 Bảng 3.10: Ảnh hưởng pH dịch thủy phân tới trình khử protein enzyme neutraza 54 Bảng 3.11: Ảnh hưởng thời gian thủy phân tới trình khử protein enzyme Neutraza .55 Bảng 3.12: Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme tới trình khử protein enzyme Neutraza 56 Bảng 3.13: Thành phần nguyên liệu sau thủy phân enzyme neutraza 58 Bảng 3.14: Ảnh hưởng pH dịch lên men tới hiệu khử protein khử khoáng vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT qua xử lí enzyme neutraza lần .60 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Bảng 3.15: Ảnh hưởng thời gian lên men tới hiệu khử protein khử khoáng vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT qua xử lí enzyme neutraza lần .61 Bảng 3.16: Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống tới hiệu khử protein khử khoáng vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT qua xử lí enzyme neutraza lần 62 Bảng 3.17: Ảnh hưởng tỉ lệ rỉ đường tới hiệu khử protein khử khoáng vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT qua xử lí enzyme neutraza lần .63 Bảng 3.18: Điều kiện khử khoáng 65 Bảng 3.19: So sánh quy trình thu chitin 68 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Một số loại giáp xác chứa chitin 11 Hình 1.2: Sắp xếp mạch cấu trúc chitin 14 Hình 1.3: Công thức cấu tạo Chitin 14 Hình 1.4: Quy trình sản xuất chitosan Pháp .17 Hình 1.5: Sản xuất chitin kết hợp E neutrase, bromelin, papain E nội PLT ……………………………………………………………………………… 21 Hình 1.6: Quy trình thu chitin từ phế liệu vỏ giáp xác 23 Hình 1.7: Cơ chế thủy phân proteaza .28 Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu sản xuất chitin 36 Hình 3.1: Vòng phân giải protein chủng nghiên cứu 42 Hình 3.2: Đặc điểm hình thái chủng DT2 Hình thái tế bào kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần (A), hình thái khuẩn lạc (B) 44 Hình 3.3: Cây phân loại chủng DT2 Trình tự gene chủng dùng để so sánh lấy ngân hàng gen có kí hiệu tương ứng hình 45 Hình 3.4: Đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis DT2 .46 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH (A), nồng độ rỉ đường (B), tỷ lệ tiếp giống (C) thời gian lên men (D) tới hiệu khử protein (cột màu trắng) khoáng (cột màu ghi)của DT2 47 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu khử protein hàm lượng protein lại PLT enzyme neutraza 52 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH tới hiệu khử protein hàm lượng protein lại PLT enzyme neutraza .53 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian tới hiệu khử protein hàm lượng protein lại PLT enzyme neutraza 54 Hình 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme tới hiệu khử protein hàm lượng protein lại PLT enzyme neutraza 56 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Hình 3.10 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) hiệu suất khử khoáng (côt màu ghi) điều kiện có trùng (cột tô màu) không trùng (cột không tô) .59 Hình 3.11 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) hiệu suất khử khoáng (côt màu ghi) điều kiện có trùng (cột tô màu) không trùng (cột không tô) 60 Hình 3.12 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) hiệu suất khử khoáng (cột màu ghi) điều kiện có trùng (cột tô màu) không trùng (cột không tô) .62 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỉ lệ rỉ đường đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) hiệu suất khử khoáng (côt màu ghi) điều kiện có trùng (cột tô màu) không trùng (cột không tô) 63 Hình 3.14 Quy trình thu chitin đề xuất 65 Hình 3.15: Sản phẩm chitin thu từ quy trình: – sử dụng enzyme neutraza; – sử dụng B subtillis lên men; – kết hợp enzyme neutraza B Subtillis 68 Nguyễn Thị Huyền Trang Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học MỞ ĐẦU Với điều kiện thuận lợi địa lí, Việt Nam có tiềm lớn nguồn lợi thủy sản Theo Hiệp hội Chế biến Xuất thủy sản Việt Nam (VASEP) năm 2010, nước xuất khoảng 240 nghìn tôm, kim ngạch đạt khoảng 2,08 tỉ USD (theo baolangson.vn/node/15965) Mặc dù mang lại tiềm kinh tế to lớn hàng năm, nhà máy chế biến tôm đông lạnh nước thải khoảng 70,000 phế liệu/ năm Nguồn phế liệu không xử lý gây ô nhiễm môi trường trầm trọng Tuy nhiên, nguồn phế liệu lại chứa lượng lớn protein, chitin, sắc tố…, chitin polime sinh học có giá trị Chitin dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao kháng nấm, kháng khuẩn có khả tự phân hủy sinh học Chính mà chitin dẫn xuất ứng dụng nhiều y học, dược phẩm, công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, xử lý môi trường… Việc sản xuất chitin chitosan có ba phương pháp phương pháp hóa học, phương pháp sinh học phương pháp hóa học kết hợp sinh học Phương pháp hóa học chủ yếu sử dụng NaOH để loại protein HCl để loại khoáng Phương pháp có ưu điểm thời gian sản xuất ngắn nhiên chất lượng chitin không cao, không tận thu thành phần có giá trị protein làm thức ăn gia súc, chất màu… Phương pháp sinh học chủ yếu sử dụng lên men vi khuẩn có khả sinh proteaza trình loại protein vi khuẩn lactic đồng thời loại protein khoáng đạt hiệu cao Tuy phương pháp cho chitin chất lượng cao, tận thu sản phẩm có giá trị có nhược điểm thời gian kéo dài, tốn công sức lao động không loại protein hoàn toàn Do đó, nay, việc nghiên cứu kết hợp phương pháp sinh học hóa học quan tâm Một hướng nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme proteaza vi khuẩn có khả sinh proteaza để loại protein Phương pháp mang lại số kết khả quan: tận thu dịch protein axit amin, giảm thiểu hóa chất sử dụng khâu xử lí protein, Nguyễn Thị Huyền Trang 10 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Do đó, chọn tỷ lệ tiếp giống 12.5 % (v/w) cho thí nghiệm 6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường tới hiệu khử protein khử khoáng DT2 Chúng thực thí nghiệm điều kiện pH = 7, tỷ lệ tiếp giống 12.5% (v/w), thời gian 40h, nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường 7.5, 10.0, 12.5 15.0% Kết thu thể hình 3.13: Hình 3.13 Ảnh hưởng tỉ lệ rỉ đường đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) hiệu suất khử khoáng (côt màu ghi) điều kiện có trùng (cột tô màu) không trùng (cột không tô) Tỉ lệ rỉ đường cao, hiệu suất khử protein cao trường hợp trùng không trùng (bảng 3.18) Bảng 3.17: Ảnh hưởng tỉ lệ rỉ đường tới hiệu khử protein khử khoáng vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT qua xử lí enzyme neutraza lần Thanh trùng Tỉ lệ rỉ đường Không trùng (v/w) DP (%) DM (%) DP (%) DM (%) 7.5 34.98 ± 0.53 60.16 ± 0.22 67.39 ± 0.12 61.16 ± 0.15 10 33.77 ± 0.34 69.56 ± 0.30 69.30 ± 0.17 62.48 ± 0.20 12.5 46.42 ± 0.19 66.47 ± 0.20 75.02 ± 0.22 59.24 ± 0.11 15 60.77 ± 0.31 61.46 ± 0.24 76.93 ± 0.30 64.76 ± 0.27 Nguyễn Thị Huyền Trang 64 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Một lần hiệu suất loại protein cao trường hợp không trùng Theo kết bảng 3.18, DP đạt cao 60.77% tỷ lệ rỉ đường 15.0% (w/w) thấp 34.98% tỷ lệ rỉ đường 7.5% điều kiện trùng môi trường nguyên liệu trước lên men Khi không trùng môi trường nguyên liệu trước lên men DP đạt cao hơn, từ 67.39, 69.30, 75.02, 76.93 với tỷ lệ rỉ đường 7.5, 10,0, 12.5, 15.0% (w/w) Hiệu suất khử khoáng đạt cao 66.47% tỉ lệ rỉ đường 12.5% trường hợp có trùng, 64.76% tỷ lệ rỉ đường 15.0% trường hợp không trùng Để đảm bảo cho trình lên men đạt hiệu khử protein khử khoáng tốt nhất, lựa chọn tỷ lệ rỉ đường 15% Như vậy, qua nghiên cứu thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu cho trình lên men loại protein loại khoáng vi khuẩn B Subtillis kết hợp sử dụng enzyme neutraza loại protein lần là: pH = 7, thời gian lên men 40h, tỉ lệ tiếp giống 12.5% (v/w), tỉ lệ rỉ đường 15.0% Quá trình lên men thực tủ nuôi lắc liên tục nhiệt độ 37oC Sau trình lên men, thành phần PLT lại sau: hàm lượng protein lại/ chất khô tổng số 1.17 ± 0,44, hàm lượng khoáng lại/ chất khô tổng số 6.54± 0,14 Sau trình lên men, hàm lượng khoáng lại tương đối nhiều Vì tiếp tục khử khoáng axit lactic VII QUÁ TRÌNH LOẠI KHOÁNG SỬ DỤNG AXIT LACTIC Từ nghiên cứu thực tế cho thấy vi khuẩn DT2 có khả loại phần khoáng phế liệu tôm Mặt khác, sử dụng enzyme neutraza để loại protein phần khoáng phế liệu nhiều Chính cần thực thêm bước loại phần khoáng phế liệu để thu chitin có chất lượng cao Sử dụng axit lactic để loại khoáng hướng xử lý phổ biến Dựa vào nghiên cứu thực hiện, lựa chọn điều kiện khử khoáng axit lactic sau: Nguyễn Thị Huyền Trang 65 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Bảng 3.18: Điều kiện khử khoáng Yếu tố Số liệu Lượng axit lactic 75 (g/l) Thời gian Tỷ lệ dung dịch axit/phế liệu tôm (w/v) 1/10 VIII ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU CHITIN Hình 3.14 Quy trình thu chitin đề xuất Nguyễn Thị Huyền Trang 66 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học 8.1 Quy trình thu chitin sử dụng lên men vi khuẩn B Subtillis kết hợp phương pháp hóa học PLT ban đầu thu nhận rửa loại bỏ tạp chất • Khử protein lên men B.subtilis điều kiện không trùng: pH = 6,5, tỉ lệ tiếp giống 12,5% (v/w), tỉ lệ rỉ đường 7,5% (v/w) thời gian 48 giờ, nhiệt độ 37 oC, tốc độ lắc 170 vòng/ phút • Rửa nước tới pH = • Khử protein lần hai dung dịch NaOH 1%, thời gian giờ, nhiệt độ 50oC, tỉ lệ PLT/NaOH 1/10 (w/v) • Rửa nước tới pH = • Khử khoáng axit lactic với tỉ lệ axit/ PLT 1/10 (w/v), nhiệt độ 65oC, thời gian giờ, khuấy liên tục (tốc độ khuấy 278,4 vòng/ phút) • Rửa nước tới pH = • Tẩy màu dung dịch Javen • Rửa nước tới pH = • Sấy khô thu chitin 8.2 Quy trình thu chitin sử dụng enzyme neutraza kết hợp phương pháp hóa học PLT ban đầu thu nhận rửa loại bỏ tạp chất • Khử protein enzyme neutrase theo tỷ lệ E/PLT = 1% (v/w), pH = 8, nhiệt độ 500C, khuấy liên tục (tốc độ khuấy 278,4 vòng/ phút) • Rửa nước tới pH = • Khử protein lần hai dung dịch NaOH 1%, thời gian giờ, nhiệt độ o 50 C, tỉ lệ PLT/ NaOH 1/10 (w/v) • Rửa nước tới pH = • Khử khoáng axit lactic với tỉ lệ axit/ PLT 1/10 (w/v), nhiệt độ 65oC, thời gian giờ, khuấy liên tục (tốc độ khuấy 278,4 vòng/ phút) • Rửa nước tới pH = • Tẩy màu dung dịch Javen Nguyễn Thị Huyền Trang 67 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học • Rửa nước tới pH = • Sấy khô thu chitin 8.3 Quy trình thu chitin kết hợp enzyme neutraza lên men vi khuẩn B Subtillis PLT ban đầu thu nhận rửa loại bỏ tạp chất • Khử protein enzyme neutrase theo tỷ lệ E/ PLT = 1.0% (v/w), pH = 8, nhiệt độ 50oC, khuấy liên tục (tốc độ khuấy 278.4 vòng/ phút) • Rửa nước tới pH = • Khử protein lên men B Subtilis điều kiện không trùng: pH = 7, tỉ lệ tiếp giống/ PLT 12.5% (v/w), tỉ lệ rỉ đường/ PLT 15.0% (v/w) thời gian lên men 40 giờ, nhiệt độ 37 0C, tốc độ lắc 170 vòng/ phút • Rửa nước tới pH = • Khử khoáng axit lactic với tỉ lệ axit/ PLT 1/10 (w/v), nhiệt độ 65oC, thời gian giờ, khuấy liên tục (tốc độ khuấy 278.4 vòng/ phút) • Rửa nước tới pH = • Tẩy màu dung dịch Javen • Rửa nước tới pH = • Sấy khô thu chitin 8.4 So sánh quy trình thu nhận chitin Từ điều kiện tối ưu nghiên cứu trên, tiến hành áp dụng vào để nghiên cứu sản xuất chitin quy mô phòng thí nghiệm Nguyễn Thị Huyền Trang 68 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Hình 3.15: Sản phẩm chitin thu từ quy trình: – sử dụng enzyme neutraza; – sử dụng B subtillis lên men; – kết hợp enzyme neutraza B subtillis Sản phẩm chitin sấy khô đến độ ẩm 5% đánh giá chất lượng dựa vào phương pháp phân tích phần II trình bày Bảng 3.19: So sánh quy trình thu chitin Chỉ tiêu so sánh Qui trình Qui trình Quy trình Hàm lượng protein lại 5,12 ± 0,67 3,68 ± 0,09 1,17 ± 0,44 Hàm lượng khoáng lại 1,09 ± 0,16 0,44 ± 0,19 Tổng thời gian (h) 13 57 49 Đối với quy trình 1: sử dụng enzyme neutraza để thủy phân protein thu chitin: sản phẩm chitin có màu trắng đẹp, mềm Khi sử dụng enzyme để thủy phân protein thời gian ngắn tận thu dịch thủy phân Tổng thời gian trình tương đối ngắn Đối với quy trình 2: sử dụng vi khuẩn DT2 để lên men khử protein phế liệu: sản phẩm chitin khó tẩy màu, nhiên chitin tương đối mềm thành phần khoáng phế liệu tôm bị khử gần triệt để Thời gian trình dài, dịch lên men có mùi khó chịu Tuy nhiên quy trình tận dụng sinh khối vi sinh vật rỉ đường nguyên liệu rẻ tiền lên có lợi ích kinh tế cao Nguyễn Thị Huyền Trang 69 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Đối với quy trình 3: kết hợp enzyme vi khuẩn DT2 để loại protein phần khoáng lên men nên sản phẩm chitin có hàm lượng protein nhỏ, không khoáng vỏ tôm Quy trình tận thu dịch thủy phân lần enzyme lần trình lên men DT2 làm thức ăn gia súc Tiết kiệm chi phí giá thành sản xuất Nguyễn Thị Huyền Trang 70 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT I KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút kết luận sau Lựa chọn chủng DT2 để lên men phế liệu tôm thu chitin Định tên chủng DT2 chủng B subtilis nhờ phương pháp hóa sinh sinh học phân tử Xác định điều kiện tối ưu cho trình khử protein PLT chủng B subtilis DT2: pH = 6.5, tỉ lệ rỉ đường 10.0% (w/w), tỉ lệ tiếp giống 5.0% (v/w), thời gian lên men 48 Tại điều kiện hàm lượng protein lại sau lên men 3,69% ± 0.09 hàm lượng khoáng lại 16,06% ± 0.19 Đề xuất qui trình thu nhận chitin dùng B subtilis DT2 kết hợp khử protein lần phương pháp hóa học Xác định điều kiện tối ưu cho trình khử protein PLT enzyme neutraza: pH = 8, nhiệt độ 50oC, thời gian tỉ lệ enzyme/PLT 1.0% Tại điều kiện hiệu suất khử protein đạt 78,29%, hàm lượng protein/ chất khô tổng số lại 24.85% Khi nghiên cứu kết hợp điều kiện khuấy trình thủy phân protein hiệu suất khử protein đạt 87.44% hàm lượng protein lại/ chất khô tổng số 11.31% Đề xuất qui trình thu nhận chitin dùng enzyme neutraza kết hợp xử lí protein lại phương pháp hóa học Kết hợp enzyme neutraza lên men vi khuẩn DT2 điều kiện không trùng để loại bỏ protein cách có hiệu Hàm lượng protein lại 1.17% II MỘT SỐ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT Cả ba quy trình chủ yếu nghiên cứu trình loại protein loại khoáng chủ yếu phải dùng axit lactic Vì vậy, để nâng cao chất lượng chitin giảm giá thành sản phẩm sử dụng kết hợp lên men vi khuẩn lactic sử dụng môi trường rỉ đường Trong trình loại protein cần nghiên cứu để thu hồi lượng protein lại axit amin dịch thủy phân dịch lên men Nguyễn Thị Huyền Trang 71 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Quá trình loại bỏ sắc tố chủ yếu dùng dung dịch nước Javen mà chưa có bước tận thu sắc tố Nguyễn Thị Huyền Trang 72 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học PHỤ LỤC Hình ảnh PLT ban đầu Nguyễn Thị Huyền Trang 73 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Dương Văn Tuyển, (2002), “Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học chăn nuôi vịt”, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Viện Chăn nuôi Việt nam, Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào cộng sự, “Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia sản xuất giò lụa, bánh cuốn”, Viện dinh dưỡng, Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm Việt Nam Đỗ Thị Bích Thủy – Đại học Nông Lâm – Đại học Huế Trần Thị Luyến – Đại học Thủy sản Nha Trang, (2006), “Nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein khỏi phần vỏ phế liệu tôm (PLT)”, Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản số 2/2006, trang 47 – 51 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên, Hóa sinh Công nghiệp, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật năm 2005 Lưu Văn Chính, Châu Văn Minh, Phạm Hữu Điển, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận, “Tổng hợp nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu N, N, N – Trimethyl chitosan (TMT)”, tạp chí Dược học số 9, mục 5, năm 2000 Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội, Phạm Thị Đan Phượng, “Nghiên cứu kết hợp enzyme proteaza công nghệ sản xuất chitin từ phế liệu đầu vỏ tôm”, Tạp chí khoa học – công nghệ Thủy sản số 3năm 2007, trang 11 – 17 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục Nguyễn Phước Đạt (2006), “Nghiên cứu quy trình sản xuất chitin – chitosan từ xương mực ống”, luận văn tốt nghiệp trường Đại học Nha trang Nguyễn Trọng Bách, (1999), “Nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ ghẹ tươi ứng dụng bảo quản thịt”, Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Nha trang, Nha trang 10 Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền, (2005), “Nghiên cứu thủy phân chitosan axit hữu cơ” “Nghiên cứu phản ứng chitosan axit fomic axit Nguyễn Thị Huyền Trang 74 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học acetic”, Hội nghị khoa học công nghệ hóa hữu toàn quốc lần thứ III, trang 210 – 221 11 Nguyễn Thị Đông, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Hoan, (2005), “Ứng dụng chitosan khối lượng phân tử thấp để kích thích sinh trưởng lúa”, tuyển tập công trình hội nghị khoa học công nghệ hóa hữu toàn quốc lần thứ 3, trang 445 – 449 12 Nguyễn Thị Đông, (2003), “Tách chitin từ phế liệu tôm phương pháp lên men lactic tổng hợp số dẫn xuất N – cacboxy chitosan”, luận án tiến sỹ hóa học 13 Phạm Lê Dũng, Nguyễn Thị Đông, Phạm Thị Mai, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Thị Kim Thanh, Rinaudo.M, Desbriers, (1999), “Dẫn xuất N-cacboxyl chitosan, chất tương tự chitin”, Tạp chí hóa học, tập 37, trang 80 – 82 14 Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền cộng sự, (1997), “Vật liệu sinh học từ chitin”, Viện Hóa học – Viện công nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia, Hà Nội 15 Trần Thị Luyến, Bùi Văn Tú, “Nghiên cứu sử dụng Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú (Penaeus monodon) để thu hồi chitin”, Tạp chí khoa học – công nghệ thủy sản 03 – 04/2006 16 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, giáo trình “Sản xuất chế phẩm kỹ thuật y dược từ phế liệu Thủy sản”, nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội năm 2004 17 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo cộng sự, (2000), “Hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phệ liệu vỏ tôm, cua”, Báo cáo khoa học, đề tài cấp bộ, Nha Trang 18 Trần Cảnh Đình,Vũ Xuân Sơn, Nguyễn Thị Hường, (2010), “Nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm enzyme”, Viện Nghiên cứu Hải sản 19 Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Ty, “Nghiên cứu tác dụng tăng sinh collagen chitosan điều trị bỏng nhiệt thực nghiệm”, Tạp chí Dược học số 9, mục 9, năm 2000 Nguyễn Thị Huyền Trang 75 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học Tài liệu tiếng anh 20 A Gildberg and E Stenberg (2001), “A new process for advanced utilisation of shrimp waste” Process Biochemistry, 36: 809-812 21 A.O ONIFADE, T.O OLUTUNDE, (2000), “Protein quality of shrimp waste” Bioresource Technology, 185 – 188 22 A Khanafari, R Marandi, Sh Sanatei, (2008), “Recovery of chitin and chitosan from shrimp waste by chemical and microbial method” Iran J Environ Health Sci Eng., 2008, Vol 5, No 1, pp 19 – 24 23 G H Jo, W J Jung, J H Kuk, K T Oh, Y J Kim and R D Park, (2008), “Screening of protease-producing Serratia marcescens FS-3 and its application to deproteinization of crab shell waste for chitin extraction” Carbohydrate Polymers, 74: 504-508 24 Hall, G.M and Desilva, S, “Lactic acid fermentation of scampi (penaeus Monodon) Waste for chitin recovery in advances in chitin and chitosan”, (ade Brine, C.J Sanf ford P.A, and Zikakis, J.P), Elsevie applied science, London 1992 25 H D De Holanda and F M Netto, (2006), “Recovery of Components from Shrimp (Xiphopenaeus kroyeri) Processing Waste by Enzymatic Hydrolysis” Journal of Food Science, 71: C298-C303 26 H K No and S P Meyers, (1989), “Crawfish chitosan as a coagulant in recovery of organic compounds from seafood processing streams” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 37: 580-583 27 J Synowiecki and N A A Q Al-Khateeb, (2000), “The recovery of protein hydrolysate during enzymatic isolation of chitin from shrimp Crangon crangon processing discards” Food Chemistry, 68: 147-152 28 J Waldeck, G Daum, B Bisping and F Meinhardt, (2006), “Isolation and Molecular Characterization of Chitinase-Deficient Bacillus licheniformis Strains Capable of Deproteinization of Shrimp Shell Waste To Obtain Highly Viscous Chitin” Appl Environ Microbiol., 72: 7879-7885 Nguyễn Thị Huyền Trang 76 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học 29 J z Synowiecki and N A Al-Khateeb, (2003), “Production, Properties, and Some New Applications of Chitin and Its Derivatives” Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43: 145-171 30 Kim S S., Kim S H and Lee Y M, (1996), “Preparation, characterization and properties of β – chitin and N – acetylated β – chitin” J.Polymer Sci., Part B: Polymer Physics, vol 34, pp 2367 – 2374 31 M Mizani, M Aminlari and M Khodabandeh, (2005), “An Effective Method for Producing a Nutritive Protein Extract Powder from Shrimp-head Waste”, Food Science and Technology International, 11: 49-54 32.M S Rao, J Muñoz and W F Stevens, (2000), “Critical factors in chitin production by fermentation of shrimp biowaste” Applied Microbiology and Biotechnology, 54: 808-813 33 N Pacheco, M Garnica-González, J Y Ramírez-Hernández, B FloresAlbino, M Gimeno, E Bárzana and K Shirai, (2009), “Effect of temperature on chitin and astaxanthin recoveries from shrimp waste using lactic acid bacteria” Bioresource Technology, 100: 2849-2854 34 N.S Mahmoud, A.E Ghaly and F Arab, (2007), “Unconventional Approach for demineralization of deproteinized crustancean shells for chitin production”, American Journal of Biochemistry and Biotechnology 3: – 35 R Chakrabarti, (2002), “CAROTENOPROTEIN FROM TROPICAL BROWN SHRIMP SHELL WASTE BY ENZYMATIC PROCESS” Food Biotechnology, 16: 81-90 36 S.-L Wang and S.-H Chio, (1998), “Deproteinization of Shrimp and Crab Shell with the Protease of Pseudomonas Aeruginosa K-187” Enzyme and Microbial Technology, 22: 629-633 37 Sydney London, (1965), “Encyclopedia ò polymer Science and Technology”, vol 3, pp 605 – 704 Nguyễn Thị Huyền Trang 77 Viện CN Sinh học & Thực phẩm Luận văn thạc sĩ khoa học 38 Synowiecki J z and Al-Khateeb N A, (2003), “Production, Properties, and Some New Applications of Chitin and Its Derivatives” Critical Reviews in Food Science and Nutrition 43:145-171 39 Theruvathil K Sini, Sethumadhavan Santhosh and Paruthapara T Mathew (2007), “Study on the production of chitin and chitosan from shrimp shell by using Baccillus subtilis fermentation”, ScienceDirect, Carbohydrate Research 342, pp 2423 – 2429 40 T K Sini, S Santhosh and P T Mathew, (2007), “Study on the production of chitin and chitosan from shrimp shell by using Bacillus subtilis fermentation” Carbohydrate Research, 342: 2423-2429 41 W J Jung, J H Kuk, K Y Kim and R D Park, (2005), “Demineralization of red crab shell waste by lactic acid fermentation” Applied Microbiology and Biotechnology, 67: 851-854 42 W J Jung, G H Jo, J H Kuk, Y J Kim, K T Oh and R D Park, (2007), “Production of chitin from red crab shell waste by successive fermentation with Lactobacillus paracasei KCTC-3074 and Serratia marcescens FS-3” Carbohydrate Polymers, 68: 746-750 43 W Jung, G Jo, J Kuk, K Kim and R Park, (2006), “Extraction of chitin from red crab shell waste by cofermentation with <i>Lactobacillus paracasei</i> subsp <i>tolerans</i> <i>Serratia marcescens</i> FS-3” KCTC-3074 and Applied Microbiology and Biotechnology, 71: 234-237 44 Y.-S Oh, I.-L Shih, Y.-M Tzeng and S.-L Wang, (2000), “Protease produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab shell wastes” Enzyme and Microbial Technology, 27: 3-10 45 Y Xu, C Gallert and J Winter, (2008), "Chitin purification from shrimp wastes by microbial deproteination and decalcification" Applied Microbiology and Biotechnology, 79: 687-697 Nguyễn Thị Huyền Trang 78 ... phế liệu tôm phương pháp enzyme vi sinh vật Nội dung luận văn gồm: • Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh protease cho trình loại protein phế liệu tôm • Nghiên cứu tối ưu điều kiện loại protein. .. hưởng đến sinh trưởng B subtilis 31 2.3.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein phế liệu tôm 33 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 I VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ... chitosan có ba phương pháp phương pháp hóa học, phương pháp sinh học phương pháp hóa học kết hợp sinh học Phương pháp hóa học chủ yếu sử dụng NaOH để loại protein HCl để loại khoáng Phương pháp có ưu