Nghiên cứu chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương đt12

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM MINH HẢO NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM MINH HẢO NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn thực hướng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu giúp đỡ, hợp tác đồng nghiệp nhóm nghiên cứu Các số liệu, kết trình bày luận văn đồng ý cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Minh Hảo ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô giáo cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn cán thuộc Phòng ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên, khuyến khích, giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận văn Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Minh Hảo iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu tương tác động hạn đến đậu tương 1.1.1 Cây đậu tương 1.1.2 Tác động hạn đến đậu tương 1.1.3 Cơ chế chịu hạn đậu tương 1.2 Nhân tố phiên mã DREB 11 1.2.1 Các nhân tố phiên mã DREB đậu tương 11 1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB2 12 1.3 Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen cải thiện khả chịu hạn đậu tương 13 1.3.1 Các kỹ thuật chuyển gen ứng dụng đậu tương 13 1.3.2 Nghiên cứu chuyển gen đậu tương 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 17 iv 2.1.1 Đặc điểm giống đậu tương ĐT12 17 2.1.2 Chủng A tumefaciens tái tổ hợp chứa vector mang gen GmDREB2 18 2.1.3 Hóa chất thiết bị 19 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào đậu tương 20 2.2.2 Phân tích chuyển gen 23 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết chuyển gen GmDREB2 tái sinh đậu tương chuyển gen 27 3.1.1 Kết khử trùng hạt tạo nguyên liệu biến nạp 27 3.1.2 Lây nhiễm tái sinh đậu tương chuyển gen 28 3.2 Phân tích có mặt gen chuyển GmDREB2 đậu tương chuyển gen hệ T0 33 3.3 Thảo luận 37 3.3.1 Thảo luận vector pBI121 promoter 35S 37 3.3.2 Thảo luận kết biến nạp, tái sinh chuyển gen xác định có mặt gen chuyển chuyển gen 37 3.3.3 Thảo luận hiệu suất chuyển gen đậu tương 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 iv DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ABA : Absisic Acid Bp : Cặp base DEPC : Diethyl pyrocarbonate DNA : Deoxyribonucleic Acid DREB : Dehydration - Responsive Element Binding dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate Đtg : Đồng tác giả E coli : Escherichia coli EDTA : Ethylene diamine tetra- acetic acid Kb : Kilo base LB : Luria Bertani OD : Optical density PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi RNA Ribonucleic Acid TAE : Tris - Acetate - EDTA Taq : Thermus aquaticus T0 : Thế hệ chuyển gen T0 (cây chuyển gen tái sinh từ chồi ống nghiệm) v/p : vòng / phút X-gal : 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường tái sinh in vitro đậu tương 20 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách DNA tổng số 23 Bảng 2.3 Triǹ h tự nucleotide của các că ̣p mồ i PCR 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.5 Chu kì nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 3.1 Kết biến nạp gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 32 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hạt giống đậu tương ĐT12 17 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen GmDREB2 18 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào đậu tương qua nách mầm 21 Hình 3.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu biến nạp 27 Hình 3.2 Giai đoạn gây tổn thương nách mầm biến nạp 28 Hình 3.3 Giai đoạn tạo đa chồi kéo dài chồi 30 Hình 3.4 Giai đoạn rễ trồng đậu tương chuyển gen ĐT12 giá thể 31 Hình 3.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số hệ T0 33 Hình 3.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt đoạn promoter 35S cấu trúc mang gen chuyển GmDREB2 đậu tương chuyển gen 34 Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển GmDREB2 cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2Cmyc-SacI từ hệ gen đậu tương chuyển gen hệ T0 … 35 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) gọi đậu nành trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Khó có tìm thấy trồng có tác dụng nhiều mặt đậu tương [5] Việt Nam nước nông nghiệp nhiệt đới, trồng đậu tương với ba mục đích giải vấn đề thiếu protein cho người gia súc, xuất cải tạo đất Cả nước hình thành vùng sản xuất đậu tương, vùng Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, đồng sông Hồng, đồng sông Cửu Long, đồng ven biển miền Trung Tây Nguyên Tuy nhiên, sản lượng đậu tương nước ta thấp, nên phải nhập từ nước để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng làm thức ăn cho gia súc [1] Trong năm gần đây, tượng biến đổi khí hậu ảnh hưởng nghiêm trọng đến nhiều nước giới có Việt Nam Đặc biệt tượng nóng lên trái đất, dẫn đến tình trạng thiếu nước trầm trọng số nơi Điều ảnh hưởng lớn tới ngành nông nghiệp nước ta, có đậu tương Đậu tương mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc nhóm chịu hạn kém, thiếu nước thời kì khác làm giảm suất chất lượng trồng Đặc tính chịu hạn đậu tương tính trạng đa gen, sản phẩm gen liên quan trực tiếp đến biểu đặc tính chịu hạn có chức điều hòa nhóm gen chịu hạn Cho đến nay, nhà khoa học chưa xác định gen định đến khả chịu hạn thực vật Để chống lại điều kiện bất lợi ngoại cảnh, đặc biệt hạn hán thể thực vật sản xuất nhiều loại protein, có DREB DREB có vai trò kích thích hoạt động phiên mã nhóm gen chịu hạn, nhân tố phiên mã đóng vai trò quan trọng biểu gen chịu hạn đậu 30 A B C D Hình 3.3 Giai đoạn tạo đa chồi kéo dài chồi A: Cảm ứng tạo đa chồi SIM tuần bổ sung BAP 2mg/l kanamycine; B: Cảm ứng tạo đa chồi SIM tuần bổ sung BAP 2mg/l kanamycine; C: Kéo dài chồi SEM tuần (bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l); D: Kéo dài chồi SEM tuần (bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l) Khi chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5cm chuyển sang môi trường rễ (RM) có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo hoàn chỉnh (Hình 3.4) 31 A B CC Hình 3.4 Giai đoạn rễ trồng đậu tương chuyển gen ĐT12 giá thể A, B: Ra rễ môi trường RM bổ sung thêm 250 mg/l cefotaxim 20 ngày; C : Ra trồng giá thể Thí nghiệm biến nạp cấu trúc chứa gen GmDREB2 qua nách mầm nhờ A.tumefaciens thực lặp lại lần với lô đối chứng (ĐC0 ĐC1) ĐC0 lô mà mảnh mầm đậu tương không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1 lô mà mảnh mầm đậu tương không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Kết thí nghiệm chuyển gen đối chứng trình bày bảng 3.1 Kết thống kê bảng 3.1 cho thấy, 300 mẫu biến nạp cấu trúc chứa gen GmDREB2 có 203 mẫu tạo đa chồi, có 393 chồi sống sót Lựa chọn 197 chồi để kéo dài số chồi cho rễ 60, số cho giá thể 20 có sống sót Đối với lô đối chứng ĐC0, với 30 mẫu biến nạp kết chồi tạo thành, chồi kéo dài, rễ giá thể Đối với lô đối chứng ĐC1, với 30 mẫu biến nạp có 20 mẫu tạo đa 32 chồi, có 35 chồi sống sót, có 20 chồi kéo dài 15 chồi chuyển vào môi trường rễ, số đưa giá thể 15 cây, có 10 sống sót Như giai đoạn tái sinh in vitro, kết chọn lọc kháng sinh thu đậu tương chuyển gen T0 Các đậu tương chuyển gen T0 ký hiệu là: ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 Hiệu suất chuyển gen giai đoạn chọn lọc kháng sinh chiếm tỷ lệ 1,67% Bảng 3.1 Kết biến nạp gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 Lô đối Số mẫu Số mẫu chứng biến nạp tạo đa thí nghiệm chồi Số chồi sống sót Số chồi kéo dài Số chồi rễ ĐC0 30 0 0 ĐC1 30 20 35 20 100 68 136 100 55 100 300 Tổng TN (1, 2, 3) Số Số trồng sống sót giá thể 0 15 15 10 67 20 109 45 15 80 148 85 25 203 393 197 60 20 Ghi chú: ĐC0*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 33 3.2 PHÂN TÍCH SỰ CÓ MẶT CỦA GEN CHUYỂN GmDREB2 TRONG CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN Ở THẾ HỆ T0 Kết tách chiết DNA từ hệ gen đậu tương chuyển gen không chuyển gen Các đậu tương chuyển gen hệ T0 sống sót giá thể tiến hành kiểm tra có mặt cấu trúc mang gen chuyển pBI121GmDREB2 Thu non đậu tương không chuyển gen đậu tương chuyển gen để tách chiết DNA tổng số đệm CTAB, điện di sản phẩm tách chiết DNA, nhuộm chụp ảnh ánh đèn tia cực tím Kết điện di DNA tổng số hình 3.5 cho thấy DNA tổng số thu từ không chuyển gen chuyển gen đảm bảo chất lượng cho phản ứng PCR  Hình 3.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm DNA hệ T0 1: Hình ảnh DNA tổng số tách từ không chuyển gen; 2, 3, 4, 5, 6: DNA tổng số tách từ đậu tương chuyển gen T0 Do độ nhạy cao PCR đồng thời thao tác đơn giản, cần thời gian ngắn cho lượng DNA theo mong muốn, phương pháp PCR ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực quan trọng nghiên cứu 34 phân tích hệ gen sinh vật, có PCR sử dụng để xác định kết biến nạp cấu trúc mang gen chuyển chuyển gen PCR phương pháp nhanh, xác để đánh giá chuyển gen Chính lý mà thí nghiệm tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 35S-F/35S-R để kiểm tra có mặt vecter mang cấu trúc pBI121GmDREB2 đậu tương chuyển gen Vector tor chuyển gen pBI121 chứa promoter 35S cặp mồi 35S-F/35S-R nhân đoạn 35S dự tính có kích thước 314 bp Hình 3.6 trình bày kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn promoter 35S cấu trúc pBI121 ( 0,5 kb M (+) (-)  0,25 kb   0,3 kb Hình 3.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt đoạn promoter 35S cấu trúc mang gen chuyển GmDREB2 đậu tương chuyển gen M: thang DNA 1kb; 1, 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05; (+): sản phẩm PCR từ vector pBI121; (-): kết PCR từ hệ gen không chuyển gen Hình 3.6 cho thấy băng DNA có kích thước khoảng 0,3 kb xuất đối chứng dương (+), vector pBI121-GmDREB2 chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05, đối chứng âm (-) 35 băng DNA kích thước Như vậy, cấu trúc pBI121-GmDREB2 có mặt chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 hệ T0 Tiếp theo thí nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi GmDREB2BamHI/GmDREB2-Cmyc-SacI để xác định có mặt gen chuyển GmDREB2 đậu tương chuyển gen T0 thu sau tiến hành thí nghiệm chuyển gen Hình 3.6 trình bày kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB2 từ DNA không chuyển gen chuyển gen hệ T0 (+) M 0,75 kb (-) 0,5 kb  ~ 0,55 kb Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển GmDREB2 cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2-cmyc-SacI từ hệ gen đậu tương chuyển gen hệ T0 M: thang DNA 1kb; 1, 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR nhân gen GmDREB2 từ hệ gen chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT1205; (+): sản phẩm PCR gen GmDREB2 từ vector pBI121-GmDREB2; (-) kết PCR từ hệ gen không chuyển gen 36 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR nhân gen GmDREB2 hình 3.6 cho thấy đối chứng dương (vector pBI121-GmDREB2) chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 tồn băng DNA có kích thước khoảng 0,55 kb Theo tính toán lý thuyết, cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2-Cmyc-SacI nhân đoạn DNA gồm gen GmDREB2 trình tự nucleotide cho hoạt động cắt hai enzyme BamHI SacI 498 bp; đoạn Cmyc KDEL có kích thước 33+12 = 45 bp dự tính sản phẩm PCR với cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2-CmycSacI nhân đoạn DNA có kích thước 498 + 45 = 543 bp Như vậy, kết PCR thu đoạn DNA có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (543 bp) sở để nhận xét gen chuyển GmDREB2 chuyển thành công vào giống đậu tương ĐT12 Gen GmDREB2 đậu tương có kích thước 480 bp intron; gen GmDREB2 phân lập từ mRNA (cDNA) đậu tương có kích thước 480 sử dụng làm gen chuyển Gen GmDREB2 nội sinh gen chuyển GmDRER2 có kích thước 480 bp, kiểm tra có mặt gen chuyển cách nhân đoạn gen GmDREB2 (480 bp) PCR Chính vậy, cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2-Cmyc-SacI cho PCR sử dụng để nhân đoạn DNA gồm gen GmDREB2, Cmyc, KDEL trình tự cắt BamHI SacI (543 bp) Cả hai thí nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR nhân đoạn promoter 35S gen GmDREB2 cho kết đậu tương chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 hệ T0 Hiệu suất chuyển gen giai đoạn kiểm tra gen chuyển PCR 4/300 = 1,33% 37 3.3 THẢO LUẬN 3.3.1 Thảo luận vector pBI121 promoter 35S Plasmid pBI121 có kích thước 13,0kb, có khả tự chép độc lập tích cực tế bào vật chủ; có kích thước nhỏ, dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập chép; mang số dấu hiệu chọn lọc giúp phân biệt tế bào mang plasmid tái tổ hợp với tế bào plasmid tái tổ hợp; tồn bền vững tế bào vật chủ Các đặc tính sở định thành phần plasmid với: Gen quan tâm đợc gắn thêm đoạn khởi động đoạn kết thúc; gen thị chọn lọc Plasmid pBI121 dạng Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens cải biến cách loại bỏ gen gây độc gắn vào gen kháng kháng sinh để chọn lọc phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, promoter 35S sử dụng rộng rãi nhờ khả hoạt động mạnh nhiều loại mô hai mầm, nhiên lại hoạt động mầm Promoter 35S promoter mạnh phân lập từ virus gây bệnh khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV), promoter mạnh khởi động phiên mã cho gen tất loại mô bào thực vật tất giai đoạn sinh trưởng phát triển Promoter 35S dài 350bp, gồm thành phần: Hộp TATA ( vị trí từ- 46 đến + 8); vùng tăng cường A (enhancer) từ vị trí - 90 đến - 46, làm tăng biểu gen ngoại lai rễ; vùng tăng cường B (enhancer) từ vị trí -343 đến 90, làm tăng biểu gen chuyển [27] 3.3.2 Thảo luận kết biến nạp, tái sinh chuyển gen xác định có mặt gen chuyển chuyển gen Kết thí nghiệm chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 qua lần biến nạp với 300 mẫu thu sống sót, Lò Thị Mai Thu chuyển gen vào hai giống đậu tương ĐT12 DT2008 giai đoạn 38 thu 16 sống sót từ 370 mẫu giống đậu tương ĐT12 32 sống sót từ 850 mẫu giống đậu tương DT2008 [8]; Lò Thanh Sơn (2015) chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 với 380 mảnh mầm thu sống sót [7]; Nguyễn Thu Hiền (2011) chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 thu 32 phát triển giá thể từ 650 mẫu biến nạp [3]; Nguyễn Thúy Hường (2011) chuyển gen vào giống đậu tương DT84 1262 mẫu biến nạp thu 28 sống sót [4] So sánh với kết tác giả Nguyễn Thị Thúy Hường, Lò Thị Mai Thu, Lò Thanh Sơn, Nguyễn Thu Hiền nhận thấy kết chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 thấp Điều yếu tố hóa chất, yếu tố thời vụ, kĩ thuật thao tác… đặc biệt đậu tương thời vụ từ bình sang giá thể đem trồng vườn điều kiện tự nhiên tốt vụ xuân hè Kết xác định có mặt gen chuyển với đậu tương chuyển gen GmDREB2 hệ T0 thu dương tính với phản ứng PCR So sánh với kết tác giả Lò Thị Mai Thu, thí nghiệm chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 với 370 mẫu thu dòng dương tính với PCR, với giống DT2008 850 mẫu thu 19 dòng dương tính [8]; nghiên cứu Lò Thanh Sơn, 380 mẫu biến nạp thu dòng đậu tương DT84 dương tính với PCR [7]; Nguyễn Thu Hiền biến nạp 650 mẫu thu dòng dương tính với PCR [3]; Nguyễn Thị Thúy Hường tiến hành viến nạp 1262 mẫu giống đậu tương DT84 thu dòng chuyển gen dương tính với PCR [4] Như nhận xét chung hiệu suất chuyển gen đậu tương thấp đậu tương loài khó tiếp nhận gen Cần phải có nghiên cứu sâu để làm rõ nguyên nhân dẫn đến hiệu suất tiếp nhận gen thấp tìm kiếm biện pháp tăng cường hiệu chuyển gen đậu tương 39 3.3.3 Thảo luận hiệu suất chuyển gen đậu tương Đối với giai đoạn chọn lọc kháng sinh ống nghiệm, thí nghiệm chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 qua lần biến nạp với 300 mẫu thu 60 chồi rễ 20 trồng giá thể, có sống sót Hiệu suất chuyển gen giai đoạn 5/300 = 1,67% Cũng theo phương pháp chuyển gen qua nách mầm hạt chín đậu tương nhờ A tumefaciens, Lò Thị Mai Thu (2014) chuyển cấu trúc CPi (SMV – BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 DT2008 giai đoạn hiệu suất 4,32% 3,76% [8]; Lò Thanh Sơn (2015) chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất chuyển gen giai đoạn 2,37% [7]; Nguyễn Thu Hiền (2011) chuyển gen HA1 vào giống đậu tương ĐT12, hiệu suất 2,37% [3]; Nguyễn Thúy Hường (2011) chuyển gen vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất 2,22% [4] So sánh với kết thí nghiệm nhận thấy rằng, hiệu suất chuyển gen giai đoan thấp hiệu suất chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 DT2008 Lò Mai Thu 2,65% 2,09%; thấp hiệu suất chuyển gen vào giống đậu tương DT84 Lò Thanh Sơn 0,7%; thấp hiệu suất chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 Nguyễn Thu Hiền 3,25% thấp kết chuyển gen Nguyễn Thị Thu Hường vào giống đậu tương DT84 0,55% Ở giai đoạn trồng giá thể tự nhiên, kết PCR phân tích có mặt gen chuyển thí nghiệm chuyển gen cho thấy, dòng đậu tương chuyển gen tạo ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT1203, ĐT12-04, ĐT12-05 có dòng đậu tương ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT1204, ĐT12-05 xác định có mặt gen chuyển, với hiệu suất chuyển gen giai đoạn 1,33% 40 Trong kết nghiên cứu Lò Thị Mai Thu (2014) chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 với 370 mẫu thu dòng dương tính với PCR, hiệu suất chuyển gen giai đoạn 1,35%, với giống DT2008 hiệu suất chuyển gen 2,24% [8]; Lò Thanh Sơn (2015) hiệu suất đạt 0,27% [7]; kết Nguyễn Thu Hiền (2011) hiệu suất 1,23% [3]; kết nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy Hường hiệu suất chuyển gen giai đoạn đạt 0,23% [4] So sánh kết kiểm tra gen PCR với nghiên cứu nhận thấy, hiệu suất chuyển gen giai đoạn thấp hiệu suất chuyển gen Lò Mai Thu với giống ĐT12 0,02% giống DT2008 0,91%; cao hiệu suất chuyển gen vào giống DT84 Lò Thanh Sơn 1,06%; cao nghiên cứu chuyển gen HA1 vào giống đậu tương ĐT12 Nguyễn Thu Hiền 0,1% cao kết Nguyễn Thị Thúy Hường 1,1% 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Cấu trúc pBI121-GmDREB2 đươ ̣c biến nạp thành công vào giống đậu tương ĐT12 qua mô nách mầm thông qua chủng A tumefaciens 1.2 Các mẫu biến nạp tái sinh in vitro, chọn lọc kháng sinh tạo đậu tương chuyển gen Kết có 203/300 mẫu biến nạp tạo đa chồi, 393 chồi sống sót, có 197 chồi chọn lọc môi trường kéo dài chồi số chồi cho rễ 60 Số chuyển gen trồng giá thể 20 có sống sót điều kiện nhà lưới, hiệu suất chuyển gen giai đoạn 1,67% (5/300) 1.3 Phân tích có mặt gen chuyển GmDRB2 dòng hệ T0 thu chuyển gen dương tính với PCR, hiệu suất chuyển gen đạt 1,33% (4/300) Đề nghị Cần tiếp tục theo dõi phân tích có mặt gen chuyển GmDREB2 dòng đậu tương chuyển gen tạo hệ để phục vụ chọn giống đậu tương chịu hạn 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Thu Hiền (2011), Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt virus H5N1 vào đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ đậu tương, Luận án Tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên Lò Thị Mai Thu (2014), Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo đậu tương chuyển gen kháng bệnh, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu tương - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp 43 Tài liệu tiếng Anh 10 Chen F., Chen S.Y and Liu Q (2002), “Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like protein induced by stresses”, GenBank, Accession AY064403 11 Chen M., Wang Q.Y., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q, Ma Y.Z (2007), “GmDREB2, a soybean DRE – binding transcription factor, conferred droungt anh high – salt tolerance in transgenic plants”, Biochem Biophys Res Commun 353(2), pp 299 – 305 12 Huang B., Jin L and Liu J (2007), “Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton”, Sci China Life Sci 50 (1), pp 7-14 13 Hussain SS, Ali M, Ahmad M, Siddique KH (2011), “Polyamines: natural and engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants” Biotechnol Adv 29, pp 300-311 14 Kobayashi F, Ishibashi M, Takumi S (2008), “Transcriptional activation of Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression of a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco” Laboratory of Plant Genetics, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, 657-8501, Japan 15 Matsukura S., Mizoi J., Yoshida T., Todaka D., Ito Y., Maruyama K., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2010), “Comprehensive analysis of rice DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes”, Mol Genet Genomics 283, pp 185–196 44 16 Mizoi J, Ohori T, Moriwaki T, Kidokoro S, Todaka D, Maruyama K, Kusakabe K, Osakabe Y, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K., 2013 Plant Physiol 161(1):346-361 17 Olhoft, P.M., D.A Agrobacteriummediated Somers, (2001), T-DNA “L-Cysteine delivery into increases soybean cotyledonarynode cells”, Plant Cell Rep 20, pp 706-711 18 Ratcliffe OJ, Riechmann JL (2002), “Arabidopsis transcription factors and the regulation of flowering time: a genomic perspective” Curr Issues Mol Biol 4, pp.77–91 19 Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang CZ, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR, Crelman R, Pilgrim M, Broun P, Zhang JZ, Ghandehari D, Sherman BK, Yu GL (2000), “Arabidopsis transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes”, Science 290, pp.2105–2110 20 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA 81: 8014-8018 21 Wang N., Liu M., Cheng X and Ma Y (2006), “Glycine max DREB protein (DREB2) gene,completecds“ GenBank, Accession DQ054363.1 22 Wang S, Yang S, Yin Y, Guo X, Wang S, et al (2009), “An in silico strategy identified the target gene candidates regulated by dehydration responsive element binding proteins (DREBs) in Arabidopsis genome” Plant molecular biology 69: 167–178 Internet 23 http://dtnguyenlythongke.blogspot.com/2014/02/thiet-ke-ti-plasmid-taito-hop-pbi121.html ... cường biểu gen liên quan đến khả chịu hạn Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: Nghiên cứu chuyể n gen GmDREB2 vào giố ng đậu tương ĐT12 Mục tiêu nghiên cứu Chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2. .. GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 phu ̣c vụ ta ̣o dòng đậu tương chuyể n gen chịu hạn Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 qua nách mầm... mang gen chuyển GmDREB2 đậu tương chuyển gen 34 Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển GmDREB2 cặp mồi GmDREB2- BamHI/GmDREB2Cmyc-SacI từ hệ gen đậu tương