Qui trình kiểm dịch nhập khẩu giống cây có múi Qui trình kiểm dịch nhập khẩu giống cây có múi Qui trình kiểm dịch nhập khẩu giống cây có múi Qui trình kiểm dịch nhập khẩu giống cây có múiQuy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực trừ nhện hại cây có múi của các thuốc trừ nhệnQuy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực trừ nhện hại cây có múi của các thuốc trừ nhện
10 TCN 549 - 2002 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật Nhóm B tiêu chuẩn ngành 10 TCN 549 - 2002 Qui trình Kiểm dịch nhập giống có múi Import quarantine procedure for citrus variety Phạm vi đối tợng áp dụng - Quy trình áp dụng cho việc Kiểm dịch thực vật lô giống có múi nhập vào lãnh thổ Việt Nam qua cửa đờng bộ, đờng thuỷ, đờng sắt, đờng hàng không, sở Kiểm dịch thực vật Sau nhập sở cách ly khác phạm vi nớc Thuật ngữ định nghĩa Trong qui trình thuật ngữ dới đợc hiểu nh sau: - Cây có múi: Bao gồm ăn thuộc họ Rutaceae - Giống có múi: Bao gồm hạt, phận có múi dùng để nhân làm giống - Giống có múi nhập nội: Là giống có múi đợc nhập vào lãnh thổ Việt Nam - Điều kiện cách ly: Là điều kiện tách biệt với bên trồng cây, tác nhân sinh học lan truyền xâm nhập từ vào - Kiểm dịch Sau nhập khẩu: Là biện pháp kỹ thuật kiểm tra sinh vật hại tiềm ẩn lô giống nhập điều kiện cách ly - Sinh vật hại tiềm ẩn: Là sinh vật hại theo giống nhập nhng mắt thờng phơng tiện thô sơ cha phát đợc Trình tự bớc kiểm dịch 3.1 Kiểm dịch cửa 3.1.1 Kiểm tra hồ sơ giấy tờ - Thực theo qui định hành Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn - Các giấy tờ có liên quan (Nếu có) 90 10 TCN 549 - 2002 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật 3.1.2 Kiểm tra lô giống nhập Việc kiểm tra lô giống nhập đợc áp dụng theo TCVN 473189;10 TCN 336 - 98; 10 TCN 337 - 98;10 TCN 338 - 98 3.2 Kiểm dịch Sau nhập 3.2.1 Kiểm tra sơ sinh vật hại lô giống nhập 3.2.2 Xử lý trớc gieo trồng - Nếu nuôi cấy mô xử lý - Nếu hạt giống phải đợc ngâm dung dịch 8Hydroxyquinoline Sunphat 1% phút - Nếu cây, phận loại sản phẩm khác: + Phải đợc khử trùng Methyl Bromide (CH3Br); + Nhúng dung dịch Sodium Hypochlorite (Na ClO 4H2O) có chứa 1% clo phút; 3.2.3 Gieo trồng: Các vật liệu giống đợc nhân trồng điều kiện cách ly 3.2.4 Kiểm tra sinh vật tiềm ẩn: Kiểm tra vật liệu giống nhập sở Kiểm dịch thực vật Sau nhập nhằm xác định sinh vật gây hại tiềm ẩn Riêng bệnh Vi khuẩn, Virus, Viroid Mycoplasma sử dụng phơng pháp cụ thể sau để chẩn đoán: + PCR - Phản ứng chuỗi Polymerasa (Polymerasa Chain Reaction) + ELISA - Men liên kết miễn dịch (Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assays) + Chỉ thị sinh học (Biological Indexing) (Các phơng pháp đợc giới thiệu phụ lục kèm theo) 3.2.5 Thời gian kiểm tra Thời gian kiểm tra sở Kiểm dịch thực vật Sau nhập từ - 12 tháng 3.2.6 Kết kiểm tra Danh mục Đối tợng Kiểm dịch thực vật sinh vật hại tiềm ẩn phát đợc giống có múi nhập 3.2.7 Kết luận 1) Tình hình dịch hại 2) Xử lý lô giống 3) Cấp giấy chứng nhận Kiểm dịch thực vật Sau nhập (nếu đủ điều kiện) 91 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật 10 TCN 549 - 2002 Phụ lục Kiểm dịch thực vật Sau nhập Kiểm tra Kiểm dịch Sau nhập Bảng Các phơng pháp kiểm tra Phản ứng chuỗi Polymerasa Sử dụng chẩn đoán số loại bệnh ẩn Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza closterovirus) Xylella fastidiosa Spiroplasma citri Virus lùn Satsuma (Satsuma dwarf ilarvirus) Virus nhỏ cam quýt (Citrus tatter leaf capillovirus) Men liên kết miễn dịch Chỉ thị sinh học Các loài Các giống thị Citrus sinensis Cam Citrus limon Chanh Eureka Citrus medica L Chanh Yên Citrus aurantifolia Chanh Tây ấn Tổ hợp Virus bệnh đốm (Psorosis complex) Spiroplasma citri Liberobacter asiaticum Liberobacter africanum Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza closterovirus) Virus quăn cam quýt (Citrus leaf rugose virus) Virus khảm (Citrus variegation ilarvirus) Viroid vẩy vỏ (Citrus exocortis viroid) Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza closterovirus) Virus biến dạng gân (Citrus 92 10 TCN 549 - 2002 Poncirus trifoliata sinensis 1.1 X Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật veinenation virus) Chanh ba Bệnh nhỏ cam quýt (Citrus tatter C quất Swingle leaf capillovirus) Phơng pháp PCR Mỗi loài sinh vật có cấu trúc DNA khác giống loài có khác Trong giống, DNA loài có đoạn cấu trúc giống nhau, nhng có đoạn có cấu trúc khác mà cấu trúc đặc trng cho loài mà loài khác Đây sở di truyền để phân biệt loài loài khác Phơng pháp PCR nhằm nhân lên gấp bội số lợng đoạn DNA đặc trng để từ chẩn đoán xác đợc loài 1.2 Phơng pháp ELISA Kỹ thuật đợc dựa kết hợp men với kháng thể kháng nguyên thành vật đánh dấu men sau chúng lại có phản ứng với kháng nguyên kháng thể tơng ứng thành hợp chất miễn dịch men đánh dấu Men kết hợp hợp chất miễn dịch gặp chất đệm thúc đẩy phản ứng thuỷ phân chất đệm tạo màu vàng Tốc độ phản ứng thuỷ phân nhanh, màu vàng rõ, chứng tỏ men nhiều, điều chứng tỏ nồng độ kháng nguyên cao Do tính đặc hiệu phản ứng ELISA ta xác định đợc đặc tính kháng nguyên Bộ Kit để kiểm tra sử dụng cho bệnh sau: - Xylella fastidiosa - Spiroplasma citri - Lùn Satsuma (Satsuma dwarf ilarvirus) - Tàn lụi có múi (Citrus tristeza closterovirus) - Virus nhỏ có múi (Citrus tatter leaf cappillovirus) 1.3 Chỉ thị sinh học Dùng thị để xác định bệnh ẩn có múi hai mức nhiệt độ: * Nhiệt độ 18 - 25oC (tốt 20 - 22 oC) cho tác nhân gây bệnh sau: - Virus tàn lụi có múi (Viruses Citrus tristeza closterovirus) - Virus biến dạng gân có múi (Citrus veinenation virus) - Virus khảm (Citrus varegation ilarvirus) 93 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật 10 TCN 549 - 2002 - Vius quăn có múi (Citrus leaf rugose virus) - Virus bé có múi (Citrus tatter leaf capillovirus) * Nhiệt độ 25 - 35oC (tốt 30 - 35 oC) cho tác nhân gây bệnh: - Viroid vảy vỏ có múi (citrus exocortis viroid) - Viroid mạch dẫn có múi (citrus cachexia viroid) - Spiroplasma citri - Liberobacter asiaticum - Liberobacter africanum Bảng 1.3.1 Số thị cần nhân giống Cam Số chậu (15cm) Số chậu Chanh Eureka Chanh Tây ấn Chanh Rusk Cam Chanh yên 2 Dải nhiệt độ Lạnh 18-25oC Nóng 25-35oC Cây thị Bảng 1.3.2 Cây thị dùng cho việc kiểm tra bệnh Cây thị thích hợp Bệnh Cachexia (Xyloporosis) Chanh yên Cây thị khác - Chanh sần - Poncirus trifoliata Virus quăn (Citrus leaf Chanh Tây ấn rugose) - Citrus limon Virus khảm variegation) Đậu tơng đậu đen (Citrus Chanh yên - Bởi đỏ Duncan Giòn (Crinkly leaf) Chanh Eureka - Cristacortis Cam - Quýt Orlando - Cam chua Vảy vỏ (Exocortis) Chanh yên Chanh sần Greening and Dieback Cam - Quýt Sexton 94 10 TCN 549 - 2002 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật Cây thị thích hợp Bệnh Cây thị khác - Bởi Duncan Impietratura Cam Bởi Tổ hợp bệnh đốm Virus Cam (Psorosis complex) Quýt Emperor Homosassa, - Chanh Tây ấn Đốm vòng dòngB Cam (Ringspot (Psorosis B )) - Lùn Satsuma dwarf) - Quýt Satsuma (Satsuma - Sesamum indicum Stubborn Cam - Quất Sexton - Bởi Duncan Nhỏ lá/Lùn (Tatter Chanh ba leaf/ stunt) quất Swingle - Chanh Troyer Đậu cilindrica) đen (Vigna - Citrus excelsa - Nicotiana clevelandii Hai chủng tàn lụi cam Chanh Tây ấn quýt (Tristeza stem Chanh Eureka pitting and seedling Chanh Mexica yellows) - Cam đắng Seville Biến dạng gân/U thân Chanh Tây ấn gỗ (Vein enation/ woody Gall) Chanh sần Cam chua aurantium) (Citrus Bảng 1.3.3 Triệu chứng bệnh thị Dải nhiệt độ Bệnh Quăn (Citrus leaf rugose) Biến dạng gân (Citrus variegation) Giòn (Crinkly leaf) Cristacortis 95 Cam Chanh Eureka Chanh Tây ấn CF LP Chanh ba lá, quýt Chanh yên AS AS OL LP Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật Lạnh Nóng Impietratura Đốm dòng A (Psorosis A) Đốm dòng B (Psorosis B) Nhỏ lá/lùn (Tatter leaf / stunt) Đốm tàn lụi (Tristeza stempitting) Vàng tàn lụi (Tristeza yellows) Biến dạng/u thân gỗ (Veinenation / woody gall) Exocortis Greening and dieback Stubborn 10 TCN 549 - 2002 OL CF OL CM &S CVF&WP LY & S VE LE VY & LM CM AS - Asteroid spots (đốm dạng sao) (đốm vàng) CF - Chlorotic flecks CM - Chlorotic mottling (đốm màu) flecking (đốm màu gân) CVF - Chlorotic vein vàng LE - Leaf epinasty LP - Leaf puckering (nhăn lá) lá) OL - Oak leaf pattern (dải sùi lá) VE - Veinenation (biến dạng gân) gân) LM - Leaf mottle (đốm lá) LY - Leaf yellowing (vàng S - Stunting (lùn cây) VY - Vein yellowing (vàng WP - Wood pitting (Đốm thân gỗ) Nhân giống, chăm sóc bảo quản sở Sau nhập 2.1 Nhân gốc ghép thị Các hạt đợc gieo để làm thị sinh học gốc ghép đợc lấy từ sở bệnh có uy tín, hạt đem gieo khay để nhiệt độ 20 - 25 oC Cây thị chanh yên (Citrus medica L.) đợc nhân giống từ cành nhiệt độ 30 - 35 oC Cây đợc trồng hỗn hợp chất độn (của Trờng Đại học California) theo tỷ lệ thể tích phù hợp gồm: than bùn : cát bột đá phân vô đợc tiệt trùng theo phơng pháp Paster (ở 60oC 30 phút) thêm vào nhiều 10% vỏ trấu (tính theo thể tích) 96 10 TCN 549 - 2002 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật Trớc sử dụng làm thị gốc ghép không bón thúc cho Sau chuyển chúng vào chậu túi nilon có chứa 250 300g hỗn hợp chất theo công thức Trờng Đại học California Nếu biểu triệu chứng thiếu dinh dỡng bón bổ sung hỗn hợp chất độn với tỷ lệ máu khô bột xơng: Dolomit Sau đa đợc ghép trồng điều kiện nhiệt độ 30 - 35oC 2.2 Nhân giống từ mắt ghép Hai đợc nhân giống từ mắt ghép gốc chanh Sần Ba đến bốn tuần sau ghép mắt, cắt chồi nách chanh sần để tập trung cho mắt ghép phát triển Chọn làm thị Nếu cần tiến hành ghép đỉnh sinh trởng Cây đợc nhân lên từ thị đợc trả lại cho chủ hàng 2.3 Phòng trừ dịch hại Sử dụng thuốc hoá học, dầu thực vật thuốc sinh học để phòng trừ sinh vật hại nhà kính Các sinh vật hại thờng có nhện hai chấm, nhện to bụng, rệp phấn, rệp sáp Chú ý rệp muội đen có múi phải đợc sớm diệt trừ triệt để nhằm ngăn chặn việc truyền Virus Loại bỏ tác nhân gây bệnh nhân giống Ghép đỉnh sinh trởng kỹ thuật nhân dòng giống có múi đợc loại bỏ bệnh, với khả tạo dòng Virus tác nhân gây bệnh khác Tất có múi phải đợc ghép đỉnh sinh trởng lần trớc xuất khỏi sở Kiểm dịch Sau nhập Điều có nghĩa đảm bảo Xanthomonas campestris pv citrumelo, phytoplasma, Viroid Virus Các bớc kiểm tra đợc làm nhiều lần đến cho kết kiểm tra khẳng định bệnh Những gốc ghép đợc sản xuất từ tổ chức giới có chứng nhận đạt tiêu chuẩn không cần phải ghép lại Việt Nam 3.1 Mắt ghép dùng ghép đỉnh sinh trởng Việc ghép đỉnh sinh trởng đợc thực có mắt ghép thích hợp đợc đa tới Nếu có chồi ghép nhập không thích hợp cho việc ghép ban đầu mắt ghép đợc ghép vào thân mẹ sau chọn mắt ghép thời điểm thích hợp để tiến hành ghép 3.2 Xử lý mắt ghép để ghép đỉnh sinh trởng Tiệt trùng bề mặt mắt ghép trớc bắt đầu ghép Nhúng mắt ghép dung dịch Ethanol 70 % phút, sau nhúng dung dịch Clorin (Clo) 0,2% Sodium hypochrorite 97 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật 10 TCN 549 - 2002 10 phút Bảo quản mắt ghép nhiệt độ 26 oC cát ẩm tiệt trùng với chu kỳ chiếu sáng 16 đến đem sử dụng 3.3 Sản xuất gốc ghép để ghép đỉnh sinh trởng Sử dụng chanh ba lá, chanh sần Citrus grandis (Chỉ dùng cho giống Pomelo) làm gốc ghép Lấy hạt từ tơi sau rửa thịt Tách bỏ lớp vỏ hạt bảo quản giấy lọc ẩm đến đem sử dụng Khử trùng bề mặt hạt dung dịch Clorin 0,5 % Sodium hypochlorite (Có chứa 1% clo) 10 phút Sau rửa kỹ nớc tiệt trùng tối thiểu lần Đa hạt vô trùng vào môi trờng Agar để buồng cấy, sau đa vào tủ ấm 26 oC bóng tối Nếu hạt không dùng sau tách khỏi quả, ta phơi giá đỡ Hạt đợc tiệt trùng bề mặt đợc bảo quản cách nhúng dung dịch Clorin % Sodium hypochlorite Sau tiến hành làm nh hạt tơi Sau - ngày hạt mọc Chuẩn bị ống nghiệm để trồng giữ môi trờng đồng có chứa môi trờng hỗn hợp Murshige Skoog + đờng + agar, tiệt trùng 121 oC 20 phút Đặt hạt nảy mầm lên bề mặt agar ống nghiệm nuôi cấy chồi bắt đầu mọc Khi chồi ghép đạt đến độ dài thích hợp - cm, sau 10 - 12 ngày đa ống nghiệm vào buồng tối - oC Chọn thẳng đa vào buồng lạnh để ghép chồi đỉnh Thời gian lu giữ năm 3.4 Ghép đỉnh sinh trởng Ngâm dụng cụ cồn 70% khoảng trớc dùng Chuẩn bị mẩu dao cạo tra vào cán Nhúng dao cắt vào chất tẩy sau làm cồn hơ khô lần cắt Không làm cháy lỡi dao sau nhúng cồn Thay đổi lỡi dao chúng bị cùn Tiệt trùng bề mặt cành ghép trực tiếp dung dịch Clorin 0,5 % Sodium hypochlorite 5-10 phút, tuỳ thuộc vào điều kiện cành ghép Nếu chúng đợc tiệt trùng trồng cát, chúng đợc sử dụng Nếu chúng bị nhiễm bẩn đặt chúng vải xử lý dung dịch Chlorin 0,01 % Sodium hypochlorite phút sau rửa cẩn thận lần nớc lọc Cắt tỉa mầm chồi bên, mở vết ghép hình chữ T tiến hành ghép Loại bỏ hết cành ghép để lộ mô phân sinh Sử dụng lỡi dao cho mô phân sinh Đặt mô phân sinh lên vết ghép đóng 98 10 TCN 549 - 2002 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật nắp vết ghép lại Đặt giấy lọc trồng ống nghiệm có hỗn hợp môi trờng Murshige Skoog + đờng + muối sắt hoà tan + White's vitamin Xử lý môi trờng nhiệt độ 121 oC 10 phút Giữ nhiệt độ 28 oC với chu kỳ chiếu sáng 16 Chăm sóc tối thiểu - tuần dài Cây cần đợc cắt tỉa mầm giai đoạn sinh trởng ống nghiệm chuyển vào môi trờng 3.5 Chuyển đợc ghép đỉnh sinh trởng khỏi ống nghiệm Sau - tuần, mắt ghép mọc chồi đợc cm với lá, đa khỏi ống nghiệm, tỉa bớt rễ trồng chậu có chứa hỗn hợp chất độn Giữ điều kiện ánh sáng yếu tuần Duy trì ẩm độ cao vài ngày đầu cách dùng nhựa che phủ Khi cứng cáp ta loại bỏ dần nhựa che phủ Có thể sử dụng biện pháp tơng tự nh thấy mắt ghép xanh nhng cha phát triển Hàng ngày tới 2g/l Ca(NO3)2 Kiểm tra dòng ghép để khẳng định loại bỏ hết bệnh 99 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật 3.6 10 TCN 549 - 2002 Môi trờng nuôi cấy Môi trờng Các hợp chất Hàm lợng Rắn Lỏng Dung dịch muối KNO3 1,90 g/l 1,90 g/l Murashige & Skoog NH4NO3 1,65 g/l 1,65 g/l CaCl2.2H2O 440 mg/l 440 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l 170 mg/l MnSO4.H2O 16,9 mg/l 16,9 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l 8,6 mg/l H3BO3 6,2 mg/l 6,2 mg/l Kl 0,82 mg/l 0,82 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l Na2-EDTA - 37,3 mg/l FeSO4.7H2O - 27,8 mg/l Myo-I-Inositol - 37,3 mg/l Nicotinic - 27,8 mg/l Pyridoxine - 100,0 mg/l Thiamine HCl - 1,0 mg/l Đờng Sucrose 30 g/l 1,00,2 mg/l Agar Agar 10 g/l 75 g/l Muối sắt hoà tan Một số chất khác 100 ... 3.1.2 Kiểm tra lô giống nhập Việc kiểm tra lô giống nhập đợc áp dụng theo TCVN 473189;10 TCN 336 - 98; 10 TCN 337 - 98;10 TCN 338 - 98 3.2 Kiểm dịch Sau nhập 3.2.1 Kiểm tra sơ sinh vật hại lô giống. .. nhận Kiểm dịch thực vật Sau nhập (nếu đủ điều kiện) 91 Tuyển tập tiêu chuẩn bảo vệ thực vật 10 TCN 549 - 2002 Phụ lục Kiểm dịch thực vật Sau nhập Kiểm tra Kiểm dịch Sau nhập Bảng Các phơng pháp kiểm. .. thực vật Sau nhập từ - 12 tháng 3.2.6 Kết kiểm tra Danh mục Đối tợng Kiểm dịch thực vật sinh vật hại tiềm ẩn phát đợc giống có múi nhập 3.2.7 Kết luận 1) Tình hình dịch hại 2) Xử lý lô giống 3) Cấp