Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (reverse hybridization

-Bệnh được chia làm 2 loại chính là alpha thalassemia α-thalassemia và beta thalassemia β-thalassemia tùy thuộc vào loại đột biến xảy ra ở gen αquy định tổng hợp chuỗi alpha globin, nằm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lýđào tạo sau Đại học, các Thầy giáo, Cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội đãgiúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoànthành luận văn

Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo, các bạn đồng nghiệp Trung tâmChẩn đoán trước sinh - Bệnh viện phụ sản Trung ương đã tạo điều kiện thuậnlợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và quá trình thu thập số liệu

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Hoàng Thị NgọcLan và TS Lương Thị Lan Anh, những người thầy đã tận tình, trực tiếphướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thànhluận văn này

Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ủng hộ,giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa học

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Lê Phương Thảo

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng

kỹ thuật lai phân tử (Reverse hybridization)” là đề tài do tôi thực hiện, tất cảcác số liệu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công

bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác Nếu sai, tôi xin hoàn toànchịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Lê Phương Thảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

LỜI CAM ĐOAN 2

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ 6

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ 8

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Bệnh Thalassemia

1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Đối tượng nghiên cứu 36

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 37

2.4 Cách thức tiến hành nghiên cứu 39

2.5 Hạn chế sai số trong nghiên cứu 47

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 47

2.7 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49

3.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 49

3.2 Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng phương pháp Reverse hybridization 50

3.3 Đánh giá giá trị của phương pháp 57

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 66

4.1 Đặc điểm của đối tượng tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 66

4.2 Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse hybridization và tỷ lệ các loại đột biến 71

4.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 77

KẾT LUẬN 83

1 Các đột biến gen được phát hiện bằng kỹ thuật Reverse hybridization 83

2 Giá trị của kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 83

KIẾN NGHỊ 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 85

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC VIẾT TẮT

NST Nhiễm sắc thể

DNA Deoxyribo Nucleotid Acid

PCR Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng khuếch đại chuỗi)SEA South East Asia

ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation

System Polymera Chain ReactionMLPA Multiplex Ligation-dependent Probe

AmplificationNOR Normal (Bình thường)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

Bảng 1.1 Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình thường

Bảng 1.2 Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường [16], [20]

Bảng 1.3 Kiểu gen và các thể bệnh α-thalassemia 13

Bảng 1.4 Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở người Việt Nam [11] 18

Bảng 1.5 Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gap-PCR 23

Bảng 1.6 Các đột biến gen β globin và mồi đặc hiệu 26

Bảng 1.7 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng β-Globin StripAssaySEA 30

Bảng 1.8 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng α-Globin StripAssay 31

Bảng 2.1 Các chỉ số nghiên cứu 38

Bảng 2.2 Chỉ dẫn cách đánh giá đột biến trên Teststrip 44

Bảng 2.3 Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen α globin 46

Bảng 2.4 Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen β globin 46

Bảng 3.1 Đặc điểm về dân tộc của thai phụ 49

Bảng 3.2 Tuổi thai ở thời điểm chọc hút dịch ối của đối tượng nghiên cứu .49

Bảng 3.3 Tiền sử đẻ con Thalassemia 49

Bảng 3.4 Tiền sử phù thai 50

Bảng 3.5 Tỷ lệ phát hiện đột biến 50

Bảng 3.6 Phân bố loại đột biến 50

Bảng 3.7 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh α -thalassemia 52

Bảng 3.8 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia 53

Bảng 3.9 Kiểu gen các thai được chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia .54

Bảng 3.10 Kiểu gen các trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia 54

Bảng 3.11 Kết quả chẩn đoán trước sinh cho 11 gia đình có con đầu mắc HbH hoặc β-thalassemia thể nặng 55Bảng 3.12 Đối chiếu kết quả về phân bố kiểu gen của thai từ 2 phương

pháp ARMS-PCR/gap-PCR và Reverse hybridization 57Bảng 3.13 Đối chiếu về kết quả xác định các dạng đột biến cụ thể 57Bảng 3.14 So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc α-

thalassemia) 59Bảng 3.15 So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc β-

thalassemia) 60Bảng 4.1 So sánh đặc diểm của 2 phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR và Reverse hybridization trong chẩn đoán Thalassemia 80

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Hình 1.1 Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb

Hình 1.2 Vị trí gen α globin trên NST 16

Hình 1.3 Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α

Hình 1.4 Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α

Hình 1.5 Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin 10

Hình 1.6 Vị trí gen β globin trên NST 11 14

Hình 1.7 Năm đột biến xẩy ra (đóng khung) ở vị trí đầu của intron thứ nhất của gen  globin 17

Hình 1.8 Chẩn đoán đột biến mất đoạn α+-thalassemia bằng multiplex gap-PCR 24

Hình 1.9 Chẩn đoán đột biến mất đoạn α0-thalassemia bằng multiplex gap-PCR 24

Hình 1.10 Chẩn đoán β-thalassemia bằng ARMS-PCR 25

Hình 1.11 Các vị trí đột biến trên Teststrip của β-Globin StripAssay SEA .32

Hình 1.12 Các vị trí đột biến trên Teststrip của α-Globin StripAssay 33

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu 39

Biểu đồ 3.1 Các loại đột biến gây bệnh α-thalassemia 51

Biểu đồ 3.2 Các loại đột biến gây bệnh β-thalassemia 52

Hình 3.1 Đồng hợp tử đột biến SEA 61

Hình 3.2 Dị hợp tử đột biến SEA 62

Hình 3.3 Không phát hiện đột biến gen 63

Hình 3.4 Đồng hợp tử đột biến CD17 64

Hình 3.5 Dị hợp tử đột biến kép CD41/42 / CD26 65

Hình 4.1 Sơ đồ sàng lọc trước sinh bệnh Thalassemia 69

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thalassemia là một dạng bệnh của huyết sắc tố hemoglobin (HST Hb) phổ biến trên thế giới Bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường,nguyên nhân là do đột biến gen gây giảm hoặc không tổng hợp protein globintham gia cấu tạo Hb, dẫn đến thiếu hụt Hb trong hồng cầu Trên thế giới, ướctính 7% dân số mang gen bệnh và mỗi năm có khoảng 300.000 ÷ 500.000 trẻđược sinh ra với thể đồng hợp tử nặng của bệnh này Tại Việt Nam, cókhoảng hơn 5 triệu người mang gen và bị bệnh Thalassemia, hàng năm cóthêm 100.000 trẻ mang gen bệnh và 1.700 trẻ mắc bệnh nặng do đột biến cả 2gen được sinh ra

-Bệnh được chia làm 2 loại chính là alpha thalassemia (α-thalassemia)

và beta thalassemia (β-thalassemia) tùy thuộc vào loại đột biến xảy ra ở gen α(quy định tổng hợp chuỗi alpha globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 16) hay gen

β (quy định tổng hợp chuỗi beta globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 11) Theothống kê, có trên 300 đột biến gen α và trên 200 đột biến gen β có liên quanđến bệnh Thalasemia , Cá thể đồng hợp tử mang 2 alen đột biến α-thalassemia loại SEA/ SEA gây bệnh Hb Bart’s, đây là thể nặng nhất của bệnhα-thalassemia Thai nhi mắc Hb Bart’s thường bị phù rau thai, thai chết lưutrong tử cung hoặc chết sớm sau sinh Thể này đặc biệt phổ biến ở các nướcĐông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Philippines Bệnh nhân β-thalassemiathể nặng hay còn gọi là thể Cooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép 2 đột biếnkhác nhau, thường có biểu hiện thiếu máu nặng dần sau 3 ÷ 6 tháng tuổi, phụthuộc vào truyền máu và thải sắt suốt đời Người bệnh Thalassemia thể ẩn làngười có kiểu gen dị hợp tử mang 1 alen đột biến, có thiếu máu nhược sắctrên huyết đồ nhưng lại không có biểu hiện trên lâm sàng Phương pháp điềutrị chủ yếu hiện nay đối với bệnh Thalassemia vẫn là truyền máu, thải sắt, cắt

lách và điều trị các biến chứng khi cần , , Quá trình này rất tốn kém mà hiệuquả không cao Vì thế, bệnh trở thành gánh nặng không chỉ cho bệnh nhân vàgia đình mà cho toàn xã hội [9] Đối với các trường hợp gia đình có bố mẹ làngười mang gen bệnh hoặc tiền sử sinh con Thalassemia thì biện pháp sànglọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia có ý nghĩa quan trọng và làphương pháp phòng ngừa hiệu quả nhất

Ở Việt Nam, để chẩn đoán bệnh Thalassemia chúng ta đang sử dụngphương pháp multiplex PCR (PCR đa mồi) để sàng lọc các đột biến: 5 độtbiến mất đoạn lớn của gen α globin như: SEA (South East Asia), THAI

(Thailand), FIL (Philippin), -α4.2, -α3.7 và các đột biến điểm HbQs, HbCs và 8đột biến phổ biến của gen β globin gây ra 95% các trường hợp β-thalassemiabao gồm: CD17 (AAG>TAG), CD41/42 (-TCTT), -28 (A>G), CD71/72 (+A),IVS 1.1 (G>T), IVS 1.5 (G>C), IVS 2.654 (C>T) và CD26 (GAG>AAG) ,xác định kiểu gen bằng kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification RefractoryMutation System Polymerase Chain Reaction) và giải trình tự vùng genglobin Các phương pháp này dễ dàng áp dụng cho việc phát hiện các đột biếnđơn lẻ đã biết, nhưng lại không có khả năng xác định cùng lúc nhiều đột biến.Hiện nay, kỹ thuật lai phân tử là một trong những kỹ thuật được dùng để chẩnđoán thay thế các phương pháp trên Kỹ thuật Reverse hybridization (lai phân

tử ngược) được cải tiến trên cơ sở của kỹ thuật lai phân tử có thể phát hiệncùng lúc được nhiều đột biến khác nhau trên cùng một gen Kỹ thuật Reversehybridization đã được ứng dụng hiệu quả trong xác định đồng nhiễmgenotype virus sinh u nhú ở người (HPV) Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuậtnày chưa được áp dụng trong chẩn đoán bệnh Thalassemia Đây là một quytrình mới, có nhiều ưu điểm so với các phương pháp hiện đang được áp dụng,

vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Chẩn đoán trước sinh bệnh

Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization)”, với

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN

1.1 Bệnh Thalassemia

1.1.1 Cấu tạo của Hemoglobin (Hb) và các gen tổng hợp chuỗi globin

Phân tử Hb cấu tạo bởi 4 chuỗi globin và 4 phân tử Hem, mỗi chuỗiglobin gắn với một phân tử Hem Tùy theo các giai đoạn phát triển cá thể màglobin gồm các chuỗi polypeptid khác nhau Các chuỗi polypeptid đều có cấutrúc từ các acid amin và được sắp xếp theo một thứ tự chặt chẽ Ngoài ra cấutrúc không gian của các chuỗi polypeptid này cũng rất quan trọng trong vaitrò đảm bảo chức năng vận chuyển khí của phân tử Hb [12]

Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giảIgram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptid racác loại: Zeta (ζ), epsilon (ε), gamma (γ), alpha (α), beta (β), delta (δ) [13].Các gen chi phối sự hình thành chuỗi ε, γ, δ, β nằm trên nhiễm sắc thể (NST)

số 11; các gen chi phối sự hình thành chuỗi ζ, α nằm trên NST số 16 Tronggiai đoạn phôi, Hb chủ yếu là Hb Gower I (ζ2ε2), Hb Gower II (α2ε2) và HbPortland (ζ2γ2) Trong giai đoạn thai, loại Hb chủ yếu là HbF (α2γ2) Tronggiai đoạn trưởng thành, loại Hb chủ yếu là HbA1 (α2β2) và một ít HbA2 (α2δ2).Người trưởng thành có 97,5% HbA1, khoảng 2% HbA2 và khoảng 0,5% HbF

Bảng 1.1 Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình thường

Loại Hb Thành phần

Hb A1 α2 β2 Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường

Hb A2 α2 δ2 Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường

Hb F α2 γ2 Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi

Hb Gower 1 ζ2 ε2 Phôi thai 2 ÷ 3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai

Hb Gower 2 α2 ε2 Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1

Hb Portland ζ2 γ2 Phôi thai 2 ÷ 3 tuần đầu

Số lượng acid amin trong chuỗi polypeptid đặc trưng cho từng loạichuỗi, ví dụ: chuỗi α có 141 acid amin, chuỗi β gồm 146 acid amin Trình tựcác acid amin trong chuỗi rất nghiêm ngặt, sự thay thế của acid amin nàybằng acid amin khác trong nhiều trường hợp thể hiện thành những bệnh của

Hb

Hình 1.1 Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb

Ở người bình thường, số lượng chuỗi α globin và chuỗi β globin đượcsản xuất cân bằng để tham gia cấu tạo phức hợp α2β2, tế bào máu của ngườibình thường có thể tích tế bào khoảng 100 µm3

Thalassemia là một dạng bệnh của Hb, trong đó chuỗi α globin giảmhoặc không được tạo thành gọi là bệnh α-thalassemia, chuỗi β globin giảmhoặc không được tạo thành gọi là bệnh β-thalassemia

1.1.2 Bệnh α-thalassemia

α-thalassemia là bệnh di truyền alen lặn NST thường do đột biến gen αglobin nằm trên nhánh ngắn NST số 16 (16p13.3), gây giảm hoặc không tổnghợp chuỗi α globin

Hình 1.2 Vị trí gen α globin trên NST 16

(Nguồn: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBA1 [15] )

Cụm gen α globin ở người dài khoảng 70kb, chứa 2 gen α globin: α1(chiều dài 840bp, chứa 3 exon và 2 intron), và α2 (chiều dài 830bp, chứa 3exon và 2 intron) Ngoài ra nó còn chứa một gen ζ2 phôi thai; 3 gen giả gồmpseudo zeta1 (ψζ1), pseudo α1 (ψα1), pseudo α2 (ψα2) và một gen theta1 (θ).Gen ζ2 hoạt động tổng hợp chuỗi ζ trong suốt giai đoạn phôi thai, gen α1 vàα2 chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi α globin, các gen còn lại không có chứcnăng Các gen chức năng sắp xếp theo trật tự 5’- ζ2 - α2 - α1 - 3’, được baoquanh bởi các gen có biểu hiện mạnh như MPG, NPRL3 và Luc7L, được điều

tiết chủ yếu bởi vùng không mã hóa có tính bảo thủ cao (multispeciesconserved sequences, MSCR2) hay còn gọi là vùng HS-40 [16].

Hình 1.3 Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α

(Nguồn: Douglas R Higg, 2013 [16] )

Gen α1 và α2 đều mã hóa các chuỗi α globin gồm 141 acid amin nhưng

do trình tự khởi động (promoter) của 2 gen khác nhau nên khả năng biểu hiệncủa gen α2 mạnh hơn gen α1 từ 2 đến 3 lần Vì vậy các đột biến xảy ra ở gen α2thường có hậu quả nặng nề hơn những đột biến ở gen α1 [16], [17]

α-thalassemia là một trong những bệnh Hb phổ biến nhất, phân bố khắpthế giới Đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu, chiếm tới 60 ÷ 90%các nguyên nhân gây phù thai ở các nước Đông Nam Á Trong đó, tỷ lệngười mang gen đột biến mất đoạn dạng SEA ở Đông Nam Á là cao nhất, ởBắc Thái Lan là 14%, Nam Trung Quốc là 5,0 ÷ 8,8%, Hồng Kông là 4,5%,Trung tâm Thái Lan là 3,7%, Bắc Đài Loan là 3,5%

1.1.2.1 Cơ chế sinh bệnh

Bệnh α-thalassemia là bệnh Hb do thiếu hụt hoặc thiếu hoàn toàn chuỗi

α trong phân tử Hb Đột biến gây bệnh α-thalassemia chủ yếu là các đột biếnmất đoạn, đột biến không mất đoạn ít gặp hơn Cơ chế sinh bệnh cũng khácnhau với từng loại đột biến

Đến nay, hơn 300 loại đột biến trên vùng gen α globin đã được pháthiện, bao gồm các đột biến mất đoạn lớn - mất đoạn cả 2 gen (mất 1 phầnhoặc toàn bộ cả 2 gen α), đột biến mất đoạn nhỏ - mất đoạn 1 gen (mất 1 phầnhoặc toàn bộ gen α1 hoặc gen α2) và đột biến điểm [4]

- Đột biến mất đoạn gen thalassemia: là nguyên nhân chủ yếu gây

α-thalassemia (~ 90%), bao gồm mất đoạn từ 1 đến 2 gen α globin

+ Đột biến dẫn đến α + -thalassemia

Là đột biến mất đoạn ở 1 gen α gây giảm tổng hợp chuỗi α globin Phổbiến là các mất đoạn 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) trong gen α Cơ chế tạo racác mất đoạn này là do sự tái tổ hợp giữa các vùng tương đồng trên gen α.Các gen mã hóa chuỗi α nằm trong 2 vùng tương đồng cao, các vùng đó đượcchia thành các vùng: X, Y và Z, tách biệt nhau bởi các đoạn chèn nhỏ Trongquá trình phân bào của dòng tế bào mầm, sự trao đổi chéo không cân bằng sẽlàm cho 1 NST bị mất 1 gen α và 1 NST có 3 gen α Trao đổi chéo xảy ra ởvùng Z, tạo ra 1 NST mất 1 đoạn gen dài 3.7kb và 1 NST có 3 gen α(αααanti3.7) Tương tự, nếu trao đổi chéo xảy ra ở vùng X sẽ tạo nên 1 NSTmất 1 đoạn gen dài 4.2kb và 1 NST có 3 gen α (αααanti4.2) Tần suất xuấthiện NST có 1 gen α và 3 gen α trong tinh trùng là từ 1 ÷ 5 x 10-5 Các mấtđoạn và lặp đoạn cũng có thể xảy ra trong các tế bào sinh dưỡng bởi các cơchế liên quan [16]

Hình 1.4 Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α

(Nguồn: Douglas R Higgs, 2013 [16])

Bên cạnh các mất đoạn 1 gen phổ biến là 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2)thì các mất đoạn toàn bộ 1 gen α (α1 hoặc α2) cũng đã được quan sát Các mấtđoạn này được hình thành do sự tái tổ hợp giữa các vùng không tương đồngtrong cụm gen α Mặc dù bị mất hẳn 1 gen α nhưng ảnh hưởng của loại độtbiến này đến hoạt động biểu hiện của gen α còn lại cũng tương tự như -α3.7 và-α4.2, điều này đã được khẳng định trong một số nghiên cứu theo dõi các đặcđiểm lâm sàng, cận lâm sàng của các cá thể mất 1 phần gen α và các cá thểmất toàn bộ 1 gen α [20]

+ Đột biến mất đoạn dẫn đến α 0 -thalassemia

Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại mất đoạn 2 gen bao gồm mất

1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn 2 gen α làm vắng mặt hoàn toànquá trình tổng hợp gen α Cơ chế hình thành các mất đoạn này được cho là docác tổ hợp sai lệch, các chuyển đoạn tương hỗ và quá trình cắt ngắn NST số

16 Phổ biến là các đột biến vùng Địa Trung Hải (Mediterranean, MED), đột

biến vùng Đông Nam Á (Southeast Asia, SEA), đột biến người Philippin

( FIL) Các đột biến mất đoạn khác như: -α5.2, -(α)20.5, mất đoạn 100 ÷ 200 kb lấy

đi toàn bộ cụm gen α globin cùng các gen khác (gen quy định 1 enzym sửachữa DNA và ức chế sự phân tách GDP từ Rho - Rho GDP, gen mã hóaprotein disulfide isomerase - PDI-R, và vùng điều hòa gen - promotor), mấtgen α1, gen θ, vùng trình tự xuôi chiều tính từ tâm động từ cụm gen α, mấtvùng điều tiết gen MCS-R nhưng còn lại 2 gen α, dù hiếm gặp hơn nhưng đềudẫn đến α0-thalassemia Đồng hợp tử các nhiễm sắc thể có đột biến α0-thalassemia sẽ gây hội chứng phù thai do Hb Bart’s Dị hợp tử đột biến α0-thalassemia và α+-thalassemia sẽ gây bệnh HbH [16], [17]

Hình 1.5 Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin

(Nguồn: David H K Chui, 1998)

- Đột biến không mất đoạn trong α-thalassemia

Bao gồm chủ yếu là các đột biến điểm trong vùng HS-40 và trong genα1 hoặc gen α2 Hiện nay người ta đã xác định được 69 đột biến điểm liênquan đến biểu hiện của gen α, ký hiệu αNDα hoặc ααND (ND: nondeletion, αND:đột biến điểm trên gen α)

Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến T thành C ở bộ ba kếtthúc dịch mã Đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á (~ 4%) Độtbiến làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành codon CAA mã hóa choacid amin Glutamine vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mãkết thúc tiếp theo trong khung dọc mới dừng lại, kết quả là 1 chuỗi α globin bịkéo dài thêm 31 acid amin so với phân tử protein 141 acid amin ban đầu,tạo nên Hb Constant Spring (HbCs) Đột biến này phá vỡ các vùng không

mã hóa làm phân tử ARN thông tin tạo thành không ổn định nên mức độbiểu hiện yếu, chỉ khoảng 3% so với chuỗi α2 bình thường, vì vậy trongmột số trường hợp không thể phát hiện được bằng điện di phân tích cácthành phần Hb [16], [20]

Ngoài ra còn có các mất đoạn trong khung dọc (in-frame deletions), độtbiến dịch khung dọc (frame-shift mutations), đột biến vô nghĩa (nonsensesmutations) dẫn tới sản xuất ra các protein bất thường (như mô tả ở bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường [16], [20]

Vị trí đột biến Biến đổi protein Huyết sắc tố

T > G (codon 32) Methionin > Arginin Hb Rotterdam

T > C (codon 125) Leucin > Prolin Hb Quong Sze

G > A (codon 32) Methionin > Isoleucin Hb Amsterdam

G > C (codon 59) Glycin > Arginin Hb Aadana

1.1.2.2 Quy luật di truyền và cơ chế di truyền

Quy luật di truyền: theo quy luật alen lặn trên NST thường

Cơ chế di truyền: bệnh có thể do gen bệnh truyền từ bố, mẹ cho conhoặc do đột biến mới phát sinh qua quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ đi vàothế hệ con, sự biểu hiện bệnh ở thế hệ con còn tuỳ thuộc vào kiểu gen

Tùy mức độ đột biến của gen mà có các thể bệnh khác nhau

1.1.2.3 Phân loại các thể bệnh theo kiểu gen

Như đã biết có hai gen chi phối tổng hợp α globin Như vậy cặp NST

số 16 có 4 alen chi phối tổng hợp α globin

- Trong 4 alen có 1 alen không hoạt động, kiểu gen của người thuộc thểbệnh này là: αα/α- (HBA1HBA2/HBA-) hoặc α-/αα (HBA-/HBA1HBA2),người mang kiểu gen này thường không biểu hiện triệu chứng (silent carrier).Thể bệnh này còn gọi là α-thalassemia 2

- Trong 4 alen có 2 alen không hoạt động, loại này còn gọi là αthalassemia thể nhẹ hoặc α-thalassemia 1 Người bệnh α-thalassemia thể nhẹtrong máu hồng cầu thể tích giảm, nhưng không có biểu hiện triệu chứng lâmsàng Người thuộc thể bệnh này có 2 kiểu gen là:

-+ αα/ (HBA1HBA2/ ): cả hai gen α globin trên cùng một NST bị độtbiến, hai gen trên NST kia vẫn bình thường Loại này chủ yếu gặp ở ĐôngNam Á

+ α-/α- (HBA-/HBA-): trong hai NST, mỗi NST có một alen bị độtbiến, alen kia hoạt động bình thường Thể bệnh này thường gặp ở nhữngngười da đen, cá thể mang kiểu gen này do nhận được hai NST mang kiểu gen

α- từ hai người bệnh α-thalassemia 2

- Người bệnh mang kiểu gen α-/ (HBA-/ ): có 3 trong 4 alen αglobin trên hai NST không hoạt động, chỉ có 1 alen α globin hoạt động.Người bệnh mang kiểu gen này thường là con của cặp bố mẹ, mà một tronghai bố mẹ mang thể bệnh α-thalassemia 2, còn người kia mang thể bệnh α-thalassemia 1 Người bệnh này có mức độ thiếu máu vừa phải hoặc nặng,

trong máu có HbH (β4), hồng cầu thể tích trung bình thấp khoảng 50µm3

(bình thường là 100µm3), thể hiện bệnh ngay lúc mới sinh

- Người bệnh không có gen α nào hoạt động, kiểu gen là ( / ), đây làthể bệnh nặng nhất, kiểu gen này là hậu quả giao phối của hai cá thể α-thalassemia 1 có kiểu gen là αα/ (HBA1HBA2/ ) hoặc cá thể có kiểu gen

α-/ (HBA-/ ) với cá thể có kiểu gen αα/ (HBA1HBA2/ ) α-thalassemiathuộc thể bệnh này trong máu xuất hiện Hb Bart’s (γ4) Hb Bart’s không cókhả năng vận chuyển oxy gây phù bào thai dẫn đến thai chết ngay trong giaiđoạn bào thai hoặc khi mới sinh

Bảng 1.3 Kiểu gen và các thể bệnh α -thalassemia

Bệnh HbH (β4): thiếu máu tan máu

1.1.3 Bệnh β-thalassemia

Bệnh βthalassemia là bệnh do đột biến gen HBB (Hemoglobin beta gen β globin) nằm trên nhánh ngắn NST số 11 (11p15.5) Gen HBB dài1600bp, gồm 3 exon và 2 intron β-thalassemia là một trong những bệnhhuyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới Ở Việt Nam, khi nghiêncứu nguyên nhân thiếu máu ở trẻ em Việt Nam, Nguyễn Công Khanh và cộng

-sự đã cho thấy bệnh β-thalassemia chiếm 49% các trường hợp thiếu máu tanmáu nặng và đứng hàng đầu trong các nguyên nhân gây thiếu máu do tan máu

ở trẻ em [23] Bệnh β-thalassemia phổ biến ở các dân tộc ít người khu vựcmiền núi và trung du phía bắc Tỷ lệ người mang gen phân bố trong cả nước

và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc Đặc biệt, tỷ lệ manggen bệnh rất cao ở các dân tộc ít người như: Mường (25%), Thái (16,6%),Nùng, Sán dìu (14,3%), Pako (8,33%) , [25]

Hình 1.6 Vị trí gen β globin trên NST 11

(nguồn: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBB [27])

Trẻ mắc β-thalassemia thể nặng gây hậu quả nghiêm trọng đến sự pháttriển cá thể và ảnh hưởng đến tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng [26].Đặc biệt việc điều trị rất khó khăn và tốn kém, ít hiệu quả, thường tử vongsớm trong những năm đầu của cuộc sống Vì vậy, việc phòng bệnh được đặt

ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan tràn của bệnh di truyền này Tập

quán kết hôn cùng huyết thống là nguyên nhân chính lan truyền nguồn genbệnh và làm tăng tỷ lệ mắc bệnh gây ảnh hưởng đến nòi giống tộc người Nênviệc phát hiện sớm người mang gen bệnh để tư vấn di truyền trước hôn nhân

là giải pháp quan trọng nhất trong việc phòng bệnh, từ đó làm giảm tỷ lệ mắcbệnh β-thalassemia ở trẻ em

1.1.3.1 Cơ chế sinh bệnh

Bệnh β-thalassemia gây nên do đột biến gen làm giảm hoặc mất chứcnăng của gen β globin dẫn đến giảm hoặc không tổng hợp được chuỗi βglobin

Trong bệnh β-thalassemia, chuỗi β globin bị thiếu hụt, chuỗi α globinđược sản xuất quá mức và hình thành dạng phức hợp Hb đồng nhất chỉ có mộtloại chuỗi α (α4), những Hb này ở dạng không hoà tan và tủa trong những tếbào máu dẫn tới tế bào hồng cầu bị phá huỷ ở tuỷ xương và ở lách Cũng nhưbệnh α-thalassemia, những tế bào hồng cầu trong bệnh β-thalassemia bị giảmkích thước (50 ÷ 80 µm3) và số lượng

Đột biến gen dẫn đến không tổng hợp, hoặc giảm tổng hợp chuỗi βglobin, thay vào đó là sự tăng tổng hợp các chuỗi γ và các chuỗi α để tạothành HbF (α2γ2), loại bệnh này còn tăng cường tổng hợp các chuỗi δ để tạothành HbA2 (α2δ2),, vì vậy người bệnh có HbF và HbA2 nhiều hơn người bìnhthường

Locus gen β globin nằm trên NST số 11, nếu cả hai gen β globin đều bịđột biến mất chức năng hoàn toàn, không sản xuất được β globin, khi đó gọi

là β0-thalassemia Nếu một hoặc hai gen β globin bị đột biến nhưng vẫn sảnxuất một số lượng nhỏ β globin, khi đó gọi là β+-thalassemia

1.1.3.2 Quy luật di truyền

Bệnh di truyền theo quy luật alen lặn trên NST thường

1.1.3.3 Một số dạng đột biến trên gen β globin

Hiện nay đã phát hiện trên 200 loại đột biến trên gen β globin , xếpvào 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin làm mất chứcnăng của gen β gây β0-thalassemia, và nhóm làm giảm số lượng chuỗi βglobin gây β+-thalassemia Các đột biến này mang tính đặc trưng và phân bốvới tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc

Sau đây là cơ chế một số dạng đột biến thường gặp:

- Đột biến điểm tại vùng promoter: do thay thế nucleotid tại vị trí hộp TATA

hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi β globin chỉ còn 10% so với bìnhthường

- Những đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): sự thay thế một nucleotid

trong exon có thể dẫn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc (UAA, UAGhoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường và tạosản phẩm β globin không vững bền bị phá hủy ngay trong tế bào Dạng đồnghợp tử những đột biến này gọi là β0-thalassemia

- Đột biến tại những dấu hiệu nối (splicing signals): quá trình cắt những

intron và nối các exon của gen β globin đòi hỏi các vị trí cho nối GT tại đầu 5’của intron và vị trí nhận nối AG tại đầu 3’ của intron bình thường là đòi hỏicần thiết cho việc nối exon bình thường Những đột biến ở vị trí cho nối GThoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở việc nối exon, do đó không tạomARN β globin thuần thục và hậu quả không tạo ra sản phẩm β globin gọi là

β0-thalassemia

Hình 1.7 Năm đột biến xẩy ra (đóng khung)

ở vị trí đầu của intron thứ nhất của gen β globin

(Nguồn: Trịnh văn Bảo, 2011 [14] )

Những đột biến tại vị trí 5, 6 của intron dẫn tới giảm khả năng nối RNA(Ribonucleic Acid) chính xác nhưng còn tổng hợp được β globin gọi là β+-thalassemia

Ribonucleic Acid) được lắp ghép không chính xác và dẫn tới β+-thalassemia

- Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: vị trí AATAAA tại vùng không dịch mã

là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào chấttham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein Các đột biến điểm xẩy

ra tại vị trí AATAAA sẽ gây giảm tổng hợp β globin gây β+-thalassemia

- Những đột biến khung xẩy ra ở các exon: do thêm vào hoặc mất đi một

hoặc vài nucleotid, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đổi khung đọc mã ditruyền làm thay đổi sản phẩm β globin, ví dụ: thêm AG vào trước mã 145 của

gen β globin tạo nên Hb Cranston có 157 acid amin dài hơn chuỗi β globinbình thường 11 acid amin.

Bảng 1.4 Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở người Việt Nam [11]

STT Loại đột biến Kiểu đột biến Thalasemia Thể bệnh

1.1.3.4 Phân loại bệnh β-thalassemia theo thể bệnh

- β-thalassemia thể nhẹ (thalassemia minor): người bệnh có kiểu gen dị hợp,

một gen bình thường và một gen bị đột biến β+ hoặc β0, tuy nhiên ở ngườibệnh gen β globin bình thường vẫn sản xuất một số lượng lớn β globin, dovậy người bệnh không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, cơ thể phát triểnbình thường không có biến dạng xương, thiếu máu thường rất nhẹ (Hb 90 ÷

110 g/l) Điện di Hb có tăng HbA2

- β-thalassemia thể trung gian (thalassemia intermedia): thể bệnh này trong

lâm sàng chỉ những người có triệu chứng thiếu máu, nhưng chưa đòi hỏi phảitruyền máu Những người này có bất thường trong cả hai gen β globin, nhưngmột hoặc cả hai gen đột biến này là nhẹ, vì vậy vẫn còn sản xuất được βglobin Những người thuộc thể bệnh này có biểu hiện thiếu máu nhẹ, điện di

Hb có tăng HbF và HbA2

- β-thalassemia thể nặng (thalassemia major): người bệnh có kiểu gen đồng

hợp, cả hai gen β globin ở trạng thái đột biến Có thể xuất hiện β0-thalassemia

hoặc β+-thalassemia tuỳ thuộc vào không còn khả năng hoặc còn khả năng sảnxuất một lượng nào đó của chuỗi β globin

Người β-thalassemia thể nặng biểu hiện bệnh rất sớm ngay năm đầutiên của cuộc sống, với triệu chứng thiếu máu nặng (Hb < 60g/l), màng xươngtrở nên mỏng dẫn đến dễ gẫy xương bệnh lý, hoặc biến dạng xương mặt,xương sọ, gan, lách to vì phải tăng cường sản xuất những tế bào máu Điện di

Hb có chủ yếu HbF

- Thể phối hợp β-thalassemia với HbE: còn gọi là dị hợp tử kép βthalassemia/HbE, thể bệnh này biểu hiện thiếu máu nặng và các triệu chứngtương tự β-thalassemia thể nặng Điện di Hb có chủ yếu HbF và HbE

-1.1.3.5 Điều trị và tiên lượng

Người mang gen β-thalassemia thể nhẹ không cần điều trị đặc hiệu kể

cả khi có thiếu máu nhẹ và vừa β-thalassemia thể trung gian có thể truyềnmáu khi có thiếu máu nặng, nhưng không thường xuyên Nếu phải truyền máunhiều lần thì bệnh nhân β-thalassemia thể trung gian cũng có thể có nhiễm sắt

và phải dùng thuốc thải sắt từng đợt β-thalassemia thể nặng thường thiếu máunặng phải truyền máu thường xuyên Việc truyền máu (khối hồng cầu) phảiđảm bảo duy trì nồng độ Hb từ trên 100g/l để cho trẻ được phát triển bìnhthường Đối với những bệnh nhân có mức độ thiếu máu nặng và tốc độ thiếumáu nhanh thì việc duy trì Hb từ 100g/l đòi hỏi một phác đồ truyền hồng cầurất tích cực [28]

Một trong những mặt trái của truyền máu thường xuyên là làm cho cơthể ứ đọng một lượng sắt lớn, làm tổn thương đến các cơ quan như tim, gan,tụy… gây ra những biến chứng nặng nề Trong trường hợp này, thải sắt làbiện pháp quan trọng giúp bệnh nhân tránh được các biến chứng đó Có thể

thải sắt bằng đường tiêm dưới da liên tục hoặc tiêm tĩnh mạch (Desferal),hoặc đường uống (Kelfer) Việc thải sắt cần tiến hành đều đặn 2 ÷ 5 ngày mỗituần [29], [30].

Ngoài truyền máu và thải sắt, các tác giả còn đề xuất một số biện phápđiều trị hỗ trợ như kích thích sinh tổng hợp HbF (bằng Hydrea vàErythropoetin), dùng các chất chống oxy hóa, chống gốc tự do…

Gần đây phương pháp ghép tủy xương đã được áp dụng để điều trị thalassemia thể nặng và đã tiến hành thành công ở một số bệnh nhân, tuynhiên tỷ lệ tử vong của phương pháp ghép tủy xương vẫn còn cao, do đóphương pháp này không được phổ biến rộng rãi Kết quả ghép tủy tốt hơn ởtrẻ em dưới 3 tuổi, mới truyền máu ít và không có biến chứng nặng Nhữngbước tiến khác trong điều trị β-thalassemia thể nặng, đó là liệu pháp gen, dựatrên nguyên tắc những gen β globin của người bình thường được truyền vàotủy xương của người bệnh β-thalassemia thể nặng hoặc phương pháp kíchthích để mở gen Hb bào thai theo cơ chế hoạt động đền bù cho những genkhuyết tật ở người trưởng thành [31]

β-Tiên lượng của bệnh β-thalassemia phụ thuộc vào thể bệnh nhẹ haynặng và việc truyền máu Người bệnh β-thalassemia có tuổi thọ giảm, thườngsống dưới 25 tuổi

1.1.3.6 Phòng bệnh

Áp dụng các biện pháp sàng lọc phát hiện bệnh thalassemia, phát hiệnngười mang gen ở trạng thái dị hợp tử, tư vấn di truyền cho các gia đình cótồn tại gen bệnh, tư vấn di truyền trước hôn nhân để cho các cặp vợ chồng tựlựa chọn hạn chế sinh đẻ hoặc áp dụng chẩn đoán trước sinh với các phươngpháp di truyền phân tử dựa trên DNA (Deoxyribonucleic Acid) chiết tách từ tế

bào ối hoặc tế bào tua rau, hoặc những tế bào bào thai lưu hành trong máu mẹ.

Sự áp dụng đồng bộ các phương pháp này có thể làm giảm tỷ lệ sinh ra nhữngtrẻ bị bệnh Thalassemia

1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia

1.2.1 Một số kỹ thuật di truyền phân tử thường dùng để chẩn đoán trước

sinh bệnh thalassemia ở Việt Nam

Bệnh huyết sắc tố (haemoglobinopathies) là một nhóm đa dạng cácbệnh di truyền lặn nguyên nhân do các bất thường về cấu trúc hoặc số lượngchuỗi globin của phân tử Hemoglobin (Hb) Đây là một trong những bệnh ditruyền đầu tiên được mô tả ở cấp độ phân tử và do đó trở thành nguyên mẫucho việc phát triển các kỹ thuật xác định đột biến mới Hiện nay trên thế giới

có rất nhiều kỹ thuật khác nhau dựa trên phản ứng PCR được sử dụng nhằmphát hiện các đột biến gen globin, bao gồm: dot blot analysis, reverse dot blotanalysis, ARMS (the amplification refractory mutatin system), DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis, gap-PCR, phân tích enzymeendonuclease hạn chế (restriction endonuclease - RE analysis), real-time PCR,Sanger sequencing, Pyrosequencing, MLPA (multiplex ligation-dependent probeamplification) và hệ thống phân tích gen [32], [33], [34], [35]

Mỗi kỹ thuật đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựachọn phương pháp sử dụng ở mỗi phòng xét nghiệm (labo) phụ thuộc vàonhiều yếu tố như: trình độ chuyên môn và kỹ thuật hiện có của labo chẩnđoán, các dạng đột biến và tỷ lệ đột biến trong quần thể, ngoài ra còn phụthuộc vào kinh phí hiện có tại mỗi cơ sở

Ở Việt Nam, các phương pháp thường được dùng để xác định đột biếngen globin được trình bày như ở phần dưới đây

1.2.1.1 Kỹ thuật multiplex gap-PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinhhọc phân tử, nhằm phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong ống nghiệm.Phương pháp này được Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985 và Saiki thửnghiệm thành công vào năm 1988

Gap-PCR, hay còn gọi là PCR khoảng cách, là kỹ thuật sử dụng haimồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch xuôi và mạch ngược trong vùng DNAchứa đoạn gen bị mất Với các đột biến mất đoạn có kích thước nhỏ hơn 1 kb,cặp mồi sẽ tạo ra hai sản phẩm, trong đó đoạn nhỏ hơn là sản phẩm từ allen bịmất đoạn Với những đột biến mất đoạn lớn, khoảng cách giữa hai mồi quálớn để có thể khuyếch đại được allen bình thường, mà chỉ có thể khuyếch đạisản phẩm từ allen mang đột biến mất đoạn Trong trường hợp này allen bìnhthường sẽ được khuyếch đại thông qua một điểm đứt gãy của đột biến, sửdụng một mồi theo nguyên tắc bổ sung với trình tự bị mất và một mồi kháctheo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA còn lại Đây là kỹ thuật nhanh, đơngiản, tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là cần phải biết được điểm đứt gãymới thiết kế được cặp mồi tương ứng

Multiplex-PCR là phản ứng PCR đa mồi sử dụng đồng thời nhiều cặpmồi để khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR Phươngpháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng vàonhiều công trình nghiên cứu Đối với Thalassemia, người ta thường dùng kỹthuật Multiplex gap-PCR trong chẩn đoán các mất đoạn α-thalassemia [36],[37], [38], [39], một vài mất đoạn β-thalassemia [40], [41], [42], [43], [44],[45], mất đoạn δβ-thalassemia và HPFH thalassemia [46]

Bảng 1.5 Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gap-PCR

45 kb deletion

SpanishSicilianVietnameseMacedonian/Turkish

HPFH2 (Ghanaian)HPFH3 (Indian)Gap-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh các đột biến mất đoạngây α0-thalassemia và α+-thalassemia, nhưng đòi hỏi sự ứng dụng cẩn thận đốivới chẩn đoán trước sinh Hầu hết các dạng α-thalassemia thường gặp do độtbiến mất đoạn đều có thể được chẩn đoán bằng gap-PCR [47] Hiện nay người

ta đã công bố các trình tự mồi (primers) cho chẩn đoán 3 đột biến mất đoạngây α0-thalassemia và 2 đột biến mất đoạn gây α+-thalassemia [36], [37], [38],[39], được liệt kê như trong bảng 1.4 Các đột biến mất đoạn α0-thalassemiabao gồm: đột biến dạng SEA, thường được tìm thấy ở các cá thể người ĐôngNam Á; MED và -(α)20.5, thường gặp ở người Địa trung hải; FIL, hay gặp ởngười Philippin; và THAI, ở người Thái 2 đột biến mất đoạn α+-thalassemia

bao gồm đột biến mất đoạn 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) trên 1 gen α Hiệnnay, các mồi thường được thiết kế theo dạng kép hoặc đa mồi, theo đó 2 độtbiến -α3.7 và -α4.2 sẽ được phát hiện qua 1 phản ứng, MED và -(α)20.5 trong 1phản ứng, và 3 đột biến ở người Đông Nam Á ở 1 phản ứng [47].

Hình 1.8 Chẩn đoán đột biến mất đoạn α+ -thalassemia bằng

multiplex gap-PCR

(Nguồn: John Old , 2012 )

Hình 1.9 Chẩn đoán đột biến mất đoạn α0 -thalassemia bằng multiplex gap-PCR

(Nguồn: John Old, 2012 )

tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và 1 mồi chung ngược chiều với mồi đặchiệu alen Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA khuếchđại với các kích thước khác nhau đã biết trước

Các primer ARMS đặc hiệu đột biến được sử dụng trong thư việnOxford được dùng để chẩn đoán 25 đột biến gây bệnh β-thalassemia thườnggặp trên thế giới cũng như 1 số đột biến điểm gây bệnh α-thalassemia [47]

Hình 1.10 Chẩn đoán β-thalassemia bằng ARMS-PCR

(Nguồn: Hossein N., 2001 [51]) (Internal control band: band nội chuẩn)

Ở Việt Nam, Lê Thị Hảo đã ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử pháthiện đột biến gen gây bệnh β-thalassemia và xây dựng được kỹ thuật ARMS

để phát hiện đột biến gen này tại thành phố Hồ Chí Minh [52]

Hiện nay, ARMS-PCR thường được dùng để sàng lọc 2 đột biến điểmHbCs, HbQs gây α-thalassemia Còn với β-thalassemia, 9 đột biến thường gặpđược chia thành 3 nhóm và được được sàng lọc đồng thời như bảng 1.5 theonghiên cứu của Hương Lê (2000) trên quần thể người Đông nam Á [53] Độtbiến được phát hiện qua multiplex ARMS-PCR, được xác định kiểu gen bằngARMS-PCR Riêng với đột biến CD26 của HbE được phát hiện trực tiếp bằngARMS-PCR nếu có HbE dương tính với điện di huyết sắc tố

Bảng 1.6 Các đột biến gen β globin và mồi đặc hiệu

Bước sàng

lọc Loại đột biến Mồi đặc hiệu

Mồi chung

Độ dài (bp)

-TAG)CD41/42 (-TTCT)-28 (A > G)

IVS 1-1 (G > T)

CD17MCD41/42M-28MIVS 1-1M

439107281

2 IVS 1-5 (G > C)

CD71/72 (+A)IVS 2-654 (C > T)CD95 (+A)

IVS 1-5MCD71/72MIVS 2-654MCD95M

Thal BThal CThal FThal B

285241382163

1.2.1.3 Phương pháp MLPA

Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) rađời năm 2002 và được MRC-Holland phát triển, là một bước tiến mới trongchẩn đoán các bệnh di truyền nói chung và Thalassemia nói riêng Nhiềunghiên cứu chỉ ra rằng MLPA là phương pháp dễ dàng, nhanh chóng, hiệuquả, kinh tế và phù hợp trong việc phát hiện các vi mất đoạn và vi lặp đoạn,thậm chí là những mất đoạn nhỏ Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế các

probe gắn đặc hiệu với các đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng.Thông thường, mỗi probe chứa 2 đoạn oligonucleotid có kích thước khácnhau.

Ở Việt Nam, kỹ thuật MLPA được thực hiện bằng cách sử dụng bộ đầu

dò thương mại P140-B4 để phát hiện các đột biến mất đoạn trên gen α và βglobin Kết quả được phân tích trên phần mềm COFALYSER

1.2.1.4 Phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen là xác định thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid: A(adennine), C (cytosine), G (guanine), T (thymine) trên phân tử DNA Hiệnnay, giải trình tự gen thường được thực hiện trên các máy tự động (như ABI3130 ), kết quả được phân tích bằng phần mềm đi kèm, sau đó được đưa lênngân hàng gen (Gene Bank) để so sánh với trình tự gen globin chuẩn Qua đó,

có thể xác định các đột biến điểm chưa biết và các biến thể của bệnh

Mặc dù các phương pháp như: multiplex gap-PCR và ARMS-PCR đãgiúp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia khá hiệu quả nhưngvẫn còn tồn tại nhiều hạn chế, đó là không phát hiện được cùng lúc nhiều độtbiến, sử dụng đa mồi nên khá phức tạp, cần điện di để kiểm tra sản phẩm, sửdụng hóa chất độc hại đối với người làm xét nghiệm, thời gian lâu, trong khiyêu cầu quan trọng của chẩn đoán trước sinh là phải đơn giản, nhanh chóng

và chính xác Với phương pháp MLPA và giải trình tự gen thì chi phí lại quáđắt, không phù hợp với phần đông dân số Việt Nam

1.2.2 Phát hiện các đột biến gây bệnh Thalassemia trong chẩn đoán trước

sinh bệnh Thalassemia bằng phương pháp lai ngược (reverse hybridyzation)

Kỹ thuật Reverse dot blot hybridization (Reverse hybridization) cungcấp một nền tảng cho kỹ thuật lai các đầu dò đặc hiệu cao Các đầu dò đặc

hiệu alen (allele specific oligonucleotide - ASO probes) bình thường và độtbiến được gắn cố định trên các dải nitrocenllulose (nitrocenllulose strips) cómàng nylon hoặc các hạt Luminex (Luminex beads), thay vì gắn trực tiếp lênmẫu DNA phân tích Đây là một phương pháp không sử dụng phóng xạ.Trong kỹ thuật này, các đầu dò ASO đặc hiệu đột biến (mutant) và bìnhthường (wild type) được lai với các mẫu DNA nhằm sàng lọc nhiều đột biếncùng lúc Phương pháp Reverse hybridization lần đầu được mô tả bởi Saiki vàcộng sự [54], và sau đó được phát triển để sàng lọc các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở người Sicilian, và được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh[55], [56].

Về lý thuyết, Reverse hybridization có thể được thiết kế để phát hiệnbất cứ đột biến nào đã được xác định trong một quần thể nhất định sau khi cácđiều kiện đã được sắp đặt cẩn thận Reverse hybridization đã được sử dụng đểxác định các đột biến gây bệnh α-thalassemia [56], β-thalassemia cũng nhưxác định kiểu gen của các biến thể của gen β globin chính (HbS, HbC,HbD…) [47]

Sản phẩm khuếch đại DNA được đánh dấu bằng cách sử dụng mồi cóđầu 5’ sửa đổi với biotin, hoặc đánh dấu trong quá trình khuếch đại DNA(bằng biotin-16-dUTP) Các sản phẩm khuếch đại này có thể được biến tính

và lai với các đầu dò cố định Sau các bước rửa nghiêm ngặt, sản phẩm laiđặc hiệu có thể được phát hiện Trên các thanh lai (Reverse hybridizationStrips), kết quả này có thể nhìn thấy bằng mắt thường Còn đối với Luminexbeads, kết quả sẽ được đo bằng phần mềm đặc hiệu (Luminex Reader)

Dựa trên kỹ thuật Reverse hybridization, hãng ViennaLab DiagnosticsGmbH của Austria đã xây dựng bộ kit Globin StripAssay ứng dụng cho chẩnđoán bệnh Thalassemia, nhằm phát hiện 22 đột biến trên gen β globin - dạngphổ biến ở người Đông Nam Á (β-Globin StripAssay SEA), và 21 đột biếntrên gen α globin (α-Globin StripAssay) Bộ kit này đáp ứng tiêu chuẩn ISO,

tất cả các sản phẩm đều được đánh dấu CE (Conformité Européene) và IVD(In Vitro Diagnostics) Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đãchứng tỏ Globin StripAssay là một phương pháp đơn giản, nhanh, hiệu quảtrong việc phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia [51], [57], [58],[59], [60] Hiện nay, kit Globin StripAssay đã được ứng dụng ở nhiều nướctrên thế giới như: Áo, Iran, Singapo, Thái Lan…

1.2.2.1 Ưu điểm của phương pháp

Phương pháp này đã chứng tỏ có nhiều ưu điểm so với các phươngpháp thông thường:

- Không sử dụng các hóa chất độc hại

- Phương tiện máy móc đơn giản ( máy PCR, agarose gel, máy lắc …)

- Phân tích kết quả đơn giản từ các thanh phản ứng (Teststrip)

1.2.2.2 Quy trình xét nghiệm

Quy trình xét nghiệm gồm 3 bước:

- Tách chiết DNA

- Phản ứng khuếch đại PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu

- Lai các sản phẩm khuếch đại với Teststrip có sẵn chứa các đầu dòoliginucleotide đặc hiệu alen đột biến (mutant) và alen người bìnhthường không có đột biến (wild type) Sau các bước rửa đặc hiệu,trình tự giới hạn được phát hiện nhờ các phản ứng màu enzym

1.2.2.3 Các đột biến có thể được phát hiện

Kit Globin StripAssay phát hiện được hơn 20 đột biến trên mỗi genglobin

- β-Globin StripAssay SEA

Bảng 1.7 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng β-Globin StripAssaySEA

STT Loại đột biến Kiểu đột biến Thể bệnh Thalasemia

- α-Globin StripAssay

Bảng 1.8 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng α-Globin StripAssay

STT Tên đột biến Kiểu đột biến Thể bệnh Thalasemia

Hình 1.11 Các vị trí đột biến trên Teststrip của β-Globin StripAssay SEA