Nghiên cứu sản xuất sản phẩm bột dinh dưỡng từ chế phẩm bã đậu nành (OKARA)

i Header Page of 133   Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy, TS Lê Chiến Phương, người gợi mở đề tài, cung cấp nhiều kiến thức thực nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa công nghệ thực phẩm trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM kiến thức thầy cô truyền đạt cho em năm tháng giảng đường đại học Em xin chân thành biết ơn Ths Nguyễn Thị Thu Huyền người động viên tinh thần, hưỡng dẫn, dạy cho em kinh nghiệm hỗ trợ em hết mình, đóng góp ý kiến chân thành, tận tình sữa chữa lỗi mà em mắc phải suốt thời gian làm đồ án Em xin chân thành cảm ơn lãnh đạo viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt công việc suốt thời gian thực đề tài Em xin tỏ lòng biết ơn anh Nguyễn Hoàng Hải, người hưỡng dẫn bảo tận tình, thông cảm, chia kinh nghiệm, hỗ trợ cho em tài liệu quý báu để em có luận văn tốt ngày hôm Cảm ơn Mẹ tạo điều kiện đầy đủ vật chất tinh thần, cảm ơn TS Lê Thị Phú người thầy người mẹ thứ hai cổ vũ động viên truyền đạt kiến thức hoá sinh, vi sinh quý báu, không quên cảm ơn bạn sinh viên phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực phẩm giúp đỡ tận tình thời gian qua Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Phan Đỗ Trọng Nhân Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page of 133 ii TÓM TẮT ĐỒ ÁN Nghiên cứu với mục đích tận dụng nguồn phế phẩm bã đậu nành Trước đây, bã đậu nành thường nhà sản xuất sữa đậu nành bán cho hộ gia đình hay trang trại để làm thức ăn cho gia súc hàm lượng xơ không tan protein không tan lại bã đậu nành với hàm lượng lớn sử dụng làm thức ăn cho người, qua công đoạn sấy nghiền bã đậu nành trạng thái dạng bột mịn gọi Okara với thành phần đạm Okara chiếm từ 35%-36%, thành phần xơ chiếm 2%-10% Vì vậy, việc tìm phương pháp tận dụng phụ phẩm Okara để tạo sản phẩm bột dinh dưỡng phục vụ lại người quan trọng Một giải pháp sử dụng enzyme protease vi sinh vật B.amyloliquefaciens sinh khối nấm sợi Linh chi enzyme cellulose Ứng dụng công nghệ sinh học cách cấy giống Linh chi vào chất bột okara qua công đoạn phối trộn với nước với tỷ lệ okara: nước(g:g) 1:3 tạo bột okara với hàm ẩm thích hợp 50,4%, với mục đích Linh chi tiết enzyme cellulase thuỷ phân cellulose có okara, sau sinh khối nấm sợi Linh chi lan khắp bề mặt lòng chất tiến hành xay nhuyễn khối Linh chi để khoảng ngày tủ lạnh để enzyme thuỷ phân sâu vào chất cắt mạch cellulose ngắn tốt Tiếp theo cấy giống vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens để vi khuẩn tiết enzyme protease thuỷ phân protein không tan thành peptid mạch ngắn, acid amin Nghiên cứu cách cấy tỷ lệ giống cho phù hợp thời gian để hệ enzyme thuỷ phân hợp chất không tan nhiều tốt, tiến hành xác định tiêu dinh dưỡng có bán thành phẩm Bán thành phẩm sau xử lý sấy chân không nghiền mịn để tạo sản phẩm bột dinh dưỡng, nhiên sản phẩm vị đắng nhẫn nấm Linh chi, để hạn chế nhược điểm tiến hành phối trộn đường isomalt với tỷ lệ bột: isomalt (g:g) 1:2 tạo sản phẩm hoàn thiện mặt cảm quan Sự biến đổi mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus amylolyquefaciens qua kết khảo sát thời gian tăng sinh cho thấy vi khuẩn B.A tăng trưởng tốt điều kiện pH 7, nuôi 24 với mật độ 3,8 *10^13 CFU/ml Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page of 133 iii Hoạt tính enzyme protease vi khuẩn B.A đạt cực đại cấy tăng sinh vi khuẩn 24 với hoạt độ xác định 20,42 (đvht/ml MT) Qua đó, tạo tiền đề cho việc cấy giống vi khuẩn B.A vào sinh khối nấm sợi Linh chi khảo sát cách đo hàm lượng đạm formol qua thời gian thuỷ phân khác kết khảo sát cho thấy ứng với thời gian thuỷ phân 24 giờ, tỷ lệ giống 10%, hàm lượng đạm formol 2,74% phù hợp cho việc cấy vi khuẩn B.A Đối với nấm Linh chi, qua kết khảo sát hoạt độ enzyme cellulase cho thấy hoạt tính enzyme đạt cực đại thời gian nuôi nấm ngày với hoạt độ xác định 15,657 UI/ml Các tiêu quan trọng sản phẩm bột dinh dưỡng sau : độ ẩm 8,3%, đạm tổng số 2,457%, đạm formol Nformol 2,74%, đường tổng 2,341%, đường khử 0,625%, hàm lượng lipid 2,32%, hàm lượng cellulose 0.34% Tổng lượng mà sản phẩm cung cấp cho người sử dụng 37 Kcal Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền iv Header Page of 133 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Phiếu giao khóa luận/ đồ án tốt nghiệp Lời cảm ơn Tóm tắt đồ án Mục lục iii Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt x Danh mục hình xi Danh mục bảng xiii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 1.1 Giới thiệu đậu nành 1.1.1 Đặc điểm đậu nành 1.1.2 Thành phần dinh dưỡng đậu nành 1.1.3 Công dụng đậu nành 1.2 Tổng quan bã đậu nành okara 1.2.1 Giới thiệu 1.2.2 Tình sử dụng nghiên cứu bột okara nước 1.2.3 Tình sử dụng nghiên cứu bột okara nước 1.2.4 Thành phần dinh dưỡng okara (tính theo 100g) 10 1.2.5 Quy trình thu nhận okara từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành 15 1.3 Tổng quan Linh chi 15 1.3.1 Hệ thống phân loại 15 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page of 133 v 1.3.2 Đặc tính sinh học nấm Linh chi 16 1.3.3 Thành phần dược tính nấm Linh chi 17 1.3.4 Công dụng nấm Linh chi 19 1.3.5 Enzyme cellulase nấm Linh chi 19 1.4 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 20 1.4.1 Hệ thống phân loại 20 1.4.2 Đặc điểm phân bố 20 1.4.3 Đặc điểm hình thái 21 1.4.4 Cấu trúc 21 1.4.5 Sự hình thành bào tử 23 1.4.6 Hệ enzyme B amyloliquefaciens 23 1.4.7 Công dụng B.amyloliquefaciens 24 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu 25 2.2 Dụng cụ thiết bị 25 2.2.1 Dụng cụ 25 2.2.2 Các thiết bị 25 2.3 Sơ đồ nghiên cứu vi sinh vật 25 2.3.1 Nghiên cứu hình thái đặc điểm sinh lý vi khuẩn B.A 25 2.3.1.1 Quan sát hình thái vi khuẩn B.A phương pháp nhuộm Gram 26 2.3.1.2 Quan sát bào tử B.A phương pháp nhuộm bào tử 26 2.3.1.3 Định tính enzyme protease vi khuẩn B.A 26 2.3.1.4 Đặc điểm sinh lý vi khuẩn B.A cách khảo sát ảnh hưởng pH đến tăng sinh B.A .27 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page of 133 vi 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái, hoạt chất sinh học, đặc điểm sinh hoá nấm sợi Linh chi 28 2.3.2.1 Phương pháp làm tiêu để quan sát nấm sợi Linh chi 28 2.3.2.2 Phương pháp xác định hoạt chất sinh học nấm sợi Linh chi 29 2.3.2.3 Phương pháp định tính enzyme cellulase nấm sợi Linh chi cách đo đường kính vòng phân giải 30 2.4 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme vi sinh vật 30 2.4.1 Xác định hoạt độ protease vi khuẩn B.A theo phương pháp Anson cải tiến 30 2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase Linh chi 33 2.4.3 Nghiên cứu quy trình công nghệ chế biến sản phẩm bột dinh dưỡng từ chế phẩm bã đậu nành Okara 36 2.4.3.1 Quy trình sản xuất dự kiến 36 2.4.3.2 Bố trí thí nghiệm 38 2.5 Phương pháp phân tích tiêu dinh dưỡng 44 2.5.1 Phương pháp phân tích độ ẩm 44 2.5.2 Xác định hàm lượng N tổng số phương pháp Kjeldahl 44 2.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng N amoniac 45 2.5.4 Phương pháp xác định hàm lượng N formol 45 2.5.5 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng 45 2.5.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 46 2.5.7 Phương pháp xác định hàm lượng lipid 46 2.5.8 Phương pháp xác định hàm lượng cellulose 46 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page of 133 vii 3.1 Kết quan sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi sinh vật nấm Linh chi 48 3.1.1 Bacillus amyloliquefaciens 48 3.1.1.1 Đặc điểm sinh lý vi khuẩn B.A cách khảo sát thời gian tăng sinh B.A 48 3.1.1.2 Định tính enzyme protease vi khuẩn B.amyloliquefaciens 50 3.1.2 Nấm Linh chi 50 3.1.2.1 Kết định tính chất có hoạt tính sinh học nấm Linh chi 50 3.2 Kết định lượng hệ enzyme vi sinh vật dùng đề tài 53 3.2.1 Kết khảo sát hoạt tính chung enzyme protease vi khuẩn B.amyloliquefaciens theo thời gian 53 3.2.2 Kết khảo sát hoạt tính enzyme cellulase nấm Linh chi theo thời gian 54 3.3 Kết chế biến sản phẩm 55 3.3.1 Kết khảo sát tỉ lệ trương nước (okara:nước) 55 3.3.2 Kết khảo sát tỷ lệ giống vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens cấy vào khối nấm Linh chi đến hàm lượng đạm formol chất lượng cảm quan 56 3.3.3 Kết cảm quan sản phẩm xác định tỷ lệ phối trộn isomalt bột dinh dưỡng 60 3.4 Kết phân tích tiêu dinh dưỡng sản phẩm 62 3.4.1 Độ ẩm 62 3.4.2 Chỉ tiêu đạm tổng số Nts 63 3.4.3 Chỉ tiêu đạm formol Nformol 63 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page of 133 viii 3.4.4 Chỉ tiêu đạm NH3 63 3.4.5 Đường tổng 64 3.4.6 Đường khử 64 3.4.7 Hàm lượng lipid 64 3.4.8 Hàm lượng cellulose 65 3.4.9 Hoạt lực enzyme có g sản phẩm 66 3.5 Cảm quan sản phẩm 66 3.6 Kết tính nhu cầu lượng cần thiết người ngày 67 3.6.1 Tính nhu cầu lượng ngày 67 3.6.2 Kết tính toán lượng cung cấp cho người từ sản phẩm 68 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69 4.1 Kết luận 69 4.2 Đề nghị 69 TÀI LIÊU THAM KHẢO I PHỤ LỤC .IV Phụ lục A Một số môi trường, hóa chất dùng đề tài IV Phụ lục B Các đường chuẩn dùng đề tài VI Phụ lục C Cách tiến hành thí nghiệm nhuộm vi sinh vật định tính enzyme cellulase VII PL.C.1 Nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens VII PL.C.2 Nhuộm bào tử vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens VIII Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page of 133 ix PL.C.3 Định tính enzyme cellulase nấm sợi Linh chi cách đo đường kính vòng phân giải VIII Phụ lục D Các phương pháp phân tích tiêu chất lượng IX PL.D.1 Phương pháp phân tích độ ẩm IX PL.D.2 Xác định hàm lượng N tổng số phương pháp Kjeldahl X PL.D.3 Phương pháp xác định hàm lượng N amoniac XI PL.D.4 Phương pháp xác định hàm lượng N formol XII PL.D.5 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng XIII PL.D.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử XV PL.D.7 Phương pháp xác định hàm lượng lipid XVI Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền x Header Page 10 of 133 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B.A : Bacillus amyloliquefaciens CFU: colony forming unit TCA: trichloracetic acid PGA: Plate Count Agar UV: ultra violet NB: Nutrient broth CMC: Carboxyl Methyl Cellulose Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 10 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 87 of 133 II [12] Nguyễn Trí Lộc, GĐ nhà máy II Cty Tribeco, phát biểu Sở KH & CN TP.HCM tháng 10.2007 [13] Nguyễn Đức Lượng chủ biên (2004), Công nghệ enzyme, Đại học Quốc gia TP.HCM, trường ĐH Bách Khoa, NXB Đại học Quốc gia, TPHCM, 308-386 [14] Nguyễn Đức Lượng chủ biên (2003), Thực tập Công nghệ sinh học, tập – Thí nghiệm vi sinh vật học, Trường Đại học Quốc gia TP HCM, trường ĐH Bách Khoa, NXB Đại học Quốc gia, TP HCM, 34-50 [15] http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html [16] Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Kỹ thuật, Hà Nội, 83 [17] Lê Chiến Phương, Lê Thị Bích Phượng, Đỗ Thị Tuyến, Vũ Đăng Khánh (2004), Nghiên cứu chế biến loại thực phẩm ăn liền, thực phẩm lên men có giá trị dinh dưỡng cao, tiện sử dụng từ đậu nành phế liệu nó, Viện Sinh học Nhiệt đới, TPHCM [18] Lê Chiến Phương, Võ Thanh Trang (2007), Nghiên cứu chế biến mai đậu nành, tóm tắt kỷ yếu hội nghị khoa học công nghệ, Viện sinh học Nhiệt đới, TPHCM [19]http://trangon.com/news.php?id=118&trangon=Nam_Linh_chi_va_cong_dung [20] Lê Chiến Phương, Vũ Văn Độ, Võ Thanh Trang, Phan Văn Dân (2008), Sử dụng sinh khối nấm sợi để chế biến thực phẩm, dự án kết hợp với tỉnh Biên Hòa [ 21] http://www.thuvienhoasen.org/anchay-21-daunanh.htm [22] Trần Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 143-145 [23] Hồ Thị Ren (2004), Thử nghiệm xử lý bã đậu nành (okara) nấm mốc thành nguyên liệu thích hợp để chế biến thực phẩm, Khóa luận cử nhân khoa học ngành CNSH, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, TPHCM Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 87 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 88 of 133 III [24] Đồng Thị Thanh Thu (2000), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia, TPHCM, 218-231 [25] http://www.soymilkquick.com [26] Lê Ngọc Tú chủ biên, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Đoan Diên (1998), Hóa sinh học công nghiệp, NXB Khoa học Kỹthuật, Hà Nội, 153-154 [27] Jonathan W.DeVries, Ph.D, Total dietary fiber, Medallion Laboratories [28] Fax nhà máy Dielac gởi phòng kỹ thuật Cty Sữa Việt Nam 10.8.2001 [29] Bộ môn Dược liệu, khoa Dược (2003), Giáo trình Thực tập dược liệu, Trường Đại học Y dược TPHCM, 26,61 [30] Hội nghị triển khai chương trình phát triển sản phẩm công nghiệp chủ lực TP.HồChí Minh giai đoạn 2002-2005, 18.12.2002 [31] http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus_2.html [32] Vander Riet, W.B.; Wight, A.W; Cilliers, J.J.L; Datel, J.M.Food (1989) “Chemical investigation of tofu and its by product okara”, Food Chem, (34), 193202 [33] PGS Tiến sĩ Dương Thanh Liêm, Dinh dưỡng thực phẩm, trường đại học Nông Lâm TPHCM, 70,71 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 88 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền IV Header Page 89 of 133 PHỤ LỤC A Một số môi trường, hóa chất dùng đề tài PL.A.1 Môi trường sữa đậu nành: Sữa đậu nành bổ sung 3% đường Hấp khử trùng 1210C 15 phút PL.A.2 Môi trường cá pepton (CP) (nuôi cấy B.A) Nước mắm 30oN: 20ml Pepton: 10g Agar: 20g Nước cất vừa đủ1000ml Chỉnh pH trung tính PL.A.3 Môi trường PGA (nuôi cấy nấm linh chi) Khoai tây: 200g Glucose: 20g Agar: 20g Nước cất: 1000ml PL.A.4 Môi trường Czapek – Dox NaNO3: 3,5g KH2PO4: 1,5g MgSO4: 0,5g KCl: 0,5g FeSO4: 0,1g Agar: 20g Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 89 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 90 of 133 V H2O: 1000ml pH 6,5÷7,0 Môi trường A1: Môi trường thử khả phân giải casein Môi trường Czapek – Dox thạch + 1% casein Môi trường A2: Môi trường thử khả phân giải tinh bột Môi trường Czapek – Dox thạch + 1% tinh bột tan PL.A.5 Môi trường Nutrient broth (NB) (Hòa tan 13g môi trường vào 1000ml nước) Peptone : 5g NaCl : 5g Dịch chiết thịt bò : 1,5g Chiết nấm men : 1,5g pH : 7,4 ± 0,2 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 90 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền VI Header Page 91 of 133 PHỤ LỤC B Các đường chuẩn dùng đề tài Đường chuẩn tyrosine C 1.2 y = 2.9669x + 0.0087 R² = 0.9977 0.8 C 0.6 Linear (C) 0.4 0.2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Đường chuẩn Glucose y = 0.0007x R = 0.9986 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 100 200 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 91 of 133 300 400 500 600 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền VII Header Page 92 of 133 PHỤ LỤC C Cách tiến hành thí nghiệm nhuộm vi sinh vật định tính enzyme cellulase PL.C.1 Nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens - Lau nhẹ tiêu giấy mềm, hơ qua đèn cồn - Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía mặt lame để đánh dấu vết khuẩn phía lame - Nhỏ dung dịch NaCl ‰ lên vòng tròn - Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl ‰ lame - Dàn mỏng thành vết bôi, cố định cách hơ nhanh lửa đèn cồn - Đặt tiêu lên thủy tinh chữ U, thau nhựa - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính - Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước - Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước - Tẩy màu cồn 96o từ 15-20 giây: giữ phiến kính góc nghiêng nhỏ cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo Ngay rửa vết bôi lại với nước Thời gian khử màu bước đóng vai trò định kết trình nhuộm - Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin để yên vòng 30 giây Rửa với nước - Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát kính hiển vi với vật kính dầu x100 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 92 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 93 of 133 VIII PL.C.2 Nhuộm bào tử vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens - Làm vết bôi phiến kính để khô tự nhiên - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng lửa đèn cồn bốc hai phút rửa với nước - Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng bốc vòng phút - Rửa vết bôi nước - Tẩy màu dung dịch H2SO4 1% phút - Rửa vết bôi nước - Nhuộm vết bôi xanh methylen 5-15 phút - Rửa lại với nước để khô tự nhiên - Quan sát kính hiển vi với vật kính dầu (x100) Bào tử mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh PL.C.3 Định tính enzyme cellulase nấm sợi Linh chi cách đo đường kính vòng phân giải -Chuẩn bị đĩa Petri chứa môi trường có chất cảm ứng -Cấy chủng nấm Linh chi Ganoderma lucidum vào đĩa Petri -Ủ nhiệt độ thường 2-3 ngày Tất thao tác thực tủ cấy vô trùng  Đọc kết -Nhuộm màu với thuốc thử lugol: lấy 15ml thuốc thử lugol cho vào đĩa Petri Để yên phút Kiểm tra vòng phân giải: -Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi sinh vật không màu, suốt, vòng phân giải CMC Phản ứng (-): môi trường xung quanh vi sinh vật màu xanh tím Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 93 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền IX Header Page 94 of 133 PHỤ LỤC D Các phương pháp phân tích tiêu chất lượng PL.D.1 Phương pháp phân tích độ ẩm Dụng cụ hóa chất: Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ (đến 100 – 105oC 130oC) Cân phân tích, bình hút ẩm, phía chứa chất hút ẩm (H2SO4 đậm đặc, Na2SO4 khan, CaCl2 khan, sillicagen…) Chén nhôm Cách tiến hành: - Cân đĩa sấy khô, cân 10g mẫu chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho vào chén nhôm - Cho tất vào tủ sấy 100 – 105oC, sấy khô đến trọng lượng không đổi, thường khoảng - Sấy xong, làm nguội bình hút ẩm (25 – 30 phút), đem cân cân phân tích Tính kết quả: Độ ẩm %X xác định theo công thức: Trong đó: = (( 1− 2) × 100 1− 0) ( CT 2.3) G : trọng lượng chén nhôm (g) G1 : trọng lượng chén nhôm trọng lượng mẫu thử trước sấy (g) G2 : trọng lượng chén nhôm trọng lượng mẫu thử sau sấy (g) Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 94 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 95 of 133 X PL.D.2 Xác định hàm lượng N tổng số phương pháp Kjeldahl Hóa chất thiết bị: Máy Kjeldahl bán tự động hãng Prolabo Burret 25 ml , bếp nung , bình chưng cất ,H2SO4 đậm đặc, NaOH 32%, HCl 0,25N Chất xúc tác: hỗn hợp 60g selenium + 75g CuSO4+ 165g K2SO4 Hỗn hợp thị màu: + Hòa tan 0,264g methyl đỏ 250 ml cồn tuyệt đối + Hòa tan 1,28g bromocresol blue 50 ml cồn tuyệt đối Trộn hai dung dịch , bổ sung đến lít cồn tuyệt đối Dung dịch acid boric 4% với thị màu : hòa tan 80g acid boric 1800 ml nước cất, đun nóng chút, để nguội bổ sung 25 ml hỗn hợp thị màu Bổ sung đến lít nước cất Cách tiến hành: Vô hóa mẫu: - Nguyên tắc: vô hóa chất đạm vô hóa tất chất đạm dù dạng (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô amonsulphate (NH4)2SO4) đậm đặc chất xúc tác - Thực hành: cân 100mg mẫu nghiền nhỏ, 1g chất xúc tác cho vào ống phá mẫu + ml H2SO4 đậm đặc, nối thu khí bắt đầu phá mẫu Khi thời gian phá mẫu kết thúc để ống phá mẫu nguội Bổ sung 50 ml nước cất, trộn để nguội, lắp vào máy chưng cất Chưng cất: Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 80 ml NaOH 32% Khởi động trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 95 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 96 of 133 XI dịch acid boric 4% có thị màu Ngừng chưng cất dịch chưng cất không NH3 (thử giấy quỳ) Chuẩn độ HCl 0,25N Ngừng chuẩn độ xuất màu phớt đỏ Tính kết quả: Thông qua lượng HCl 0,25N ta biết lượng acid boric kết hợp với NH3 biết NH3 giải phóng từ mẫu ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g Nitơ hữu (CT 2.4) VHCl 0.25N: thể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ(ml) C : trọng lượng mẫu đem xác định (g ) PL.D.3 Phương pháp xác định hàm lượng N amoniac Hóa chất thiết bị: Máy Kjeldahl bán tự động hãng Prolabo Burret 25 ml, MgO khan Dung dịch H2SO4 0,1N Dung dịch NaOH 0,1N Phenolphtalein 1% Cách tiến hành: Cân 1g nguyên liệu hay sản phẩm hòa tan vào 10 ml nước cất cho vào ống phá mẫu Cho vào 5g MgO Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất Dịch chưng cất đưa vào bình tam giác chứa 10ml H2SO4 0,1N + giọt phenolphtalein 1% Chưng cất tới không NH3 (thử giấy quỳ) Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 96 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 97 of 133 XII Định phân lượng H2SO4 0,1N NaOH 0,1N, ta biết lượng acid phản ứng với NH3 Làm mẫu đối chứng với 10 ml nước cất Tính kết quả: Gọi V0 thể tích NaOH 0,1N thử không Vt thể tích NaOH 0,1N thử thật ΔV = V0 - Vt lượng NaOH 0,1N tương đương với lượng NH3 phóng thích hấp thụ H2SO4 0,1N → Số g đạm amoniac 100 g mẫu: ΔV x 0,0014 x 100 = ΔV x 0,14 (g/100g) (2.5) Trong đó: 0,0014 số g đạm amoniac tương ứng với ml NaOH 0,1N PL.D.4 Phương pháp xác định hàm lượng N formol Dụng cụ thiết bị: Dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm Dung dịch formol-phenolphtalein trung hòa NaOH 0,2N: lấy 50ml dung dịch formol 40%, thêm vào vài giọt phenolphtalein 1%, chuẩn độ NaOH 0,2N dung dịch có màu hồng nhạt Dung dịch NaOH 0,2N, HCl 0.2N Chất thị màu phenolphtalein 1% cồn Cách tiến hành: - Cân 2g mẫu tươi, thêm 10ml nước cất, lọc qua giấy lọc, chỉnh nước đến 20ml - Hút 20 ml dịch lọc vào bình tam giác, thêm vào 10ml dung dịch formol trung hòa NaOH 0,2N + vài giọt phenolphtalein 1%, lắc để phản ứng xảy Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 97 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền XIII Header Page 98 of 133 hoàn toàn Sau đó, định phân NaOH đến dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, lấy màu chuẩn màu formol sau trung hòa - Thực lần thử thật, lần thử không (thay 20 ml dịch lọc 10 ml nước cất) Tính kết : Số g nitơ acid amin có lít mẫu: Trong = ( )× × × × × (CT 2.5) X: lượng gam nitơ acid amin có lít mẫu a- Số ml NaOH 0.2 N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm b- Số ml NaOH 0.2 N dùng để chuẩn dung dịch mẫu đối chứng T : hệ số hiệu chỉnh nồng độ cua dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn T=1 m: số gam mẫu lấy cho thí nghiệm 0.0028: số gam nito ứng với 1ml NaOH 0.2 N PL.D.5 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng Dụng cụ hóa chất: Bình định mức 500 ml, 100 ml, 50 ml Erlen 50 hay 100 ml Cối chày sứ Phiễu lọc Ống nghiệm Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 98 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 99 of 133 XIV Ống hút Quang phổ kế Cồn 96o, cồn 80o Phenol 5% H2SO4 đậm đặc Dung dịch đường saccharose 0,1% : 500 mg saccharose sấy khô 60oC, hòa tan 50 ml nước cất Cách tiến hành: - Cách trích đường: lấy g nguyên liệu tươi nghiền nhỏ cho vào cốc thủy tinh 50ml thêm 10ml cồn 96o Đun sôi nồi cách thủy cho sôi lần Khuấy đũa thủy tinh Sau để nguội, lọc qua giấy lọc không tro (khi lọc nhớ gạn lấy phần cồn đừng để cặn đổ lọc) - Sau cho 10ml cồn 80o vào cốc đựng bã, khuấy đun sôi lần bếp cách thủy Để nguội lọc tiếp tục, chiết rút khoảng lần, xong để bã lên lọc rửa – lần cồn 80o (rửa một) - Cồn qua lọc cho bay nhiệt độ phòng lò cách thủy đun nhẹ Sau cồn bay hết, mẫu để lâu bình hút ẩm - Cặn khô cốc pha loãng thành 50ml với nước cất (bình định mức) Nếu có cặn để lắng xuống Khi đem làm màu, dung dịch pha loãng thành – 10 lần tùy nồng độ nhiều hay - Thực phản ứng màu: hút ml đường cho vào ống nghiệm thêm vào ml dung dịch phenol 5% Sau đó, cho xác ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm Để 10 phút lắc đều, giữ nồi cách thủy 10 – 20 phút 25 – 30oC để xuất màu Màu bền vững vài Xác định cường độ màu quang phổ kế 490 nm Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 99 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 100 of 133 XV Xây dựng đường chuẩn: Lấy bình định mức 100 ml cho vào theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, ml dung dịch đường saccharose mẫu 0,1% cho nước cất tới vạch định mức Từ bình lấy 1ml cho vào ống nhuộm màu phenol 5% H2SO4 đậm đặc Trong ống nghiệm chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μg saccharose So màu bước sóng 490 nm, sau vẽ đồ thị mẫu Làm thêm ống thử với ml nước cất Tính kết quả: Trị số mật độ quang (OD) ống đối chứng sau trừ trị số ống thử xác định đường cong mẫu.Với dung dịch cần xác định nồng độ, ta trừ ống thử chiếu lên đường cong mẫu để suy nồng độ đường ống, từ tính % lượng đường mẫu PL.D.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử Dụng cụ hóa chất: Dung dịch kali ferixianua (K3Fe(CN)6) : hòa tan 1,65 K3Fe(CN)6 10 g NaNO3 lít nước cất Bảo quản dung dịch lọ thủy tinh màu nâu Dung dịch sắt sulphate (Fe2(SO4)3) : hòa tan g Fe2(SO4)3 10 ml H2SO4 đậm đặc Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn bình định mức, pha loãng thành 1000 ml Gelatin 10% Trộn lẫn dung dịch Fe2(SO4)3 gelatin 10% theo tỉ lệ 20 : Hỗn hợp dung dịch sử dụng ngày Cách tiến hành: Lấy 1g nguyên liệu hòa tan 20ml nước cất, lọc lấy dịch lọc (dịch đường), rửa bã lọc sau hiệu chỉnh đến mức 50ml Cho vào ống nghiệm (V = 20ml) ml dịch chiết đường ml dung dịch kali ferixianua, khuấy đều, đun nồi cách thủy sôi Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 100 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 101 of 133 XVI 15 phút Sau để nguội, thêm vào ống nghiệm 4ml dung dịch Fe2(SO4)3 khuấy dẫn đến mức 20ml Đo cường độ màu máy so màu bước sóng 710 nm Tính kết quả: Dựa vào mật độ quang học (OD) đối chiếu với đồ thị chuẩn, tính khối lượng đường PL.D.7 Phương pháp xác định hàm lượng lipid Dụng cụ hóa chất: Máy Soxhlet, giấy lọc, ether dầu hỏa ether ethylic Cách tiến hành: Giấy lọc sấy 105oC đến trọng lượng không đổi Nguyên liệu sản phẩm nghiền nhỏ, sấy 105oC đến trọng lượng không đổi Cân xác 2- g nguyên liệu khô tuyệt đối cho vào giấy lọc gói lại cho kín không để mẫu rơi Để giấy lọc có chứa mẫu vào trụ chiết máy Soxhlet Chiết ether dầu hỏa ether ethylic Sau chiết hết lipid (khoảng giờ), lấy túi mẫu ra, cho bay hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi Tính kết quả: Hàm lượng lipid thô tính theo công thức ( CT 2.6 ) X : hàm lượng lipid % a : trọng lượng giấy lọc mẫu trước chiết (g) b : trọng lượng giấy lọc mẫu sau chiết (g) c : trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid (g) Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 101 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền ... tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 14 of 133 GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Huyền Header Page 15 of 133 xv Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành. .. biến sản phẩm bột dinh dưỡng Bước đầu tạo sản phẩm bột dinh dưỡng từ phụ liệu bã đậu nành Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 19 of 133 GVHD: Ths Nguyễn... giống thời gian thuỷ phân đến sản phẩm .57 Hình 3.14 Sản phẩm bột dinh dưỡng 66 Đề tài: Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara) Footer Page 12 of 133 GVHD: