Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG CÂY TRỒNG Khái niệm I Các chất điều hòa sinh trưởng trồng 1.1 Auxin 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Quá trình trao đổi chất auxin 1.1.3 Những ảnh hưởng auxin trồng II Gibberellin (GA) 2.1 Sinh tổng hợp gibberellin 2.2 Những ảnh hưởng sinh lý gibberellin 2.3 Ứng dụng GA III Cytokinin 3.1 Nguồn gốc 3.2 Sinh tổng hợp cytokinin 10 3.3 Những ảnh hưởng sinh lý cytokinin 11 II GIỚI THIỆU VI KHUẨN AZOTOBACTER VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH 12 2.1 Đặc tính vi khuẩn Azotobacter 12 2.1.1 Hình thái học 14 2.1.2 Nang vi khuẩn 14 2.1.3 Đặc tính vật lý: 14 2.2 Khả sản xuất chất kích thích sinh trưởng tác động chúng tới trồng 15 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG 16 SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh III PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CÁC PHYTOHORMONE 17 3.1 Phân lập 17 3.2 Tuyển chọn chủng VK Azotobacter sinh tổng hợp IAA 18 3.3 Tuyển chọn chủng sinh Gibberelin 18 3.4 Kiểm tra hoạt lực tổng hợp IAA chủng vừa tuyển trọn thực tế 19 3.5 Lên men thu sinh khối 20 3.6 Kiểm tra sinh khối 21 IV CHUẨN BỊ CHẤT MANG 22 4.1 Giới thiệu chung chất mang 22 4.2 Lựa chọn chất mang cho Azotobacter 22 4.3 Xử lí chất mang 23 4.4 Cấy chủng 24 4.5 Bảo quản 24 4.6 Sử dụng 24 PHẦN II PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG TỔNG HỢP RA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG 25 I Phân lập, tuyển chọn chủng Pseudomonas tổng hợp chất kích thích sinh trưởng Auxin 25 1.1 Đặc điểm chủng Pseudomonas sp 25 1.2 Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas từ mẫu khác 25 II Phân lập tuyển chọn chủng Azospirillum tổng hợp Auxin Giberelin 30 2.1 Đặc điểm Azospirillum 30 2.2 Phân lập tuyển chọn Azospirillum từ mía tỉnh Cần Thơ(ĐH Cần Thơ nghiên cứu ) 31 2.3 Phân lập tuyển chọn Azospirillum từ mẫu đất rừng quận Thanjavur, Tamil Nadu, Ấn Độ[6] 32 PHẦN III GIỚI THIỆU VỀ AZOTOBACTER 35 Phân lập chủng Azotobacter spp từ đất 35 SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh LỜI MỞ ĐẦU Cùng với việc gia tăng dân số mạnh mẽ vấn đề an ninh lương thực cho quốc gia toàn giới, từ nảy sinh yêu cầu cao nên nông nghiệp, nhằm nâng cao sản lượng, chất lượng sản phẩm nông sản phục vụ sống người Từ lâu, người nông dân sử dụng loại phân bón hóa học công cụ hữu ích giúp nâng cao suất vụ mùa Thực tế cho thấy, phân bón hóa học giúp cải thiện cách đáng kể sản lượng lương thực thu Song mặt khác, việc sử dụng gia tăng phân bón hóa học cân đối nghiêm trọng yếu tố dinh dưỡng gây nhiều ảnh hưởng xấu đến hiệu sản xuất môi trường sinh thái Để phát triển nông nghiệp bền vững, cần phải có chiến lược an toàn dinh dưỡng cho đất trồng: bảo đảm cung cấp đủ liều lượng cần thiết chất dinh dưỡng thiết yếu lúc cần, theo tỷ lệ cân đối chất phân bón, phù hợp với yêu cầu loại vùng đất trồng điều kiện thời tiết, khí hậu khác nhau: an toàn dinh dưỡng cho đất trồng có nghĩa bảo đảm phát triển hệ sinh thái đất Đất trồng không tập hợp nguyên tố hóa học, mà giới sống – nơi trú ngụ sinh sống hàng triệu triệu sinh vật, nơi giờ, phút diễn hàng loạt phản ứng lý, hóa sinh học Thông qua phản ứng lý, hóa, sinh học hoạt động sinh vật sống, đất trồng có điều kiện để hồi phục cân thông qua quy luật tự nhiên Nếu phá vỡ quy luật này, đất bị hủy hoại không phát huy vai trò Bảo đảm an toàn dinh dưỡng cho đất trồng không nâng cao suất, chất lượng nông sản, giảm chi phí sản xuất, nâng cao hiệu kinh tế mà góp phần bảo vệ môi sinh, môi trường thông qua việc tạo cân tự nhiên, giảm bớt hóa chất độc sử dụng phòng trừ sâu bệnh hại trồng Chiến lược an toàn dinh dưỡng cho đất trồng sử dựng cân đối phân bón hóa học phân bón sinh học cho trồng phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng điều kiện đất đai, khí hậu phân bón sinh học có vai trò vô quan trọng Phân bón sinh học không cung cấp cho trồng chất dinh dưỡng cần thiết mà góp phần trì độ phì nhiêu đất trình canh tác, có vai trò quan trọng thâm canh Phân bón sinh học nhóm phân bón có nguồn gốc từ chất liệu sinh học bao gồm loại phân vi sinh vật, phân hữu chế biến thông qua trình lên men vi sinh vật SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh PHẦN I TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG CÂY TRỒNG Khái niệm Phân vi sinh kích thích sinh trưởng sản phẩm chứa vi sinh vật sống , có khả tổng hợp chất kích thích sinh trưởng như: auxin (IAA), Cytokinin, GA, ethylene kích thích phát triển trồng nâng cao suất nông sản I Các chất điều hòa sinh trưởng trồng 1.1 Auxin 1.1.1 Phân loại Auxin chia thành nhóm sau : - Những dẫn xuất indole: Indole-3-acetic (IAA) Indole-3-butyric acid (IBA) - Những benzoic acid: 2,3,6-trichlorobenzoic acid 2-methoxy-3-6- dichlorobenzoic acid (Dicamba) - Những chlorophenoxyacetic acid: 2,4,5 - trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) - Picolinic acid: 4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid (Tordon hay Pichloram) - Những naphthalene acid: α β-naphthaleneacetic acid (α β - NAA) - Những naphthoxyacetic acid: α β-naphthoxyacetic acid (α β- NOA) 1.1.2 Quá trình trao đổi chất auxin - Sự tổng hợp IAA: Auxin tổng hợp tất thực vật bậc cao, tảo, nấm vi khuẩn Ở thực vật bậc cao IAA tổng hợp chủ yếu đỉnh chồi từ vận chuyển xuống với vận tốc 0,5- 1,5cm/h Sự vận chuyển auxin có tính chất phân cực nghiêm ngặt, tức vận chuyển theo hướng gốc Chính mà xa đỉnh ngọn, hàm lượng auxin giảm dần tạo nên gradien nồng độ giảm dần auxin từ đỉnh xuống gốc Ngoài đỉnh auxin tổng hợp quan non khác non, non, phôi hạt sinh trưởng, mô phân sinh tầng phát sinh Quá trình tổng hợp auxin xảy thường xuyên mạnh mẽ xúc tác enzyme đặc hiệu Axit β-Indol Axetic loại auxin phổ SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh biến cây, tổng hợp từ tryptophan đường khử amin, cacboxyl oxy hóa Công thức tổng quát Axit β - Indol Axetic C10H9O2N - Sự phân hủy auxin: Sự phân hủy auxin trình quan trọng điều chỉnh hàm lượng auxin Auxin sau tác dụng bị phân hủy làm hoạt tính trường hợp hàm lượng cao dư thừa auxin bị phân hủy để giảm hàm lượng Sự phân hủy auxin chủ yếu xảy đường enzyme IAA-oxidase IAA-oxidase hoạt động mạnh cây, đặc biệt hệ thống rễ Dưới tác dụng xúc tác IAAoxidase, IAA bị ôxy hóa chuyển thành dạng hoạt tính metilen oxindol - Sự biến đổi thuận nghịch dạng tự dạng liên kết: IAA tồn hai dạng dạng tự dạng liên kết IAA tự dạng gây hoạt tính sinh lý Tuy nhiên, tế bào IAA tự chiếm hàm lượng thấp so với dạng IAA liên kết IAA liên kết dạng chủ yếu, chúng hoạt tính sinh lý có hoạt tính sinh lý thấp AIA liên kết chủ yếu với gluxit với axit amin Dạng liên kết IAA có ý nghĩa lớn việc dự trữ IAA, làm giảm hàm lượng IAA tự do, tránh tác dụng IAA-oxidase dạng vận chuyển auxin Nhờ ba trình trao đổi chất tiến hành đồng thời auxin mà hàm lượng auxin tương đối ổn định bảo đảm sinh trưởng, phát triển quan thể hài hòa, không bị rối loạn Bằng đường tổng hợp hóa học, hàng loạt hợp chất có chất tương tự auxin đời có ý nghĩa quan trọng việc điều chỉnh sinh trưởng Có nhiều chất quan trọng như: α-NAA; IAA; IBA; 2,4D; 2,4,5T 1.1.3 Những ảnh hưởng auxin trồng Auxin liên quan đến nhiều trình sinh lý Vài ảnh hưởng auxin điều hòa trình sinh lý thực vật kể đến sau: quan trọng  Vươn dài tế bào: Các bước ảnh hưởng lên vươn dài auxin tác động tóm tắt sau: - Giảm tính chống chịu vách tế bào sức căng Điều gây bẻ gãy liên kết không cộng hóa trị xyloglucans cellulose vách tế bào - Có thay đổi chế độ nước với tế bào Ngay áp suất thẩm thấu tế bào không thay đổi, nước tế bào xử lý với auxin trở nên yếu giảm áp suất - Sự giảm nước cho phép nước di chuyển vào bên tế bào tạo áp suất phía vách tế bào có tính dẻo tạo vươn dài SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh - Khi vươn dài hoàn tất, liên kết không cộng hóa trị polysaccharide tái lập trở lại Quá trình không thuận nghịch cellulose  Quang hướng động: Quang hướng động phát triển mô thực vật hướng phía sáng đáp ứng với thông lượng trực tiếp gradient Theo giả thuyết Cholodny - Went ánh sáng chiếu từ phía gây di chuyển auxin phía tối, nồng độ auxin phía tối cao phía chiếu sáng Sự phân phối auxin không xem nguyên nhân gây nghiêng  Địa hướng động: Là hướng động quan thực vật đáp ứng với trọng lực Nếu câyđược đặt nằm ngang, chồi nghiêng lên phía ngược chiều với trọng lực (địa hướng động âm), trái lại rễ nghiêng xuống theo chiều trọng lực (địa hướng động dương) Theo thuyết Cholodny-Went địa hướng động thân rễ đáp ứng với trọng lực tích lũy IAA phía thấp Trong thân IAA kích thích sinh trưởng mặt đáy thân làm cho thân nghiêng phía Khi cắt chóp rễ khả đáp ứng rễ trọng lực bị đặt chóp rễ trở lại tính địa hướng động phục hồi  Ưu chồi ngọn: Chồi biết nguyên nhân khống chế phát triển chồi bên Khi cắt chồi ngọn, chồi bên phát triển Tuy nhiên theo thời gian, chồi bên phát triển trội lên ức chế phát triển chồi bên mọc sau Sau auxin phát hiện, hàm lượng cao đỉnh chồi ghi nhận Ưu chồi ghi nhận nhiều loài thực vật điều khiển chất điều hòa sinh trưởng  Sự tượng rễ: Julius Von Sachs (1880) cho non chồi hoạt động có chứa chất điều hòa sinh trưởng có khả dẫn truyền kích thích tượng rễ IAA biết chất có khả kích thích tượng rễ cành giâm cho thấy khả ứng dụng thực tiễn Những auxin tổng hợp thường dùng thay IAA tự nhiên chúng không bị phân hủy enzyme IAA oxidase hay enzyme khác tồn mô thời gian dài Áp dụng auxin ngoại sinh kích thích tượng rễ phát triển sớm rễ, trái lại vươn dài rễ nói chung bị ức chế trừ áp dụng với nồng độ đủ nhỏ Sự ức chế sinh trưởng auxin thường có liên quan đến kích thích sinh tổng hợp ethylene  Sự sản sinh ethylene: Sự kích thích sản sinh ethylene gây auxin ghi nhận cà chua Zimmerman Wilcoxon (1935) Ngày nay, auxin biết chất điều hòa sinh trưởng kích thích sinh tổng hợp ethylene nhiều loài thực vật đậu xanh, lúa, cỏ lồng vực…  Sự phát triển trái: Sự gia tăng kích thước trái chủ yếu nở rộng tế bào gây Auxin có liên quan đến nở rộng tế bào đóng vai trò việc định phát triển trái Vai trò mạnh mẽ auxin phát triển trái gồm hai yếu tố Thứ mối quan hệ phát triển hột với kích thước cuối hình dạng trái Thứ hai việc áp dụng auxin lên trái giai đoạn đặc thù phát SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh triển gây đáp ứng Ví dụ dâu tây, nội phôi nhủ phôi bế sản xuất auxin, di chuyển kích thích sinh trưởng Vị trí bế trái có ảnh hưởng lớn đến hình dạng trái Bế dâu tây nằm bên đế hoa thịt dễ dàng tác động Khi tách tất bế trái không phát triển Tuy nhiên, tách tất bế áp dụng auxin lên đế hoa trái phát triển bình thường  Sự rụng: Nếu cắt bỏ phiến non dễ rụng Tuy nhiên cuống không rụng xử lý auxin IAA Sự rụng thành lập tầng rời tượng bị chi phối auxin Sự rụng gia tăng lượng auxin nội biên lớn auxin ngoại biên Xử lý auxin phía tầng rụng làm giảm lão hóa, phía thân tầng rụng kích thích lão hóa gây rụng Sự giảm auxin nội sinh quan khác gây rụng Việc xử lý NAA hay 2,4 D làm giảm rụng trái  Sự thể giới tính: Việc xử lý auxin làm thay đổi giới tính hoa số loài thay đổi giới tính ghi nhận có liên quan đến kích thích sinh tổng hợp ethylene Khi xử lý auxin ngoại sinh làm tăng số lượng hoa họ bầu bí II Gibberellin (GA) 2.1 Sinh tổng hợp gibberellin Nói chung người ta chấp nhận gibberellin tổng hợp từ mevalonic acid chồi non sinh trưởng tích cực hột phát triển Chu trình mevalonic acid liên quan đến sinh tổng hợp gibberellin mà liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, abscisic acid brassinosteroid (hình 3.6) Sau mevalonic acid biến đổi thành mevalonicacid pyrophosphate thành isopentenyl pyrophosphate tách theo hướng tổng hợp cytokinin, abscisic acid đường khác theo bước để tạo thành ent-kaurene dẫn đến thành lập phân tử gibberellin Quá trình tổng hợp gibberellin bị ức chế chất làm chậm sinh trưởng bước chuyển hóa từ geranylgeranyl pyrophosphate thành copyl pyrophosphate Các chất làm chậmsinh trưởng gốc pyrimidine, triazole, tetcyclacis inabenfide ức chế biến đổi từ entkaurene thành ent-kaurenol, từ ent-kaurenol thành ent-kaurenal, từ ent-kaurenal thành entkaurenoic acid Quá trình sinh tổng hợp gibberellin nấm G.fujikuroi thực vật bậc cao chia thành giai đoạn chính: - Chuyển hóa mevalonic acid thành ent-kaurene - Chuyển hóa ent-kaurene thành gibberellin prototype, GA12-aldehyde SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh - Chuyển hóa GA12 - aldehyde thành C20-, thành C19 - GA với đường không 13-hydroxyl hóa đường 13-hydroxyl hóa sớm vị trí khác sau thành dạng GA khác 2.2 Những ảnh hưởng sinh lý gibberellin Gibberellin có liên quan đến nhiều trình sinh lý Tuy nhiên chi, loài với yếu tố khác định gibberellin đặc hiệu hiệu Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều trình sinh trưởng phát triển thực vật phát triển thân, nảy mầm hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh sinh, đậu trái lão hóa - Ảnh hưởng phát triển thực vật sống: Các gibberellin biết có khả kích thích vươn dài thân hay phân chia tế bào Sự kích thích vươn dài GA thể rõ non phận non, trưởng thành hay quan già ảnh hưởng Nhìn chung, GA kích thích sinh trưởng nhiều loài đặc biệt lùn Khác với auxin, ảnh hưởng vươn dài GA lên thực vật sống rõ đoạn mẫu cắt Thực vật đáp ứng với loại gibberellin khác khác Đối với trục hạ diệp rau diếp, ảnh hưởng kích thích vươn dài GA8 không rõ nét, ảnh hưởng kích thích vươn dài GA4, GA1 GA3 mạnh dần GA9 lại có ảnh hưởng mạnh Trong vài trường hợp ảnh hưởng kích thích vươn dài trục hạ diệp dưa leo gibberellin hiệu - Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: Có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp GA phát Đây tính trạng đơn gene, kích thước biến dị phần năm bình thường lùn chủ yếu lóng bị ngắn lại Các dạng đột biến lùn đột biến bắp lùn (Zea mays L.) d1 d5 lúa lùn (Oryza sativa L.) Tan-ginbozu WaitoC GA nội sinh kiểm soát hoạt động bắp lúa GA1 Việc xử lý GA ngoại sinh làm cho cao trở lại bình thường Cũng có dạng đột biến lùn không đáp ứng với việc áp dụng gibberellin ngoại sinh lùn sau xử lý - Ảnh hưởng lên nảy mầm hột miên trạng: Hiện GA biết chất có khả kích thích nảy mầm phá vỡ miên trạng nhiều loại trồng GA kích thích hoạt động enzyme thủy phân hydrolase hột ngũ cốc GA ngoại sinh tác động lên lớp aleurone hột ngũ cốc kích thích sản sinh enzyme α-amylase để tác động lên phân hủy tinh bột thành đường đơn Tác động có tác dụng kích thích nảy mầm phá vỡ miên trạng Khoai tây nảy mầm sớm xử lý với GA3 GA kích thích nảy mầm hột rau diếp mà không cần xử lý ánh sáng đỏ GA thay điều kiện nhiệt độ thấp ngày dài để phá vỡ miên trạng SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh - Ảnh hưởng lên trổ hoa: Gibberellin có khả thúc đẩy trình trổ hoa nhiều loài thực vật Đối với cần yêu cầu ngày dài hay trải qua điều kiện lạnh trước trổ hoa xử lý GA điều kiện không cảm ứng chúng tượng hoa trổ hoa Ảnh hưởng có liên quan đến kích thích trình phân chia tế bào vươn dài tế bào - Ảnh hưởng lên phân hóa giới tính, đậu trái lão hóa: GA làm thay đổi giới tính hoa tương tự auxin, cytokinin ethylene Tuy nhiên, GA có hiệu ngược với auxin ethylene GA làm tăng số hoa đực dưa leo GA gây nên tượng trình sinh tạo nên trái không hột GA giúp cho trái to trì hoãn lão hóa Các loại trái nho không hột Nhật, Úc, Mỹ châu Âu thường có xử lý GA3 Bằng cách giảm lão hóa, GA giữ cho vỏ trái cam quít tươi lâu hơn, chậm mềm chín kéo dài thời gian bảo quản GA làm cho vỏ táo đẹp hơn, kiểng trổ hoa sớm tập trung GA3 giúp trình sản xuất malt công nghiệp sản xuất bia hiệu ngắn 2-3 ngày 2.3 Ứng dụng GA - Kích thích tăng chiều cao, tăng sinh khối - Tăng suất tạo không hạt - Phá bỏ ngủ nghỉ hạt, củ - Điều chỉnh giới tính III Cytokinin 3.1 Nguồn gốc Cytokinin hợp chất adenin thay thế, kích thích phân chia tế bào chức điều hòa sinh trưởng khác giống kinetin(6-furfurylaminopurine) Cytokinin phân lập từ DNA tinh trùng cá trích trùng gọi kinetin có khả kích thích phân chia tế bào hay phân bào (cytokinensis) mô lõi thuốc Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên phân lập từ hột bắp non gọi làzeatin(6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino)purine) Ngày nay, hầu hết cytokinin tìm thấy zeatin (hình 3) SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Hình Cấu trúc Zeatin Hiện nay, có nhiều cytokinin tổng hợp biết Có chất thông dụng kinetin (6furfurylaminopurine), BA (6-benzylaminopurine), BPA (6-benzylamino)-9-(2tetrahydropyranyl)-9H-purine) (hình 4) Cytokinin tìm thấy hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh không ký sinh, vi khuẩn, có phần lớn tRNA vi sinh vật tế bào động vật Hiện có 200 cytokinin tự nhiên tổng hợp phát Hình Cấu trúc 6-(furfurylamino)purine (Kinetin), benzylaminopurine BPA (6benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine) 3.2 Sinh tổng hợp cytokinin Cytokinin có nhiều miền phân sinh vùng phát triển có hiệu liên tục bao gồm rễ, non,trái phát triển hột Chúng xem tổng hợp rễ vận chuyển đến chồi có nhiều báo cáo cho thấy cytokinin tìm thấy nhựa gỗ Tuy nhiên, cytokinin tìm thấy nhiều mô trái hột cho thấy chúng tổng hợp Sự sinh tổng hợp cytokinin liên quan đến bước khởi đầu chu trình mevalonic acid đến isopentenyl phosphate (hình 3.6) SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 10 of 126 10 Header Page 26 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Mẫu đất họ đậu đồng sông cửu long Đất thu phơi bong mát, đập nhỏ rây qua rây 2mm; cân 1g đất cho vào bình tam giác chứa 99ml nước cất tiệt trùng, lắc máy lắc xoay vòng tốc độ 200 vòng/phút 2h Sau đó, chuyển 1ml dung dịch đất sang bình tam giác 99ml nước cất tiệt trùng ống nghiệm, khuấy mạnh máy lắc rung 30 giây tiếp tục pha loãng đến tần suất 10-7 Hút 0,1ml dung dịch từ ống nghiệm lên môi trường pseudomonas bị cách ly thạch trắng (difco) bổ xung 10ml glyxerin 50mg/lit cycloheximit, dung que thủy tinh trải đợi khô buồng cấy vô trùng đặt đĩa petri tủ ủ 30oc sau hay ngày, cách khuẩn lạc xuất bề mặt môi trường, chuyển khuẩn lạc rời sang môi trường cách ria cấy để nhận khuẩn lạc rời cuối đường cấy chuyển khuẩn lac rời sang ống nghiệp nắp đen chứa môi trường để trữ xem chủng Các chủng xác địh khả tổng hợp IAA môi trường king B có không bổ xung 2,5mM tryptophan chủng vi khuẩn nuôi môi trường xác định nhiệt độ 30o vòng ngày, sau đem ly tâm môi trường 14000 vòng/phút phút, dịch ly tâm trộn với thuốc thử salkowski R2(4,5 g/l FeCl3 10,8 M H2SO4 vòng 30 phút đo máy quang phổ bước song 530 nm, sau xác định lượng IAA dựa đường chuẩn tinh khiết IAA Chủng tạo nhiều IAA chọn làm chủng giống ([1]http://publication.ctu.edu.vn/en/index.php/tapchi/doc_details/1371-phan-lp-va-tuyn-chncac-chng-vi-khun-pseudomonas-co-kh-nng-hoa-tan-lan-va-sinh-tng-hp-auxin-cao) SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 26 of 126 26 Header Page 27 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Thành phần môi trường king B Thành phần 1L 500mL Nước 1L 500mL proteose peptone 20g 10g K2HPO4 1,5g 0,75g MgSO4•7H2O 1,5g 0,75g glycerol 10mL 5mL Agar 15g 7,5 mL Trộn môi trường: nước peptone trộn với sau đun sôi hòa tan, thêm chất khác vào đung nóng tất chúng hòa tan (http://wiki.bugwood.org/Kings_medium_B) b Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas (Murnberg, Đức) [2] [2]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=12&cad=rja &ved=0CCoQFjABOAo&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissue s%2Fbiy-08-32-1%2Fbiy-32-1-2-07035.pdf&ei=IHuoULHRPIijiAfdjYGoCg&usg=AFQjCNGBU8AVhSniRQ1Ei3AoehXxm6mT WA&sig2=lYxclDRKbnAJY_c_Brq8Yg c Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas ( Hokkaido, Nhật Bản) [3]  ml dầu thô+ 50ml môi trường MSM có bổ xung cao nấm men 0,1% SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 27 of 126 27 Header Page 28 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh o  Nuôi cấy 30 c máy lắc đến xuất vẩn đục  Pha loãng canh trường cấy lên môi trường thạch agar + kerosene ( nguồn C) đĩa thạch bịt kín hợp chất vinel tape  Tách khuẩn lạc đem nuôi cấy môi trường MSM Định lượng IAA phương pháp salkowski d Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas (Aligrarh, Ấn Độ) [4]  Mẫu đất súp lơ, lúa mỳ vùng phụ cận thành phố Aligrarh, Ấn Dộ  Môi trường dinh dưỡng thạch agar hay king B để tách chủng pseudomonas  Sau chúng nuôi cấy môi trường jensen có bổ xung không bổ xung trytophan, nuôi trong1 tuần pseudomonas,  2ml dịch ly tâm+ giọt orthophosphoric acid+ 4ml solawaski đo OD 530 nm [4]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7&c ad=rja&ved=0CFoQFjAG&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology %2Fissues%2Fbiy-05-29-1%2Fbiy-29-1-5-04101.pdf&ei=xlWoUOSpAoqhiAe8_IDoCw&usg=AFQjCNGdepVDJzpSRulhrOxdh5AMWDGiA&sig2=q9VLw4FUjswdvndc3qjO9g Bảng so sánh IAA chủng pseudonoma SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 28 of 126 28 Header Page 29 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 29 of 126 29 Header Page 30 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Mẫu đất đồng Sông Cửu Long Mẫu đất Ấn Độ II Phân lập tuyển chọn chủng Azospirillum tổng hợp Auxin Giberelin 2.1 Đặc điểm Azospirillum Vi khuẩn Azospirillum sp thuộc chi Rhodosprillales, biết vi khuẩn gram âm, có hình dạng thể xoắn, cong hình dấu phẩy dạng xoắn khuẩn, chiều dài khoảng 2,0–3,8 µm chiều rộng khoảng 1,0–1,5 µm, sinh trưởng tốt 300C Azospirillum có khả tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật Auxin Gibberelin giúp rế trồng phát triển tốt hơn, gia tăng diện tích tiếpxúc rễ với đất SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 30 of 126 30 Header Page 31 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh 2.2 Phân lập tuyển chọn Azospirillum từ mía tỉnh Cần Thơ(ĐH Cần Thơ nghiên cứu ) Dòng vi khuẩn Azospirillum sp phân lập từ mía, nuôi cấy môi trường NFb lỏng, Pha 15 ml môi trường NFb cho vào ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ướt 121o C 20 phút Định lượng IAA phương pháp Salkowski (Glickmann Dessaux, 1995) Hút cẩn thận 1ml phần dịch vi khuẩn sau ly tâm cho vào ống duharm Cho ml thuốc thử Salkowski R2 pha vào ống duharm Ủ hỗn hợp tối 10 phút để phản ứng xảy hoàn toàn sau đo quang phổ OD bước sóng 530 nm Kết đo OD dòng phân lập thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn , từ suy nồng độ IAA dòng Chủng tạo nhiều IAA chọn làm chủng giống sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 31 of 126 31 Header Page 32 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh [5](http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja &ved=0CB4QFjAA&url=http%3A%2F%2Fpublication.ctu.edu.vn%2Findex.php%2Ftapchi %2Fdoc_download%2F1467-kho-sat-kh-nng-sinh-tng-hp-iaa-va-c-nh-m-ca-vi-khungluconacetobacter-sp-va-azospirillum-sp-c-phan-lp-t-cay-mia&ei=zqiSUMPCCiViAfM9oGQBQ&usg=AFQjCNFbCgUrd0Y4p-CjO3T116TEuJBxtA&sig2=ExjIv6xqGLSM08YIiVt-g) 2.3 Phân lập tuyển chọn Azospirillum từ mẫu đất rừng quận Thanjavur, Tamil Nadu, Ấn Độ[6]  Phân lập từ mẫu đất rừng quận Thanjavur, , Tamil Nadu, Ấn Độ  g mẫu đất hòa tàn vào nước vô trùng pha loãng đến 10  0,1 ml dịch pha loãng cho vào ống nghiệp chứa môi trường NfB (nitrogen free o bromothymol) bán rắn, nuôi cấy 32 C vòng 48 h hình thành lớp màng mỏng, lớp màng mỏng cấy lên môi trường Nfb rắn đường ziczac o 32 C 24h  Hình thành khuẩn lạc riêng rẽ có màu trắng, vàng hồng cấy lên o môi trường thạch muối nhỏ nuôi 32 C vòng 24h SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 32 of 126 32 Header Page 33 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh [6]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ca d=rja&sqi=2&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pelagiaresearchlibrary.c om%2Fder-chemica-sinica%2Fvol1-iss3%2FDCS-2010-1-3-138-145.pdf&ei=kd-oUPBJYyjigf1pYHQDg&usg=AFQjCNG_LO9nIBar_G3_dc_7GFd6VnEDw&sig2=jrMZ0GUl35lqs0GLlqQuMg SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 33 of 126 33 Header Page 34 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh BẢNG THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ĐÃ SỬ DỤNG ĐỂ PHÂN LẬP CHỦNG 1.Thành phần môi trường king B Thành phần 1L 500mL Nước 1L 500mL proteose peptone 20g 10g K2HPO4 1,5g 0,75g MgSO4•7H2O 1,5g 0,75g glycerol 10mL 5mL agar 15g 7,5 mL Môi trường NFb: axit malic- 0,5g; MgSO4.7H2O- 0,2g; NaCl-0,1g; CaCl2-0,02; Na2MoO4-0,002g; MnSO4.H2O-0,01g; EDTA 1,64%-4 mL; Bromothymol xanh 0,5% (W/W cồn) -2mL; KOH-4,5g; Biotin-0,1g; nước cất 1L, pH-6,8 Môi trường MSM: 0.4% NH4NO3,0.47% KH2PO4, 0.0119% Na2HPO4, 0.001% CaCl2 2H2O, 0.1%MgSO4 7H2O, 0.001% MnSO4 4H2O, and 0.0015% FeSO4 4H2O,pH 7.0 Môi trường Jensen: sucrose 20g, dipotassium hydrogen phosphate 1g, magnesium sulfate 0,5g, sodium chloride0,5g ferrous sulfate 0,1g, sodium molybdate 0,005g, agar 20g, lít nước ph=6,9 Môi trường dinh dưỡng thạch agar: 0.5 % peptone , 0.3 % beef extract/yeast extract, 1.5 % agar, 0.5% NaCl, distilled water, pH adjusted to neutral (6.8) at 25 °C SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 34 of 126 34 Header Page 35 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh PHẦN III GIỚI THIỆU VỀ AZOTOBACTER Azotobacter thường tìm thấy đất hiệu cho việc cải thiện độ phì nhiêu đất tăng suất trồng Nó chuyển hóa nitơ trực tiếp từ không khí giúp cho việc sản xuất ngũ cốc tốt Azotobacter có xu hướng nhạy cảm với môi trường axit, nồng độ phosphate cao nhiệt độ 35 º C Azotobacter tìm thấy rhiosphares số nhà máy sản xuất hormone chất kích thích tăng trưởng Azotobacter tự nhiên cố định nitơ rhizosphare Có nhiều chủng khác Azotobacter, chủng có tính chất hóa học, sinh học khác đối chút Tuy nhiên, số chủng có khả cố định nitơ cao hơn chủng khác Bên cạnhviệc cố định nitơ, Azotobacter sản xuất Thiamine, Riboflavin, Indole, Nicotine axit acetic gibberellins Khi Azotobacter áp dụng cho hạt giống, hạt giống nảy mầm cải thiện đến mức độ đáng kể Phân lập chủng Azotobacter spp từ đất a Lấy mẫu Mẫu đất thu thập từ bảy địa điểm khác nhau, sau: đất trồng họ đậu đất trồng thực vật đất trồng lúa đất trồng cỏ đất lâm nghiệp Đất chưa sử dụng Nước sông trầm tích Lấy mẫu đất thu thập từ bảy địa điểm khác nhau,mẫu đất thu thập số nhựa túi xách, bút đánh dấu, thìa, rượu dao thực Lúc đầu người ta chọn khu vực để lấy mẫu, sau họ lựa chọn bốn năm điểm khu vực thu thập đất trộn bốn hay năm điểm mẫu đất với Đủ lượng đất thu thập từ trang web, giữ túi nilon gắn thẻ Mẫu đất thu thập từ cm đất, nơi mà hầu hết hoạt động vi sinh vật diễn ra, nơi mà hầu hết vi khuẩn tập trung SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 35 of 126 35 Header Page 36 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Môi trường dùng cho phân lập b Xác định độ ẩm 50 mẫu gm cân bằn cốc thủy tinh 150ml sạch, trọng lượng cốc thủy tinh cân trước đổmẫu đất Sau lưu giữ 105 º C ± º C 24 giờ, sau lần trọng lượng mẫu đất cốc thủy tinh đưa combinedly Sự khác biệt độ ẩm đất ghi lại tính độ ẩm mẫu c Xác định PH mẫu 25 gm (lĩnh vực ẩm) cân cốc thủy tinh khô ml 150 50 ml nước cất bổ sung Khuấy máy votex pH mẫu đo máy đo PH d Chuẩn bị môi trường phân lập Người ta chuẩn bị mơ trường cho lít sau: Theo phương tiện truyền thông thành phần, thuốc thử cân cân điện tử - 1000 ml nước cất đo bình định mức thực bình nón - Các thuốc thử (trừ agar) trộn với nước cất - Sau trộn thuốc thử, pH điều chỉnh cách thêm HCl dung dịch NaOH có cần thiết - Sau điều chỉnh pH, agar trộn vào dung dịch - Sau trộn thạch, môi trường đem di hấp khử trùng - Cuối môi trường đổ hộp Petri vô trùng SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 36 of 126 36 Header Page 37 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh e Phân lập 10 gm mẫu thu thập thêm vào 90 ml nước cất vô trùng bình nón vô trùng (250 ml), lắc kĩ máy votex sau để yên 30 phút ml dung dịch mẫu sau chuyển sang ống nghiệm chứa ml nước cất lắc tay lần để yên 30 phút Tiếp tục pha loãng đến 10 Một ml mẫu (từ 101 đến 105 phần nhỏ) rót Petri vô trùng có chứa khoảng 15 ml môi trưpwngf sau hấp khử trùng (45 º C),môi trường Ashby, sau ủ nhiệt độ 28 ± º C khoảng - ngày Sau ủ,các khuẩn lac lạc xuất môi trường Sau người ta tính toán số lượng Azotobacter gram đất f Nghiên cứu khả phát triển chủng số môi trường  Người ta tiến hành nghiên cứu mơi trường có nồng độ muối khác thay đổi từ 0-1% sau ủ vòng 48h nhiệt độ 28oC  Người ta tiến hành nghiên cứu sinh trưởng phát triển chủng điều kiện nhiệt độ thay đổi từ 10oC-50oC để dánh giá khả chịu nhiệt chủng từ lựa chọn chủng tối ưu phục vụ cho việc sử dụng sản xuất phân sau  g Kết Dựa vào bảng kết ta thấy chủng lấy từ vùng đất trồng đậu tương có mật độ tế bào nhiều Từ bảng số liệu ta thấy chủng mẫu sống sót nồng độ NaCl 1,0% Các chủng mẫu 1,2,3,4,5 cho thấy tăng trưởng tối đa 0% NaCl mẫu 1,3,4 cho thấy tăng trưởng mức 0% 0,2% không SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 37 of 126 37 Header Page 38 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh nhau,các mẫu tăng trưởng 0,4% 0,6% nồng độ NaCl tăng nồng độ NaCl 0,8% Từ thấy mẫu dùng để sản xuất phân bón ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng Ta thấy Tất mẫu phân lập tăng trưởng tối đa 30 º C mẫu 1, cho thấy tốc độ tăng trưởng tối đa 30 º C 40 º C Không có mẫu phân lập sống sót 50 º C mẫu cho thấy tốc độ tăng trưởng mức 10 º C từ ta thấy nhiệt độ ủ mẫu nên 30oC Kết luận nghiên cứu cho thấy mẫu đất lấy từ vùng trồng đậu tương phù hợp với điều kiên canh tac cua trồng dùng để sản xuất phân bón vi sinh giảm giá thành sản phẩm SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 38 of 126 38 Header Page 39 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN (SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà) http://en.wikipedia.org/wiki/Azotobacter PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ HOẠT TÍNH NITROGENAZA VÀ SINH TỔNG HỢP IAA, Đỗ Thu Hà, ĐH Đà Nẵng, 2008 Evidence for a Non- trytophan dependent pathway, E Prinsen et al,1993 Antifungal and Phytohormone Production Potential of Azotobacter chroococum Isolates from Groundnut Rhizophere, 2009 Biosynthesis of cytokinins, Tatsuo Kakimoto, 2003 PHẦN (SVTH: Đặng Thị Thuý) [1]http://publication.ctu.edu.vn/en/index.php/tapchi/doc_details/1371-phan-lp-va-tuynchn-cac-chng-vi-khun-pseudomonas-co-kh-nng-hoa-tan-lan-va-sinh-tng-hp-auxin-cao [2]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=12&cad=rja &ved=0CCoQFjABOAo&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissue s%2Fbiy-08-32-1%2Fbiy-32-1-2-07035.pdf&ei=IHuoULHRPIijiAfdjYGoCg&usg=AFQjCNGBU8AVhSniRQ1Ei3AoehXxm6mT WA&sig2=lYxclDRKbnAJY_c_Brq8Yg [4]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7&cad=rja &ved=0CFoQFjAG&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissues%2 Fbiy-05-29-1%2Fbiy-29-1-5-04101.pdf&ei=xlWoUOSpAoqhiAe8_IDoCw&usg=AFQjCNGdepVDJzpSRulhrOxdh5AMWDGiA&sig2=q9VLw4FUjswdvndc3qjO9g [5]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja &ved=0CB4QFjAA&url=http%3A%2F%2Fpublication.ctu.edu.vn%2Findex.php%2Ftapchi %2Fdoc_download%2F1467-kho-sat-kh-nng-sinh-tng-hp-iaa-va-c-nh-m-ca-vi-khungluconacetobacter-sp-va-azospirillum-sp-c-phan-lp-t-cay-mia&ei=zqiSUMPCCiViAfM9oGQBQ&usg=AFQjCNFbCgUrd0Y4p-CjO3T116TEuJBxtA&sig2=ExjIv6xqGLSM08YIiVt-g [6]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja &sqi=2&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pelagiaresearchlibrary.com%2Fder -chemica-sinica%2Fvol1-iss3%2FDCS-2010-1-3-138-145.pdf&ei=kd-oUPBJYyjigf1pYHQDg&usg=AFQjCNG_LO9nIBar_G3_dc_7GFd6VnEDw&sig2=jrMZ0GUl35lqs0GLlqQuMg PHẦN (SVTH: Nguyễn Văn Hùng) SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 39 of 126 39 Header Page 40 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 40 of 126 40 ... 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh PHẦN I TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG CÂY TRỒNG Khái niệm Phân vi sinh kích thích sinh trưởng sản phẩm chứa vi sinh vật sống... 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG Chất mang Phân lập, tuyển chọn VSV Xử lý Lên men sinh khối Nghiền mịn Thu sinh khối hỗn... luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng Footer Page 29 of 126 29 Header Page 30 of 126 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh