giáo trình công nghệ gen

Chương Sản xuất, xác nhận độ bền vững trồng chuyển gen 1.1 Các phương pháp chuyển gen Cho đến có 150 loài thực vật khác nhau, nhiều loài trồng chuyển gen thành công Những thực vật chuyển gen diễn biến bật công nghệ gen thực vật giới thiệu bảng 1.1 Để tạo biến đổi gen năm qua loạt phương pháp khác thực Trong đó, ba phương pháp sau ứng dụng rộng rãi (giới thiệu mục 1.1.1 đến 1.1.3) Bảng 1.1 Diễn biến bật công nghệ gen thực vật Năm 1980 1983 1984 1985 198 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1994 1998 Những phát triển quan trọng Lần chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Marker chọn lọc, Ti-plasmid loại bỏ gen không cần thiết Biến nạp vào tế bào trần Kháng thuốc trừ cỏ Kháng virus Lần đưa biến đổi gen đồng ruộng Kháng côn trùng Biến nạp phi sinh học Điều khiển chín cà chua Kháng thể thực vật bậc cao Biến nạp phi sinh học ngô Tính bất dục đực nhân tạo Thay đổi thành phần carbohydrate Tạo alkaloid tốt Thay đổi acid béo Biến nạp phi sinh học lúa mỳ Lần phân giải plastic nhờ biến đổi gen Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất thị trường Lần 10 gen chuyển đồng thời vào thực vật Trên giới có 48 Mỹ có 35 loại thực vật biến đổi gen thị trường hóa 1999 Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt Cây biến đổi gen trồng diện tích 40 triệu Cho đến khoảng 9000 thí nghiệm biến đổi gen đưa đồng ruộng (ở EU: 1360) Phương pháp chọn lựa tùy thuộc loại vector biến nạp sử dụng Các vector plasmid thiết kế thích hợp 1.1.1 Chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục đích công nghệ gen thực vật tạo biến đổi gen có đặc tính Ở DNA lạ đưa vào tế bào thực vật tồn bền vững hệ gen Các vi khuẩn đất A tumefaciens số loài họ hàng có khả chuyển phần nhỏ DNA vào tế bào thực vật qua kích thích tạo khối u Những khối u không gian sống vi khuẩn Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn tạo khối u Những opine phổ biến nopalin octopin Về hóa học opine sản phẩm ngưng tụ amino acid với cetoacid amino acid với đường Octopin tạo nên từ amino acid arginine pyruvate, nopalin tạo nên từ arginine α-cetoglutaraldehyd Công thức cấu tạo opine trình bày hình 1.1 COOH HC NH CH COOH HC CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH NH NH C C NH Octopin CH3 NH COOH CH2 CH2 H2N COOH H2N NH Nopalin Hình 1.1 Công thức cấu tạo opine A tumefaciens “thực hiện” kỹ thuật gen tạo biến đổi gen có lợi cho Như vậy, khẳng định kỹ thuật gen trình nhân tạo không Khả chuyển DNA A tumefaciens sử dụng công nghệ gen đại Để hiểu trình này, điều cần thiết làm rõ tương tác sinh học Agrobacterium với thực vật Việc sử dụng A tumefaciens 1907, người ta phát vi khuẩn có khả tạo nên khối u hai mầm bị thương, gọi khối u cổ rễ (Hình 1.2) Trong năm bảy mươi người ta tìm thấy chủng A tumefaciens tạo khối u có plasmid lớn có kích thước 200 đến 800 kb Qua thí nghiệm chuyển đến chủng không độc (không có plasmid này), khẳng định plasmid cần thiết cho việc tạo khối u Vì vậy, plasmid gọi Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid) Hình 1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens a: Dưới kính hiển vi điện tử b: Khối u từ khối u xuất chồi cách tự nhiên Ti-plasmid mang gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết tế bào thực vật bị thương, cắt vận chuyển đoạn gọi TDNA T-DNA phần Ti-plasmid, chuyển vào thực vật (transfer-DNA) Trên định vị gen tạo khối u tổng hợp opine TDNA giới hạn hai vùng, bờ trái bờ phải (LB : left border RB: right border) Các bờ gồm trình tự lặp lại 25 bp, trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA T-DNA đưa vào DNA thực vật nhân tế bào Vị trí gắn vào thường ngẫu nhiên, nhiên thường vùng có khả chép Quá trình lây nhiễm mô tả hình 1.3 Bị thương Nhiễm sắc thể vi khuẩn Ti-plasmid với T-DNA Agrobacterium Nhiễm sắc thể nhân tế bào thực vật Agrobacterium Tế bào thực vật Vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật gắn T-DNA Agrobacterium khối u Khối u T-DNA vi khuẩn DNA nhân tế bào thực vật Các tế bào khối u thực vật Hình 1.3 Sơ đồ lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ở opine người ta phân biệt octopin nopalin Một số loài vi khuẩn A tumefaciens chứa Ti-plasmid loại octopin loại khác nopalin Những plasmid octopin tạo octopin phân giải chúng, không tạo phân giải nopalin Một khác biệt khác loại plasmid Agrobacterium Tiplasmid loại nopalin chứa copy T-DNA, ngược lại plasmid octopin chứa ba Ở hình 1.4, đoạn T-DNA định vị gen tổng hợp opine tạo khối u Khối u tạo nên phytohormone (auxin cytokinin) tạo tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích phân chia tế bào tạo nên mô không phân hóa tms tmr nos T-DNA RB noc vir tra ori Hình 1.4.Ti-Plasmid Agrobacterium dạng nopalin T-DNA: Transfer-DNA, LB: Bờ trái RB: Bờ phải, ori: khởi đầu chép A tumefaciens noc: Phân giải nopalin, noc: Tổng hợp nopalin tmr: Tổng hợp cytokinin, tms: Tổng hợp auxin, tra: Vận chuyển tiếp hợp, vir: Vùng virulence (vùng độc tính) Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết tế bào bị thương Khi tế bào bị thương chúng tiết hợp chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan trọng việc nhận biết gắn kết vi khuẩn tế bào thực vật Cơ chế nhận biết giải thích nhờ tính đặc hiệu A tumefaciens với hai mầm, mầm phản ứng loài Vì vậy, Agrobacterium sử dụng giới hạn cho biến nạp mầm Khi bổ sung syringon người ta biến nạp nấm A tumefaciens Thực vật mầm quan trọng ngô biến nạp A tumefaciens + Khối u xuất gen A tumefaciens Sự phát triển khối u sau nhiễm A tumefaciens dựa tác dụng hai phytohormone Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone mã hóa chủ yếu từ gen T-DNA Sự tổng hợp auxin thực hai gen tms1 tms2 Gen tms1 mã hóa tryptophan-2monooxygenase xúc tác cho biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamid Sản phẩm gen tms2 indol-3-acetamid-hydrogenase, xúc tác để tạo auxin: indolylacetic acid Ngoài T-DNA mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase Enzyme gắn 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin isopentenyladenin isopentenyladenosin Hydroxyl hóa tiền cytokinin enzyme thực vật để tạo nên cytokinin Auxin tạo nên với cytokinin làm cho khối u lớn lên, phân chia tế bào không phân hóa kích thích H CH2-COO- CH2OH C=C N H CH3 HN-CH2 N N N N H Hình 1.5 Cấu tạo indol-3-acetate (một auxin) zeatin (một cytokinin) A tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ chất nhận, mã hóa gen vùng vir Sự nhận biết chất nhận dẫn đến hoạt hóa tất gen vir Vùng vir bao gồm nhiều gen Một sản phẩm gen vir khác endonuclease nhận biết bờ phải trái T-DNA cắt TDNA vị trí Sau đó, protein gắn vào sợi đơn T-DNA phức hệ chuyển vào thực vật tác dụng sản phẩm gen vir (Hình 1.6) LB RB T-DNA LB RB  LB RB  virE2 virD2 virD2 LB RB Phức hệ T-DNA-Protein Hình 1.6 Sơ đồ biểu diễn trình di chuyển T-DNA Ti-plasmid 1: TDNA với bờ phải bờ trái chèn vào Ti-plasmid 2: Sợi đơn cắt nhờ protein mã hóa gen virD2 3: Sợi đơn T-DNA giải phóng kết hợp với protein virD2 virE2 mã hóa, chỗ đứt sợi đơn thứ hai tổng hợp bổ sung 4: Lấp đầy chỗ trống Ti-plasmid (đường gạch nối đậm) Sợi T-DNA tự vận chuyển vào tế bào thực vật dạng phức hệ DNA-protein Quá trình phức tạp nên không thích hợp cho việc ứng dụng công nghệ gen có ba nguyên nhân sau: - Việc tạo mô gen tổng hợp cytokinin auxin tái sinh từ tế bào thành hoàn chỉnh khỏe mạnh - Sự tổng hợp opine không mong muốn tiêu tốn lượng không cần thiết - DNA lạ đưa vào Ti-plasmid T-DNA Những plasmid lớn 200 kb lớn, khó thao tác phòng thí nghiệm Người ta thành công việc làm biến đổi Ti-plasmid T-DNA để phytohormone không tạo nên Trong bước gen tổng hợp opine cắt đưa vào gen chọn lọc (xem mục 1.2), ví dụ gen kháng kanamycin Ngày nay, người ta sử dụng hệ thống gọi vector hai nguồn (binary vector), chức Ti-plasmid thực hai plasmid Plasmid lớn mang vùng vir plasmid nhỏ mang bờ trái phải T-DNA Đây vùng T-DNA cần thiết cho việc vận chuyển gen vào thực vật, plasmid nhỏ đủ cho vận chuyển xác chí với bờ Giữa bờ phải trái gen chọn lọc gen lạ chèn vào Sơ đồ cấu tạo vector hai nguồn giới thiệu hình 1.7 Ưu điểm vector chỗ, thao tác thực với plasmid nhỏ Tất công việc tạo dòng, việc đưa DNA lạ, thực tế bào E.coli, plasmid lớn hoàn thiện chuyển vào A tumefaciens Quá trình biến nạp thực mô thực vật phù hợp, ví dụ mô Chúng ủ với vi khuẩn, sau vi khuẩn phải loại bỏ mô tái sinh thành hoàn chỉnh Cây Arabidopsis thaliana trở thành mô hình quan trọng nghiên cứu di truyền thực vật Phương pháp mô tả phương pháp thấm qua, không tế bào mô mà sử dụng Cây chưa nở hoa ngâm phần vào dung dịch A tumefaciens Sau đó, sàng lọc hệ biến nạp để xác định biến đổi gen Dĩ nhiên phương pháp thích hợp với nhỏ có chu kỳ sống ngắn có khả sản sinh lượng hạt lớn, hiệu phương pháp không cao vir Ti-plasmid Không có T- DNA A.t ori LB T2 Gen P2 T1 SMG P1 RB Mod T-DNA RB LB E coli plasmid với T- DNA E.c ori R kan Hình 1.7 Sơ đồ biểu diễn hệ thống vector hai nguồn để biến nạp A tumefaciens Các gen tạo khối u tổng hợp npalin loại ra, T-DNA mang gen đánh dấu để chọn lọc thực vật (SMG) Các gen khác chèn vào A t ori: Khởi đầu chép để nhân lên A tumefaciens, E c ori: Khởi đầu chép để nhân lên E coli kanR: gen kháng kanamycin để chọn lọc E.coli A tumefaciens P1, P2: Promoter, T1, T2: Terminator, vir: Vùng vir Ý nghĩa gen vir chuyển A tumefaciens -T-DNA giải thích sau: Gen virA mã hóa cho protein màng, chất nhận hợp chất phenol tế bào bị thương Sự nhận biết chất dẫn đến hoạt hóa sản phẩm gen virG, đến lượt lại kích thích chép biểu tất gen vir Sự hoạt hóa protein thuộc gen virG vận chuyển nhóm phosphate (photphoryl hóa) Hai protein mã hóa từ gen virD2 virE2 quan trọng việc chuyển T-DNA Protein virD2 endonuclease, cắt sợi đơn đặc hiệu bờ phải trái T-DNA, Protein virE2 gắn vào sợi đơn ngăn cản gắn lại với Ti-plasmid (Hình 1.7) Sau đó, chế tổng hợp sửa chữa DNA, từ sợi đơn lại Ti-plasmid xuất lại T-DNA hoàn chỉnh Ngoài ra, protein virD2 gắn vào đầu 5’ T-DNA sợi đơn cắt liên kết đồng hóa trị Bằng cách xuất phức hệ DNA-protein chuyển vào tế bào thực vật Quá trình xảy chưa biết hết chi tiết, 11 protein mã hóa từ gen virB tạo nên phức lỗ, qua lỗ phức hệ DNA-protein vận chuyển vào thực vật Khi đến tế bào thực vật phức hệ phải đưa vào nhân tế bào Protein virD2 virE2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho phép phức hệ qua màng nhân gắn vào DNA thực vật cách ngẫu nhiên chỗ gãy sợi DNA tế bào thực vật Tuy nhiên, vị trí tái tổ hợp quan sát đặc hiệu, trình tự ngắn 5-10 bp Quá trình kết hợp thực nhờ enzyme thực vật, có tham gia protein virD2 1.1.2 Chuyển gen phương pháp phi sinh học Biến nạp phi sinh học phương pháp có triển vọng thực vật, phát triển năm 1987 Sanford cộng tác viên, đặc biệt ngũ cốc thường biến nạp A tumefaciens tái sinh thực vật từ tế bào trần gặp khó khăn Để vượt qua thành tế bào người ta thiết kế dụng cụ để bắn hạt wolfram vàng bọc DNA vào tế bào Hạt nhỏ vào tế bào không gây hại kéo dài (Hình 1.8) Ưu điểm phương pháp này: - Không cần phải phân hủy thành tế bào enzyme - Về lý thuyết tế bào mô biến nạp - Không phức tạp biến nạp A tumefaciens Một so sánh hai phương pháp trình bày bảng 1.2 Vector cần cho biến nạp phi sinh học đơn giản vector biến nạp A tumefaciens 10 primer thích hợp cho phép phát rõ ràng cấu trúc chuyển gen bên cạnh gen xuất tự nhiên Với phương pháp diện cấu trúc DNA phát thông tin diện nguyên liệu thực vật mục nát DNA tự hấp thụ vào bề mặt đất Độ nhạy phương pháp phát quan trọng thường tùy thuộc vào qui trình tinh DNA điều kiện PCR Giới hạn phát xác định cho cấu trúc dùng củ cải đường chuyển gen với cặp primer khác (Bar/TR1, TR2/nptII 35SBNYVV-cp) khoảng 102 trình tự đích/gam đất (Gebhard cs, không công bố) DNA củ cải đường chuyển gen phát mẫu đất vị trí không sử dụng từ 6, 12 18 tháng sau củ cải đường bị cày lấp đất Paget cs (1993) nhận thấy DNA thuốc chuyển gen phát năm sau thu hoạch chuyển gen Becker cs (1994) thông báo DNA hoa dã yên chuyển gen phát mẫu đất vào thời điểm tháng sau cày lấp đất Mặc dù có vài khảo sát bền vững DNA chuyển gen đất, bền vững cấu trúc thời gian dài chứng minh rõ ràng Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy DNA hấp thụ vào bề mặt khoáng, phủ lên nguyên liệu thực vật bị thối rữa 4.2.3 Nghiên cứu chuyển gen từ thực vật vào vi sinh vật 4.2.3.1 Chuyển gen ngang từ thực vật vào vi sinh vật đất Chuyển gen ngang (horizontal gene transfer) tượng chuyển gen nguyên liệu di truyền trực tiếp từ cá thể riêng biệt vào cá thể khác trình tương tự gây nhiễm (infection) Phân biệt với trình bình thường chuyển gen dọc (vertical gene transfer)-từ bố mẹ vào cái-xuất trình sinh sản Công nghệ di truyền nói chung thường khai thác chuyển gen ngang, gen chuyển loài xa mà trước không giao phối tự nhiên Ví dụ, gen người chuyển vào lợn, cừu vi khuẩn Các gen cóc chuyển vào khoai tây Như vậy, gen ngoại lai (foreign gene) đưa vào lương thực 119 Chuyển gen ngang phần đề cập đến DNA ngoại lai chuyển gen diện đất, vi khuẩn phát triển khả để nhận gen cuối cùng, trình tự hợp genome vi khuẩn + Các nhân tố tồn tự nhiên (vector) chuyển gen ngang cá thể virus (thường virus gây bệnh), plasmid transposon, đa số chúng mang phát tán gen kháng thuốc kháng kháng sinh Các gen vào tế bào sau sử dụng nguyên liệu tế bào để nhân lên nhiều nhảy vào (cũng ngoài) khỏi genome tế bào Các nhân tố tự nhiên bị giới hạn rào cản loài, ví dụ virus lợn nhiễm vào lợn không nhiễm vào người được, virus súp-lơ công vào cà chua Tuy nhiên, công nghệ di truyền sản xuất vector nhân tạo (mang gen ngoại lai) cách tái tổ hợp phần hầu hết nhân tố gây nhiễm tự nhiên, chức gây bệnh chúng bị loại bỏ, thiết kế lại chúng để khắc phục rào cản, vector sau gắn gen người để chuyển vào tế bào tất động vật có vú khác, tế bào thực vật + Các gen ngoại lai đưa vào với tín hiệu di truyền mạnh-được gọi promoter (gen khởi động) enhancer (vùng tăng cường)-để tăng biểu gen cao mức bình thường mà chúng biểu tế bào Các promoter sử dụng phổ biến từ virus thực vật có họ hàng với virus động vật Các gen thị chọn lọc (selectable marker) đưa vào với gen quan tâm, cho tế bào hợp thành công gen ngoại lai vào genome chúng chọn lọc Các gen thị sử dụng phổ biến gen kháng kháng sinh có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn transposon, cho phép tế bào chọn lọc với kháng sinh Các gen thị thường trì sau thể biến đổi di truyền + Một promoter thường dùng cho chuyển gen từ virus khảm súp-lơ (cauliflower mosaic virus, CaMV), có quan hệ gần gũi với virus viêm gan B, với retrovirus AIDS virus CaMV promoter hoạt động hầu hết thực vật, nấm men, côn trùng E coli Đây promoter mạnh giúp cho gen ngoại lai biểu dư thừa (over-expression) ảnh hưởng đến gen vật chủ nằm xa vị trí gen ngoại lai chèn vào 120 + Sự chèn đoạn gen ngoại lai vào genome vật chủ không chịu kiểm soát công nghệ di truyền Nó hoàn toàn ngẫu nhiên cho hiệu không mong đợi, bao gồm độc tố chất gây dị ứng lương thực, ung thư tế bào động vật có vú + Nguy công nghệ di truyền làm tăng tiềm chuyển gen ngang qua loài không họ hàng Các chế tế bào cho phép gen ngoại lai chèn đoạn vào genome di chuyển chúng nhảy lần Ví dụ: enzyme integrase xúc tác cho hợp DNA virus genome vật chủ, mang chức disintegrase, xúc tác cho phản ứng ngược lại Các gen ngoại lai sau chèn đoạn trở lại vào vị trí khác genome, phát tán kiểm soát tới thể sống khác Các gen kháng thuốc diệt cỏ kháng kháng sinh vi khuẩn thường sử dụng thị chọn lọc chuyển gen Vì thế, chuyển ngang (horizontal transfer) gen kháng từ thực vật vào vi sinh vật thường thảo luận hiệu ứng tiềm tàng không mong muốn chuyển gen vào vi sinh vật đất Tuy nhiên, chưa có chứng rõ ràng việc chuyển gen từ thực vật vào vi sinh vật Nghiên cứu an toàn sinh học (biosafety) chuyển gen ngang từ chuyển gen vào vi sinh vật (vi khuẩn nấm) có hai hướng sau: - Tìm hiểu chế chuyển gen từ thực vật vào vi sinh vật - Đánh giá hậu sinh thái Bức tranh hoi việc chuyển gen ngang mong đợi từ thực vật vào vi sinh vật diện mẫu đất nhạy cảm cao phương pháp phát ứng dụng, đặc biệt quan trọng để làm giảm xác suất chuyển gen, chưa phát Để tránh dấu hiệu dương tính giả (false positive), phương pháp dùng phải có tính đặc hiệu cho phép phân biệt rõ ràng cấu trúc từ gen kháng xuất tự nhiên Hầu hết chế cho việc chuyển gen từ thực vật vào vi sinh vật biến nạp tự nhiên đòi hỏi hấp thụ DNA tự Vi khuẩn đất khả biến tự nhiên hợp DNA ngoại lai genome Để chuyển gen từ thực vật vào vi sinh vật điều kiện đồng ruộng, có chế cho phép hấp thụ chép vật chủ mà chọn lọc vật 121 chủ để biểu tính trạng quan trọng Sự phát chuyển gen ngang thực cách phân tích vi khuẩn sau giai đoạn nuôi cấy Để có thông tin diện cấu trúc loại vi khuẩn nuôi cấy phần vi khuẩn phủ trực tiếp đất phân tích để tìm DNA chuyển gen 4.2.3.2 Chuyển gen từ thực vật vào virus Kết chuyển gen biểu protein vỏ virus khảm thuốc (tobacco mosaic virus, TMV) làm chậm phát triển bệnh xuất năm 1986 Cùng phương thức sử dụng sau để tạo tính kháng cho loại virus khác nhau, nhà di truyền học đặt câu hỏi an toàn trồng chuyển gen từ ngày Nguy rõ rệt tiềm tạo virus gây nhiễm tái tổ hợp, ví dụ gen chuyển virus (viral transgene) liên kết trao đổi phần với nucleic acid virus khác Do vỏ protein không ngăn virus xâm nhập vào tế bào thực vật, gen chuyển (transgene) tiếp xúc với nucleic acid nhiều virus mang tới thực vật vector côn trùng (insect vector) Một số nghiên cứu chứng minh virus thực vật công loạt gen virus khác từ chuyển gen - Virus gây bệnh khảm hoại tử cỏ ba màu đỏ (red clover necrotic mosaic virus-RCNMV) dạng khiếm khuyết thiếu gen cho phép chuyển từ tế bào đến tế bào khác (vì không gây nhiễm được) tái tổ hợp với gen thuốc chuyển gen Nicotiana benthamiana, sinh sản virus gây nhiễm - Cây cải (Brassica napus) chuyển gen VI, nhân tố hoạt động dịch mã, virus khảm súp-lơ, tái tổ hợp với phần bổ sung virus thiếu gen đó, tạo virus gây nhiễm 100% chuyển gen - Thí nghiệm tương tự tiến hành N bigelovii tạo thể tái tổ hợp gây nhiễm mở rộng phạm vi vật chủ virus - Cây N benthamiana biểu đoạn gen protein vỏ virus CCMV (cowpea chlorotic mottle virus) tái tổ hợp với virus khiếm khuyết gen Một công trình nghiên cứu cho thấy có tái tổ hợp 122 gen chuyển virus gây nhiễm CCMV, nhiên với tần số cao tái tổ hợp virus gây nhiễm - N benthamiana biến nạp với cấu trúc khác chứa trình tự mã hóa protein vỏ ACMV (African cassava mosaic virus) Các chuyển gen gây nhiễm với đột biến khuyết đoạn protein vỏ ACMV tạo triệu chứng ngấm nhẹ (mild systemic) đối chứng Một số bị nhiễm dòng chuyển gen phát triển triệu chứng ngấm gay gắt đặc trưng ACMV Sự tái tổ hợp xuất DNA virus đột biến DNA cấu trúc hợp nhất, kết tạo hệ virus tái tổ hợp với đặc điểm dạng hoang dại Khi tất thí nghiệm đòi hỏi tái tổ hợp virus khiếm khuyết chuyển gen, nghĩ điều kiện tự nhiên virus không bị khiếm khuyết, virus tái tổ hợp sinh - Sự tái tổ hợp CaMV dạng hoang dại dạng chuyển gen VI chứng minh N bigelovii Ít số virus tái tổ hợp có độc tính dạng hoang dại Người ta nhận thấy thí nghiệm có CaMV, tần số tái tổ hợp cao nhiều so với virus khác Trong CCMV tái tổ hợp phục hồi từ 3% chuyển gen N benthamiana chứa trình tự CCMV, CaMV tái tổ hợp phục hồi từ 36% chuyển gen N bigelovii Người ta nghi ngờ đứt gãy DNA sợi đôi xảy trường hợp tái tổ hợp CaMV thực tế DNA chuyển gen bao gồm promoter CaMV 35S 4.2.4 Phân tích tiếp nhận gen chuyển thực phẩm Công nghệ sinh học có vai trò quan trọng phát triển tương lai giới thách thức đặt làm để có nhiều nước phát triển tiếp cận với công nghệ đại Năm 1994, thực phẩm chuyển gen đầu tiên, cà chua mang tính trạng chín chậm, trồng tiêu thụ số nước phát triển Từ đó, ngày nhiều loại thực phẩm có nguồn gốc từ trồng chuyển gen thương mại hóa sử dụng toàn giới Việc đưa thực phẩm vào bữa ăn hàng ngày làm tăng lên băn khoăn đáng độ an toàn chúng 123 Các giống trồng chuyển gen ngày phát triển nhờ vào công cụ công nghệ sinh học đại Cũng mà nhiều người thắc mắc liệu thực phẩm có an toàn loại thực phẩm có nhờ sử dụng biện pháp nông nghiệp truyền thống hay không Vậy khác biệt lai giống thông thường công nghệ sinh học thực vật Thực hai có một mục tiêu tạo giống trồng có chất lượng cao với đặc tính cải thiện giúp chúng phát triển tốt ngon Sự khác biệt chỗ mục đích đạt cách Lai giống truyền thống đòi hỏi trao đổi hàng ngàn gen hai để có tính trạng mong muốn Trong đó, nhờ công nghệ sinh học đại, lựa chọn đặc tính mong muốn chuyển riêng vào hạt giống Sự khác biệt hai kỹ thuật lớn Phương pháp công nghệ sinh học hợp lý hơn, có hiệu cao đem lại kết tốt Các kỹ thuật sử dụng công nghệ sinh học đại cung cấp cho nhà lai tạo giống công cụ xác cho phép họ chuyển đặc tính mong muốn vào trồng Hơn nữa, họ làm điều mà không bị chuyển thêm tính trạng không mong muốn vào thường xảy sử dụng lai giống truyền thống Công nghệ sinh học thực vật tạo điều kiện cho nhà khoa học kiểm soát gen chuyển, nhờ nghiên cứu chi tiết tính trạng đưa vào Thực phẩm có nguồn gốc từ trồng chuyển gen phải trải qua nhiều thử nghiệm loại thực phẩm lịch sử Trước đưa thị trường, chúng phải đánh giá cho phù hợp với quy định vài tổ chức khoa học quốc tế đưa Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Nông Lương (FAO), Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD)… Những quy định sau: - Các sản phẩm chuyển gen cần đánh giá giống loại thực phẩm khác Các nguy gây thực phẩm có nguồn gốc từ công nghệ sinh học có chất giống loại thực phẩm thông thường - Các sản phẩm xem xét dựa độ an toàn, khả gây dị ứng, độc tính dinh dưỡng chúng dựa vào phương pháp kỹ thuật sản xuất 124 - Bất kỳ chất đưa thêm vào thực phẩm thông qua công nghệ sinh học phải cho phép trước đưa thị trường việc loại chất phụ gia chất bảo quản hay màu thực phẩm cần phải cho phép trước thương mại hóa Một số nhận định vấn đề an toàn thực phẩm, sau: - Mức độ ăn toàn thực phẩm chuyển gen tương đương với thực phẩm khác trình đánh giá an toàn thực phẩm chuyển gen kỹ lưỡng nhiều so với việc đánh giá thực phẩm khác Quá trình đánh giá an toàn thực phẩm đảm bảo thực phẩm chuyển gen mang lại tất lợi ích thực phẩm thông thường thêm tác hại - Chưa có chứng cho thấy thực phẩm chuyển gen có thị trường gây lo ngại sức khoẻ người hay có khía cạnh an toàn so với trồng tạo nhờ lai giống truyền thống - Một điểm đặc trưng kỹ thuật chuyển gen đưa vào hay nhiều gen xác định rõ Điều giúp cho việc thử nghiệm độc tính trồng chuyển gen dễ thực so với trồng bình thường 4.2.4.1 Các chất gây dị ứng Một mối quan tâm lớn thực phẩm chuyển gen chất gây dị ứng (một protein gây phản ứng dị ứng) chuyển vào thực phẩm May mắn nhà khoa học biết nhiều thực phẩm gây dị ứng trẻ nhỏ người trưởng thành Khoảng 90% dị ứng thức ăn có liên quan tới tám thực phẩm nhóm thực phẩm-động vật có vỏ (tôm, cua, sò, hến), trứng, cá, sữa, lạc, đậu tương, hạch lúa mỳ Những loại thực phẩm nhiều chất gây dị ứng khác xác định rõ khó tin chúng đưa vào thực phẩm chuyển gen Tuy vậy, việc kiểm tra tính dị ứng khâu quan trọng việc kiểm tra an toàn trước giống trồng đưa làm thực phẩm Hàng loạt thử nghiệm câu hỏi phải xem xét kỹ để định liệu thực phẩm có làm tăng dị ứng hay không 125 Các chất gây dị ứng có đặc tính chung như: chúng không bị phân hủy trình tiêu hóa, chúng có xu hướng không bị phân hủy trình chế biến thực phẩm, chúng thường có nhiều thực phẩm Không có protein chuyển vào thực phẩm chuyển gen thương mại hóa lại mang đặc tính Chúng phải tiền sử khả gây dị ứng hay độc tính, chúng không giống với chất gây dị ứng hay độc tố biết chức chúng biết rõ Chúng có hàm lượng thấp thực phẩm chuyển gen, nhanh chóng bị phân hủy dày kiểm tra lại xem có an toàn không nghiên cứu thực phẩm cho động vật Các gen mã hóa thông tin di truyền có mặt tất loại thực phẩm việc ăn chúng không gây ảnh hưởng xấu Không có tác hại di truyền xảy tiêu hóa DNA Trên thực tế, nhận DNA ăn có mặt tất thực vật động vật 4.2.4.2 Đánh giá độ an toàn thực phẩm Bất kỳ sản phẩm chuyển gen trước đưa thị trường phải thử nghiệm toàn diện, nhà khoa học giám định viên đánh giá độc lập xem có an toàn hay không dinh dưỡng, độc tính, khả gây dị ứng khía cạnh khoa học thực phẩm dựa quy định tổ chức có thẩm quyền nước Chúng bao gồm: hướng dẫn sản phẩm, thông tin chi tiết mục đích sử dụng sản phẩm, thông tin phân tử, hóa sinh, độc tính, dinh dưỡng khả gây dị ứng Các câu hỏi điển hình đặt là: (1) Các thực phẩm chuyển gen có tạo từ thực phẩm truyền thống công nhận an toàn hay không (2) Nồng độ độc tố hay chất gây dị ứng thực phẩm có thay đổi hay không (3) Hàm lượng chất dinh dưỡng có thay đổi hay không (4) Các chất thực phẩm chuyển gen có đảm bảo tính an toàn hay không (5) Khả tiêu hóa thức ăn có bị thay đổi hay không (6) Các thực phẩm có tạo nhờ quy trình chấp nhận hay không Ngay câu hỏi câu hỏi khác thực phẩm chuyển gen trả lời, nhiều việc phải làm trình phê chuẩn trước thực phẩm chuyển gen thương mại hóa Thực tế, thực phẩm 126 chuyển gen loại sản phẩm nghiên cứu nhiều loại sản xuất 4.2.4.3 Gen kháng kháng sinh Một vài giống trồng chuyển gen có chứa gen quy định tính trạng kháng kháng sinh Các nhà khoa học sử dụng tính trạng thị (marker) để nhận biết tế bào chuyển gen vào Ngày có nhiều lo lắng gen thị phát tán từ trồng chuyển gen sang vi sinh vật cư trú ruột người chúng làm tăng khả đề kháng kháng sinh Đã có nhiều nghiên cứu thử nghiệm khoa học vấn đề để tới kết luận sau: Khả gen kháng kháng sinh phát tán từ vây trồng chuyển gen sang sinh vật khác vô thấp; chí kiện xảy gen kháng sinh phát tán sang sinh vật khác tác động việc không đáng kể thị sử dụng trồng chuyển gen có ứng dụng thú y y học hạn chế Tuy nhiên, để làm dịu lo lắng xã hội, nhà nghiên cứu yêu cầu tránh sử dụng gen kháng kháng sinh trồng chuyển gen Việc sử dụng thị thay khác đánh giá phát triển 4.3 Nguy môi trường hệ sinh thái Mặc dù “thế hệ thứ nhất” giống trồng công nghệ sinh học tập trung vào việc đem lại lợi ích kinh tế đáng kể cho người nông dân, song ngày có nhiều chứng cho thấy công nghệ sinh học mang lại lợi ích lớn an toàn lương thực môi trường Những kết sử dụng công nghệ sinh học Mỹ cho thấy, việc sử dụng thuốc trừ sâu giảm đáng kể, môi trường bảo đảm sản lượng tăng tiết kiệm chi phí sản xuất Mặc dù kết sử dụng công nghệ sinh học vùng có khác lợi ích kinh tế mang lại rõ ràng, không người sử dụng mà môi trường người tiêu dùng Các lợi ích giống lai công nghệ sinh học phụ thuộc hóa chất đầu vào, nguy gây ô nhiễm nguồn nước thấp hơn; việc hạn chế sử dụng hóa chất tăng độ an 127 toàn nước, đảm bảo môi trường tốt cho sinh vật tự nhiên; vụ mùa ứng dụng công nghệ sinh học cho suất cao Tuy nhiên, tranh luận xung quanh ảnh hưởng chuyển gen môi trường ngày phức tạp Vấn đề phức tạp có nghiên cứu công bố Như chuyển gen có an toàn với môi trường hay không Việc đánh giá ảnh hưởng chuyển gen tới môi trường thường khó khăn phải xem xét nhiều yếu tố Một số nhà khoa học tập trung vào nguy tiềm tàng chuyển gen số khác lại nhấn mạnh triển vọng lợi nhuận 4.3.1.Thực trạng môi trường Dân số gia tăng, trái đất ngày nóng lên đa dạng sinh học (biodiversity) dần ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Sự phá hủy rừng môi trường tự nhiên, sử dụng ngày nhiều than đá dẫn tới gia tăng không ngừng lượng khí CO làm trái đất nóng lên Người ta dự đoán nhiệt độ trung bình trái đất tăng từ 2-3oC tính đến năm 2100, đồng thời với biến động thời tiết Sự thay đổi khí hậu làm thay đổi chế độ mưa, gây nên di cư người biến đổi hoạt động nông nghiệp Thêm vào dân số gia tăng (theo dự đoán đến năm 2020, dân số giới lên tới tỷ người) dẫn đến phá hủy tự nhiên, giảm chất lượng nước thay đổi dòng chảy Sinh cảnh (biotope) bị làm cho nhiều loài đứng trước nguy tuyệt chủng Bởi vậy, để bảo tồn rừng, sinh cảnh đa dạng sinh học, cần phải đảm bảo nhu cầu lương thực tương lai dựa quỹ đất có 4.3.2 Những lợi ích chuyển gen Cây chuyển gen có lợi ích tiềm tàng môi trường Chúng giúp bảo tồn nguồn lợi tự nhiên, sinh cảnh động-thực vật địa Thêm vào đó, chúng góp phần giảm xói mòn đất, cải thiện chất lượng nước, cải thiện rừng nơi cư ngụ động vật hoang dại 128 Thực vật với khả tự bảo vệ chống lại côn trùng cỏ dại giúp giảm liều lượng nồng độ thuốc trừ sâu sử dụng Ví dụ: Trung Quốc, Bt giúp giảm lượng thuốc diệt côn trùng xuống 40 kg/ha Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước vùng sử dụng thuốc Ví dụ: nước chảy qua cánh đồng Bt Mỹ hoàn toàn không nhiễm thuốc trừ sâu suốt năm nghiên cứu Bộ Nông nghiệp Mỹ Thực vật kháng thuốc diệt cỏ giúp cho việc sử dụng biện pháp không cày đất (yếu tố quan trọng việc bảo tồn đất đai) trở nên phổ biến Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen Canada phải cày cấy so với trồng cải dầu truyền thống Cây chuyển gen tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, với diện tích đất canh tác thu nhiều lương thực Ví dụ: Ở Mỹ, vào năm 1999 có 66 triệu ruộng ngô tránh sâu đục thân 4.3.3 Đánh giá chuyển gen an toàn môi trường Các chuyển gen đánh giá cẩn thận ảnh hưởng tới môi trường trước đưa thị trường tuân theo quy tắc tổ chức chuyên gia môi trường khắp giới xây dựng Chẳng hạn, Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm (1989), Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm (1992), phủ Canada năm (1994) Những người đánh giá ảnh hưởng chuyển gen bao gồm người tạo chúng, quan kiểm soát nhà khoa học khác Hầu hết quốc gia sử dụng quy trình đánh giá tương tự để xem xét tương tác chuyển gen môi trường Bao gồm thông tin vai trò gen đưa vào, ảnh hưởng nhận gen, đồng thời câu hỏi cụ thể ảnh hưởng không mong muốn như: - Ảnh hưởng lên sinh vật sinh vật cần diệt môi trường - Cây chuyển gen có tồn môi trường lâu bình thường xâm chiếm nơi cư ngụ không 129 - Khả gen phát tán ý muốn từ chuyển gen sang loài khác hậu xảy 4.3.4 Những rủi ro chuyển gen Khả xảy lai chéo xa gen chuyển vào trồng với cỏ họ hàng, khả tạo loại cỏ Lai chéo xa lai không mong muốn trồng với có quan hệ họ hàng Lo ngại ảnh hưởng chuyển gen môi trường khả tạo loài cỏ thông qua lai chéo xa với họ hàng hoang dại đơn giản tồn lâu tự nhiên Khả xảy ra, đánh giá trước trình chuyển gen kiểm soát sau đưa trồng Một nghiên cứu năm 1990 kéo dài 10 năm chứng minh thực vật chuyển gen (như cải dầu, khoai tây, ngô, củ cải đường ) không làm tăng nguy xâm chiếm hay tồn lâu dài môi trường tự nhiên so với không chuyển gen tương ứng Các tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng điều tra đồng thời với không chuyển gen tương ứng (Crawley cs 2001) Tuy nhiên, nhà nghiên cứu cho kết nghĩa thay đổi di truyền làm gia tăng tính hoang dại hay khả phát tán trồng mà chúng trồng suất cao khó tồn lâu dài không canh tác Do đó, việc đánh giá chuyển gen theo trường hợp quy định quan trọng 4.3.5 Ảnh hưởng chuyển gen trực tiếp lên sinh vật sinh vật cần diệt Tháng năm 1999, xuất báo cáo hạt phấn từ ngô Bt có ảnh hưởng bất lợi ấu trùng bướm Monarch Báo cáo gây lo lắng nguy tiềm tàng bướm Monarch sinh vật sinh vật cần diệt khác Một số nhà khoa học lại cho cần phải thận trọng việc giải thích kết nghiên cứu nghiên cứu phản ánh tình khác với thực trạng môi trường Báo cáo cho thấy nghiên cứu tiến hành phòng thí nghiệm khởi đầu vấn đề quan trọng, nhiên 130 dựa vào không đủ sở để rút kết luận nguy quần thể bướm Monarch cánh đồng Một báo cáo khác Ủy ban bảo vệ môi trường Mỹ số liệu nghiên cứu chứng minh protein trồng ảnh hưởng bất lợi sinh vật sinh vật cần diệt Thêm vào đó, nghiên cứu trường Đại học Illinois (Mỹ) cho thấy bướm Monarch không bị gây hại hạt phấn Bt điều kiện đồng ruộng thực Nhìn chung, mối quan tâm tới sinh thái môi trường xuất phát từ chuyển gen đánh giá trước thương mại hóa chúng Đồng thời cần có kiểm soát hệ thống nông nghiệp tốt để phát giảm thiểu mối nguy hại xảy Chúng ta cần so sánh phương pháp chuyển gen đại truyền thống để làm sáng tỏ mối rủi ro tương đối lợi ích việc áp dụng chuyển gen 4.4 Nguy có người 4.4.1 Quản lý chặt sản phẩm biến đổi gen Mọi hoạt động có liên quan đến loại sản phẩm xuất nhập khẩu, vận chuyển sử dụng, nghiên cứu khoa học, khảo nghiệm chuyển giao kết nghiên cứu phải nằm quản lý quyền để quản lý an toàn sinh vật biến đổi gen sản phẩm chúng, đảm bảo tuân thủ nghiêm ngặt biện pháp quản lý rủi ro Các tổ chức cá nhân thực hoạt động vi phạm quy chế, gây thiệt hại cho sản xuất, cho môi trường sức khỏe người phải bồi thường thiệt hại chi phí khắc phục hậu Trường hợp nghiêm trọng bị truy cứu trước pháp luật Các chuyên gia cho rằng, bên cạnh ưu điểm suất, chất lượng, khả chống chịu sâu bệnh thời tiết khắc nghiệt, sinh vật chuyển gen mối nguy gây an toàn sinh học Một số gen gen kháng thuốc hay gen mang chế "kết thúc" (terminator) nảy mầm khuếch tán vào môi trường dẫn tới tình trạng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh khả nảy mầm nhiều loại trồng Bên cạnh đó, sản phẩm biến đổi gen gây dị ứng cho người tiêu dùng 131 4.4.2 Nguy hiểm cho sức khoẻ người Không có vấn đề quan trọng bật sức khỏe người liên quan đến trồng thực phẩm biến đổi di truyền (được tiêu thụ nhiều Mỹ) Tuy nhiên, thực phẩm biến đổi gen không đánh dấu, người dân chịu hậu xấu liên quan đến việc họ tiêu dùng loại thực phẩm Điều quan trọng cần nhớ 3-4 năm vừa qua, đậu tương ngô kháng côn trùng thuốc diệt cỏ trồng hàng triệu acre Mỹ sử dụng tiếp chế biến thực phẩm Ngăn cấm ngăn cấm phần nhập sản phẩm CNSH canh tác thương mại Yêu cầu dán nhãn sản phẩm CNSH Các nước thành viên European Union (EU): Austria, Belgium, Cyprus, Czech Rep., Denmark, Estonia, Finland, France, Germany, Greece, Hungary, Ireland, Italy, Latvia, Lithuania, Luxemboug, Malta, Netherlands, Poland, Portugal, Slovakia, Slovenia, Spain, Sweden, UK Hình 4.6 Bản đồ nước ngăn cấm yêu cầu dán nhãn thực phẩm công nghệ sinh học (CNSH) Liên minh châu Âu (European Union, EU) cam kết theo tiêu chuẩn quy định cho dán nhãn thực phẩm công nghệ sinh học, gần số nước thành viên thực Hơn thập kỷ qua, chuyên gia an toàn thực phẩm xác nhận số vấn đề tiềm tàng tăng lên kết trồng thực phẩm chuyển gen, bao gồm khả đưa độc tố chất gây dị ứng vào thực phẩm an toàn trước đây, làm tăng độc tính với mức độ nguy hiểm thực phẩm, mà trước sản acre tương đương 0,4 hectare (ha) 132 xuất số chất không độc, làm giảm bớt giá trị dinh dưỡng thực phẩm Trong số tác động tiềm tàng này, nhà khoa học giám định viên lo lắng chất gây dị ứng mới, thực vậy, hai kiện thập kỷ vừa qua phù hợp với điều đó: - Đầu tiên, một báo công bố tờ New England Journal of Medicine (NEJM) vào năm 1996 xác nhận dự báo công nghệ di truyền chuyển chất gây dị ứng từ thực phẩm gây dị ứng biết vào thực phẩm khác (Nordlee cs 1996) Một vài năm trước đó, nhà khoa học Pioneer Hi-Bred Seed Company chuyển thành công gen từ dẻ Brazil (Brazil nut) vào đậu nành để cải thiện chất lượng dinh dưỡng trồng hạt Các thí nghiệm cho thấy người dị ứng với hạt dẻ Brazil dị ứng tương tự với đậu nành chuyển gen - Thứ hai, năm cuối thập niên 1990, người ta thông báo dạng biến dị ngô Βt (StarLink) chứa tác nhân gây dị ứng tiềm tàng đưa vào thực phẩm cách bất hợp pháp làm lên sóng tranh luận điều đó, cuối giảm xuất ngô, gây hoang mang cho ngành công nghiệp thực phẩm, tạo nghi ngờ rộng lớn cấu tổ chức giám định Mỹ Cục Bảo vệ Môi trường (EPA) không chấp thuận sử dụng ngô StarLink làm thực phẩm cho người lo ngại độc tố Βt gây phản ứng dị ứng người tiêu dùng Năm 1998, quan đồng ý cho phép sử dụng StarLink dùng làm thức ăn gia súc Hai năm sau, liên minh nhóm có chung lợi ích công cộng kiểm tra sản phẩm quầy thực phẩm bán lẻ tìm thấy ngô StarLink vỏ bánh thịt chiên dòn (taco shell) Sau đó, ngô chuyển gen không chấp thuận lại tìm thấy nhiều sản phẩm khác Người ta bắt buộc phải thu hồi lại đóng cửa nhà máy, ngừng xuất khẩu, mua lại ngô bị nhiễm bẩn Sự cố StarLink minh họa rõ ràng yếu hệ thống giám định Mỹ khu vực hậu thương mại hóa, tiếp tục ám ảnh nông dân Mỹ, nhà chế biến thực phẩm, công ty công nghệ sinh học 133 ... gây tồn nhiều copy gen allel Đặc biệt tồn nhiều copy gen lạ gần (sự xếp nhiều phân tử vector hệ gen biến nạp gen nhiều copy gen biến nạp) tạo nên trình Người ta cho bất hoạt gen biến nạp lặp lại... biểu gen biến nạp Trong năm qua nhiều promoter phát để tăng cường biểu gen Những gen biến nạp 24 biểu đặc hiệu củ khoai tây, chí tế bào riêng lẽ hạt phấn Hình 1.17 Xác định biểu gen nhờ gen thị... mong muốn Tiếp theo gen promoter xác định Tính đặc hiệu promoter kiểm tra gen thị Ở promoter tạo dòng trước gen thị biến nạp vào thực vật Ở thực vật biến đổi gen vị trí biểu gen chứng minh, ví