Chương IV CÔNG NGHỆ ANTISENSE

Chương IV CÔNG NGHỆ ANTISENSE MỞ ĐẦU Trị liệu antisense thiết kế để chuyển phân tử antisense tới TB đích, phân tử lai tạo ức chế cách đặc hiệu biểu gen gây bệnh (Hình 4.1) Trước kia, thuật ngữ antisense bao hàm vài nghĩa khác biệt lại có quan hệ gần gũi công nghệ antisense hay anticode, ribozym hay acid nucleic xúc tác (catalytic ribonucleic acid - RNA), triplex hay antigene aptamer (Bảng 1) Cho tới chưa có thuật ngữ chuyên môn để mô tả công nghệ lĩnh vực Mục đích sử dụng thuật ngữ trị liệu antisense chương cách tiếp cận antisense theo nghĩa kinh điển Chúng ta đề cập tới ribozym aptamer chương sau Acid nucleic antisense oligonucleotid chuỗi đơn bổ cứu cho trình tự RNA DNA đích Hơn 25 năm trước, Zamecnik Stephenson lần giới thiệu phương pháp trị liệu antisense Hơn nữa, RNA antisene tự nhiên phát với nghĩa điều hòa biểu gen tế bào sống Tuy nhiên, phát lý thú không làm hấp dẫn nhà nghiên cứu thực nghiệm trị liệu antisense thời kỳ 1970-1980 phát triển chậm Sau đột phá lớn tổng hợp tự động oligonucleotid người ta thu lượng đủ lớn oligonucleotid chất lượng cao cho nghiên cứu in vitro in vivo người, công nghệ antisense phát triển nhanh chóng áp dụng rộng rãi nghiên cứu chức điều hòa gen, hiệu chỉnh biểu gen phê chuẩn thuốc Hiện có nhiều công trình nghiên cứu công bố tiềm sử dụng oligonucleotid điều trị bệnh cho người bệnh cao huyết áp bệnh tim mạch khác, bệnh ung thư, rối loạn di truyền bệnh nhiễm trùng virus Thuốc antisense có tên Vitravene phê chuẩn để điều trị bệnh viêm võng mạc cảm ứng với cytomegalovirus Một số antisense oligonucleotid tham gia thử nghiệm lâm sàng pha I-II với tư cách tác nhân kháng ung thư (điều trị riêng rẽ hay kết hợp với hóa trị liệu thông thường) Một phạm vi có quan hệ gần gũi công nghệ RNA interference (RNAi) RNAi lần phát với tư cách chế bảo vệ tế bào chống lại xâm lấn gen ngoại lai Caenorhaditis elegans sau quan sát thấy nhiều loài nhân thực côn trùng, cỏ, nấm động vật có xương sống RNAi chế nội bào có ảnh hưởng lớn đặc hiệu trình tự, làm yên lặng gen hậu phiên mã để kiềm chế gen Các RNA sợi kép xử lý Dicer - enzym có tên ribonuclease III TB để tạo nên cặp đôi khoảng 21 nt với phần nhô gọi small interfering RNA (siRNA) gián tiếp phân hủy RNA thông tin đặc hiệu trình tự Các phân tử siRNA TB động vật có vú có khả làm yên lặng cách đặc hiệu biểu gen Vì vậy, công nghệ RNAi sử dụng thay hiệu lực so với công nghệ làm yên lặng gen khác antisense ribozym Hình 4.1 Mô hình đơn giản trình biểu gen chế tác động antisense oligonucleotid Antisense oligonucleotid bổ cứu với trình tự RNA đích Nó lai tạo đặc hiệu với RNA đích dẫn đến ngừng trình phiên dịch làm tăng phân giải RNA hoạt tính RNase H giảm đồng hóa RNA ức chế ghép đôi RNA (Theo Ruiwen Zhang Hui Wang (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) Bảng 4.1 Những đặc tính antisense công nghệ RNAi Phân tử Công nghệ Antisense Đích hoạt hóa DNA RNA phân tử b RNA Ribozym RNA Triplex- forming sàng -oligonucleotid Aptamer DNA DNA DNA RNA Protein RNAi RNA RNA RNA Vị trí tác động TB Bào tương Cơ chế tác động a Bào tương Nhân TB Nhân TB, bào tương, TB Bào tương Ngừng dịch mã, hoạt hóa RNase H, ức chế ghép đôi, phá vỡ cấu trúc RNA Ngừng dịch mã, Hủy cấu trúc RNA Khóa phiên mã Can thiệp chức protein Thúc đẩy phân giải RNA Tình trạng phát phát triển thuốc c Thử nghiệm lâm sàng Thử nghiệm lâm sàng Thử nghiệm lâm sàng Thử nghiệm tiền lâm Thử nghiệm lâm sàng pha I Nghiên cứu in vitro, giới hạn nghiên cứu in vivo a Ghi chú: Vị trí tác động vị trí khởi đầu tương tác phân tử hoạt hóa với phân tử đích b RNA RNA đích pre -RNA, mRNA RNA virus Antisense Vitravene phê chuẩn để điều trị bệnh viêm võng mạc cảm ứng cytomegalovirus Một vài antisense khác sử dụng thử nghiệm lâm sàng pha I-II Bảng 4.2 Những antisense oligonucleotid với tư cách tác nhân kháng ung thư thử nghiệm lâm sàng Gen đích bcl-2 Trình tự oligonucleotid Các bệnh nhắm vào Antisense oligonucleotid hệ thứ ( phosphorothioate) 5-TCTCCCAGCGTGCCCAT-3 U lympho, UT tuyến tiền liệt, U hắc tố bcr-abl bcr-abl 5- CGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATTGAT-3 5- CGCTGAAGGGCTTTTGAACTGTGCTT-3 Bệnh bạch cầu dạng tủy mạn tính Bệnh bạch cầu dạng tủy mạn tính c-myc c-raf-1 5-TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3 5- TCCCGCCTGTGACATGCATT-3 Bệnh bạch cầu dạng tủy mạn tính UT kết tràng, UT thận, UT buồng Ha-ras 5- GGGACTCCTCGCTACTGCCT-3 UT tụy Sarcoma, UT tụy, UT kết tràng, u hắc IGF-IR 5’- GGACCCTCCTCCGGAGCC-3 U tế bào hình ác tính, UT buồng 5- GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3 U lympho, UT phổi không TB nhỏ UT buồng trứng Bệnh bạch cầu dạng tủy cấp, hội trứng tố trứng PKCP53 5-CCCTGCTCCCCCCTGGCTCC-3 chứng PKA- RIa loạn sản tủy Antisense oligonucleotid hệ thứ (khung hỗn hợp) 5- GCGCGCCTCCTCACUGGC-3 Khối u đặc Ghi chú: PKC-protein kinase C; tiểu đơn vị điều hòa PKC-RIa I protein kinase A phụ thuộc AMP vòng (cAMP) Tuy nhiên, công nghệ nhiều giới hạn sử dụng phân tử siRNA để điều hòa biểu gen đặc hiệu lại phụ thuộc cận đích hiệu chuyển giao siRNA vào TB đích Phần lớn báo cáo công nghệ siRNA lấy từ kết in vtro, hiệu ứng việc sử dụng dài hạn in vivo chưa xác định Chúng ta đề cập tới RNAi hay siRNA mục khác CÔNG NGHỆ ANTISENSE Hóa học antisense Cả antisense RNA DNA sử dụng nghiên cứu chức gen cách làm yên lặng biểu gen đích Antisense RNA Antisense RNA tự nhiên chứng minh có liên quan tới việc điều hòa gen thể bình thường Các antisense RNA tổng hợp sử dụng cho nghiên cứu in vitro Vì RNA nhạy cảm với phân giải nuclease nên tiềm sử dụng mặt dược lý học antisense RNA bị hạn chế Trước có cách tiếp cận việc ứng dụng antisense TB sống Đó biểu nhân (nuclear expression) antisense gen antisense công nghệ hóa vi tiêm RNA antisense tổng hợp vào TB Các antisense RNA cải biến hóa học nghiên cứu với tư cách phân tử antisense RNA ổn định điều hòa xuống gen liên quan tới ung thư Chẳng hạn antisense 2-O-methyl RNA 30- mer nhắm vào thymidylat synthase (TS) mRNA thể rõ tác nhân antisense có hiệu ứng in vitro TS enzym chủ chốt chuyển hóa nucleotid biểu kiểm soát protein sản phẩm TS chất điều hòa âm tự động Khi rối loạn điều hòa làm tăng tổng hợp TS dẫn tới kháng thuốc TB tác nhân kháng ung thư 5-fluorouracil Antisense 2-O-methyl RNA thiết kế nhắm trực tiếp vào yếu tố điều hòa hoạt tính ngược cis (nucleotid 80-109) TS mRNA, ức chế biểu TS tế bào RKO ung thư kết tràng người, tùy thuộc vào liều lượng sử dụng Biểu TS không bị tác động việc xử lý với sense kiểm soát không thích ứng Các nhà nghiên cứu chứng minh antisense 2-O-methyl RNA 18-mer nhắm vào trình tự lõi (same core) ức chế biểu TS Tuy nhiên, giảm kích cỡ oligonucleotid làm hoạt tính antisense Sau điều trị với antisense RNA mức protein TS giảm thùy thuộc vào thời điểm mức giảm cao sau 24 biểu oligonucleotid Tuy nhiên, phân tích Northern blot lại cho thấy TS mRNA không bị tác động việc xử lý với antisense RNA đời sống bán phần protein TS không thay đổi sau xử lý antisense Điều chứng minh chế tác động antisense RNA trung gian qua trình làm ngừng dịch mã, không liên quan tới tính ổn định mRNA Sự phát rõ antisense RNA cải biến hóa học với thời gian ngắn có tiềm làm yên lặng gen Tuy nhiên, việc ứng dụng in vivo antisense RNA nhiều điều cần làm rõ Antisense DNA Antisense oligodeoxynucleotide trình tự ngắn DNA chuỗi đơn sản xuất với số lượng lớn tổng hợp hữu tự động với nhiều phận gắn kết (linkage) hay nhóm tận (terminal) cải biến Vì antisense DNA sử dụng nhiều antisense RNA ribozym Các ví dụ antisense DNA thử nghiệm lâm sàng có ghi Bảng 4.2 Các phosphodiester oligonucleotid chưa cải biến Những phát sớm antisense bắt đầu với phosphodiester oligonucleotid (PO-oligos) Do lực cao với đích chúng nên PO-oligos gắn cách ổn định vào mRNA đích nhiệt độ chảy (melting temperature) Tm PO-oligos RNA duplex cao PO-oligos hoạt hóa RNase H, kết làm phân giải mRNA (Hình 4.1) Bất lợi PO-oligos nhạy cảm với nuclease việc ứng dụng PO-oligos hạn chế Các tương đồng oligonucleotid với khung cải biến Nhiều nghiên cứu chứng minh việc cải biến khung oligonucleotid làm cho TB dễ tiếp thu làm tăng đề kháng với nuclease antisene oligonucleotid Trong số phosphothiat oligonucleotid - (PS-oligos) methylphosphonat oligonucleotid (MP-oligos) nghiên cứu nhiều Đối với MP-oligos, năm 1970 lần Miller cộng tổng hợp hợp chất với việc thay -CH3 O khẳng định sức đề kháng hợp chất nuclease nội ngoại bào cao Điểm chảy MP-oligos sau: RNA duplex cao PO-oligos, oligonucleotid không tích điện MPoligos nên xuyên qua màng sinh chất dẽ so với PO-oligos Bất lợi MP-oligos hiệu ứng lai tạo tương đối thấp bất lực với việc hoạt hóa RNase H Khi thay isosteric oxy sulfur gốc phosphor DNA tạo PS-oligos Cũng oligonucleotid khác, PS-oligos trì trạng thái điện đích âm nên hòa tan nước nhiều MP-oligos Các PS-oligos kháng nuclease dễ dàng hoạt hóa RNase H Bất lợi PSoligos hấp thu TB có độc tính không đặc hiệu in vivo Do vậy, phần lớn antisense oligonucleotid test lâm sàng PS-oligos (Bảng 4.2) Các oligonucleotid có cải biến đầu tận Các nghiên cứu cho thấy antisense oligonucleotid bị phân giải đầu 3, đầu đầu Để nâng cao hấp thu TB sức đề kháng với nuclease oligonucleotid, nhiều cải biến đầu tận oligonucleotid thực Chẳng hạn chất polylysine, avidin (acridine) cholesterol sử dụng để nâng cao hấp thu TB hiệu ứng antisense oligonucleotid Tuy nhiên, giá trị cải biến chưa xác định, đặc biệt thí nghiệm in vivo Các oligonucleotid với khung hỗn hợp Để nâng cao đặc tinh cuả antisense nucleotid người ta thiết kế oligonucleotid khung hỗn hợp (mixed backbone oligonucleotid MBO) Một loại MBO có đoạn phosphorothiat đầu và có oligodeoxynucleotid cải biến đoạn oligoribonucleotid định vị phần trung tâm oligonucleotid Một số MBO thấy đặc tính nâng cao PS-oligos như: lực với RNA, hoạt hóa RNase H hoạt tính kháng khối u Thêm vào đó, nhiều dẫn liệu dược lý học chấp nhận phân giải in vivo khái luận dược động học thu lượm từ MBO Một số MBO đưa vào thử nghiệm lâm sàng (Bảng 4.2) Một ví dụ khác MBO có chứa đoạn 2-5 ribo 3-5 deoxyribonucleotid Các nghiên cứu nhiệt độ chảy phosphodiester MBO rõ hợp 2-5 ribonucleotide vào 3-5 oligodeoxyribonucleotid làm giảm liên kết với chuỗi đích so sánh với tất 3-5 oligodeoxyribonucleotid có chiều dài trình tự Khi tăng số liên kết 2-5 (từ đến 10) làm giảm liên kết với chuỗi DNA đích Các tương đồng MBO làm ổn định duplex với chuỗi DNA đích duplex với chuỗi RNA đích Những MBO thể rõ ổn định cao việc kháng lại nuclease Mặc dầu cải biến 2-5 không tạo hoạt tính cho RNase H không gây ảnh hưởng tới chất hoạt hóa RNase H đoạn 3-5 deoxyribonucleotid liền kề chỗ cải biến, lại tác động tới tăng sinh TB, kéo dài thời gian đông máu ly giải thành phần hồng cầu so với PS-oligos đối chứng Những kết chứng minh với số giới hạn liên kết 2-5 gắn kết với PS-oligos để nâng cao đặc tính antisense oligonucleotid với tư cách tác nhân trị liệu Các chế tác động antisense Cơ chế xác tác động antisense oligonucleotid chưa rõ hoàn toàn, có lẽ phức tạp Tuy nhiên có nhiều chứng ủng hộ cho ý kiến cho hoạt tính sinh học antisense nucleotid rõ ràng bị ảnh hưởng yếu tố khác mức phân tử, tế bào, tổ chức /mô toàn thể Các yếu tố nồng độ oligonucleotid vị trí đích (RNA), nồng độ RNA đích, chuyển hóa RNA chế tương tác oligonucleotid RNA đích Nhiều chế tác động antisense đưa ra, có chế chính, dừng trình lai tạo hoạt hóa RNase H (Hình 4.1) Các nghiên cứu trước chứng minh antisense nucleotid gắn tương tác với vùng mã hóa (code region) gây phong tỏa mRNA thông qua việc đọc ribosome dừng dịch mã (Hình 4.1) Sau người ta chứng minh antisense nucleotid đích tới vùng mã khởi đầu ức chế xuống biểu gen Hơn nữa, antisense oligonucleotid tạo hiệu ứng antisense thông qua việc gắn với vùng mũ 5, vùng poly A / vị trí ghép nối pre -RNA, sau can thiệp tới ghép nối RNA, đột biến vận chuyển Một chế chủ chốt khác tương tác hoạt hóa RNase H vài dạng antisense oligonucleotid PS-oligos, gắn với RNA đích chúng để hình thành RNA:DNA duplex, hoạt hóa enzym RNase H, kết phân giải RNA đích Tuy nhiên, dạng khác oligonucleotid MP-oligos lại đặc tính RNase H người tách dòng xác định đặc tính tạo thuận lợi cho việc nghiên cứu chế antisense RNase người có chung nhiều đặc tính enzym RNase H E.coli Enzym người tách riêng RNA khỏi phức DNA:RNA duplex sản phẩm với đầu tận 5’phosphate 3’-hydroxy nghĩa bóc tách phần RNA chuối đơn nhô nằm cạnh DNA:RNA duplex, nhiên khả phân giải chất chuỗi RNA DNA có cải biến vị trí phân cắt 2’ Enzym người có vận tốc phân cắt khởi đầu heteroduplex có chứa RNA-phosphorothiat DNA lớn so với RNA:DNA duplex Một RNA:DNA duplex ngắn giúp cho việc cắt ngắn thành mảnh bp DNA:RNA với khe (gapsize) nhỏ để cắt ngắn thành mảnh 5bp Những phát tạo thuận lợi cho việc thiết kế antisense nucleotide phụ thuộc RNase H Nhìn chung, coi tác động RNAi kiểu chế tác động antisense, sử dụng RNase chuỗi kép để thúc đẩy thủy phân RNA đích Veckers cộng so sánh hiệu antisense nucleotid thiết kế tối ưu với cách hoạt động theo chế RNAi oligonucleotid để thiết lập phương thức tác động theo chế phụ thuộc RNase H tế bào người Các nhà nghiên cứu thấy oligonucleotid xứng đáng với thuật ngữ: tiềm năng, hiệu tối đa, kéo dài tác động đặc hiệu trình tự Hơn nữa, hoạt tính siRNA oligonucleotid oligonucleotid phụ thuộc RNase H bị tác động cấu trúc bậc hai mRNA đích Khi kiểm tra 80 siRNA oligonucleotid duplex thiết kế để gắn vào RNA từ gen người khác loại cho thấy: nhìn chung có tương hỗ hoạt tính oligonucleotid phụ thuộc RNase H nhắm vào vị trí Một khác biệt lớn cách tiếp cận oligonucleotid phụ thuộc RNase H có hoạt tính kháng lại đích pre -mRNA, siRNA lại hoạt tính Phát chứng minh công nghệ dựa tảng siRNA công nghệ anisense phụ thuộc RNase H cách tiếp cận hiệu để đánh giá chức gen, thí nghiệm với tảng tế bào Tuy nhiên, phát liệu có hiệu lực in vivo hay không cần xác định Nguyên lý thiết kế antisense Mặc dầu mẫu thiết kế antisense oligonucleotid lý thuyết đơn giản (chỉ để nhận dạng oligonucleotid bổ cứu sở trình tự mRNA) Nhưng việc lựa chọn antisense oligonucleotid đặc hiệu hiệu lại vấn đề lớn thuộc kinh nghiệm nghiên cứu kết thực nghiệm Hơn nữa, trình tự oligonucletid xác định CpG GGGG để phụ thuộc trình tư (sequence - dependent) hiệu ứng không antisense (non-antisense effect) Những trình tự cần phải tránh nhận dạng thuốc antisense đặc hiệu trình tự (sequence-specific antisense drugs) Một số cách tiếp cận phổ thông lựa chọn trình tự antisense tối ưu bàn luận Cách tiếp cận bách - trình tự ngẫu nhiên (random sequence walkingr) Phương pháp bách - trình tự dựa sở quy luật cặp đôi base Watson -Crick trình tự biết gen đích theo đường thẳng để thiết kế lựa chọn antisense oligonucleotid Thông thường nhiều oligonucletid ngẫu nhiên (10-100 phụ thuộc vào chiều dài gen khảo sát) có chiều dài xác định (15-25 mer) nhắm vào vùng khác mRNA đích tổng hợp cách tách biệt hoạt tính antisense chúng xác định cách sử dụng chắn với sở tế bào phi tế bào in vitro Đây phương pháp thông dụng sử dụng nhiều thí nghiệm antisense thu kết tốt tốn nhiều thời gian, công sức (chỉ 5% oligonucleotid phát có hiệu ứng) Chọn lọc đích với trợ giúp máy tính Khi áp dụng phương pháp người ta thường thấy có thay đổi một vài base, thay đổi ý nghĩa mặt cấu trúc oligonucleotid lại tạo nên khác biệt hoạt tính antisense Hiệu lực oligonucleotid bổ cứu cho RNA đích xác định chủ yếu cấu trúc bậc RNA đích Vì hiệu antisense oligonucleotid liên quan nhiều tới khả vị trí sử dụng làm đích cho RNA đích Những vị trí sử dụng mRNA lại đoán trước sử dụng chương trình máy tính thông qua cách tiếp cận khác để tiên đoán cấu trúc bậc RNA Chẳng hạn sử dụng chương trình gấp nếp RNA (RNAfolding program) MFOLD (genetics Computer Group, Madison, WI) antisense oligonucleotid thiết kế để kháng lại vùng đích mRNA (đã dự đoán trước) dựa cặp đôi phân tử base, mà sử dụng thiết kế oligonucleotid Các dãy oligonucleotid Những ích lợi công nghệ dãy DNA (DNA array technology) dẫn đến việc phát triển dãy quét oligonucleotid phương pháp để xác định antisense oligonucleotid hoạt tính Phương pháp cho phép tổng hợp tổ hợp lượng lớn oligonucleotid song song với việc đo lực liên kết tất oligonucleotid với mRNA đích Cũng mối tương quan lực liên kết hoạt tính antisense tạo sở cho tối ưu hóa antisense oligonucleotid Tuy nhiên, phương pháp chưa test rộng rãi nghiên cứu antisense Sàng lọc dựa sở phân giải RNase H Như đề cập trên, hoạt hóa RNase H chế antisense, đặc biệt PS-oligos Các thí nghiệm lâm sàng RNase H kết hợp sử dụng với thư viện oligonucleotid ngẫu nhiên bán ngẫu nhiên để tới tối ưu hóa oligonucleotid; mRNA đích phiên mã in vivo với đuôi đánh dấu trộn lẫn với thư viện oligonucleotid; vị trí phân cắt RNase H sau xác định điện di gel Tuy nhiên, phương pháp chưa xác định cách xác vị trí dùng mRNA đích phân giải RNase H xảy nhiều vị trí Vì khó mà đoán trước hoạt tính anisense đơn lẻ sở RNase mapping CÁC NGUYÊN LÝ ĐÁNH GIÁ ANTISENSE Cũng loại thuốc khác, việc trị liệu oligonucleotid cần phải trải qua trình đánh giá cách hệ thống lâu dài thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng (Hình 4.2 4.3) Hoạt tính sinh học thuốc antisense bao hàm hiệu ứng mong muốn không mong muốn bị ảnh hưởng nhiều yếu tố khác từ mức phân tử, tế bào, tổ chức /mô hay toàn thể (Bảng 4.3 4.4) Các antisense oligonucleotid gây hiệu ứng sinh học lên gen đích thông qua vài chế riêng biệt bao gồm chế antisense không antisense tế bào mô đích hay không đích Hơn nữa, việc chuyển giao thuốc antisense tới tế bào đích vấn đề then chốt đến thành công Trong nghiên cứu in vivo, lipid thường sử dụng để tạo thuận lợi cho hấp thu tế bào oligonucleotid Nhưng cần phải lưu ý rằng, tỷ lệ lipid đối oligonucleotid tác động tới kết hấp thu hoạt tính sinh học oligonucleotid Độc tính TB riêng lipid xác định cần phải lý giải kết in vivo Trái lại nghiên cứu in vivo việc hấp thu oligonucleotid dường tốt so với thí nghiệm in vitro Do có lẽ không cần phải sử dụng phương tiện vận chuyển đặc biệt cho oligonucleotid Đánh giá dược lý học Đã có số lượng lớn báo cáo mô tả tính chất dược động học nhiều loại antisense oligonucleotid Các antisense oligonucleotid với chiều dài thành phần base khác đánh giá mẫu khác chuột lớn, chuột nhắt, thỏ, khỉ người với phương thức đưa vào thể khác (qua tĩnh mạch, màng bụng, da, cơ, uống hít) Trong hầu hết cấc trường hợp, hàm lượng oligonucleotid gốc (parent) sản phẩm bị phân giải (trong số trường hợp) báo cáo mẫu huyết tương Trong số nghiên cứu khác người ta phân phối oligonucleotid tới nhiều mô khác Nhìn chung PS-oligos có đời sống phân phối bán phần huyết tương ngắn t1/2 đời sống loại thải bán phần lại dài t1/2 thang 40 -60 Dược động học huyết tương oligonucleotid không liên quan tới chiều dài hay trình tự bậc nhất, trừ trường hợp oligonucleotid cải biến khung có đoạn đặc hiệu đầu /hoặc đầu Các antisense oligonucleotid phân phối nhiều với nồng độ cao gan thận Bài tiết qua nước tiểu có lẽ đường loại thải Việc trì oligonucleotid mô đích mô bình thường liên quan trực tiếp tới tính ổn định in vivo Để tăng hiệu ứng trị liệu cần phải tăng thời gian trì oligonucleotid nguyên vẹn thể cách làm tăng tính ổn định in vivo giảm tiết Các nghiên cứu phòng thí nghiệm cho thấy MBO kéo dài trì mô PS-oligos Tuy nhiên, phân phối mô không đặc hiệu có tích lũy nên trì mức (nồng độ) cao kéo dài oligonucleotid mô vật chủ làm tăng rủi ro Hơn nữa, độc tính rủi ro tăng tùy thuộc trạng thái bệnh cá thể chức tổ chức gan thận Đánh giá hiệu lực antisense Có lẽ khía cạnh quan trọng antisense oligonucleotid hiệu ứng đích tính đặc hiệu tác nhân antisense (Hình 4.2, Bảng 4.3) Các oligonucleotid thiết kế thường test mức in vitro in vivo (Hình 4.2) In vitro thử nghiệm dựa sở TB hoăc phi TB sử dụng cách thường quy để xác lập tảng cho nghiên cứu xa Sự hấp thu TB oligonucleotid test có lẽ phụ thuộc vào dạng TB, nồng độ thuốc, điều kiện nuôi cấy TB hệ thống chuyển giao Nói chung, chấp nhận phần lớn oligonucleotid vượt qua màng TB vào tận tế bào chất với hàm lượng đủ để đạt tới hiệu ứng mong muốn Để tăng hấp thu TB in vitro, vài phương tiện chuyển giao liposome phospholipid sử dụng có tính chất thường quy để tránh việc phải sử dụng nồng độ antisense cao ngày đầu nghiên cứu Hình 4.2 Đánh giá tiền lâm sàng antisense oligonucleotid với tư cách thuốc kháng ung thư (Theo Ruiwen Zhang Hui Wang (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) Hình 4.3 Đánh giá lâm sàng antisense oligonucleotid sản xuất theo tiêu chuẩn GMP với tư cách thuốc chống ung thư (Theo Ruiwen Zhang Hui Wang (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) Để chứng minh tính đặc hiệu oligonucleotid test, mức độ biểu gen đích, người ta thường sử dụng phương pháp Western blot, phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược (reverse transcriptase polymerase chain reaction RTPCR) / phân tích Northern blot Nếu muốn khảo sát ức chế biểu protein tác động lên chuyển hóa mRNA gen đích theo thời gian, liều lượng, cách thức phụ thuộc trình tự phải xác định hiệu ứng đặc hiệu antisense Cũng phải thực kiểm chứng đặc biệt (chưa xử lý, oligo không thích hợp, lipid) Để chứng minh xa tính đặc hiệu antisense oligonucleotid test việc kiểm soát protein hay gen quản gia chẳng hạn actin phải phân tích đồng thời Các thử nghiệm nhằm xác định biến đổi, tăng sinh apoptosis TB sử dụng để vẽ tranh tổng thể hoạt tính kháng u oligonucleotid test so sánh với đối chứng Tuy nhiên, thử nghiệm tạo kết dương tính giả hay âm tính giả Chẳng hạn như, số lipid dùng để nâng cao hấp thu oligonucleotid lại có độc tính TB Vì thế, kiểm chứng đặc biệt (âm tính, dương tính, không xứng đôi) cần thiết Các đáp ứng liều lượng, thời gian phụ thuộc trình tự chứng tốt hiệu ứng antisense việc thiết lập tảng cho đánh giá in vivio xa cho oligonucleotid test Bảng 4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết lý giải thí nghiệm tiền lâm sàng Thể loại Các đích phân tử OLIGONUCLEOTID Nghiên cứu in vitro Nghiên cứu in vivo Cơ chế tác động Các yếu tố điều kiện T Tính đặc hiệu trình tự mRNA chọn Nồng độ mRNA Tỷ lệ tổng hợp mRNA Sự thoái hóa mRNA Các gen có liên quan /không liên quan khác Tinh khiết không tinh khiết Trình tự cấu trúc Hóa học cải biến Test vi sinh vật Chất gắn /mang đặc biệt Tính ổn định oligonucleotid Hệ thống test Hấp thu phân phối TB Dạng TB điều kiện nuôi cấy Nồng độ oligonucleotid Các oligonucleotid đối chứng Phương thức chuyển giao (vi tiêm, lipid) Thực nghiệm xác định mRNA mức protein đích Tính ổn định invivo oligonucleotid Gắn vào protein /hoặc đại phân tử khác Động dược học: hấp phụ, phân phối, chuyển hóa tiết Động học độc chất học Dược động lực: tương tác oligonucleotid đích mRNA Hiệu ứng phụ thuộc liều Hiệu ứng không phụ thuộc liều Các vấn đề dược khoa: công thức việc chuyển giao Hệ thống test mô hình bệnh Sử dụng động vật chăm sóc Liều lượng, liệu trình thời gian điều trị Trị liệu kết hợp Thực nghiệm xác định mRNA mức protein đích Đích cuối hiệu ứng trị liệu (tăng trưởng khối u, độc chất học) Hiệu ứng đặc hiệu trình tự antisense Hiệu ứng không antisense, hiệu ứng phụ thuộc trình tự Hiệu ứng không đặc hiệu Hoạt tính RNase H Bằng chứng hoạt tính kháng u in vivo antisense oligonucleotid quan trọng việc phát triển đường dây thông tin Nhưng thật khó mà tạo kết làm cho người ta tin tưởng với test in vitro Các mô hình loại chuột mô hình ghép ngoại lai chuột nude SCID chuột nhắt mô hình chuột chuyển gen thường hay sử dụng trước tới thử nghiệm lâm sàng Đích cuối hiệu ứng số liệu khối lượng khối u, di căn, sống sót, marker phân tử đánh giá mô bệnh học Có mô hình test sử dụng - phụ thuộc vào lịch trình thời gian điều trị Thứ hiệu ứng khởi đầu ung thư việc tạo oligonucleotid Vấn đề xác định sử dụng protocol ex vivo TB xử lý với antisense oliogonucleotide trước ghép ngoại lai TB Tốc độ hình thành khối u ức chế tăng trưởng coi đích mô hình Thứ hai là, hiệu ứng ức chế tăng trưởng khối u oligonucleotid test thực nghiệm với việc sử dụng proptocol xử lý in vivo, việc xử lý oligonucleotid bắt đầu giai đoạn sớm tăng trưởng khối u, thường khối u đạt tới 50-100mg Trong mô hình này, ức chế tăng trưởng khối u marker phân tử / bệnh lý đích cuối Thứ ba là, hoạt tính kháng u oligonucleotid test khối u giai đoạn muộn, người ta sử dụng protocol mà việc xử lý oligonucleotid bắt đầu khối lượng khối u đạt tới 500-1000mg, tùy thuộc vào dạng khối u Trong mô hình này, ức chế tăng trưởng khối u sống sót đích cuối Bảng 4.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết lý giải thử nghiệm lâm sàng Thể loại Chủ đề / bệnh nhân OLIGONUCLEOTID Dược lý học Điều trị hiệu ứng Các yếu tố điều kiện Các mức biểu gen đích Bệnh giai đoạn Điều kiện / trạng thái vật chủ Dân số học Trước điều trị Tinh khiết Không tinh khiết Công thức Tính ổn định in vivo oligonucleotid Gắn với protein oligonucleotid khác Động dược học: hấp phụ, phân phối, chuyển hóa tiết Động học độc chất học Dược động lực: tương tác oligonucleotid với đích mRNA Hiệu ứng phụ thuộc liều Hiệu ứng không phụ thuộc liều Liều lượng, tiến trình thời gian điều trị Trị liệu kết hợp Thực nghiệm để xác định mRNA mức protein đích Đích chót hiệu ứng trị liệu (đáp ứng, sống sót) Các tác dụng phụ Việc thiết kế mối tương quan đáp ứng liều mô hình in vivo quan trọng Các kiểm chứng đặc biệt (không xử lý, chất dẫn thuốc, oligonucleotid) cần đề cập, Bằng chứng in vivo việc ngăn chặn biểu gen đặc hiệu điều mà người ta mong mỏi Cần phải rõ rằng, hoạt tính kháng u in vivo antisense oligonucleotid biết không thiết phải kết tất yếu chế antisense mà liên quan tới hoạt tính không đặc hiệu /hoặc hoạt tính kháng antisense đặc hiệu trình tự Trị liệu kết hợp Mặc dầu hầu hết antisense oligonucleotid test in vivo với tư cách trị liệu đơn, phương pháp điều trị kết hợp antisense oligonucleotid tác nhân hóa trị thông thường, kháng thể kháng ung thư xạ trị nghiên cứu với diện rộng Có nhiều nghiên cứu lâm sàng chứng minh điều hòa xuống sản phẩm gen đặc hiệu với antisense oligonucleotid làm TB ung thư nhạy cảm với tác nhân hóa trị, kết có hoạt tính cộng đồng thuận kháng ung thư Đích antisense receptor yếu tố tăng trưởng bì chuột double minutes (MDM2), protein kinase c-myc phụ thuộc AMP vòng (cAMP), protein kinase C Bcl-2 Những antisense oligonucleotid làm tăng hiệu ứng trị liệu tác nhân hóa trị paclitaxel, 5-fluorouracil, cisplatin, carboplatin, taxotere, camtothecin, irinotecan, leucovorin, gemcitabin, mefosfamid, doxorubicin, adramycin dacarbazin Tuy nhiên, chế đáp ứng cho hiệu ứng cộng hay đồng thuận antisense oligonucleotid tác nhân hóa trị chưa rõ hoàn toàn Có thể yếu tố động dược học dược động lực liên quan tới chế (Bảng 4.3) Sự đồng thuận lớp tác nhân dẫn đến từ tương tác số chế, chẳng hạn làm ngừng chu kỳ tế bào, cảm ứng apoptosis, cảm ứng đáp ứng miễn dịch sản xuất cytokin Mặc dầu hầu hết nghiên cứu hiệu ứng cộng hay đồng thuận đặc hiệu trình tự, nghiên cứu khác lại chứng minh antisense oligonucleotid làm cho irinotecan có tiềm lực kháng u phương thức độc lập trình tự - thông qua tương tác mức dược động học / chuyển hóa làm tăng chuyển đổi chất chuyển hóa hoạt tính Các thử nghiệm lâm sàng So với thử nghiệm tiền lâm sàng nghiên cứu lâm sàng oligonucleotid có số báo cáo (Bảng 4.2) Hầu hết antisense oligonucleotid test PS-oligos, sơ cho thấy độ nan toàn chấp nhận có hiệu lực kháng u giai đoạn khởi đầu người Các antisense oligonucleotid test với tư cách trị liệu đơn trị liệu kết hợp với tác nhân hóa trị khác Trong hầu hết kết thử nghiệm pha I báo cáo antisense oligonucleotid có độ an toàn tốt Các tác dụng phụ bao gồm: giảm tiểu cầu, kéo dài thời gian tạo cục đông hoạt hóa cục bộ, tăng nhẹ men gan Độc tính với thận gan không đánh kể Các nghiên cứu động dược học thực bệnh nhân rõ rằng: đời sống bán phần phân phối huyết tương ngắn lại kéo dài đời sống bán phần tiết Bài tiết qua nước tiểu đường với sản phẩm bị phân giải Ngày nay, antisense oligonucleotid thể ức chế biểu gen đích đáp ứng kháng u khởi đầu cách đặc hiệu Những hạn chế thử nghiệm pha II III báo cáo thấy cần phải có nghiên cứu xa Trên thực tế, tương lai trị liệu antisense phụ thuộc vào thành công thử nghiệm lâm sàng Đánh giá độ an toàn Các nghiên cứu kỹ lưỡng độc chất học chìa khóa cho phát triển thuốc antisense Cũng có vài giới hạn độc chất học báo cáo đánh giá antisense oligonucleotid, có nhiều phosphorothiat nghiên cứu mở rộng độ an toàn chúng vài mẫu chuột nhắt, chuột lớn, khỉ người Các hiệu ứng phụ lệ thuộc liều thí nghiệm chuột lớn chuột nhắt bao gồm: giảm tiểu cầu, phì đại lách tăng transaminase Những biến đổi mô bệnh học bao gồm: thâm nhiễm TB đơn nhân mô gan, thận lách tăng sản TB lưới nội mô TB lympho Sự khốc liệt hiệu ứng phụ phụ thuộc vào liều lượng, tần suất thời gian sử dụng oligonucleotid Nhìn chung khái lược độc chất học PS-oligos có thành phần base chiều dài khác tương tự nhau, trừ có diện motif trình tự xác định chẳng hạn CpG -dinucleotid motif poly -G Những motif góp phần làm nghiêm trọng thêm độc chất học Các nghiên cứu độc chất học tiền lâm sàng sử dụng để dẫn cho kế hoạch thử nghiệm lâm sàng về liều khởi đầu liều tăng dần Để củng cố cho thử nghiệm lâm sàng pha I, người ta nghiên cứu độc chất học động vật với việc sử dụng mẫu động vật, thường mẫu loài gặm nhấm mẫu gặm nhấm Đối với antisense oligonucleotid động vật cao cấp người thường sử dụng thử nghiệm Hơn nữa, nghiên cứu độc chất học đặc hiệu đề xướng để xác định độc chất học tim, độc chất học gan độc chất học miễn dịch KẾT LUẬN Mặc dầu có tiến đáng kể thập kỷ qua, antisense oligonucleotid chưa phát triển với tư cách phương pháp trị liệu hợp thức Một số khía cạnh quan trọng việc phát triển antisense oligonucleotid phê chuẩn các đích thuốc nâng cao hiệu lực tính đặc hiệu đích thuốc antisense Với việc ngày gia tăng antisense oligonucleotid kháng ung thư đánh giá lâm sàng hy vọng có tác nhân trị liệu cách đơn lẻ hay kết hợp với tác nhân trị liệu khác Các nghiên cứu tương lai cần thiết không cung cấp nguyên lý công nghệ antisense in vitro in vivo mà làm thỏa mãn đầy đủ nhu cầu trị liệu Các nghiên cứu cần thiết nhằm khám phá chế tác động tới hoạt tính sinh học oligonucleotid Với thuốc antisense hệ sáng chế kiểm định, hy vọng hiệu ứng trị liệu độ an toàn tác nhân nâng cao cách đáng kể