dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

Header Page of 258 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Trần Thị Sao Mai NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CÁC ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 (DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2014 Footer Page of 258 Header Page of 258 Cơng trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ KHÁNH TRÂM TS LÊ QUANG HÒA Phản biện : Phản biện : Phản biện : Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm Luận án Tiến sĩ họp vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội Footer Page of 258 Header Page of 258 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngộ độc thực phẩm có từ lâu xảy nhiều nơi giới nhƣ Việt Nam làm ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe ngƣời kinh tế xã hội Theo quan Quản lý thực phẩm dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA), năm giới có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (NĐTP) với 325 nghìn ngƣời phải nhập viện khoảng nghìn ngƣời chết NĐTP Nguyên nhân gây NĐTP từ hóa chất, vi sinh vật, độc tố tự nhiên không rõ nguyên nhân nhƣng ghi nhận từ thực tế vụ NĐTP xảy cho thấy nguyên nhân thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật Trong số tác nhân từ vi sinh vật gây NĐTP Staphylococcus aureus (S.areus) vi khuẩn gây ngộ độc phổ biến S aureus vi khuẩn hình cầu, Gram dƣơng, phân bố rải rác tự nhiên nhƣng chủ yếu đƣợc phân lập từ da, tóc, màng nhày, mũi ngƣời gia súc Ngộ độc thực phẩm tụ cầu đƣợc định nghĩa tiêu thụ độc tố đƣờng ruột, vốn tồn sẵn thực phẩm, chủng tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt S aureus tổng hợp nên Các phƣơng pháp phân tích độc tố ruột tụ cầu (Staphylococcus Enterotoxin – SE) thực phẩm nhiều bất cập tính phức tạp sử dụng, giá thành nhƣ yêu cầu trang thiết bị Phƣơng pháp tiêu chuẩn để phát SE thực phẩm phƣơng pháp ELISA Trên thị trƣờng giới có nhiều sinh phẩm để phát SE thực phẩm nhƣ TRANSIA, RIDASCREEN, TECRA VIDAS Nguyên tắc sinh phẩm dựa kỹ thuật ELISA kẹp đơi Tồn quy trình phân tích thƣờng kéo dài từ 90 phút đến Ngƣỡng phát sinh phẩm thƣờng dao động từ 0,1-5 ng/g ml mẫu tùy thuộc vào loại thực phẩm phân tích Tuy nhiên, nhƣợc điểm sinh phẩm cần máy đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết Yêu cầu hạn chế đáng kể khả phân tích trƣờng sinh phẩm Mặt khác, giá thành sinh phẩm nhập ngoại đắt, quy trình phân tích phức tạp Xu hƣớng giới phát triển phƣơng pháp phân tích Footer Page of 258 nhanh, dễ sử dụng để phân tích sàng lọc số lƣợng lớn mẫu trƣờng Gần đây, số nghiên cứu giới thành công việc phát triển que thử phát SE dựa kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm đơn giản hóa rút gọn thời gian phân tích xuống cịn 30 phút Hơn nữa, Việt Nam việc kiểm định an toàn thực phẩm phần lớn dừng lại việc phát vi khuẩn tụ cầu mà chƣa phân tích tới SE, nguyên nhân gây NĐTP tụ cầu Từ thực tế trên, thực đề tài luận án: “Nghiên cứu tạo que thử để phát nhanh độc tố ruột tụ cầu khuẩn thực phẩm” Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài luận án phát triển sinh phẩm dựa kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát nhanh SE từ SEA đến SEE thực phẩm Nội dung nghiên cứu đề tài - Sản xuất tinh SE tái tổ hợp SEA, SEC1 ứng dụng để phát triển que thử; - Sản xuất tinh kháng thể lòng đỏ trứng: IgY kháng BSA IgY kháng SE (SEA, SEB, SEC1, SED SEE), ứng dụng để tạo que thử ; - Nghiên cứu tối ƣu hóa q trình cố định kháng thể lên que thử; - Nghiên cứu xác định độ nhạy que thử Ý nghĩa khoa học, thực tiễn đề tài Đến nay, nƣớc ta việc đánh giá rủi ro vi sinh vật S aureus dựa vào việc xác định định lƣợng tụ cầu có phản ứng coagulase dƣơng tính đƣợc phân lập sản phẩm thực phẩm, phƣơng pháp cần nuôi cấy vi khuẩn phịng thí nghiệm thời gian để trả lời kết khoảng tuần Tuy vậy, kết phân tích cho thấy mẫu thực phẩm có vi khuẩn tụ cầu vàng hay khơng mà khơng tìm có độc tố vi khuẩn tiết ra, nguyên nhân thực gây NĐTP tụ cầu Kết nghiên cứu đề tài luận án giải hạn chế Việc tạo que thử phát đƣợc SE với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ sử dụng, thích hợp với phân tích trƣờng khơng cần thiết bị phức tạp, đắt tiền Các nguyên liệu để sản suất que thử (các kháng nguyên kháng thể) Header Page of 258 Footer Page of 258 đƣợc chủ động tạo Kết đề tài luận án góp phần vào việc kiểm soát tốt độc tố ruột tụ cầu, qua giảm thiểu vụ NĐTP số ngƣời bị NĐTP tụ cầu vàng gây ra, nâng cao sức khỏe cộng đồng Điểm luận án Kết nghiên cứu bật đề tài luận án tạo que thử phát đƣợc SE từ SEA đến SEE qua việc sản xuất đƣợc kháng nguyên tái tổ hợp SEA, SEC1 việc sản xuất, tinh đƣợc kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) kháng BSA, kháng thể IgY kháng đƣợc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) Cấu trúc luận án Ngoài phần mở đầu kết luận, kiến nghị, luận án gồm chƣơng: - Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu - Chƣơng 2: Đối tƣợng, vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu - Chƣơng 3: Kết nghiên cứu bàn luận - Phần phụ lục: Một số kết hình ảnh nghiên cứu Header Page of 258 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỤ CẦU KHUẨN 1.1.1 Đặc điểm sinh học tụ cầu khuẩn Tụ cầu khuẩn gọi tụ cầu vàng - Staphylococcus aureus cầu khuẩn có đƣờng kính từ 0,8-1,0 μm xếp lại với thành hình chùm nho, bắt màu Gram dƣơng, coagulase catalase dƣơng tính, khơng có lơng, khơng có vỏ, không sinh nha bào [1] 1.1.2 Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột tụ cầu vàng Ở điều kiện thông thƣờng, tụ cầu vàng phát triển đạt số lƣợng khoảng 10 cfu/g tạo độc tố Tụ cầu cần có axit amin khác cho q trình sinh trƣởng sản sinh độc tố [82] Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh độc tố ruột tụ cầu 100C nhiệt độ tối đa 480C, khoảng tối ƣu từ 40 đến 450C [97] Nồng độ muối tối đa cho sản xuất độc tố dƣới 12%, nhƣ nồng độ muối từ 12% trở lên sản xuất độc tố tụ cầu bị ức chế [82] Điều kiện thích hợp cho trình hình thành độc tố pH trung tính, q trình bị giảm hay bị ức chế pH axit Footer Page of 258 Header Page of 258 1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU VÀNG 1.2.1 Đặc điểm sinh hóa, lý hóa di truyền độc tố ruột tụ cầu Cho đến nay, ngƣời ta thống kê đƣợc có 21 loại SE, có chất chuỗi protein đơn có khối lƣợng phân tử thấp (khoảng từ 22 đến 29 kDa), chuỗi có vị trí kháng nguyên chuyên biệt Các độc tố dễ tan nƣớc dung dịch muối Đặc biệt, SE đƣợc mơ tả hầu hết có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt khơng bị protease thông thƣờng nhƣ pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain, … thủy phân chúng giữ nguyên đƣợc cấu trúc đƣờng tiêu hóa ngƣời [82] 1.2.2 Hoạt tính sinh học độc tố ruột tụ cầu Hoạt tính sinh học SE bao gồm hoạt tính siêu kháng ngun (superantigen) hoạt tính gây nơn Hoạt tính siêu kháng nguyên: gây sốt, kích hoạt hệ miễn dịch tăng nhanh số lƣợng tế bào T không chuyên biệt 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 1.3.1 Phép thử sinh học Nguyên tắc phép thử sinh học dựa việc phân tích khả gây triệu chứng điển hình nhƣ nơn, tiêu chảy động vật thí nghiệm hoạt động siêu kháng nguyên nuôi cấy tế bào Liều lƣợng SE tối thiểu cần sử dụng khoảng 200 ng [80] 1.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử Các phản ứng PCR thƣờng dùng uniplex multiplex PCR gần real-time PCR [24, 40, 85] 1.3.3 Phƣơng pháp miễn dịch Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để phát SE thực phẩm phƣơng pháp miễn dịch Những phƣơng pháp bao gồm: phƣơng pháp khuếch tán gel, phƣơng pháp ngƣng kết hạt latex – RPLA sử dụng kit RPLA phƣơng pháp ELISA [40] 1.4 KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG Footer Page of 258 1.4.1 Cấu trúc phân loại hệ thống sắc ký miễn dịch Header Page of 258 Cấu trúc hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thƣờng gồm hợp phần đƣợc biểu diễn Hình 1.1 dƣới [69]: Hình 1.1 Các hợp phần hệ thống sắc ký miễn dịch Kỹ thuật sắc ký miễn dịch thƣờng đƣợc chia làm hai loại sắc ký miễn dịch kẹp đôi sắc ký miễn dịch cạnh tranh - Sắc ký miễn dịch kẹp đơi: vị trí vạch thử nghiệm kháng thể thứ hai (khác với kháng thể cộng hợp có màu) có khả bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích đƣợc cố định Nếu độc tố có mặt mẫu phân tích, chúng tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp có màu Dƣới tác dụng lực mao quản, dung dịch chuyển động lên que thử phía vùng chứa kháng thể kháng nguyên cố định Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm bị giữ lại nhờ liên kết kháng thể vạch thử nghiệm với kháng nguyên Sự xuất vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố ruột tụ cầu Nhƣ vậy, trƣờng hợp dƣơng tính (có độc tố mẫu phân tích) xuất hai vạch màu Ngƣợc lại trƣờng hợp âm tính có vạch màu Ƣu điểm sắc ký miễn dịch kẹp đôi độ nhạy độ đặc hiệu cao sử dụng tới hai kháng thể có khả bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên vị trí khác mà khơng gây cản trở mặt khơng gian Nhƣợc điểm khó có khả phát đƣợc loại độc tố tụ cầu phổ biến nay: SEA, SEB, Footer Page of 258 SEC, SED, SEE thị trƣờng chƣa có cặp kháng thể bắt Header Page of 258 cặp với loại kháng nguyên - Sắc ký miễn dịch cạnh tranh: + Dạng 1: vị trí vạch thử nghiệm, kháng nguyên (hoặc biến thể kháng nguyên) đƣợc cố định Nếu độc tố có mặt mẫu phân tích, chúng tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp Dƣới tác dụng lực mao quản, dung dịch chuyển động lên que thử phía vùng chứa kháng nguyên cố định Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm khơng bị giữ lại vị trí liên kết đặc hiệu kháng thể bị bão hịa kháng ngun mẫu phân tích Do đó, không xuất vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố đƣờng ruột tụ cầu Nhƣ vậy, trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố mẫu phân tích, xuất vạch màu vị trí vạch kiểm chứng Ngƣợc lại, mẫu âm tính có hai vạch màu vị trí vạch thử nghiệm vạch kiểm chứng + Dạng 2: Tại vị trí vạch thử nghiệm kháng thể có khả bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích đƣợc cố định Trong trƣờng hợp này, cộng hợp kháng nguyên gắn với hạt nano vàng nano carbon Nếu độc tố khơng có mặt mẫu phân tích dung dịch chuyển động lên que thử phía vùng chứa kháng thể cố định, kháng nguyên cộng hợp tƣơng tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng ngun cộng hợp có màu vị trí vạch thử nghiệm Sự xuất vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố ruột tụ cầu Ngƣợc lại, mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu chúng cạnh tranh với kháng nguyên cộng hợp việc bị giữ lại vị trí vạch thử nghiệm Chính vậy, khơng xuất vạch màu đồng nghĩa với việc mẫu thử có chứa độc tố ruột tụ cầu Trong luận án này, sử dụng phƣơng pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh dạng để ứng dụng sản xuất que thử phát loại độc tố (SEA-SEE) thực phẩm Các ƣu điểm phƣơng pháp sắc ký miễn Footer Page of 258 dịch cạnh tranh để phát loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE bao Header Page of 258 gồm: đơn giản hóa quy trình phát triển que thử cần sử dụng kháng thể 1.4.2 Một số nghiên cứu chế tạo que thử để phát độc tố ruột tụ cầu thực phẩm Năm 2009, nghiên cứu Boyle cộng tạo que thử phát SEB sữa với ngƣỡng phát nằm khoảng từ 500 ng/ml đến µg/ml [19] Khi sử dụng máy đo từ để phát tín hiệu, que thử phát đƣợc nồng độ độc tố SEB sản phẩm sữa thấp từ đến 0,25 ng/ml Năm 2013, Keiko Yamada tạo que thử phát SEA với độ nhạy cao, phát đƣợc nồng độ thấp đến 0,2 ng/ml [83] 1.5 CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) VÀ ỨNG DỤNG CỦA IgY Kháng thể lòng đỏ trứng IgY đƣợc sản xuất phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà mái để thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà Hiện nay, số phƣơng pháp tách chiết tinh chế IgY gà đƣợc mơ tả đƣợc chia thành hai nhóm chính: Phƣơng pháp kết tủa: liên quan đến amoni, natri sulfat, natriclorua [65, 71], polyetylenglycol (PEG), axit caprylic caragenean [71]; Phƣơng pháp sắc ký: sắc ký lực, sắc ký trao đổi ion, sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc, sắc ký tƣơng tác thiophylic, sắc ký gel lọc [71] 1.6 SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 1.6.1 Sản xuất độc tố ruột tụ cầu từ S aureus từ phƣơng pháp tái tổ hợp Việc sản xuất độc tố tái tổ hợp biểu E Coli độc tố ruột tụ cầu dạng dung hợp với đuôi His GST nên giúp đơn giản hóa quy trình tinh Năm 2012, nhóm nghiên cứu sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp với đuôi GST Vector đƣợc sử dụng pGEX-6P-1 chủng E Coli BL21 để biểu protein Sau Footer Page of 258 tinh kit GST SpinTrap, protein tƣơng ứng có kích thƣớc 53 kDa dạng dung hợp với GST đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di SDS-PAGE [3] Header Page 10 of 258 1.6.2 Phƣơng pháp tinh độc tố ruột tụ cầu Đã có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng việc tinh SE nuôi trực tiếp từ tụ cầu vàng: tinh trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, điện phân, sắc ký Dye ligand, HPLC (sắc ký lỏng hiệu cao) FPLC (sắc ký lỏng nhanh protein) Phƣơng pháp sắc ký lực cho phép thu protein đích bƣớc nhất, với độ tinh lên tới 90% Đi His có lực cao với Ni2+ có vịng thơm imidazole, protein dung hợp với đuôi His đƣợc giữ lại cột sắc ký chứa hạt resin có gắn Ni2+, cịn protein không mong muốn khỏi cột CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - Các SE (SEA, SEB, SEC, SED SEE) Toxin Technology, Mỹ - Gà Leghorn trắng, ngày tuổi, cân nặng 35-40g, có nguồn gốc từ Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì - Kháng thể lịng đỏ trứng IgY thu đƣợc từ trứng gà Leghorn trắng tự nuôi đƣợc gây miễn dịch độc tố ruột tụ cầu BSA 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Vi sinh vật plasmid - Tế bào S.aureus mang gen sec1 đƣợc cung cấp phòng Vi sinh, Viện Dinh dƣỡng Quốc gia - Tế bào vi khuẩn E coli khả biến BL21 mua Biolab - Plasmid pGEX-6P-1-sea, mang gen mã hóa SEA dạng dung hợp với GST (glutathione-S-transferase) đƣợc cung cấp phịng cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội Footer Page 10 of 258 Nguyên tắc phƣơng pháp protein hấp thụ tia cực tím cực đại bƣớc sóng 280nm Header Page 13 of 258 2.3.12 Phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà Gây miễn dịch cho gà để sản xuất kháng thể IgY kháng BSA kháng thể IgY kháng độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) theo quy trình sản xuất kháng thể IgY đặc hiệu Agro-Bio 2011 2.3.13 Phƣơng pháp tinh kháng thể IgY gây kết tủa phân đoạn PEG Tinh kháng thể phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn PEG 6000 theo mô tả Polson 1980 2.3.14 Phƣơng pháp tinh IgY pha loãng nƣớc, chỉnh pH gây kết tủa Natri clorua Tinh theo phƣơng pháp pha loãng nƣớc chỉnh pH gây kết tủa Natri clorua đƣợc Petr Hokder tối ƣu hóa năm 2013 2.3.15 Phƣơng pháp tinh IgY cột “ Hi Trap IgY Purification HP” Tinh IgY theo hƣớng dẫn nhà sản xuất GE Healthcare BioSciences AB 2.3.16 Cố định IgY kháng BSA IgY kháng độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) lên màng nitrocelullose Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) đƣợc cố định lên vinyl Mylar AD back 79373 (Whatman) Kháng thể IgY kháng BSA kháng thể IgY kháng độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) đƣợc phun lên màng nitrocellulose lần lƣợt vạch kiểm chứng vạch thử nghiệm thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ) Sau gắn thêm giấy thấm, màng đƣợc cắt thành que thử có bề rộng mm máy cắt Cutter 4000 (Biodot, Anh) 2.3.17 Chuẩn bị phức hợp phát kháng nguyên - nanocarbon Kháng nguyên tinh SEC1 dạng dung hợp đƣợc gắn với hạt nanocarbon trạng thái huyền phù theo phƣơng pháp đƣợc mô tả nhà sản xuất Maiia Diagnostics Footer Page 13 of 258 11 2.3.18 Phân tích mẫu que thử Header Page 14 of 258 Mỗi mẫu phân tích có loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE với nồng độ khác đƣợc pha 100 µl dung dịch đệm chạy đƣợc đƣa vào giếng Tiếp đó, cắm que thử vào giếng ủ 15 phút Sau đó, bổ sung kháng nguyên cộng hợp Kết âm tính ứng với việc xuất vạch, kết dƣơng tính ứng với việc khơng xuất vạch vị trí vạch in kháng thể CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 3.1.1 Sản xuất tinh chế protein tái tổ hợp SEA 3.1.1.1 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEA vào tế bào E.Coli Plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA đƣợc biến nạp vào tế bào E coli khả biến phƣơng pháp sốc nhiệt môi trƣờng LB có bổ sung ampicillin 3.1.1.2.Chọn dịng chủng mang gen mã hóa SEA Sau tiến hành biến nạp thu nhận dòng tế bào E coli đƣợc chuyển gen, tiến hành sàng lọc dòng tế bào E coli để chọn dòng tạo độc tố ruột SEA nhiều việc sử dụng kỹ thuật ELISA kẹp đôi để đánh giá lƣợng SEA đƣợc tạo canh trƣờng nuôi cấy Sau chọn đƣợc dòng khuẩn lạc cho khả sinh SEA cao nhất, tiến hành lặp lại quy trình có tính đến nồng độ protein mẫu để tìm khuẩn lạc có khả sinh SEA cao dòng tế bào số 3.1.1.3 Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA Tiến hành khảo sát ba yếu tố nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng thời gian cảm ứng, lựa chọn nuôi hai nhiệt độ 300C 160C Quy trình ni đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ q trình sàng lọc, ni tế bào môi trƣờng LB lỏng tới đạt OD600 = 0.8 thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ tƣơng ứng 0,25mM, 0,5mM 1mM, sau tiến hành lấy mẫu mốc thời gian: với nhiệt độ 300C, thời gian lấy mẫu 2h, 5h, 7h; với nhiệt độ 160C, thời gian lấy mẫu 12h, 16h,19h Footer Page 14 of 258 12 Header Page 15 of 258 Hình 3.1 Đồ thị tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA Trong điều kiện nuôi cấy đƣợc thử nghiệm, điều kiện tốt cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp 300C, nồng độ chất cảm ứng 1mM thời gian cảm ứng 5h 3.1.1.4 Tinh SEA từ dịch chiết protein thô Tinh theo phƣơng pháp sắc ký lực để thu đƣợc SEA dạng tinh khiết Để kiểm tra kích thƣớc protein thu đƣợc dịch rửa giải, tiến hành điện di theo phƣơng pháp điện di biến tính protein SDS-PAGE Kết điện di thể rõ: dịch rửa giải có xuất vạch protein với khối lƣợng khoảng từ 50-60 kDa so sánh với thang protein chuẩn, kết phù hợp với protein mà mong đợi SEA trạng thái dung hợp với GST có khối lƣợng 53 kDa Hình 3.2 Điện di đồ protein SEA tái tổ hợp sau tinh Ghi chú: 1: Dịch chiết protein thô, tế bào E coli không qua biến nạp; 2: Dịch chiết protein thô, tế bào E coli qua biến nạp; 3: Dịch rửa giải thu từ trình tinh sạch; 4: Thang chuẩn protein Footer Page 15 of 258 13 Header Page 16 of 258 3.1.2 Sản xuất tinh chế protein tái tổ hợp SEC1 3.1.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ Staphylococcus aureus Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus cho thấy có băng sáng rõ có kích thƣớc lớn cao DNA tổng số S aureus Điều chứng tỏ DNA tổng số sau tách chiết khơng bị đứt gãy, cịn ngun vẹn nên đƣợc dùng làm khuôn phản ứng PCR khuếch đại gen sec1 Hình 3.3 Điện di đồ DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: DNA tổng số S.aureus 3.1.2.2 Kết khuếch đại gen sec1 kỹ thuật PCR Từ sở nguồn DNA tổng số tách từ chủng S.aureus, tiến hành thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SEC-F SEC-R để khuếch đại gen sec1 khoảng 801 bp Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1,2% Hình 3.4.Điện di đồ sản phẩm PCR gel agarose 1,2% Ghi chú: Kênh M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: Đoạn gen sec1 Kết điện di cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F SEC-R thu đƣợc đoạn DNA đặc hiệu, rõ nét khơng có vạch phụ k m theo, có kích thƣớc khoảng 801 bp, với kích thƣớc lý thuyết thiết kế mồi Do vậy, sản phẩm PCR đƣợc sử dụng cho nghiên cứu 3.1.2.3 Kết thiết kế vector biểu pGS-21amang gen sec1 14 Footer Page 16 of 258 Sản phẩm PCR sau đƣợc xử lý hai enzymegiới hạn BamHI HindIII đƣợc tinh theo quy trình kit GeneJET PCR Purification Kit (Fermentas) sản phẩm nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu Tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a hai enzym giới hạn BamHI HindIII 370C để tạo vết cắt giống với đoạn gen sec1 đƣợc cài vào Vector sau mở vòng hai enzyme băng có kích thƣớc khoảng 6169 bp tƣơng ứng với kích thƣớc vector pGS-21a nhƣ lý thuyết Hình 3.5 Điện di đồ plasmid pGS-21asau cắt enzym cắt giới hạn Header Page 17 of 258 Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: vector pGM-1 mở vòng Sau mở vịng tinh vector pGS-21a, chúng tơi ghép nối vector với gen sec1 nhờ xúc tác T4 DNA ligase Sản phẩm ghép nối Plasmid pGM-1-sec1 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli BL21 3.1.2.4 Kết biểu gen mã hóa cho protein tái tổ hợp SEC1 Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1 đƣợc biến nạp vào tế bào E coli khả biến phƣơng pháp sốc nhiệt, sau đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp mơi trƣờng có ampicillin Để nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau biến nạp thành công đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin, lắc với tốc độ 150 vịng/phút, 370C OD600 đạt 0,6-0,8 bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM nuôi tiếp 300C Protein tổng số dịch chiết tế bào đƣợc phân tích gel polacrylamide cho thấy xuất băng protein với cƣờng độ đậm, có trọng lƣợng phân tử khoảng từ 42,7– 66,2 kDa so sánh với thang protein chuẩn, kết phù hợp với protein SEC1 mà chúng tơi tính toán lý thuyết Footer Page 17 of 258 15 Header Page 18 of 258 Hình 3.6 Điện di đồ biểu gen SEC1 protein tổng số tế bào E.coli BL21 Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1: Đối chứng âm (protein tổng số dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli BL21); 2: Protein dịch chiết dòng E coli biến nạp cảm ứng IPTG 3.1.2.5 Tối ưu điều kiện biểu gen sec1 Để xác định đƣợc điều kiện tối ƣu, tiến hành thử biểu gen điều kiện nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ, thời gian cảm ứng khác Chúng tiến hành khảo sát khả tổng hợp protein SEC1 tái tổ hợp điều kiệnnồng độ chất cảm ứng IPTG (0,05 -1 mM), nhiệt độ (300C 370C) thời gian (2 giờ, giờ) Dịch chiết thu đƣợc sau phá tế bào đƣợc kiểm tra điện di gel acrylamide 12% Hình ảnh điện di gel polyacrylamide cho thấy điều kiện tốt cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp SEC1 300C, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,3mM thời gian cảm ứng 8h Hình 3.7 Điện di đồ protein SEC1 biểu điều kiện nhiệt độ thời gian với nồng độ IPTG 0,3mM Ghi chú: 1: Thang protein chuẩn, 2-8: điều kiện nhiệt độ thời gian là: 8h, 370C; 8h300C; 5h,370C; 5h,300C; 2h, 370C; 2h,300C, 0h 3.1.2.6 Tinh chế protein tái tổ hợp SEC1 Chúng tinh protein tái tổ hợp theo phƣơng pháp sắc ký lực sử dụng bi từ HisMag SepharoseTM Ni để thu đƣợc SEC1 dạng tinh khiết Footer Page 18 of 258 16 Kết phân tích SDS-PAGE cho thấy protein SEC1 thu nhận đƣợc có độ tinh cao, khơng tạp nhiễm protein vi khuẩn Header Page 19 of 258 Hình 3.8 Điện di đồ protein SEC1 tái tổ hợp sau tinh Ghi chú: Kênh 1,4 : Protein trước tinh sạch; Kênh 2,3: Protein sau tinh sạch; M: Marker 3.2 CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IGY 3.2.1 Kết tinh kháng thể IgY Chúng lựa chọn tách chiết IgY hai phƣơng pháp sau: phƣơng pháp tách phân đoạn nƣớc muối natri clorua đƣợc tối ƣu hóa năm 2013 [ ] phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn PEG [27] Đây phƣơng pháp có quy trình đơn giản, hiệu quả, dễ thực hiện, xử lý mẫu đơn giản, sản lƣợng tách chiết độ tinh IgY c a o , đƣợc áp dụng phổ biến nhiều nghiên cứu [77] Chúng so sánh hai phƣơng pháp tinh IgY từ lòng đỏ trứng để lựa chọn phƣơng pháp phù hợp cho tinh IgY từ lòng đỏ trứng gà Kết điện di hai phƣơng pháp cho thấy hình ảnh IgY gồm hai băng đậm, rõ nét có khối lƣợng phân tử tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử chuỗi nặng (khoảng 67kDa) chuỗi nhẹ (khoảng 25 kDa), đƣờng điện di cịn vạch khác mờ Do vậy, kết luận tách chiết thành công kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà với độ tinh cao Tuy nhiên, so sánh hình ảnh điện di IgY đƣờng số đƣờng số cho thấy vạch protein tạp kháng thể đƣờng số so với đƣờng số 2, điều chứng tỏ phƣơng pháp tinh IgY tách phân đoạn nƣớc NaCl có độ tinh cao so với phƣơng pháp pháp kết tủa phân đoạn PEG Footer Page 19 of 258 17 Header Page 20 of 258 Hình 3.9 Điện di đồ kháng thể IgY sau tinh Ghi chú: 1: IgY tinh theo phương pháp tách phân đoạn nước muối natri clorua; 2: IgY tinh theo phương pháp kết tủa phân đoạn PEG Để tạo kháng thể IgY có độ tinh cao, hoạt tính kháng thể mạnh làm nguyên liệu cho que thử phát độc tố ruột tụ cầu, kháng thể IgY đƣợc tạo từ phƣơng pháp tinh tách phân đoạn nƣớc NaCl đƣợc tinh cột sắc ký tƣơng tác thiophylic (Hi Trap IgY Purification HP) Hình 3.10 Điện di đồ giai đoạn tinh kháng thể IgY qua cột sắc ký Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1: IgY sau tinh tối ưu hóa kết tủa NaCl; 2, 3: Dịch rửa cột sau cho mẫu vào; 4: IgY thu sau tinh sạch; 5:Dịch rửa cột đệm làm 3.3 ỨNG DỤNG SEC1 TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IGY ĐỂ TẠO QUE THỬ 3.3.1 Xác định lƣợng kháng thể lên vạch kiểm chứng Footer Page 20 of 258 18 Kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng kháng thể đa dòng kháng BSA đƣợc tách chiết tinh từ lòng đỏ trứng gà Tiến hành pha loãng IgY tới nồng độ 0,1; 0,3; µg/µl in lên màng nitrocellulose với liều lƣợng 1µl/cm Chúng tơi sử dụng nồng độ kháng thể đơn dòng 0,3 μg/μl để in màng với liều lƣợng μl/cm Header Page 21 of 258 Hình 3.11 Lựa chọn lượng kháng thể đa dòng kháng BSA để cố định lên vạch kiểm chứng Nồng độ kháng thể 400 ng /que thử Nồng độ kháng thể 120 ng /que thử Nồng độ kháng thể 40 ng /que thử 3.3.2 Xác định lƣợng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm Chúng tơi sử dụng kháng thể lịng đỏ trứng IgY từ lô gà tiêm loại độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ D+E), sau tinh phƣơng pháp tách phân đoạn nƣớc NaCl, đƣợc tinh tiếp cột sắc ký in lên vạch thử nghiệm que thử Pha loãng kháng thể tới nồng độ 5; 1,5; 0,5μg/μl in dung dịch lên màng nitrocellulose với liều lƣợng μl/cm Sau sử dụng que thử để phân tích mẫu âm tính với liều lƣợng kháng nguyên cộng hợp μl/100 μl đệm chạy Dựa vào kết thí nghiệm, chúng tơi tiến hành sử dụng nồng độ kháng thể đơn dòng 1,5 μg/μl để in màng với liều lƣợng μl/cm Hình 3.12 Lựa chọn lượng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm Nồng độ kháng thể µg/que thử Nồng độ kháng thể 0,6 µg /que thử Nồng độ kháng thể 0,2 µg /que thử 3.3.3 Xác định lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng Vì sử dụng phƣơng pháp cạnh tranh để phát SEA – SEE nên lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần dùng phải có liều lƣợng nhƣng 19 Footer Page 21 of 258 phải đảm bảo mẫu âm tính phải xuất vạch Chúng tiến hành sử dụng 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 10 µl kháng nguyên cộng hợp cho mẫu âm tính Các kết lƣợng kháng nguyên cộng hợp nhỏ cho tín hiệu vạch rõ ràng 2µl Do vậy, thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi sử dụng 2µl kháng nguyên cộng hợp cho que thử Header Page 22 of 258 Hình 3.13 Lựa chọn lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10: Lượng kháng nguyên cộng hợp sử dụng cho phản ứng 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, µl 3.3.4 Xác định độ nhạy phát que thử với loại độc tố Chúng chuẩn bị mẫu kháng nguyên SEA, SEB, SEC1, SED SEE với nồng độ ban đầu là: 1000ng/ml tiến hành pha loãng đến nồng độ 300 ng/ml, 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng/ml, ng/ml ng/ml Các kết thí nghiệm với độc tố cho thấy: Với SEA, SEB SED phân tích mắt thƣờng, độ nhạy phát que thử khoảng 30-100 ng/ml Hình 3.14 Thử độ nhạy que thử với SEA, SEB, SED đệm Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; ng/ml mẫu âm tính khơng chứa SEA Footer Page 22 of 258 20 Header Page 23 of 258 Với SEC1, SEE độ nhạy phát que thử khoảng 10-30 ng/ml Hình 3.15 Thử độ nhạy que thử với SEC1 Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; ng/ml mẫu âm tính khơng chứa SEC1 Ứng dụng que thử phát SEA-SEE sữa Chúng áp dụng kết lƣợng kháng nguyên cộng hợp cho mẫu âm tính µl để thử nghiệm với nồng độ sữa pha lỗng khác nhằm tìm nồng độ sữa pha loãng thấp mà đảm bảo mẫu âm tính xuất vạch Hình3.16 Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cho que thử Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10: Độ pha loãng sữa sử dụng cho phản ứng 1; 2; 3; 4; 5; ; 7; 8; 10 lần Để tối ƣu hóa đƣợc độ pha lỗng sữa dùng cho thử nghiệm, chúng tơi tiến hành pha loãng mức độ: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 10 lần dung dịch đệm chạy Các kết mức độ pha lỗng sữa thích hợp cho thử nghiệm lần Xác định độ nhạy phát tồn q trình phân tích Từ kết sau phân tích que thử với loại độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED SEE) phân tích đệm chạy Footer Page 23 of 258 21 sử dụng chất sữa, chúng tơi kết luận độ nhạy phát tồn q trình phân tích nhƣ sau : - Với SEA SEB, SED: dung dịch đệm chạy độ nhạy phát que thử khoảng 30-100 ng/ml; sữa độ nhạy phát khoảng 30-90 ng/ml Header Page 24 of 258 Hình 3.17 Thử độ nhạy que thử với SEA, SEB, SED sữa Ghi chú: ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; ng/ml, mẫu âm tính sữa khơng chứa SEA mẫu âm tính đệm khơng chứa SEA - Với SEC1, SEE dung dịch đệm chạy độ nhạy phát que thử khoảng 10-30 ng/ml; sữa độ nhạy phát khoảng 9-30 ng/ml Hình 3.18 Thử độ nhạy que thử với SEC1 sữa Ghi chú: ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9; ng/ml, mẫu âm tính sữa khơng chứa SEC1 Footer Page 24 of 258 22 Header Page 25 of 258 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu đề tài luận án đã đạt đƣợc kết sau: Đã thiết kế thành cơng vector biểu pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa cho độc tố ruột tụ cầu SEC1 Đã biến nạp thành cơng plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA plasmid pGS-21a- sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu vào tế bào E coli BL21 Đã sàng lọc đƣợc dịng tế bào E coli có khả sinh SEA SEC1 cao Đã xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy phù hợp cho sinh tổng hợp SEA SEC1: nhiệt độ 30oC; nồng độ chất cảm ứng IPTG với SEA mM, với SEC1 0,3 mM; thời gian cảm ứnglần lƣợt Đã tinh SEA tinh khiết dạng dung hợp với GST, SEC1 dạng dung hợp với đuôi GST vùng đuôi His Đã sản xuất tinh kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng BSA kháng thể IgY kháng độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ C2+ D+E) từ gà Leghorn trắng với độ tinh hiệu suất thu hồi cao Đã tạo thành công que thử phát độc tố ruột tụ cầu với độ nhạy phát với SEA SEB, SED đệm chạy khoảng 30-100 ng/ml, sữa độ nhạy phát khoảng 30-90 ng/ml; với SEC1, SEE đệm chạy khoảng 10-30 ng/ml, sữa độ nhạy phát khoảng 9-30 ng/ml KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu nhằm tối ƣu hóa que thử để tăng độ nhạy phát với loại độc tố ruột tụ cầu (SEA-SEE), đơn giản hóa quy trình phân tích để vào sản xuất, ứng dụng để phát loại độc tố nhiều loại thực phẩm trƣờng | Footer Page 25 of 258 23 Header Page 26 of 258 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN 1) Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2012), “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát nhanh độc tố ruột A tụ cầu”, Y học thực hành, 842, tr.213-217 2) Lê Quang Hòa, Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Tô Kim Anh (2012), “Sản xuất thử nghiệm sinh phẩm ELISA phát nhanh độc tố ruột dạng A tụ cầu”, Y học thực hành, 842, tr.217- 220 3) Le Quang Hoa, Tran Thi Sao Mai, Nguyen Thị Khanh Tram, Tô Kim Anh (2014), “Development of a Lateral Flow Immunoassay for theRapid Detection of Staphylococcal Enterotoxin A in Milk”, VNU journal of Science, 30, pp 153-157 Footer Page 26 of 258 24 Header Page 27 of 258 25 Footer Page 27 of 258 ... trình phát triển que thử cần sử dụng kháng thể 1.4.2 Một số nghiên cứu chế tạo que thử để phát độc tố ruột tụ cầu thực phẩm Năm 2009, nghiên cứu Boyle cộng tạo que thử phát SEB sữa với ngƣỡng phát. .. toàn thực phẩm phần lớn dừng lại việc phát vi khuẩn tụ cầu mà chƣa phân tích tới SE, nguyên nhân gây NĐTP tụ cầu Từ thực tế trên, thực đề tài luận án: ? ?Nghiên cứu tạo que thử để phát nhanh độc tố. .. độc tố ruột tụ cầu khuẩn thực phẩm? ?? Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài luận án phát triển sinh phẩm dựa kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát nhanh SE từ SEA đến SEE thực phẩm Nội dung nghiên cứu đề