Thiết kế vector TET – ON điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi aedes aegypti

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn:1 TS Nguyễn Văn Hạnh Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Vi Đại Lâm Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngồi cố gắng nỗ lực thân, tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo, bạn bè người thân Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, tập thể cán Phịng Cơng nghệ phơi – Viện Cơng nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tồn thể thầy, giáo truyền đạt cho kiến thức, kĩ quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Văn Hạnh – Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học, ThS Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm hướng dẫn trực tiếp đề tài, thầy tận tình bảo, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt đề tài Tôi xin cảm ơn nghiên cứu sinh Đỗ Trung Kiên, anh, chị bạn sinh viên tham gia nghiên cứu – Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, thầy cô, bạn bè ủng hộ mặt vật chất tinh thần giúp tơi hồn thành tốt đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Minh Thành ii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ARN Acid ribonucleic – Một hại loại acid nucleic CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid – Một loại nucleic acid DOX Doxycycline dsRNA E.coli LB MLPA Double strand RNA – RNA sợi đôi Escherichia coli Lauria Broth Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (khuếch đại phụ thuộc mẫu dò) Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi tổng hợp PCR chuỗi polymer (Phản ứng khuếch đại DNA ống nghiệm) µl PCMV IE PTGS TeT-on Microlit ( µl = 10-3 ml) Promoter encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site Posttranscriptional gene silencing ( làm bất hoạt gene sau phiên mã) Vector pTet – DualON TRE Tetracycline -responsive RNAi RNA interference SiRNA Small interfeing RNA RISC IRES2 RNP RNA-induced silencing complex ( phức hợp làm câm lặng RNA) Internal ribosome entry site Ribonucleoprotein iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1:Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 19 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-1 24 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng cắt PJET1.2-2 24 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng nối 26 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt 27 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt 27 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối 28 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 3.9: Thành phần phản ứng cắt 29 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng cắt 30 Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối 31 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc vector Tet- On 10 Hình 2.2: Cơ chế hoạt động vector Tet-On 12 Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI [7] 13 Hình 3.1: Cấu trúc vector pJET1.2 20 Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau cắt enzyme HinIII Acc65I 32 Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau cắt enzyme HindIII Acc65I 33 Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene 34 Hình 4.4: Kết so sánh với đoạn gene tra-2 34 Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 đoạn DNA trước nối T4 35 Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme 2) BamHI HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn sau nối (Đường chạy 36 Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme BamHI HinIII sau tinh (đường chạy 2) 37 Hình 4.8: Kết vector pTRE – Tight – BI tạo rỗng enzyme BamHI HindIII 38 Hình 4.9: Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight – BI cắt enzyme BamHI HinIII (đường chạy số 2) 39 Hình 4.10: Kết cắt vector pTet – DualON enzyme NsiI XhoI (Đường chạy số 2) 40 v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Muỗi biến đổi gene 2.1.2 Công nghệ RNAi 2.1.3 Gene biểu tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti (Transformer-2 RNAi) 2.1.4 Vector Tet – On 10 2.1.5 Vector pTRE-Tight-BI 13 2.2 Tình hình nghiên cứu nước ngồi nước 15 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 16 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17 vi 3.2.2 Thời gian tiến hành 17 3.3 Hóa chất, thiết bị vật liệu 17 3.3.1 Hóa chất 17 3.3.2 Thiết bị 19 3.3.3 Dụng cụ 19 3.3.4 Vật liệu 20 3.4 Nội dung nghiên cứu 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 21 3.5.1 Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti 21 3.5.2 Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào vector pTRE – Tight – BI 26 3.5.3 Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh 29 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti 32 4.1.1 Kết tạo đoạn DNA từ vector pJET1.2-2 32 4.1.2 Kết tạo vector pJET1.2-1 rỗng 33 4.2 Kết chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector 35 4.2.1 Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau nối đoạn DNA 35 4.2.2 Kết vector pTRE – Tight – BI nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính 37 4.2.3 Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI 38 vii 4.3 Kết tạo vector Tet – on hoàn chỉnh 40 4.3.1 Kết vector pTet – DualON nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi 40 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế giới, ước tính hàng năm giới có khoảng 2,5 – tỷ người có nguy mắc bệnh muỗi truyền nhiễm sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue) Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh muỗi Aedes aegypti phải điều trị, 90% trẻ em 15 tuổi, tỉ lệ tử vong muỗi Aedes aegypti 5% Bệnh lây lan 100 nước khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới Châu Mỹ cao 42 nước, châu Phi 20 nước, khu vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đơng Nam Á nước Địa Trung Hải nước [1] Việt Nam nước có bệnh dịch lưu hành Từ năm 1960 đến dịch có xu hướng lan rộng phát triển với số mắc bệnh chết ngày tăng Bệnh chiếm tỉ lệ cao bệnh truyền nhiễm Việt Nam, nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ tình trạng tải cho bệnh viện mùa dịch [4], [5] Dịch bệnh khơng có chu kì rõ rệt, đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch xảy rải rác Để giải vấn đề nhiều hướng nghiên cứu thử nghiệm áp dụng Các nhà khoa học giới thành công việc tạo muỗi biến đổi gene kĩ thuật DNA tái tổ hợp Những muỗi biến đổi gene thả ngồi mơi trường giao phối với muỗi tạo hệ muỗi bị khuyếm khuyết chết trước trưởng thành Các nhà khoa học Mỹ Đại học Rocckefeller nghiên cứu biến đổi gene muỗi, vơ hiệu hóa nhạy bén khứu giác chúng người, khiến chúng khơng có khả tìm kiếm mục tiêu để hút máu Nhóm nghiên cứu cho muỗi có quan thụ cảm khứu giác gọi orco, xem phận cần thiết để phối hợp với 31 Sử dụng enzyme T4 ligase để nối vector pTRE – Tight – BI sau nối DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti với pTet – DualON tạo rỗng trình nối để ống eppendofp ủ qua đêm 370C, thành phần phản ứng nối trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối Thành phần phản ứng Thể tích (µl) T4 ligase 2.0 µl Buffer ligase 2.0 µl Vector pTRE – Tight – BI + DNA kẹp tóc 4.0 µl pTet – DualON tạo rỗng 13.0 µl Tổng 20.0 µl Sau q trình nối nhiệt độ phòng 10 phút, tiến hành đem bất hoạt 650 C 10 phút Sau nối T4 ligase đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính chèn vào pTRE – Tight - BI vào vector pTRE – Tight – BI ta tiến hành biến nạp vào tế bào E.coli DH5α khả biến Tiến hành nhặt khuẩn lạc đơn đem nuôi sinh khối với 3ml mơi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ni lắc 370C qua đêm Sau q trình nuôi ta tách DNA plasmid theo GenJET Plasmid Miniprep Kit hãng Thermo Scientific khuẩn lạc nuôi sinh khối mơi trường lỏng LB có chứa kháng sinh để kiểm tra trình nối T4 Sản phẩm sau tách 40C để sử dụng cho phần 32 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti 4.1.1 Kết tạo đoạn DNA từ vector pJET1.2-2 Kết điện di sau tiến hành cắt vector PJET1.2-2 chứa đoạn DNA hai enzyme HindIII Acc65I, thể hình 4.1 M 3000bp 3000bp 284bp 250bp Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau cắt enzyme HinIII Acc65I Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số vector pJET1.2-2 cắt enzyme Acc65I HinIII Vector PJET1.2-2 cho hai band, band kích thước khoảng 3000bp band kích thước khoảng 284bp band hiển thị rõ nét băng vạch nhà sản xuất thiết kế Với kết chúng tơi cắt 33 thành công vector PJET1.2-2 Chúng tiến hành thu nhận tinh đoạn DNA có kích thước khoảng 284bp kít kít QIAGEN Gel Extraction Kit để sử dụng cho nghiên cứu sau 4.1.2 Kết tạo vector pJET1.2-1 rỗng Kết hình ảnh điện di vector pJET1.2-1 rỗng cắt enzyme Acc65I HindIII hình 4.2 Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau cắt enzyme HindIII Acc65I Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số vector pJET1.2-1 cắt enzyme Acc65I HinIII Vector PJET1.2-1 sau cắt enzyme HindIII Acc65I cho hai band, band kích thước khoảng 3000bp band kích thước khoảng 284bp band hiển thị rõ nét băng vạch nhà sản xuất thiết kế 34 Với kết chúng tơi cắt thành công vector PJET1.2-1 loại bỏ đoạn khoảng 284bp lấy đoạn band kích thước khoảng 3000bp chứa đoạn DNA Chúng tối tiến hành thu đoạn gene kích thước khoảng 3000bp chứa đoạn đoạn DNA kít kít QIAGEN Gel Extraction Kit để sử dụng cho nghiên cứu sau Kết đọc trình tự đoạn Sau có kết tinh đoạn DNA chúng tơi tiến hành đọc trình tự để kiểm tra so sánh với gene Tra-2 Kết hình 4.3 hình 4.4 khơng có sai khác so với gene Tra-2: Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene Hình 4.4: Kết so sánh với đoạn gene tra-2 35 Sau trình nối T4 ligase vector PJET1.2-1 tạo rỗng đoạn DNA 2, sản phẩm nối biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Hình ảnh vector PJET1.2-1 đoạn DNA trước nối T4 ligase thể hình 4.5 M 3000bp 1000bp 250bp 284bp Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 đoạn DNA trước nối T4 Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số đoạn chèn 2; đường chạy số vector pJET1.2-1 tạo rỗng 4.2 Kết chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector 4.2.1 Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau nối đoạn DNA Kết cắt DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau nối đoạn DNA thể hình 4.6 36 M 3000bp 3000bp 630bp 250bp Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme BamHI HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn sau nối (Đường chạy 2) Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số số sản phẩm cắt pJET1.2-1 với đoạn cắt HinIII BamHI Với kết việc cắt enzyme BamHI HindIII cho band DNA sáng, rõ nét với kích thước band khoảng 2370bp khoảng 630bp phù hợp với mục đích nghiên cứu, chúng tơi tiến hành thu band có kích thước band khoảng 630bp tách DNA kít QIAGEN Gel Extraction Kit để tách gel Đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi có kích thước khoảng 630bp cắt enzyme BamHI HindIII sau tinh thể hai đường chạy hình 4.7 37 M 1000bp 630bp 250bp Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme BamHI HinIII sau tinh (đường chạy 2) Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số số sản phẩm cắt pJET1.2-1 với đoạn cắt HinIII BamHI sau tinh 4.2.2 Kết vector pTRE – Tight – BI nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính Vector pTRE – Tight – BI sau nhân số lượng lớn vi khuẩn E.coli DH5α tạo rỗng để nhận đoạn DNA quy định tính trạng giới tính enzyme BamHI HindIII Kết hình 4.8 38 M 3000bp 2800bp 1000bp Hình 4.8: Kết vector pTRE – Tight – BI tạo rỗng enzyme BamHI HindIII Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số vector pTRE – Tight – BI cắt HinIII BamHI Kết cho band kích thước khoảng 2800bp sáng, rõ nét với kết phù hợp với kích thước ban đầu chúng tơi biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α Đoạn gene thu nhận tinh kít QIAGEN Gel Extraction Kit để tách DNA Để chuẩn bị nhận đoạn chèn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 4.2.3 Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI Plasmid pTRE – Tight – BI sau chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra2 RNAi quy định tính trạng giới tính cắt hai enzyme BamHI HinIII Bất hoạt enzyme để hạn chế biến tính, trình nối thực cách thêm T4 ligase vào hỗn hợp Plasmid chuyển vào tế bào 39 E.coli DH5α biến nạp vào vi khuẩn [9] Nuôi cấy phân lập lượng lớn DNA Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào vector pTRE – Tight – BI thể hình 4.9 3000bp 2800bp 1000bp 630bp Hình 4.9: Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight – BI cắt enzyme BamHI HinIII (đường chạy số 2) Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số bỏ trống; đường chạy số sản phẩm cắt plasmid pTRE – Tight – BI nối với đoạn DNA kẹp tóc BamHI HindIII; đường chạy số sản phẩm pTRE – Tight – BI nối với DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi không cắt Kết điện di kiểm tra sản phẩm nối hình 4.2.3 cho thấy: Đường chạy số cho band sáng rõ nét, band kích thước khoảng 2800bp plasmid pTRE – Tight – BI band có kích thước khoảng 630bp kích thước đoạn chèn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti Với kết phù hợp với kích thước đem nối lúc đầu plasmid pTRE – Tight – BI đoạn chèn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi 40 4.3 Kết tạo vector Tet – on hoàn chỉnh 4.3.1 Kết vector pTet – DualON nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi Vector pTet – DualON nhân lên với số lượng phương pháp biến nạp sốc nhiệt vi khuẩn E.coli DH5α tách plasmid hóa chất để thu DNA Vector tạo rỗng để nhận vector pTRE- Tight – BI sau chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegpti enzyme NsiI XhoI Kết hình 4.10 M 4906bp 3000bp 1000b p Hình 4.10: Kết cắt vector pTet – DualON enzyme NsiI XhoI (Đường chạy số 2) Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số 1- 2: Vector pTet – DualON cắt enzyme NsiI XhoI 41 Kết hình 4.3.1 cho band vạch rõ nét kích thước khoảng 4906bp điểm cắt NsiI XhoI thiết kế điểm cắt vector pTet – DualON nhằm mục đích tạo vector pTet – DualON rỗng để nối với plasmid pTRE – Tight – BI sau nối thành công đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti đầu nối NsiI XhoI nên vector pTet – DualON sau cắt enzyme NsiI XhoI không bị thay đổi kích thước Kết tạo thành cơng vector pTet – DualON rỗng chuẩn bị để nối với plasmid pTRE – Tight – BI sau nối với đoạn DNA kẹp tóc 42 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đưa kết luận sau: Đã tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi kiểm sốt gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti từ vector PJET1.2-1 vector PJET1.2-2 có kích thước 630bp phương pháp tổng hợp gene cắt nối Đã nối thành công đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính có kích thước 630bp với plasmid pTRE – Tight – BI có kích thước 2812bp Đã tạo vector pTet – DualON rỗng enzyme XhoI NsiI với kích thước 4906bp để chuẩn bị nhận vector pTRE – Tight – BI sau nối thành công với đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 5.2 Kiến nghị Tiếp tục hoàn thiện nội dung chèn plasmid pTRE – Tight – BI sau nối đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector pTet – DualON tạo rỗng TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế, (2006), “Giám sát, chuẩn đoán điều trị bệnh sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue”, Nhà xuất Y học Hà Nội Đỗ Năng Vịnh, (2007), “Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gene tiềm ứng dụng to lớn”, Tạp chí sinh học 5(3): 265-275 Đỗ Thị Mỹ Hương, (2009), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh thái muỗi Aedes aegypti mối liên quan đến sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue tỉnh Đắc Lắc”, 2004-2008 Hoàng Anh Vường, Nguyễn Ái Phương, (1993), “ Đặc điểm dịch tễ học Dengue xuất huyết Tây Nguyên, từ 1983-1993”, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học 1993, Hội nghị khoa học Y – dược Viện trường Tây Nguyên – Khánh Hịa, trang 338-345 Hồng Anh Vường, Vũ Thị Hồng Gấm, (1998), “ Đặc điểm dịch tễ học SD/SXHD Đắc Lắc, năm 1995-1997”, Tập san vệ sinh phòng dịch Tây Nguyên, (9), tr.16-17 II Tài liệu Tiếng Anh Andrew Z Fire, Craig C Mello, (2006), “For their discovery of RNA interference – gene silencing by double – stranded RNA”, The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 Clontech Laboratories, Inc.A Takara Bio Company1290 Terra Bella Ave.Mountain View, CA 94043Technical Support (US) Cleo Goyvaerts, Therese Liechtenstein, Christopher Bricogne, David Escors and Karine Breckpot, (2013), “Targeted Lentiviral Vector: Current Applications and Future Potential), DOI: 10.5772/52770 Duong Thanh Hoang, Hanoi City (VN); Kim Phuc Hoang, Oxford(GB), (2014), “Culicinae mosquito tra-2 RNA interference technique to gentically produce maleness population” , Pub No.: US 2014/0331342 A1, Pub Date: NOV 6, 2014 10 Fortier E, Belote JM, (2000), “Temperature-dependent gene silencing by an expressed inverted repeat in Drosophila”, Genesis 2000 Apr;26(4):240-4 11 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC, (1998), “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”, Nature 1998 Feb 19; 391(6696):806-11 12 Gareth J Lycett, Fotis C Kafatos and Thanasis G Loukeris, (2014), “Conditional expression in the malaria mosquito Anopheles stephensi with Tet-On and Tet-Off systems”, 10.1543/genetis.104.028175 13 Guoliang Fu, Lees RS, NImmo D, Aw D, Jin L, Gray P, Berendonk TU, White-Cooper H, Scaife S, Kim Phuc H, Marinotti O, Jasinskiene N, James AA, Alphey L, (2010), “Female- specific flightless phenotype for mosquito control”, doi: 10.1073/pnas.1000251107 Epub 2010 Feb 22 14 Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ, (2001), “Post – transcriptional gene silencing by double – stranded RNA”, PMID: 11253050 15 Hubert Amrein, Tom Maniatis and Rolf Nothiger, (1990), “Alternatively spliced transcripts of the sex-determining gene tra-2 of Drosophila encode functional proteins of different size”, The EMBO Journal vol.9 no 1 pp.361 – 3629 16 Matthew Degennaro, Carolyn S McBride, Laura Seeholzer, Takao Nakagawa, Emily J Dennis, Chloe Goldman, Nijole Jasinskiene, Anthony A James & Leslie B Vosshall, (2013), “Orco mutant mosquitoes lose strong Preference for humans and are not repelled by volatile DEEF”, 498(7455):487-91 Doi: 10.1038/nature12206 Epub 2013 May 29 17 Marylene Poirie, Eva Niederer and Monica Steinmann – Zwicky, (1990), “A sex-specific number of germ cells in embryonic gonads of Drosophila”, Development 121, 1867-1873 (1995) 18 Saurabh Satya, Vidiarthi AS, Prasad D (2014), “RNA interference: concept to reality in crop improvement”, Planta 239 (3): 534-564 19 William Mattox, Melanie J Palmer, and Bruce S Baker, (1990), “ lternative splicing of the sex etermination gene transformer-2 is sexspecific in tile germ line but not m the soma”, Department of Biological Sciences, Stanford University, Stanford, California 94305 USA III Tài liệu Internet 20.http://khoahoc.tv/doisong/yhoc/suc-khoe/31626_muoi-bien-doi-gen-cotro-thanh-cuu-tinh-cua-nganh-y-te.aspx 21.http://khoahoc.tv/khampha/sinh-vat-hoc/vikhuan-contrung/40481_muoibien-doi-gene-ngan-benh-sot-xuat-huyet.aspx 22.http://khoahoc.tv/khampha/sinh-vat-hoc/vikhuancontrung/46805_bien-doi-gene-de-muoi-khong-ngui-duoc-mui-nguoi.aspx 23.http://voer.edu.vn/m/mot-so-thanh-tuu-trong-linh-vuc-tao-dong-vatchuyen-gen/5095526f ... tiêu diệt toàn quần thể muỗi Aedes aegypti Hiện có số nghiên cứu vector điều khiển tính trạng giới tính có vector Tet – On nhà khoa học sử dụng để điều khiển tính trạng giới tính quần thể sinh vật... định tính trạng giới tính - Chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight – BI Nội dung 3: Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh - Vector pTet... kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI 38 vii 4.3 Kết tạo vector Tet – on hoàn chỉnh 40 4.3.1 Kết vector pTet – DualON nhân với số