Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa BasmatiNghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati
MỞ ĐẦU Tình hình biến đổi khí hậu toàn cầu (BĐKH) vấn đề thời sự, thu hút quan tâm, lo lắng toàn nhân loại BĐKH diễn thường xuyên diện rộng, vượt tầm kiểm soát người gây tác động lớn đến đời sống kinh tế toàn cầu, đặc biệt nông nghiệp Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo giống trồng có khả thích ứng cao với bất lợi thời tiết cần thiết cấp bách Việt Nam quốc gia dự đoán bị ảnh hưởng nhiều tác động biến đổi khí hậu Diễn biến thời tiết năm gần cho thấy hạn nguyên nhân làm giảm suất trồng; chí có nơi, có vụ hạn gây thất thu làm sản lượng nông nghiệp không ổn định Vì vậy, việc tạo giống trồng có tính kháng hạn cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng góp phần tăng suất, xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội, tăng dân trí vị quốc gia Từ hàng ngàn năm trước, người biết tạo giống trồng mang đặc tính mong muốn phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính hai dòng mang gen mong muốn) Tuy nhiên, phương pháp cần nhiều thời gian, công sức nhiều trường hợp, lai thu kèm tình trạng không mong muốn Ngày nay, nghiên cứu hệ gen xác định đặc tính, chức gen hữu ích kỹ thuật di truyền chuyển trực tiếp gen hữu ích vào đối tượng trồng khác tạo trồng chuyển gen mang đặc tính quý tăng tính chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng suất chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hóa học cần sử dụng… Trong năm vừa qua, hàng loạt nghiên cứu chuyển gen hữu ích vào đối tượng trồng tiến hành nhiều phòng thí nghiệm kết tạo nhiều giống trồng chuyển gen mang đặc tính quý chống sâu, kháng thuốc diệt cỏ, suất cao, chất lượng tốt Đặc biệt số giống chuyển gen thương mại diện tích gieo trồng ngày tăng sản xuất, đáp ứng kỳ vọng thực tế sản xuất Tính trạng chịu hạn tính trạng đa gen, nhiều nghiên cứu tạo giống trồng chuyển gen chịu hạn nghiên cứu năm qua kết chưa có giống trồng chịu hạn thương mại hóa [9, 54, 60] Gần đây, xu hướng tạo giống trồng chuyển gen chịu hạn tập trung vào nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn (gen điều khiển chịu hạn) lý do: (1) biểu gen liên quan đến tính chịu hạn liên quan chặt chẽ đến trình phiên mã, (2) gen điều khiển tính chịu hạn mã hoá protein có khả hoạt hoá biểu hàng loạt gen chức liên quan đến chịu hạn thông qua trình phiên mã kết thực vật tăng cường tính chịu hạn Điều giải thích tính trạng chịu hạn tính trạng đa gen cần chuyển gen điều khiển tính chịu hạn tăng sức chống hạn chuyển gen Vì vậy, việc phân lập nghiên cứu đặc tính gen điều khiển trở thành vấn đề thời mang tính toàn cầu nghiên cứu lẫn nghiên cứu áp dụng Hiện có nhiều công bố chuyển thành công gen điều khiển chịu hạn vào mô hình Arabidopsis, lúa, cà chua, đậu tương, ngô Dựa vào thực tế trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati“ Với mục tiêu sau: - Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 điều khiển tính chịu hạn lúa - Tập trung tối ưu hoá quy trình chuyển gen thao tác di truyền lúa - Tạo lúa chuyển gen OsNAC6 có khả chống chịu tốt với điều kiện hạn Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 NÔNG NGHIỆP TRONG ĐIỀU KIỆN BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU 1.1.1 TÌNH HÌNH BIẾN ĐỔI KHÍ HẦU TOÀN CẦU Theo Bộ Tài nguyên- Môi trường, biến đổi khí hậu diễn phạm vi toàn cầu, khu vực Việt Nam Biến đổi khí hậu tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống môi trường phạm vi giới, có Việt Nam Biến đổi khí hậu thay đổi hệ thống khí hậu gồm khí quyển, thuỷ quyển, sinh quyển, thạch tương lai nguyên nhân tự nhiên nhân tạo giai đoạn định từ tính thập kỷ hay hàng triệu năm Sự biển đổi thay đổi thời tiết bình quân hay thay đổi phân bố kiện thời tiết quanh mức trung bình Sự biến đổi khí hậu giới hạn vùng định hay toàn Địa Cầu Trong năm gần đây, biến đổi khí hậu gọi chung tượng nóng lên toàn cầu Nguyên nhân tượng biến đổi khí hậu toàn cầu gia tăng hoạt động tạo chất thải khí gây hiệu ứng nhà kính (bao gồm nước, CO2, CH4, N2O, O3, khí CFC), hoạt động khai thác mức bể hấp thụ bể chứa khí nhà kính sinh khối, rừng, hệ sinh thái biển, ven bờ đất liền khác Theo Trung tâm Nghiên cứu Khí tượng - Khí hậu (Viện Khoa học Khí tượng thủy văn Môi trường), tình hình biến đổi khí hậu Việt Nam diễn theo chiều hướng gia tăng tần suất cường độ tượng bão, mưa lớn, nhiệt độ cao hạn hán Thời tiết năm 2010 diễn biến phức tạp, bất thường, dịch bệnh trồng, vật nuôi xảy nhiều huyện thị, hạn hán nặng vụ hè thu, lũ lụt hồi tháng 10/2010 gây ảnh hưởng không nhỏ đến sản xuất nông nghiệp người dân Theo Phó phòng Dự báo khí tượng hạn vừa dài (Trung tâm dự báo Khí tượng-Thủy văn Trung ương) Nguyễn Đức Hoà tháng mùa khô 2010, Bắc bộ, đặc biệt Bắc Trung hạn hán gay gắt nhiều so với năm ngoái Cùng với đó, vào đầu vụ từ tháng đến tháng 3-2011, mực nước sông lớn mức thấp TBNN, độ mặn vùng cửa sông khả cao TBNN, nước mặn xâm nhập sâu vào cửa sông thẩm thấu ngầm, ảnh hưởng đến nhiều diện tích canh tác địa phương ven biển Do khả vào vụ thiếu hụt lượng nước tưới tiêu tương đương với khoảng 200.000 [80] 1.1.2 ẢNH HƢỞNG CỦA BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU ĐẾN SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP Nông nghiệp giới đối mặt với khó khăn lớn tình trạng biến đổi khí hậu gây Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy tỉnh miền Bắc Tính trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng năm ảnh hưởng nghiêm trọng vùng trồng ngô lớn Trung Quốc có nguy thu hẹp 60% diện tích trồng trọt Ấn Độ phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng vòng năm qua Hiện có 1/3 số quận Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán Thiếu hụt lượng mưa cần thiết khiến tăng trưởng kinh tế quốc gia giảm sút 1% năm Đợt hạn hán tồi tệ lịch sử gần 20 năm qua Thái Lan năm đẩy quốc gia xuất gạo lớn giới đối mặt với vụ mùa thất thu Thông báo cho biết, sản lượng gạo nước vụ mùa tới, kết thúc vào tháng 8, đạt triệu so với mức dự báo triệu trước Chưa vấn đề biến đổi khí hậu (BĐKH) lại đề cập nhiều nóng bỏng thời điểm Theo nghiên cứu Liên Hợp Quốc [81], Việt Nam quốc gia bị ảnh hưởng nhiều khu vực Đông Nam Á từ BĐKH Việt Nam, nước phát triển thời kỳ công nghiệp hóa, nằm nhóm nước dễ bị tổn thương vấn đề môi trường BĐKH gây lũ lụt, hạn hán, bão… Bên cạnh đó, với bờ biển dài, vấn đề mực nước biển dâng cao làm 12,2% diện tích đất Việt Nam đe dọa tới chỗ sinh sống 17 triệu người Những biến động thời tiết bất thường gây thiệt hại lớn cho đời sống dân nhân đất nước mà thường gọi thiên tai cần nghiên cứu, xem xét theo hướng báo động toàn cầu gia tăng nhiệt độ bề mặt trái đất mực nước biển ngày dâng cao Theo nghiên cứu chuẩn bị công bố, đến cuối kỷ (2100), nhiệt độ Việt Nam tăng lên khoảng đến 4,5oC mực nước biển dâng lên khoảng 10 đến 68 cm Và biến đổi khí hậu diễn với tốc độ vòng khoảng 100 năm nữa, nhiều diện tích đất liền trái đất, có vùng đồng châu thổ sông Cửu Long sông Hồng, ngập chìm nước biển [81] Theo ước tính IPCC, mực nước biển dâng cao m làm cho 22 triệu người Việt Nam nhà cửa, đồng Sông Hồng bị ngập 5.000 km2 đồng Sông Cửu Long bị ngập 15.000 - 20.000 km2; mà hai vựa lúa lớn nhất, tập trung đông dân cư nước Mất đất, sản lượng lương thực Việt Nam giảm 12% (xấp xỉ triệu tấn) Trong miền Trung chưa hết mùa mưa lũ, tỉnh miền Bắc lại phải gồng chống hạn Sự thay đổi khắc nghiệt bất thường thời tiết khiến dải đồng sông Hồng "khát" nước Mực nước sông, hồ chứa xuống thấp, ba hồ thuỷ lợi lớn miền Bắc Hoà Bình, Thác Bà, Tuyên Quang tích 5,2 tỉ m3, thiếu 4,5 tỉ m3 so với thiết kế, đe doạ ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực [82] Theo tính toán Tổng cục Thuỷ lợi, kéo dài tình trạng mưa có khoảng 650.000 lúa Đông Xuân 2010- 2011 rơi vào cảnh thiếu nước tưới Trong đó, nhận định Trung tâm Dự báo Khí tượng Thuỷ văn Trung ương cho thấy, thời tiết từ đến cuối năm đặc biệt thời điểm gieo cấy vụ Đông Xuân khắc nghiệt khô hạn tiếp tục kéo dài Đến hết năm 2010, dòng chảy sông Bắc Bộ từ thượng lưu đến hạ lưu giảm nhanh có khả nhỏ mức trung bình nhiều năm (TBNN) từ 20-40% Trong đó, hệ thống sông sông Hồng sông Thái Bình thiếu hụt với mức 35-45% 1.2 HẠN VÀ PHÂN LOẠI HẠN 1.2.1 KHÁI NIỆM HẠN Tất sinh vật Trái đất đềucần có nước để trì hoạt động sống thể, nước có ý nghĩa sống sinh vật, đặc biệt thực vật – sinh vật khả di chuyển để tìm nguồn nước Lượng nước cần thiết cho thể thực vật phụ thuộc vào loài giai đoạn phát triển chúng Hạn thực vật khái niệm thiếu nước môi trường gây suốt trình sống hay giai đọan phát triển, làm ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển Mức độ tổn thương thực vật khô hạn gây có nhiều mức độ khác nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường Khả giảm thiểu mức độ tổn thương thiếu hụt nước gây gọi “tính chịu hạn” thực vật trồng có khả phát triển bình thường điều kiện khô hạn gọi “cây chịu hạn” Khả giảm thiểu mức độ tổn thương thiếu hụt nước gây gọi “tính chịu hạn” thực vật [3] Tuy nhiên, khó để xác định trạng thái hạn đặc trưng mức độ khô hạn môi trường gây khác theo mùa, năm, vùng địa lý dự đoán trước Mức độ khô hạn môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển cây, làm giảm suất trồng, chí dẫn đến mùa [61] Các yếu tố môi trường thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng gây nên tượng cân áp suất thẩm thấu môi trường, dẫn đễn thiếu hụt nước tế bào, gây tượng hạn hán Hạn phân biệt thành loại hạn không khí, hạn đất hạn toàn diện [11] 1.2.2 PHÂN LOẠI HẠN 1.2.2.1 Hạn không khí Hạn không khí thường có đặc trưng nhiệt độ cao (39 - 420C) độ ẩm thấp (< 65%) Hiên tượng thường gặp tỉnh miền Trung nước ta vào đợt gió Lào vùng Bắc vào cuối thu, đầu đông Hiện tượng xuất số nước giới gió Chamsin Israel; gió Mistral miền nam nước Pháp… làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến số loài trồng phong lan, cam, chanh, đậu tương… [56] Hạn không ảnh hưởng trực tiếp lên phận hoa, lá, chồi non… ảnh hưởng đến trình tung phấn Đối với thực vật nói chung lúa nói riêng hạn không khí thường gây tượng héo tạm thời nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát nước nhanh vượt qua mức độ bình thường, lúc rễ hút nước không đủ bù lại lượng nước mất, lâm vào tình trạng cân nước Nước sản phẩm khởi đầu, trung gian giai đoạn cuối trình chuyển hóa hóa sinh, môi trường để phản ứng trao đổi chất xảy [63] Vì vây, việc cung cấp đủ nước cho biện pháp canh tác quan trọng Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn trồng mục tiêu nhà tạo chọn giống Mức độ thiếu hụt nước lớn ảnh hưởng xấu đến trình sinh trưởng Thiếu nước nhẹ giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng trình già hóa tế bào Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương chết 1.2.2.2 Hạn đất Mức độ khô hạn đất tùy thuộc vào bốc nước bề măt khả giữ nước đất Hạn đất làm cho áp suất thẩm thấu đất tăng cao đến mức lấy nước qua tế bào rễ, hạn đất gây cho héo lâu dài Hạn đất tác động trực tiếp đến phận rễ làm ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng phát triển Đối với trồng cạn, hạn đất ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt nảy mầm Lượng nước đất không đủ làm co mầm héo; thiếu nước nặng gây thui chột mầm chết 1.2.2.3 Hạn toàn diện Hạn toàn diện tượng có hạn đất hạn không khí xảy lúc Trong trường hợp này, với nước không khí làm cho hàm lượng nước giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, sức hút nước từ rễ tăng lượng nước đất cạn kiệt không đủ cung cấp cho Hạn toàn diện thường dẫn đến tượng héo vĩnh viễn, khả phục hồi Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy tỉnh miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh…), gây nên thiệt hại đáng kể trồng nói chung lúa nói riêng 1.3 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Điều kiện bất lợi môi trường gây hàng loạt thay đổi hình thái, sinh lí, sinh hoá phân tử, ảnh hưởng bất lợi cho sinh trưởng phát triển thực vật Trong điều kiện bất lợi môi trường, hạn yếu tố quan trọng nhất, đặc biệt bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu Điều kiện hạn hán làm cho thực vật phải tạo hàng loạt thay đổi mặt sinh lý để tồn thích nghi với điều kiện hạn như: Cụ thể hạn hán dẫn đến việc thực vật đóng khí khổng, giảm hô hấp quang hợp, giảm thể tích nước mô, chậm trình sinh trưởng Ở mức độ phân tử, điều kiện hạn làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu tích luỹ gen/protein chống chịu stress [15, 59, 74] Ở Arabidopsis, protein kinase, nhân tố phiên mã (transcription factor), phosphatase, protease, protein biểu giai đoạn muộn phôi (late embryogenesis abundant(LEA), protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), protein sinh tổng hợp đường (proline, mannitol, sorbitol) hàng loạt protein chức khác tham gia vào trình chịu hạn thực vật [59] Các protein tham gia vào trình chống hạn thực vật phân thành hai nhóm: (1) nhóm protein chức trực tiếp tham gia chống lại với điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mannitol, sorbitol ); (2) nhóm protein điều khiển biểu gen chức liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã, kinase ) Các nhân tố phiên mã bám vào trình tự ADN đặc hiệu vùng khởi động gen gen chức tham gia vào tính chịu hạn hoạt hóa biểu gen này, kết tăng cường tính chịu hạn thực vật Các nghiên cứu gen chứng minh vùng khởi động gen nhiều gen chức chứa nhiều trình tự ADN đặc hiệu điểm bám nhân tố phiên mã Điều chứng tỏ nhân tố phiên mã hoạt hóa biểu nhiều gen chức Các nghiên cứu biểu gen chứng minh nhiều nhân tố phiên mã biểu mạnh điều kiện hạn chứng tỏ nhóm protein đóng vai trò quan trọng chế điều hòa biểu gen tăng cường tính kháng hạn thực vât [60, 74] Điều kiện hạn hán Nhóm gen nhận, truyền tín hiệu (G protein, Kinase…) Các gen điều khiển biểu Các nhân tố khởi đầu phiên mã Các gen chức (DREB, NAC, ZFHD, AREB, MYB, MYC, …) biểu Các gen chức (late embryogenesis abundant (LEA), chaperones, proteases, transporters, sugars, proline, mannitol, sorbitol ) Thực vật tăng cường tính chịu hạn Hình Cơ chế phân tử trình tăng cƣờng tính chịu hạn thực vật 1.3.1 CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CÁC QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA Sự thay đổi chuyển hóa sơ cấp thể cách đáp ứng thông thường với điều kiện stress thực vật Ví dụ, cADN mã hoá cho enzym glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase phân lập từ C plantagineum (bảng 1) tăng cường biểu bị xử lý điều kiện hạn xử lý ABA [68] Tuy nhiên mức độ tăng cường hoạt động enzym có liên quan với yếu tố stress môi trường thực vật, phản ánh gia tăng nhu cầu lượng Các protease đặc điểm quan trọng trình chuyển hoá điều kiện stress Chúng góp phần làm ngừng việc sử dụng protein thừa phân hủy chuỗi peptit túi chứa, qua giải phóng axit amin tự 10 3.3 CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN OsNAC6 VÀO GIỐNG LÚA PUSA BASMATI 3.3.1 Ảnh hƣởng nồng độ, thời gian chất khử trùng lên tỉ lệ tạo callus chất lƣợng callus giống lúa Pusa Basmati Hạt sau bóc vỏ đem xử lí với loại chất khử trùng khác nhau, với thời gian nồng độ khác Các loại chất khử trùng thời gian xử lý khảo sát nghiên cứu bao gồm: thủy ngân (HgCl) 0.1% 10 phút, javen (NaOCl) 5% có bổ sung tween 20 (một loại chất hoạt động bề mặt) 30 phút, javen (NaOCl) 50% có bổ sung tween 20 20 phút oxi già (H2O2) 15% 15 phút Các thí nghiệm thực lần, lần sử dụng 100 hạt lúa cho cách khử trùng khác nhau, kết cụ thể thu sau: - Phương pháp 1(Thủy ngân 0.1% 10 phút): Hạt sạch, nấm khuẩn callus lên kém, không vàng, không tơi xốp, có viền đen phôi phát triển yếu, tỉ lệ lên callus thấp (40 %) - Phương pháp (Javen 5% có bổ sung tween 20 30 phút): Callus lên nhanh, vàng đẹp, tơi xốp đĩa cấy xuất nhiều nấm, tỉ lệ callus thấp (25%) 56 - Phương pháp (Javen 50% có bổ sung tween 20 20 phút): Callus lên nhanh, vàng đẹp, tơi xốp, nấm khuẩn, tỉ lệ callus cao (98%) - Phương pháp (Oxi già 15% 15 phút): Callus lên kém, kích thước nhỏ, có viền đen, nấm khuẩn tỉ lệ tạo callus thấp (30%) Bảng Số liệu thống kê tỉ lệ tạo callus sau sử dụng phƣơng pháp khử trùng khác Thí nghiệm Lần 1(%) Lần 2(%) Lần 3(%) Tỉ lệ trung bình(%) 38 22 99 34 40 24 98 30 42 29 97 26 40 ± 25 ± 3,6 98 ± 30 ± Phương pháp Phƣơng pháp Phƣơng pháp Phƣơng pháp Phƣơng pháp Hình 13 Biểu đồ so sánh hiệu phƣơng pháp khử trùng lên hạt lúa Pusa Basmati 57 A B C D Hình 14 Hình ảnh so sánh hiệu cách khử trùng hạt khác A – Khử trùng thủy ngân 0,1% 10 phút, B – Khử trùng Javen 5% 30 phút, C – Khử trùng Javen 50% 20 phút, D – Khử trùng Oxi già 15% 15 phút Sau trình khảo sát, nhận thấy với phương pháp khử trùng Javen 50% có bổ sung tween 20, callus lên nhanh, đẹp, nấm khuẩn, tỉ lệ tạo callus cao Vì vậy, chọn phương pháp khử trùng để sử dụng việc tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nghiên cứu Quy trình khử trùng sau: Hạt lúa sau bóc vỏ tráng với nước cất lần khử trùng khoảng 4-5 lần, sau lắc ngâm cồn 700 với thời gian phút, tráng lại với nước cất lần khử trùng 3-4 lần trước ngâm lắc nhẹ Javen 50% có bổ sung tween 20 20 phút Sau khử trùng, hạt tráng lại với nước cất lần khử trùng 4-5 lần, sau rải lên đĩa có lót giấy thấm khử trùng để làm khô trước đặt vào môi trường tạo callus 3.3.2 TỐI ƢU HÓA MÔI TRƢỜNG TẠO CALLUS 58 Hạt lúa sau bóc vỏ khử trùng đặt lên môi trường tạo callus Trong nghiên cứu sử dụng loại môi trường tạo callus với thành phần cụ thể sau: Môi trƣờng Thành phần(/l) MS L-proline Casein BAP Succarose L-glutamine 2,4-D MS1 MS2 MS3 4,08g 4,08g 2,878g 0,3g 30g 4,08g 0,65g 0,3g 0,1mg 30g 2mg 2,5mg 30g 0,5g 2mg Với loại môi trường, sử dụng 100 hạt lúa bóc vỏ khử trùng theo quy trình giống (thí nghiệm lặp lại lần) Kết thu sau: - MS1: Callus lên kém, kích thước nhỏ, không vàng, phần lớn xuất viền đen, tỉ lệ 20 % - MS2: Callus lên chậm, khoảng 15 ngày đạt kích thước mong muốn, tơi xốp, vàng đẹp, có viền đen, tỉ lệ 95 % - MS3: Callus lên nhanh, khoảng 10 ngày đạt kích thước mong muốn, không tơi xốp, không xuất viền đen, tỉ lệ 70 % Bảng Số liệu thống kê tỉ lệ tạo callus môi trƣờng khác MS1 MS2 MS3 Lần 1(%) 18 93 68 Lần 2(%) 18 96 70 Lần 3(%) 24 96 72 59 Tỉ lệ trung bình(%) 20 ± 3,46 95 ± 1,7 70 ± Hình 15 Biểu đồ so sánh hiệu loại môi trƣờng khác lên khả hình thành callus giống lúa Pusa Basmati A B C Hình 16 Hình ảnh so sánh callus môi trƣờng khác A – Môi trƣờng MS1, B – Môi trường MS2, C – Môi trường MS3 3.3.3 TỐI ƢU HÓA MÔI TRƢỜNG TÁI SINH Tái sinh giai đoạn quan trọng trình chuyển gen, để callus chuyển gen phát triển thành hoàn chỉnh đòi hỏi phải có môi trường với thành phần phù hợp cho việc phát triển Vì tiến hành tối ưu môi trường tái sinh cho giống lúa Pusa Basmati trước tiến hành chuyển gen quan tâm vào giống lúa 60 Các loại môi trường tái sinh sử dụng để nghiên cứu TS1, TS2 TS3 với thành phần cụ thể sau: Môi trƣờng Thành phần(/l) MS Casein Sorbitol BAP Kinetin Saccarose NAA L-proline TS1 TS2 TS3 4,08g 0,3g 10g 2mg 0,5mg 30g 0,2mg 4,08g 0,3g 4,08g 0,3g 3mg 1mg 30g 0,25mg 0,65g 3mg 30g 1,5mg Ở loại môi trường đặt 100 callus chưa chuyển gen để nghiên cứu phát triển callus hiệu suất tái sinh loại môi trường Sau tuần tái sinh, kết thu sau: - Môi trường TS1: Cây lên chồi kém, tỉ lệ 25% - Môi trường TS2: Cây lên chồi tốt, tỉ lệ 80% - Môi trường TS3: Cây lên chồi môi trường TS2, tỉ lệ 45% Bảng Số liệu thống kê tỉ lệ tái sinh môi trƣờng tái sinh khác TS1 TS2 TS3 Lần 1(%) 25 77 44 Lần 2(%) 27 79 46 61 Lần 3(%) 24 84 45 Tỉ lệ trung bình(%) 25±1,5 80±3,6 45±1 Hình 17 Biểu đồ so sánh hiệu môi trƣờng tái sinh giống lúa Pusa Basmati B A C Hình 18 Hình ảnh so sánh mức độ tái sinh giống lúa Pusa Basmati loại môi trƣờng A- Môi trường TS1 B- Môi trường TS2, C- Môi trường TS3 Do hiệu suất tái sinh môi trường TS2 lớn nhất, chọn môi trường TS2 làm môi trường tái sinh chuyển gen 3.3.4 CHUYỂN GEN OsNAC6 VÀO GIỐNG LÚA PUSA BASMATI THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA 105 Để chuyển gen OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati tiến hành lây nhiễm callus với vi khuẩn Agrobacterium EHA105 mang gen OsNAC6 Toàn trình lây nhiễm tiến hành mục 2.2.5.3 Từ 100 hạt lúa đem vào nuôi cấy môi trường MS2, thu 95 callus sử dụng số lượng 62 callus để tiến hành lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium li tâm hòa tan lại 30ml môi trường MS lỏng (bảng 10) có bổ sung 30µl acetosyringone 10mg/ml, sau callus đặt môi trường đồng nuôi cấy (bảng 10) giữ tối nhiệt độ 280C vòng ngày Sau ngày, callus rửa với 800 ml nước đường có bổ sung 0,8ml kháng sinh cefotaxim 1mg/ml để loại bỏ vi khuẩn lại đặt lên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Hyromycine (bảng 10) Bảng 10 Thành phần môi trƣờng đƣợc sử dụng nghiên cứu Môi trƣờng Thành phần MS Vitamine MS 2,4- D L-proline Casein Sucarose BAP Agar Acetocyrigone Hygromycine pH MS lỏng Đồng nuôi cấy Chọn lọc Ra rễ 4,08g 4,08g/l 10ml/l 2,5mg/l 0,65g/l 0,3g/l 30g/l 0,1mg/l 8g/l 1ml/l 4,08g/l 10ml/l 2,5mg/l 0,65g/l 0,3g/l 30g/l 0,1mg/l 8g/l 2,04g/l 10ml/l 30g 5,8 5,2 1ml/l 5,8 0,65g/l 0,3g/l 30g/l 8g/l 5,8 Sau 15 ngày môi trường chọn lọc, có 20 callus sống sót chuyển sang môi trường tái sinh 20 callus sống sót sau giai đoạn chọn lọc đưa vào tái sinh môi trường TS2 có bổ sung kháng sinh Hygromycine Sau tuần tái sinh, thu 12 cụm callus có chồi sinh trưởng bình thường Các lúa non phát triển tốt chuyển sang môi trường rễ (bảng 10) Sau 10 ngày, chuyển sang cốc đất nuôi điều kiện phòng nuôi cấy có phủ nilon tuần lại chuyển tiếp sang xô to trồng điều kiện bên môi trường 63 A C B D D F E F F Hình 19 Hình ảnhAcallus qua giai đoạn từ giai đoạn đặt hạt đến giai đoạn chọn lọc A – Callus môi trường tạo callus, B - Callus môi trường Đồng nuôi cấy, C - Callus sống sót môi trường chọn lọc, D – Callus môi trường tái sinh, E – Cây chuyển gen môi trường rễ, F – Cây chuyển gen đưa môi trường 3.3.5 KIỂM TRA CÂY CHUYỂN GEN 3.3.5.1 Tách chiết ADN tổng số A Tách chiết tinh ADN tổng số từ thực vật nói chung lúa nói riêng công việc thao tác công nghệ ADN thưc vật Tuy nhiên, đối tượng thực vật lại có phương pháp tách chiết ADN khác Trong thí nghiệm khảo sát hai phương pháp tách chiết ADN tổng số lúa sử dụng phổ biến: (1) phương pháp 64 Saigai-Maroof CS, 1994 [50]; (2) phương pháp Rajendrakumar CS, 2007 [48] Kết cho thấy, hai phương pháp tách chiết cho sản phẩm ADN tổng số có chất lượng tương tự (Số liệu không minh hoạ) Tuy nhiên phương pháp Rajendrakumar CS tiết kiệm hoá chất thời gian Vì sử dụng phương pháp cho thí nghiệm tách chiết ADN tổng số Sau tuần nuôi cấy môi trường tái sinh có bổ sung Hygromycine, 12 dòng lúa sống sót tiến hành lấy mẫu non để tiến hành tách chiết ADN tổng số Hình 20 kết ADN tổng số tách chiết phương pháp Rajendrakumar CS, điện di gel agarose 0,8% Mười hai mẫu ADN tổng số quan sát gel agarose tiến hành đo nồng độ ADN máy quang phổ hấp phụ bước sóng OD260 sau pha loãng để đưa nồng độ chuẩn 20 ng/μl Hình 20 Hình ảnh ADN tổng số từ dòng lúa chuyển gen agarose 1% - 12: ADN Các dòng lúa Pusa Basmati chuyển gen 3.3.5.2 Kiểm tra xuất gen OsNAC6 dòng lúa chuyển gen phản ứng PCR Về nguyên tắc, 12 dòng lúa sinh trưởng tốt môi trường chọn lọc chứa hygromycine dòng lúa chuyển gen OsNAC6 Tuy nhiên, để khẳng định xác tồn gen OsNAC6 dòng lúa chuyển gen này, tiến hành phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn ADN tổng số tách chiết từ dòng lúa chuyển gen cặp mồi đặc hiệu Ubi-F/NOS-T50 Khi sử dụng cặp mồi này, sản phẩm PCR dự kiến có kích thước khoảng 1,3 kb hai mồi 65 cách xa vùng mã hoá gen OsNAC6 khoảng 150-bp Phản ứng PCR thực hỗn hợp phản ứng 25 µl chứa 20 ng ADN tổng số, 10 pmol primer, 10 mM dNTPs, 1x đệm 0,3 µl Taq ADN polymerase với chu kỳ nhiệt sau: 940C - phút, 30 chu kỳ ( 940C - 45 giây, 550C - 45 giây, 720C - 60 giây), kéo dài phút 720C Kết hình 24 sản phẩm phản ứng PCR điện di gel agarose 1% để kiểm tra tồn gen OsNAC6 12 dòng lúa chuyển gen Trong số 12 dòng lúa chuyển gen, có dòng không cho sản phẩm PCR, lại 11 dòng cho sản phẩm PCR băng ADN có kích thước khoảng gần 1300-bp, với kích thước dự đoán (hình 21) Từ kết kiểm tra xuất gen OsNAC6 dòng lúa chuyển gen phản ứng PCR cho phép đến kết luận có 11 dòng lúa Pusa Basmati chuyển gen OsNAC6 1,3 kb Hình 21 Điện di sản phẩm nhân gen mã hoá nhân tố phiên mã OsNAC6 dòng lúa Pusa Basmati chuyển gen M: Thang ADN chuẩn 1kb; 1: Đối chứng dương; 2: Đối chứng âm; - 14: Các dòng lúa chuyển gen 66 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết trình nghiên cứu trình bày trên, rút số kết luận sau: 4.1.1 Đã phân lập gen OsNAC6 từ thư viện cDNA giống lúa Japonica Gen OsNAC6 có trình tự nucleotit tương đồng 100% so với trình tự nucleotit gen OsNAC6 giống lúa Japonica ngân hàng GenBank(mã số: AB028185.1), 93% với nhân tố phiên mã NAC ngô (mã số: EU956242.1) 91% với nhân tố phiên mã NAC bạc hà đắng (mã số: AM500854.1) 4.1.2 Đã thiết kế vector chuyển gen mang gen OsNAC6 theo thống gateway Vector pBCKH-OsNAC6 có khung vector pBI101 promoter Ubiquitine điều khiển liên tục biểu gen, thích hợp cho việc chuyển gen lúa nói riêng thực vật nói chung 4.1.3 Bước đầu xây dựng thành công qui trình chuyển gen OsNAC6 thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào giống lúa Pusa Basmati Đã tối ưu phương pháp khử trùng hạt đạt hiệu 98%, đồng thời tối ưu môi trường tạo callus đạt hiệu 95% môi trường tái sinh đạt hiệu 80% cho giống lúa Pusa Basmati Từ 100 hạt đưa vào môi trường tạo callus thu 12 dòng chuyển gen sinh trưởng tốt môi trường tái sinh chọn lọc có bổ sung hygromycin Kết kiểm tra có mặt gen OsNAC6 dòng lúa chuyển gen việc sử dụng phản ứng PCR đặc hiệu cho thấy, số 12 dòng lúa chuyển gen có 11 dòng mang gen OsNAC6, chứng tỏ hiệu suất chuyển gen OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati 11% 67 4.2 KIẾN NGHỊ 4.2.1 Tiếp tục nghiên cứu biểu gen OsNAC6 dòng lúa chuyển gen thông qua thí nghiệm Northern blot, Real-time PCR… 4.2.2 Nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh trưởng, khả chịu hạn nói chung stress nói riêng dòng lúa chuyển gen OsNAC6 so với giống đối chứng 4.2.3 Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen hoàn thiện quy trình chuyển gen OsNAC6 vào giống lúa Việt Nam, đặc biệt giống lúa Indica 4.2.4 Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen OsNAC6 vào đối tượng trồng nông nghiệp khác ngô, bông, đậu tương… để nghiên cứu biểu gen tìm kiếm khả áp dụng 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học Công nghệ Nguyễn Ánh Hồng (2000) Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật, Giáo trình cho Cao học Nông nghiệp NXB Nông nghiệp Hà Nội Trần Thị Phương Liên (1998), “Chuyên đề 3: Cơ chế phân tử tính chịu hạn thực vật” Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abe H., Urao T., Ito T., Seki M., Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K (2003), “Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and At MYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisis acid signaling”, Plant Cell, 15, pp 63-78 Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997) Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant Plant Cell 9: 841-857 Alamillo JM, Bartels D (2006), “Light and stage of development influence the expression of desiccation-induced genes in the resurrection plant Craterostigma plantagineum”, Plant Cell Environ, 19,pp 98-105 Baker, S S (1994), “The 5‟-region of Arabidopsis thailiana cor15a has cisacting element that confer cold, drought and ABA regulated gene expression”, Plant Mol Biol 24, pp 701-713 69 10 Bartels D., Sunkars R (2005), “Drought and salt tolerance in plant”, Critical review in plant science, 24, pp 23-58 11 Bohnert H.L., Jesen R.G (1996), “Strategies of engineering water stress tolerance in plants” Tibtech, 14, pp 89-97 12 Bohnert HJ, Nelson DE, Jensen RG (2005), “Adaptations to environmental stresses”, Plant Cell 7, pp.1099–111 13 Celebi-Toprak F., Behnam B., Serrano G., Kasuga M., Yamaguchi-Shinozaki K., Naka H., Watanabe JA., Yamanaka S and Watanabe KN (2005), “Tolerance to salt stress of the transgenic Tetrasomic Tetraploid Potato, Solanum tuberosum cv Desiree appears to be induced by the DREB1A gene and rd29A promoter of Arabidopsis thaliana” Breeding Sciences, 55, pp 311-319 14 Collinge, M Boller, T (2001) Differential induction of two potato genes, Stprx2 and StNAC1, in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding Plant Mol Biol 46: 521-529 15 Choi H., Hong JH., Ha J., Kang JY., Kim SY., (2000), “ABFs, a family of ABA responsive element binding factors”, Journal of Biological Chemistry, 275, pp 1723-1730 16 Daniels MJ, Mirkov TE, Chrispeels MJ (2004), “The plasma membrane of Arabidopsis thaliana contains a mercury-insensitive aquaporin that is a homolog of the tonoplast water channel protein TIP”, Plant Physiol, 106, pp.1325–33 17 DeClercq J., Zambre M., Van M M., Dillen W and Angenon G (2002), “An optimized Agrobacterium - mediated transformation procedure for Phageolus acutifolius A.Gray”, Plant Cell Rep, (21), pp 333 – 340 70 [...]... gen OsNAC6 t th vin bng k thut PCR Da vo trỡnh t nucleotide ca gen OsNAC6 c cụng b trờn ngõn hng gen, chỳng tụi tin hnh thit k cp mi c hiu OsNac6- F /OsNac6- R (bng 1) nhõn trỡnh t nucleotide mó húa gen OsNAC6 Mi OsNac6- F gm 27 nucleotide; gm trỡnh t nhn bit ca enzym gii hn BamHI u 5, 15 nucleotide vựng khụng mó húa gen u 5 v 5 nucleotide vựng mó húa gen bt u t trỡnh t khi u dch mó (ATG) u 3 Mi OsNac6- R... tớnh gen OsNAC6 v cho kt qu l cỏc cõy lỳa chuyn 18 gen tng cng tớnh chu hn, mn, lnh c bit, ngoi vic tng cng tớnh chng chu vi bt li thi tit, cõy lỳa chuyn gen OsNAC6 cũn tng cng tớnh khỏng bnh bc lỏ so vi cõy i chng [42] Gn õy, gen NAC lỳa ONAC045 cng c cụng b liờn quan n tớnh chng chu vi iu kin bt li mụi trng Gen ONAC045 nh v nhõn v biu hin mnh trong iu kin hn, mn, lnh v x lý ABA Cõy lỳa chuyn gen. .. húa cỏc gen tham gia vo tớnh chu hn [66] Gen OsMAPK5 cng ó c phõn lp v nghiờn cu c tớnh lỳa Biu hin gen OsMAPK5 trong cõy lỳa chuyn gen tng cng tớnh chu hn, mn v lnh trong khi c ch s biu hin ca gen OsMAPK5 trong cõy chuyn gen tng cng tớnh khỏng cao vi cỏc bnh o ụn (Magnaporthe grisea), bnh thi ht do vi khun (Burkholderia glumae) Kt qu ny m ra tim nng ỏp dng gen OsMAPK5 trong cỏc cõy chuyn gen nhm... th tớnh chu hn vi cỏc cõy lỳa chuyn gen pdh45 1.5 CC PHNG PHP CHUYN GEN VO THC VT Hin nay cú nhiu phng phỏp chuyn gen vo thc vt Tuy nhiờn nhng phng phỏp cú giỏ tr thc tin quan trng ch hn ch trong hai nhúm phng phỏp chớnh: chuyn gen trc tip v chuyn gen giỏn tip thụng qua vi khun t Agrobacterium 1.5.1 CC PHNG PHP CHUYN GEN TRC TIP 23 Chuyn gen trc tip l k thut chuyn gen thụng qua tip nhn ADN tinh ch vo... chuyn mt s gen chỳng mang vo cõy trng c coi l hin tng chuyn gen t nhiờn Khi cỏc nh nghiờn cu thnh cụng trong vic s dng on T-ADN ca Ti-plasmid a gen thõm nhp vo h gen ca t bo thc vt thỡ vic chuyn gen thụng qua Agrobacterium tr thnh cụng c rt hu hiu trong cụng ngh gen thc vt S khỏm phỏ ny ó m ra mt hng chuyn gen mi vo thc vt Agrobacterium cú 3 thnh phn di truyn cn thit cho quỏ trỡnh chuyn gen: - Vựng... l Pakistan Ging lỳa Basmati l ngun phỏt trin ch yu trong lnh vc nụng nghip trng lỳa khu vc Punjab Ht go basmati di hn hu ht cỏc loi go khỏc, khi ó nu chớn cú c im c trng l ht go ri ch khụng dớnh Cm nu bng go basmati cú th c xỏc nh bi mựi thm ca nú Go Basmati hin nay cú hai loi: trng v nõu Hin nay cú mt s dũng lỳa basmati nh: cỏc dũng truyn thng bao gm Basmati- 370, Basmati- 385 v Basmati- Ranbirsinghpura... dũng lai ging bao gm Pusa Basmati 1 (cũn c gi l 'Todal', bi vỡ ht cú rõu u), cỏc dũng go thm cú ngun gc t ging basmati c nhng khụng c xem l ging basmati tht, nh PB2 (cũn gi l sugandh-2), PB3 v RH-10 Ging lỳa Pusa Basmati- 1(PB1) ó c cỏc nh khoa hc ti Vin Nghiờn cu Nụng nghip n , New Delhi a vo nghiờn cu v chng minh kh nng nhn gen tt v tr thnh ging mụ hỡnh ca n trong lnh vc chuyn gen thc vt õy cng l... khin cỏc gen tng cng tớnh khỏng hn lm cho cỏc gen ny biu hin mnh v kt qu l cõy chuyn gen cú tớnh khỏng rt cao vi iu kin hn Cỏc phõn tớch ADN microarray v s liờn quan gia biu hin ca cỏc gen iu khin quỏ trỡnh phiờn mó thuc nhúm NAC vi biu hin ca cỏc gen liờn quan n tớnh khỏng hn cng ó a ra kt lun l khi cỏc gen iu khin quỏ trỡnh phiờn mó biu hin trong cõy chuyn gen ó hot hoỏ s biu hin ca mt s gen chc nng... chuyn gen [67] Trờn cõy mụ hỡnh Arabidopsis, biu hin ca gen ABF3 hoc AREB2/ABF4 dn n cõy chuyn gen tng cng tớnh khỏng hn [32], trong khi ú biu hin ca gen ABF2 dn n cõy chuyn gen tng cng tớnh khỏng hn, mn v nhit cao[34] b Nhúm nhõn t MYB v MYC Hai gen iu khin quỏ trỡnh phiờn mó Arabidopsis cú tờn gi l AtMYC2 v AtMYB2 cng c cụng b bỏm vo trt t ADN c hiu MYC (CANNTG) v MYB (C/TAACNA/G) trờn on iu khin gen. .. Ti-plasmid v T-ADN Phng phỏp chuyn gen giỏn tip thụng qua vi khun Agrobacterium c s dng rng rói v hiu qu do: - S bn sao ca gen c chuyn vo t bo thc vt thp Do võy, gim ti thiu s khụng biu hin ca gen c chuyn, tng kh nng chuyn gen bn vng, hiu qu chuyn gen cao - Trỏnh c s hỡnh thnh ca cỏc cõy chuyn gen khm - K thut n gin d thc hin 1.6 TèNH HèNH NGHIấN CU CHUYN CC NHN T PHIấN M IU KHIN GEN LIấN QUAN N TNH CHU HN ... tn cụng [7; 14] Cú ớt nht 100 gen NAC h gen Arabidopsis v 75 gen NAC h gen lỳa ó c phõn lp nhng ch mt s ớt 17 gen NAC c nghiờn cu chc nng [46] Phn ln protein ca gen NAC cha ng vựng bỏm ADN tn... nh sau: - Phõn lp gen mó húa nhõn t phiờn mó OsNAC6 iu khin tớnh chu hn lỳa - Tp trung ti u hoỏ quy trỡnh chuyn gen v thao tỏc di truyn trờn cõy lỳa - To cõy lỳa chuyn gen OsNAC6 cú kh nng chng... hỏn Nhúm gen nhn, truyn tớn hiu (G protein, Kinase) Cỏc gen iu khin biu hin Cỏc nhõn t u phiờn mó Cỏc gen chc nng (DREB, NAC, ZFHD, AREB, MYB, MYC, ) biu hin Cỏc gen chc nng (late embryogenesis