Tài liệu môn Nhập môn công nghệ sinh học

LỜI MỞ ĐẦU 4 NỘI DUNG 4 I. Khái niệm và phân loại: 4 II. Sự phát triển của test kit: 6 III. Cơ chế chẩn đoán miễn dịch: 7 1. Bản chất của sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể: 7 2. Phương pháp ELISA: 8 3. Phân loại ELISA: 10 3.1. Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 10 3.2. ELISA gián tiếp 11 3.3. Sandwich ELISA 12 3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp 13 3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp 14 3.4. Phản ứng ức chế cạnh tranh 14 3.4.1. Direct CElisa: Kiểm tra kháng nguyên 15 3.4.2. Direct CElisa: Kiểm tra kháng thể 17 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA 17  Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch 18 IV. Cơ chế chẩn đoán phân tử: 20 1. Kỹ thuật PCR: 20 2. Quy trình kỹ thuật: 21 3. Phương pháp RTPCR (PCR ngược) 21 4. Một số phương pháp chẩn đoán phân tử khác 23

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG TIỂU LUẬN MÔN: NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Test Kit Nhóm Chiều thứ 6, tiết 11-12 GVHD: Trần Hoàng Ngâu Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016 DANH SÁCH THÀNH VIÊN VÀ PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ Họ tên Phan Thị Băng Trâm MSSV 2008130142 Trần Hoài Nam 2008130116 Nguyễn Cao Thủy Tiên 2008140314 Vũ Thị Xuân Hiền 2008140083 Nhiệm vụ -Tìm phần khái niệm phương pháp miễn dịch -Tổng hợp -Tìm phần phương pháp miễn dịch -Tìm phần phương pháp phân tử -Tìm phần phương pháp phân tử Ghi Nhóm trưởng Hoàn thành Hoàn thành Hoàn thành Hoàn thành MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Trong sống đại, việc bảo vệ sức khỏe vấn đề quan tâm Vì việc sử dụng công cụ để dễ dàng việc dự đoán bệnh hay vấn đề thường gặp cần thiết Test kit công cụ Thuật ngữ “test kit” không dùng phổ biến, nhắc tới sản phẩm lại quen thuộc Test kit dùng nhiều lĩnh vực công nghiệp hay nông nghiệp Ngoài loại test kit gần gũi mà ta biết viết trình bày thêm số loại Hơn nữa, viết đề cập tới chế hoạt động chung số loại test kit - loại liên quan tới ngành công nghệ sinh học y dược Bài viết làm rõ số vấn đề liên quan tới test kit để ta hiểu rõ công dụng chế chúng Qua đó, chọn cho test phù hợp để sử dụng Bài viết bao gồm phần: - Khái niệm phân loại Sự phát triển test kit Cơ chế chẩn đoán miễn dịch ứng dụng Cơ chế chẩn đoán phân tử ứng dung Bài viết tham khảo nhiều tài liệu khác nên chắn có thiếu sót Mong nhận thông cảm góp ý Xin cảm ơn! NỘI DUNG I Khái niệm phân loại: 1.Khái niệm: Test kit hiểu nôm na kiểm tra Nó công cụ để kiểm tra vấn đề cụ thể cách lấy lượng nhỏ mẫu chờ xem kết thời gian ngắn 4 Tesst kit không sản phẩm nhỏ gọn bán thị trường ta thấy mà kiểm tra/chẩn đoán bệnh viện hay phòng thí nghiệm gọi test kit Hiện chúng thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, độ xác cao Những sản phẩm đưa thị trường nước ta phần nhỏ thông dụng que thử thai, đo pH, test nhóm máu, test nước, hóa chất thực phẩm… Nhưng nước phát triển có loại test kit phát số bệnh tiểu đường, viêm gan B/C, test vi khuẩn, test DNA, thuốc…thậm chí test HIV 2 Phân loại: Có nhiều phương pháp sử dụng test kit, phương pháp phổ biến sử dụng ngành công nghệ sinh học y dược ngành khác phương pháp chẩn đoán phân tử phương pháp chẩn đoán miễn dịch Người bị nghi nhiễm bệnh Lấy mẫu máu, phân, nước tiểu, sinh thiết… Tăng sinh vi sinh vật Bổ sung môi trường phù hợp Phân lập Nhận dạng thông qua phụ thuộc tăng trương, miễn dịch hoăc phân tử Xét nghiệm kháng thể: tìm kháng nguyên vi sinh vật/virus, sử dụng kháng thể huỳnh quang, EIA… Phương pháp phân tử miễn dịch Xết nghiệm phân tử: tìm gen gây nguồn bệnh chính,lai hóa nucleic acid, PCR • Phương pháp chẩn đoán miễn dịch, điển hình ELISA: Test kit ELISA giúp cung cấp kết xác, nhạy cảm quán Mỗi đầu dò protein nghiên cứu dụng cụ điều chỉnh để cung cấp đọ nhạy cảm mặt sinh lý có liên quan Ngoài ra, dụng cụ xác nhận sử dụng loại mẫu phổ biến, bao gồm huyết thanh, huyết tương dịch nuôi cấy tế bào Lysates (dịch phân giải) di động sử dụng để xác nhận dụng cụ phát protein truyền tín hiệu phosphoryl hóa Ưu điểm kit ELISA:  Dùng 800 đối tượng khác  Tối ưu hóa cho hiệu suất nhạy, xác quán  Kết có 2,5 - 4h  Xác định với nhiều loại mẫu • Phương pháp chẩn đoán phân tử, điển hình PCR RT-PCR: Từ khuôn DNA nhỏ giot máu, sợi tóc hay tế báo… người ta khuếch đại xác, trật tự lớn lên đến hàng triệu nhằm phục vụ cho trình khảo sát phản ứng PCR ứng dụng rộng rãi y học : chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV ung thư cổ tử cung, gen APC ung thư đại tràng, gen BRC1 – BRCA2 ung thư vú, gen TPMT bệnh bạch cầu trẻ em, gen NF-1,2 u xơ thần kinh…), nghiên cứu kháng nguyên bạch cầu người… Trong vi sinh vật PCR phương tiên hưu dụng để phát tác nhân gây bệnh II Sự phát triển test kit: 1960s and earlier 1980’s to 1990’s 1983 1991 1997 2000 2002 2003 Phát nhiều dấu ấn sinh học xét nghiệm chẩn đoán bệnh mầm bệnh Xét nghiệm miễn dịch phát triển Những công ty dược bán mua công ty chẩn đoán, hơp thành đối thủ lớn Công nghệ PCR sử dụng nhiệt Tag polymerase enzyme để khuếch đại đoạn DNA, công cụ nghiên cứu công nghệ sinh học phát triển toàn giới Ra sản phẩm microarray FDA phê chuẩn việc bán thuốc thử cần phân tích cho phòng thí nghiệm ủy quyền Hoàn thành công trình nghiên cứu gen người Phòng thí nghiệm tự động, công nghệ microaray tăng, thương mại hóa Khởi động đề án đồ haplotype (SNPs)(dự án HAPMAP) FDA tổng hợp hướng dẫn để sử dụng markers sinh học thử nghiệm lâm sàng 6 Biểu đồ phát triển thị trường chẩn đoán ống nghiệm (IDV) toàn cầu năm 2012, tỉ lệ nhu cầu cầu chẩn đoán (theo Genetic Engineering News) Top 10 công ty IVD (in vitro diagnostics) có doanh thu lớn năm 2007(theo top 10 Global In-vitro Diagnostics Business Insights) III.Cơ chế chẩn đoán miễn dịch: Bản chất kết hợp kháng nguyên kháng thể: Sự kết hợp kháng nguyên kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt kháng nguyên kháng thể Sự kết hợp xảy phần giwois hạn phần tử kháng nguyên (nhóm định) phần giới hạn phần tử kháng thể (trung tâm hoạt động) Theo Pauling, phẩn tử kháng thể thường hóa tri hai, nghĩa lúc kết hợp với hai phần tử kháng nguyên Còn kháng nguyên đa hóa trị nên lúc kết hợp với nhiều phần tử kháng thể Cho nên kháng nguyên kháng thể kết hợp với tạo thành phức hợp hình mạng lưới khong gian ba chiều Vì kích thước lớn nên phức hợp kết tủa ngưng kết Kháng nguyên kháng thể kết hợp với theo tỉ lệ phản ứng yếu thừa hoăc thiếu kháng nguyên kháng thể Phản ứng rõ rệt lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với phân tử kháng thể Sự kết hợp phần tử kháng nguyên kháng thể xảy nhờ lực như: lực liên kết ion nguyên tử nhóm hóa học mang điện tích trái dấu; lực liên kết cầu nối hydro nguyên tử hydro mang điện tích dương với nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls hai phân tử phụ thuôc vào tương tác đám mây điện tử mặt lực ố thủy diện tiếp xúc phía kháng nguyên kháng thể có acid amine ố thủy kháng nguyên kháng thể kết hợp, nước bị đẩy tạo nên lưc gắn kết acid amine ố thủy đó, kết hợp phản ứng hóa học Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu Một kháng nguyên kết hợp với kháng thể kích thích thể tạo thành Do phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể sử dụng để xác định kháng nguyên kháng thể hai phân tử biết Hiệu giá kháng thể huyết thành người động vật xác định nhờ kháng nguyên biết cho biết tiếp xúc trước với kháng nguyên Ngược lại nhờ kháng thể biết kháng nguyên khác vi sinh vật nhận mặt Mặt khác hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép lựa chọn thích đáng vi sinh vật dùng để làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng 8 Phương pháp ELISA: ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa dùng để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫ cần phân tích Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm thực phẩm Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có nhiều dạng mà đặc điểm chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme Khi cho thêm chất thích hợp (thường nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên thông qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát Phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi gọi tên gọi khác EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) kĩ thuật rẻ tiền an toàn mà đảm bảo độ xác ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể chất tạo màu; thực qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Là kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn hợp dung dịch thí nghiệm 9 (Trích từ Chemicon International) Phân loại ELISA: 3.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Direct ELISA: Đây dạng đơn giản phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) 10 Sơ đồ: Tiến trình thực phản ứng ELISA trực tiếp - Ưu điểm: Đơn giản - Nhược điểm: + Độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng nguyên có epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitope + Phải đánh dấu cho kháng thể chuyên biệt với đối tượng 3.2 ELISA gián tiếp Indirect ELISA: Phương pháp khác Direct ELISA chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không gắn enzyme mà mục tiêu gắn đặc hiệu kháng thể khác (kháng thể kháng thể gắn với enzyme) Sơ đồ : Tiến trình thực phản ứng ELISA gián tiếp - Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa - Nhược điểm: Độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng 3.3 Sandwich ELISA Đây dạng ELISA sử dụng phổ biến thực tiễn cho phản ứng mạnh nhạy Được gọi “sandwich” kết thí nghiệm đánh giá thông qua kết hợp hai loại kháng thể kháng thể bắt (capture antibodies) kháng thể phát (detection antibodies) Kỹ thuật phân làm hai dạng Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich) 11 DAS ELISA gồm dính thụ động kháng thể vào pha rắn (đáy giếng) Những kháng thể sau kết hợp với kháng nguyên thêm vào Những kháng nguyên pha loãng blocking buffer nhằm ngăn dính không chuyên biệt chúng vào pha rắn Ở đây, phần blocking buffer không nên chứa kháng nguyên mà kết hợp với kháng thể bắt Sau ủ rửa, phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn Kháng thể bắt sau thêm vào Do vậy, kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích kháng thể bắt Kháng thể thứ hai giống kháng thể khác nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể Sau ủ, rửa, thêm chất vào đọc máy đo quang phổ Vì sử dụng kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn tính chuyên biệt thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt Điều giới hạn linh hoạt phương pháp, ví dụ kháng thể sử dụng phải đánh dấu riêng (cho kháng nguyên khác nhau) Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn chuẩn bị kháng thể Hệ thống bị giới hạn chỗ kháng nguyên phải có hai epitope hai kháng thể bắt phát kết hợp trực tiếp với kháng nguyên Kháng thể bắt pha rắn kháng thể phát chống lại epitope khác phức hợp kháng nguyên Do đó, thuận lợi khảo sát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể phát kháng thể bắt khác Việc sử dụng kháng thể bắt phát dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí gắn kết sẵn có cho phát Kích thước mối quan hệ không gian epitope kháng nguyên đích quan trọng ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm Sandwich ELISA chia làm hai hệ thống: 3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp Sơ đồ :Tiến trình thực ELISA Sandwich trực tiếp - Ưu điểm: Có thể phát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát khác - Vì phương pháp có ưu điểm hẳn phương pháp khác mà chọn phương pháp để chẩn đoán bệnh virus nghiên cứu 12 Chú ý: sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát giống dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát Mối quan hệ kích thước vị trí không gian epitope có ảnh hưởng đến thử nghiệm 3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp Sơ đồ: Tiến trình thực phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp Chuyên biệt Direct sanwich ELISA antispecies kháng thể gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên 3.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai chất tham gia phản ứng lực bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng cạnh tranh đắn hai chất cạnh tranh phải đưa vào đồng thời Sự khác biệt ức chế cạnh tranh Cả hai phản ứng có tham gia hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên Nếu kháng thể ủ trước phản ứng gọi ức chế (blocking/ inhibition assays) Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai kháng thể thêm vàođồng thời với (hình 1) 13 Sự khác biệt ức chế cạnh tranh 3.4.1 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên bề mặt đĩa lượng kháng thể gắn enzyme chuẩn độ để tối ưu Kháng nguyên kháng thể gắn enzyme thêm vào đĩa lúc để tạo ưu cạnh tranh Nếu kháng nguyên tương tự kháng nguyên gắn đĩa kháng thể gắn enzyme gắn lên kháng nguyên Khi nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao ngăn cản kết hợp kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%) Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ : pha loãng) cạnh tranh giảm Như nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao độ hấp thu màu giảm Kháng nguyên cạnh tranh thêm trực tiếp vào đĩa pha loãng blocking buffer trước thêm kháng thể gắn enzyme Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan nồng độ phân tử cần kiểm tra kháng nguyên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng kháng nguyên) 14 Sau ủ rửa, lượng kháng thể đánh dấu định lượng sau thêm chất kháng nguyên mẫu kiểm tra hay tương đồng kháng nguyên gắn kết với kháng nguyên đánh dấu cạnh tranh với kháng nguyên Kết mẫu có chứa kháng nguyên cạnh tranh làm giảm cường độ màu đối chứng âm không Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên 15 3.4.2 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Sự cạnh tranh kháng thể mẫu kháng thể đánh với vị trí kháng nguyên đĩa Mẫu kháng thể đánh dấu trộn với trước thêm vào đĩa Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Các yếu tố ảnh hưởng đến kết ELISA • Nếu đối chứng âm cho kết dương tính nhiễm từ chất tạo màu từ kháng thể đánh dấu đối chứng bị nhiễm • Nếu màu không xuất đối chứng dương mẫu phải kiểm tra lại tất hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản • Nếu màu xuất thấp đối chứng dương mẫu kiểm tra phải kiểm tra lại kháng thể gắn enzyme nồng độ chất tạo màu 16 Nếu có tạo màu mẫu không tạo màu với đối chứng dương kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng điều kiện bảo quản • Khi chạy lại thử nghiệm điều kiện gặp cố nên thay đổi yếu tố thí nghiệm  Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch: nhiều test kit bệnh dấu hiệu người hều hết phương pháp Nguyên tắc: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu phân bố giấy sắc ký Kháng nguyên (KN) đặc thù vi sinh vật gắn cố định “vạch phản ứng” Khi nhỏ huyết cần xác định kháng thể (KT) lên sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) huyết kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu di chuyển giấy sắc ký bị giữ lại “vạch phản ứng” KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết “vạch phản ứng” màu Nếu huyết KT đặc hiệu, “vạch phản ứng” KN giữ KKT gắn màu, không màu Giới thiệu test kit xét nghiệm chẩn đoán viêm gan B (HbsAg) phương pháp sắc ký miễn dịch: + Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính phương pháp dòng chảy chiều để phát có mặt kháng nguyên vi rút Viêm gan B huyết huyết tương Màng kit thử phủ lớp kháng thể kháng HBsAg vùng kết Trong trình làm xét nghiệm, mẫu huyết huyết tương phản ứng với phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ mao dẫn, gặp phản ứng kết tủa màu với kháng thể kháng HBsAg lớp màng tạo vạch màu Sự có mặt vạch màu vùng kết kit thử cho biết kết dương tính, ngược lại trường hợp vạch màu kết âm tính Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, vạch màu luôn xuất vùng chứng (gọi vạch chứng) để khẳng định lượng mẫu đủ lớp màng thấm tốt • + Kết quả: • Dương tính: xuất hai vạch đỏ rõ rệt: vùng chứng gọi vạch chứng (C), vạch vùng kết gọi vạch kết (T) Lưu ý: độ đậm màu đỏ vạch kết (T) khác phụ thuộc vào nồng độ HBsAg có mẫu phẩm Vì vậy, độ mờ vạch kết (T) coi dương tính • Âm tính: xuất vạch chứng (C) Không thấy xuất vạch kết (T) dù đậm hay mờ • Kết qủa giá trị: không thấy xuất vạch chứng (C) Nguyên nhân thường gặp lượng mẫu phẩm không đủ thao tác xét nghiệm sai Đọc lại hướng dẫn làm lại xét nghiệm kit thử khác Nếu tình trạng cũ, liên lạc với đại lý phân phối để giải đáp  Giới thiệu test kit chẩn đoán HIV : 17 + Nguyên lý: dựa nguyên tắc thử nghiệm sắc ký miễn dịch in vitro để xác định định tính kháng thể kháng HIV tuýp huyết thanh, huyết tương máu toàn phần người Khi thêm mẫu thử mẫu pha loãng vào “sample pad”, mẫu di chuyển đến “conjugate pad” tái hỗn dịch với phức hợp kháng nguyên HIV tuýp - vàng cộng hợp làm khô “conjugate pad” Hỗn hợp di chuyển dọc theo màng tượng mao dẫn phản ứng với kháng nguyên HIV tuýp giữ cố định vùng phản ứng (ký hiệu T) Nếu kháng thể kháng HIV có mặt đủ mẫu thử, vạch màu vùng T xuất Nếu kháng thể kháng HIV không đủ mẫu thử vùng T không màu Mẫu thử tiếp tục di chuyển đến vùng chứng (ký hiệu C) tạo thành vạch có màu đỏ tím, cho thấy thử nghiệm tiến hành đúng, thích hợp kết có giá trị + Kết quả: âm tính: Nếu có vạch xuất vùng C Dương tính: Nếu xuất vạch vùng C vùng T (1 2) chứng tỏ thử nghiệm dương tính Không có giá trị chẩn đoán: Vùng C không xuất vạch cửa sổ kết sau tiến hành thử nghiệm, thử nghiệm xem giá trị Nguyên nhân bước tiến hành không que thử bị hư Khuyến cáo thử nghiệm lại mẫu que thử IV Cơ chế chẩn đoán phân tử: Kỹ thuật PCR: 18 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp khuếch đai nhanh nhiều đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp thực eppendoff thời gian ngắn ta có thê thu nhiều DNA Kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực : chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh gây bệnh, giải mã di truyền, tạo giống đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hóa sinh vật mức độ phân tử… Nói đến chẩn đoán bệnh, kỹ thuật chủ yếu dùng phòng xét nghiệm chưa thông dụng thị trường Nguyên tắc kỹ thuật PCR: tạo lượng lớn đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa sở hoạt động DNA-polymerase để tổng hợp sợi bổ sung Các yếu tố để thực phản ứng PCR bao gồm: - Sợi khuôn DNA cần biết trình tự nucleotide đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide - Hai đoạn mồi ngắn để xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA Là tín hiệu hướng (5’ → 3’) enzyme DNA-polymerase Mồi dài khoảng 20 nucleotide nucleotide hai đầu mồi không tự kết hợp với theo nguyên tắc bổ sung - Có đầy đủ loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP - Môi trường đệm cung cấp ion Mg nước tinh khiết enzyme RNase DNase - Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) Dung tích tổng số cho phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl Đặc điểm phản ứng PCR chọn lọc, nhạy nhanh Quy trình kỹ thuật: Bước - Thực qúa trình biến tính DNA nhiệt Đưa DNA vào dung dịch phản ứng (gồm thành phần cần thiết cho chép), tăng nhiệt độ dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30s÷1 19 phút Tại nhiệt độ này, phân tử DNA mạch kép bị tách (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi Bước - Thực phản ứng lai Sau bước 1, nhiệt độ hạ xuống từ từ nhỏ nhiệt độ Tm mồi, vào khoảng 37÷68°C thời gian lưu 30s÷1 phút Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuôn Mồi tổng hợp hóa học, có mồi ngược xuôi Người ta dựa vào trình tự nucleotide đầu 3’ khuôn để tổng hợp mồi Sau bổ sung DNApolymerase để kéo dài mồi Bước - Tổng hợp mạch hay gọi kéo dài (extension) - Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C vài chục giây đến phút để DNApolymerase tổng hợp sợi Trong thực tế, thời gian nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi DNA cần khuếch đại - Kết thúc chu kỳ từ DNA kép mẹ tổng hợp sợi DNA kép Cứ vậy, phản ứng xảy 25 đến 40 chu kỳ Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ trì 72°C khoảng từ đến 10 phút cho tất sợi đơn xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Sau hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm - Sản phẩm PCR kiểm tra cách chạy điện di gel agarose nồng độ từ 0,8%÷2% để phát đa hình đoạn DNA đặc thù, đoạn DNA bị thay đổi tác nhân (đột biến, tái tổ hợp) Phương pháp RT-PCR (PCR ngược) Nguyên tắc bản: Phản ứng RT-PCR thực chất phản ứng nhân đoạn giới hạn khuôn RNA, theo nguyên lý phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn thứ chép RNA khuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động enzyme chép ngược Giai đoạn thực 50÷55°C thời gian 30 phút Giai đoạn dùng DNA vừa chép làm khuôn cho phản ứng PCR, trình thực theo ba bưóc trình bày Sau phản ứng kết thúc, sản phẩm phản ứng PCR ngược giảm xuống 4°C để bảo quản sử dụng Để đánh giá phát sản phẩm PCR ngược người ta điện di gel agarose 0,8÷1% Và DNA chuẩn DNA λ cắt enzyme HindIII có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb  RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) 20 Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang phương pháp xác đáng tin cậy nhất, đắt Nguyên lý phương pháp đầu dò chuyển lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát (hiện tượng FRET) Đầu dò DNA hay RNA gắn đặc hiệu vào khu vực hai đoạn mồi để định lượng DNA chứa trình tự đầu dò, làm tăng đáng kể độ đặc hiệu, chí cho phép định lượng có mặt số sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu Khả cho phép làm thử nghiệm đa mồi sử dụng đầu dò đặc hiệu đánh dấu mầu khác Sơ đồ real-time PCR TaqMan Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang đầu (Reporter – 5’) chất chặn đầu (Quencher – 3’), vị trí gần chất mang chất chặn làm thuốc nhuộm huỳnh quang truyền lượng tới chất chặn gần không phát quang Khi taq polymerase hoạt động, enzyme có hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần chất mang chất chặn bị phá vỡ nên tượng FRET không xảy nữa, chất huỳnh quang không bị chặn, trạng thái tự nên phát quang tín hiệu phát quang máy đo lạiỀ Sản phẩm đích tăng lên sau chu kỳ phản ứng lượng chất huỳnh quang tự giải phóng tích tụ lại ngày nhiều PCR tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnh quang; Khi phản ứng bắt đầu, giai đoạn gắn mồi PCR, mồi đầu dò gắn đặc hiệu vào DNA đích; Quá trình tổng hợp chuỗi thực từ vị trí mồi, taq polymerase chạm vào đầu dò hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease enzyme phá hủy đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi chất chặn làm tăng lượng chất 21 huỳnh quang dạng tự Chất huỳnh quang đo máy real-time PCR, lượng tăng trung bình nhân chất huỳnh quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ sản phẩm sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) phản ứng Một số phương pháp chẩn đoán phân tử khác: Phương pháp lai phân tử (Hydrid) Phương pháp lai phương pháp khuếch đại tín hiệu sử dụng phổ biến để phát HPV (Human Papillomavirus), HCV (virus viêm gan C),… bệnh phẩm, dựa phát quang phản ứng hóa học phức hợp gồm kháng thể bị bắt giữ -dung dịch lai tín hiệu khuếch đại Hình phương pháp lai phân tử phát HPV Ví dụ phương pháp lai test kit phát HPV: • Hệ xét nghiệm II bắt giữ thể lai (Hybrid Capture II Test System) Có nhiều phương pháp lai ứng dụng phát HPV kỹ thuật lai bắt giữ (Hybrid Capture technology) kỹ thuật ứng dụng phổ biến Kit ứng dụng kỹ thuật lai bắt giữ để phát HPV hệ (second-generation HPV detection kitHCII) tập đoàn Diegene công bố US FDA công nhận vào năm 1999 kỹ thuật sử dụng nhiều lâm sàng Nguyên tắc kỹ thuật dựa tượng lai HPV DNA với đầu dò RNA đặc hiệu Đầu dò RNA đánh dấu phóng xạ không đánh dấu phóng xạ Phức hợp lai DNA-RNA phát kháng thể đặc hiệu gắn alkaline phosphatase máy miễn dịch huỳnh quang Mỗi phức hợp lai phát tín hiệu huỳnh quang (relative light unit - RLU), số lượng tín hiệu huỳnh quang tương ứng lượng DNA đích mẫu bệnh phẩm 22 Kit HCII sử dụng mồi DNA đặc hiệu 13 type HPV “nguy cao”: HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68 type HPV “nguy thấp”: 6, 11, 42, 43, 44 Lai bắt giữ xét nghiệm có độ nhạy cao có khả phát 1pg/µl DNA HPV16, tương ứng với 105 đoạn gen chép • Phương pháp lai Southern-blot Nguyên tắc lai Southern-blot dựa khả tiếp nhận DNA màng lai nitrocellulose Sự đời phương pháp điện di gel cho phép phân tách đoạn DNA cắt enzym cắt giới hạn dựa kích thước chúng phương pháp chuyển DNA từ gel sang màng lai nitrocellulose sở cho đời phương pháp lai E.M Southern mô tả năm 1975 Lai Southern-blot phương pháp ứng dụng sớm phát HPV Đây phương pháp có độ nhạy cao, cho phép phát đoạn DNA đích sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ (hệ thống phát enzym) Các điều kiện cho trình lai kiểm soát thời điểm khác sau trình lai cách thay đổi nhiệt độ nồng độ muối Một số ứng dụng test kit: • Bộ kit RT-PCR phát virus gây bệnh đốm trắng tôm: người ta tách đoạn gen đặc hiệu virus gây bệnh đốm trắng thiết kế cặp mồi để nhân đoạn lên Sau điện di thấy có băng thích hợp chắn tôm bị nhiễm bệnh • Bộ kit phát virus zika: Kit có độ đặc hiệu cao, mồi trình tự bắt cặp có độ tương đồng 100% so với trình tự gene Virus Zika dựa phân tích kỹ lưỡng gene virus 23 • Bộ kit chẩn đoán virus HPV: phát 23 kiểu gen khác HPV thông qua phương pháp PCR kết hợp với phương pháp khác KẾT LUẬN Sức khỏe ngày quan tâm phát triển test kit vô cần thiết quan trọng Trên hầu hết phương pháp dùng test kit, nhiều phương pháp khác, chí kết hợp nhiều phương pháp với Bài viết nêu phần số phương pháp sử dụng quy trình hay sản phẩm phương pháp phương pháp phổ biến dùng công nghệ sinh học y dược 24 Có thể phương pháp nêu nêu chưa đầy đủ nói phần quan trọng, giúp người đọc hiểu test kit chúng sử dụng nào, đâu Ngoài ra, viết có số sản phẩm cụ thể cho phương pháp, nhiều sản phẩm khác Ở Việt Nam loại test kit hạn chế sản phẩm thị trường giá thành nhu cầu kiểm tra sức khỏe người thường xuyên không cao nước phát triển Hi vọng có sản phẩm Test kit phù hợp với điều kiện nước ta hơn, người quan tâm biến đổi thể để nhanh chóng phát chữa trị TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Văn Phùng (2001), Một số ứng dụng PCR vi sinh vật Tạp chí Y học thực hành 2011 Hoàng Văn Sơn (2002), Thành tự sinh học phân tử ung thư học Tạp chí Thông tin Y dược số Phạm Hùng Vân (1996), phản ứng chuỗi PCR, cách mang sinh học phân tử Nguyễn Lân Dũng, vi sinh vật học, NXB Giáo dục 1997 Genetic Engineering anh Biotechnology, ChoPra BL and Anwan N, 1990 Molecular Biotechnology, Glick BR and Jackj P, 1994 Phạm Thành Hổ, Di truyền học, NXB Giáo dục, 2000 [...]... nhanh chóng phát hiện và chữa trị TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Lê Văn Phùng (2001), Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật Tạp chí Y học thực hành 2011 2 Hoàng Văn Sơn (2002), Thành tự mới của sinh học phân tử trong ung thư học Tạp chí Thông tin Y dược số 2 3 Phạm Hùng Vân (1996), phản ứng chuỗi PCR, một cuộc cách mang trong sinh học phân tử 4 Nguyễn Lân Dũng, vi sinh vật học, NXB Giáo dục 1997 5 Genetic... phương pháp với nhau Bài viết chỉ nêu được một phần trong số các phương pháp được sử dụng trong các quy trình hay trong các sản phẩm nhưng các phương pháp này là các phương pháp phổ biến dùng trong công nghệ sinh học và y dược 24 Có thể các phương pháp được nêu trên đây nêu chưa được đầy đủ nhưng cũng nói được phần quan trọng, giúp người đọc có thể hiểu được thế nào là test kit và chúng được sử dụng như... (Hybrid Capture technology) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến nhất Kit ứng dụng kỹ thuật lai bắt giữ để phát hiện HPV thế hệ 2 (second-generation HPV detection kitHCII) do tập đoàn Diegene công bố và được US FDA công nhận vào năm 1999 là kỹ thuật được sử dụng nhiều hơn trong lâm sàng Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên hiện tượng lai HPV DNA với đầu dò RNA đặc hiệu Đầu dò RNA có thể được đánh dấu bằng phóng... trên bản giấy sắc ký Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại “vạch phản ứng” Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng” hiện màu Nếu trong... gian ngắn ta có thê thu được rất nhiều bản sao DNA Kỹ thuật này có thể được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực : chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh gây bệnh, giải mã di truyền, tạo giống mới và các đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử… Nói đến chẩn đoán bệnh, kỹ thuật này chủ yếu dùng trong các phòng xét nghiệm chứ chưa thông dụng ngoài thị trường Nguyên tắc... (Hydrid) Phương pháp lai là phương pháp khuếch đại tín hiệu được sử dụng phổ biến để phát hiện HPV (Human Papillomavirus), HCV (virus viêm gan C),… trong bệnh phẩm, dựa sự phát quang bằng phản ứng hóa học của phức hợp gồm kháng thể bị bắt giữ -dung dịch lai và tín hiệu được khuếch đại Hình phương pháp lai phân tử phát hiện HPV Ví dụ về các phương pháp lai trong các bộ test kit phát hiện HPV: • Hệ xét... lai Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuôn Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi Người ta còn có thể dựa vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi Sau đó bổ sung DNApolymerase để kéo dài mồi Bước 3 - Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài... Nguyễn Lân Dũng, vi sinh vật học, NXB Giáo dục 1997 5 Genetic Engineering anh Biotechnology, ChoPra BL and Anwan N, 1990 6 Molecular Biotechnology, Glick BR and Jackj P, 1994 7 Phạm Thành Hổ, Di truyền học, NXB Giáo dục, 2000 ... triển Những công ty dược bán mua công ty chẩn đoán, hơp thành đối thủ lớn Công nghệ PCR sử dụng nhiệt Tag polymerase enzyme để khuếch đại đoạn DNA, công cụ nghiên cứu công nghệ sinh học phát triển... ngành công nghệ sinh học y dược ngành khác phương pháp chẩn đoán phân tử phương pháp chẩn đoán miễn dịch Người bị nghi nhiễm bệnh Lấy mẫu máu, phân, nước tiểu, sinh thiết… Tăng sinh vi sinh vật... chóng phát chữa trị TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Văn Phùng (2001), Một số ứng dụng PCR vi sinh vật Tạp chí Y học thực hành 2011 Hoàng Văn Sơn (2002), Thành tự sinh học phân tử ung thư học Tạp chí Thông