KHOA SINH HỌC
d
LE QUANG HUNG
_KHAO SAT SU TANG TRUONG CUA TE BAO SUNG NGUOI TRONG DIEU KIEN
IN VITRO
KHOA LUAN CU NHAN KHOA HOC NGANH SINH HOC
CHUYEN NGANH SINH HOC DONG VAT
<Wười hướng dén khoa hoe
ThS TRAN LE BAO HA
Trang 2Em xin chân thành cảm ơn quỷ thây cơ đã nghiệm thu và
Trang 3Phĩ Giáo sư Tiến sĩ NGUYÊN TƯỜNG ANH
Trưởng Bộ mơn Động vật — Sinh ý Động vật — ĐHKHITN
Xin cảm on tam lịng nhiệt tình, tận tụy của người thầy
dang kinh đã dìu dắt chúng em trong quá trình học tập và
giờ đây thấy lại cĩ mặt cùng chúng em để giúp chúng em
bước lên bậc thang cuối cùng của đời sinh viên
Xin thầy nhận nơi chúng em tất cả lịng kinh trọng và biết
Trang 4Thac si PHAN KIM NGOC
Phĩ Bộ mơn Động vật — Sinh lý Động vật —- ĐHKHTN
Sự thành cơng cua đề tài gắn liên với tấm lịng nhiệt tình,
hăng say của người thầy đây trách nhiệm
Bước trên đường đời, lịng em mãi nghĩ đến cơng ơn của
người thầy kinh yêu
Trang 5Thac si TRAN LE BAO HA
Giảng viên Bộ mơn Động vật — Sinh ly Déng vat -DHKHTN
Kính cảm ơn cơ đã tận tình hướng dẫn em hồn thành
khĩa luận tốt nghiệp
Trang 6Củ nhán Võ Thị Bích Phượng C nhấn Phạm Văn Phúc
Cử nhân Nguyễn Huỳnh Trang Thi Cử nhân Vũ Tuân Trung
Bộ mơn Động vật và Sinh lý dong vat - DHKHTN
Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ em
Trang 7Bác sĩ LÊ VŨ CHÍ PHƯỚC
Giảng viên Bộ mơn Vì sinh ŸY học - TTĐT&BDCBYT
Bac si LE HOANG SON
Bac si chuyén khoa 1 — Bénh viện Da liéu T, p.HCM
Bác sĩ LỄ ĐÌNH HIẾU
Bác sĩ chuyên khoa l — Bệnh viện Nhán dán 115
Trang 8e Ban giảm hiệu Trường ĐH KHIN
e Phong dao tạo và các phịng ban
e Cùng tất cả các thầy cơ giảng day tai Khoa Sinh học, ĐH KH IN
Những người đã luơn quan tâm, dìu dat, tao moi điêu
kiện thuận lợi trang bị cho chúng em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt bốn năm học qua
Trang 9Hinh anh dua con ngay nao con bé bong, gio da lon khén bằng sự vun đắp mơ hơi, nước mắt, tình thương và sự che chở của cha mẹ
Hy sinh tất cả cuộc đời để nuơi dưỡng con, đổi lấy những
nếp nhăn với mái tĩc bạc để được nhìn con khơn lớn Sự
trưởng thành của con đã bước đi trên lịng hy sinh của cha me
Khơng cĩ lời biết ơn nao dé bay tỏ lịng con, chỉ biết
Trang 10Xin cam on bạn bè thương yếu đã cùng nhau chia sẻ
những vui buơn, những khĩ khăn và những thành quả suốt
bốn năm học qua Đặc biệt cám ơn các bạn Hà Thanh Qué,
Võ Lê Thải Hiến, Phan Thị Phượng, Truong Ngoc Uyén Dy,
Phạm Thị Phượng và Nguyễn Quang Tiến đã hết mình động viên va giup do toi
Hãy nhận nơi tơi những tình cảm tốt đẹp và chân thành
Trang 11MUC LUC IUv in e 5 1 MUC LUC ng nh ng ng v 1 Danh mục hình - - - : + < + c2 SE y v v 11 Danh mục bảng c1 v11 9 ng ng ng HH vn kh 1V Danh mục biểu đồ - s93 35135381 15351E813 5815115388118 TEESEEEEEEeEEESEErErkrrri V Các chữ viết tặt - 1 Là Cà S T11 TH TH 1113111111111 TT TH T11 71y0, VI
Chương I: ĐẶT VẤN ĐỀ G5 2à S T1 E11 7111311311151 1111k reo 1 Chương II: TƠNG QUAN TÀI LIỆỆU .- ¿5+ 55552252 £se£zxzsrzerres 2
HI.1 Đại cương VỀ địa - - - - s19 Ỳ cv 3y SE HT TT TT ng Tưng ke 2 TL.1.1 GiGi thigu 2 II 4 II.1.2.1 Lớp biểu bì ¿s32 3SEEESEEESEEEEEEEEEEEEEErkerrkrkrrkrkrrerkrerred 5 "0u 5 b LỚP SỢI HH ng ng HH ng ệp 5
P0 4A Ặ a4aal an 6
A LOp DONG 0007 — Oa 6
© LOp 01177 .Ư 6
f Các tế bào thuộc lớp biểu bì . ¿- 52 55s vs rxcree 6 ø Hình thái điển hình của các tế bào biểu bì .- 9
h Một số cau trúc đặc biệt của tế bào biểu bì 10 II.1.2.2 Lớp trung DÌ c c1 102 v1 911 ng ng ngu 12 II.1.2.3 Màng cơ bản .- c cv ng ng kh ven 12
II.1.2.4 Sự phân bố mạch và thần kinh - 2-2 2s s+zs+zz£xsrszrez 12
II.1.2.5 Cẫu trúc phụ trên đa - - ¿2x33 EEEESEEEkrkersrkrkrkrrsrs 13 11.2 Đại cương về da bao quy đầu - - + s2 xS*£keEEvEErkersrererkrsee 15
Trang 12
II.2.1 Giới thiệu 2-56 St t1 S3 SH EEEkEY E1 E111 111111 EExkrrkee 15
IIL2.2 Câu trúc đa bao quy đầu . + + ©s+ 2 k‡E‡EEEkEErkerkrrrrkrkrrkee 16 i58 2: l6 II.2.2.2 Câu trÚC . - ¿52t 3 EEE 3 v1 27181111121113711111111 1x rkrrrd l6 H3 Tế bào Sừngg - 561121 91x 1 1 TH TT TT Tàn TT Huy) 18 icsc 0 1 18 IEW 9.0.0): he 18 II.3.2.1 Cơ chế biệt hĩa tế bào gốc biểu bì -¿- ¿55-572 c55e: 18 II.3.2.2 Cơ chế hĩa sừng ở biểu bì đa +: 52 S52 s>xcxs rxee 21
IIL3.3 Các phương pháp thu nhận tế bào sừng -. 2 +55 5c: 22 11.3.4 Cac mơi trường nuơi tế bào sỪng - + 6s + z xxssvvrxrkesee 23
I3.4.1 Mơi trường cĩ huyết thanh -¿- 555 ssscs2 c2 23
II.3.4.2 Feeder nguyên bào SỢI c Hs ke 24
II3.4.3 Mơi trường khơng huyết thanh . s2 55+: 25
IIL3.4.4 Mơi trường bổ sung nhân tố từ thực vật 26
II3.5 Các yếu tố ảnh hưởng lên tế bào sừng . -¿-¿- 56c +2 27 11.3.5.1 Hormone và các nhân tơ tăng trưởng .-. -: 27
TT.3.5.2 ¡o aằằ 3 27
11.3.6 Ung dụng của việc nuơi tế bào sừng - ¿s52 sxvszvsrxrxrsee 28 IIL3.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi TƯỚC - cc s33 +3 30
Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHAP -. 55-552 552 31 HII.1 Vật liệu - 5255 St E3 2E EEEEEEEEExrkrrkrkkrkrrrrkerkrkerrrrrrkrrrrrrred 31
IIL1.1 Dụng cụ n9 1191919 0v ng ng gà 32
III.1.2 ThiẾt bị, S152 v31 3 EE1971111111111071E111111 111.11 1eEkeD 33 III.1.3 Quy trình chuẩn bị dụng cụ ¿5c 52 St ‡EvEeErkerrrrtsrkrrkee 35 IS: 1 :‹- 36 III.1.4 Chuẩn bị hĩa chất 52t xvveExEExvrxrkerrrrxerxerrrrrrrrred 37
III.2 Phương pháp nghiên cứu
III2.1 Thiết kế nghiên cứu - ¿5-2 9xx S*2EEEEEEEEEErrkrEkrkrrkrkrrkee 42
III2.2 Đối tượng nghiên CỨU . + 213k SE EEEEEESEEEErkersvrrerkrsee 42
Trang 13
LH.2.3 Nội dung nghiÊn CỨU - G1 S19 HH ng ng gy 44
III2.3.1 Mục tiêu tổng quát ¿52 tt kckEEkEkEkrkerkerkrkrred 44 III2.3.2 Mục tiêu khảo sát 44
III.2.3.3 Trình tự thí nghiệm tơng quát + - + 56s svvvszvrvrvd 44 IH.2.3.3 Các quy trình thí nghiỆm - 2-6 S1 1v ve 45
Phương pháp thu nhận lớp biểu bì -. .: ¿5:5 ©s- 46
Phương pháp nuơi sơ cấp biểu bì 5 52 sec set 47
Phương pháp nuơi thứ cấp tế bào sừng . - 48
Phương pháp xác định mật độ tế bào -. .: - :-: 48 Phương pháp xử lý số liệu -: ¿55s ccvrxersrree 49 Chương IV: KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN . - «55c 55s 5s sesscsesessssese 49 IV.1 Kết quả thu nhận lớp biểu bì - sẻ 3S E*kEEEEEEEEEkrkrrerkrrees 49
IV.2 Kết quả xác định mơi trường tối ưu cho khả năng bám dính
của tế bào biểu bì - 52 St t1 1111111111111 11111111 ErrU 55
IV.3 Kết quả nuơi sơ cấp tế bào sừng - - cà sàntxy key 59
IV.4 Kết quả sự tăng trưởng của tế bào sừng ở nuơi thứ cấp 62
Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, - - - 5 St SESEEEkEkEEEkrkerrrkee 69 V.1 Kết luận - - c1 2t EEEEEEEEEE2EE71EE1111E111111171 11.1 kerrrrkre 69 V.2 Để nghị - G11 HT T3 TT TT TH TH TH cưg 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO - - 2-2 SE S2 E£ESEESEEEEEEEEEEEEEEEEkEErkrrerkrkee 71 PHU LUỤC - - C19112 EEkE3E11181313 1151111111111 111115111151 111100 73
Trang 14
Hình 2.] Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Hình 2.7 Hình 2.8 Hình 2.9 Hình 2.10 Hinh 2.11 Hinh 2.12 Hinh 2.13 Hinh 2.14 Hinh 2.15 Hinh 2.16 Hinh 2.17 Hinh 2.18 Hinh 2.19 Hinh 3.1 Hinh 3.2 Hinh 3.3 Hinh 3.4 Hinh 3.5 Hinh 4.1 Hinh 4.2 Hinh 4.3 DANH MUC HINH Bè mặt da người
Cấu trúc và thành phân của da Câu trúc và thành phân của biểu bì
Lớp biểu bì nhuộm mơ học
Hắc tố bào và tế bào sừng
Tế bào Merkel và Langerhans
Các hình dạng của biêu mơ da Liên kết chặt
Thẻ liên kết Khe liên kết
Cấu trúc lơng và các tuyến tiết Cấu trúc bao quy đầu
Da bao quy đầu trẻ em
Tế bào gốc biêu mơ nhuộm huỳnh quang
Quá trình biệt hĩa từ tế bào gốc thành tế bào biểu bì Sự đi chuyển và biệt hĩa của tế bào sừng ở biểu bì
Nguyên bào sợi chuột
Chứng loét da
Gen Math-1 được chuyền vào tế bào sừng và biểu hiện đốm cam
Các dụng cụ và thiết bị phịng thí nghiệm
Các hĩa chất sử dụng
Quy trình thu nhận lớp biểu bì
Quy trình nuơi sơ cấp biểu bì da quy đầu người
Nhuộm tế bào bang Trypan Blue
Cơ chế tách lớp của Dispase
Bĩc lớp biểu bì ra khỏi trung bì
Biểu bì đã tách rời hồn tồn khỏi trung bì
Trang 15
DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Tỷ lệ % tế bào bám sau 24 giờ
Bang 4.1 Tỷ lệ % tế bào bám sau 48 giờ
Trang 16CHUONG |
DAT VAN DE
Trang 17
w a’ ^`
DAF VAN DE
N7 cứu hình thái, đặc diễm, chức năng và ứng dụng của tế bào sừng là một
đề tài thu hút sự quan tâm lớn của các nhà khoa học Từ những năm 60 thế kỷ XX, các nhà khoa học đã tách và nuơi thử nghiệm tế bào sừng thành cơng
Ứng dụng rộng rãi nhất và sớm nhất của việc nuơi cấy tế bào sừng người là điều trị bỏng và loét đa bằng tắm tế bào sừng đồng nuơi cấy với lớp feeder 3T3 (Clancy và cộng sự, 1988; Compton và cộng sự, 1989) và MCDB 153 (Pitelkow và Scott, 1986) Hệ này cũng được dùng để giải đáp những câu hỏi liên quan đến da
liễu như chứng viêm da tiếp xúc (SaInte-Matie và cộng sự, 1998), các bệnh viêm da
như vay nén (Cowan và cộng sự, 1998) Việc nuơi tế bào sừng cũng đã được chứng
minh là rất cĩ giá trị trong việc nghiên cứu sự biệt hĩa biểu mơ
Tế bào sừng, chiếm 95% số tế bào trong biểu bì, đĩng một vai trị quan
trọng trong ngành cơng nghệ sinh học liên quan đến da Các nghiên cứu vẻ tế bào sừng cung cấp một nền tảng kiến thức rất phong phú về đa, là một phương tiện để thử nghiệm những sản phẩm tác động lên da Bên cạnh đĩ tế bào sừng trong nuơi
cây cịn là nguồn thay thế da trong điều trị bỏng hay vết thương mat da Các nhà khoa học đã nuơi thành cơng tế bào sừng trên nhiều mơi trường khác nhau, đồng thời tìm ra các yếu tố ảnh hưởng đến tế bào sừng trong nuơi cấy ïw viro Ở Việt Nam, các nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng chưa được phát triển nhiều
Nghiên cứu của chúng tơi cĩ mục đích khảo sát tế bào sừng da bao quy đầu
người về khả năng bám trong giai đoạn sơ cấp, khả năng tăng sinh và đường cong
tăng trưởng của tế bào sừng trong điều kiện nuơi ¿w vio Đây sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về tế bào sừng trong tương lai ở Việt Nam
Trang 18
CHUONG II
Trang 19H.1 ĐẠI CƯƠNG VẺ DA
I.1.1 GIỚI THIỆU
Da là một trong những cơ quan lớn nhất và hoạt động nhiều nhất ở cơ thể
người Là một hệ thuộc biéu mơ, cấu trúc của da chuyên biệt bao bọc và ngăn cách tồn bộ bề mặt của cơ thê người với mơi trường tự nhiên bên ngồi, gồm ba lớp cầu trúc chính:
- Lớp biểu bì (Epidermis) - Lớp trung bì (Dermis) - Lớp hạ bì (Hypodermis)
- Ở đa cịn cĩ các tổ chức tuyến tiết, lơng, mĩng, các thụ quan
Đối với người Việt Nam trưởng thành, diện tích bề mặt da trung bình là 1,8 mˆ, chiếm khoảng 15-17% trọng lượng tồn cơ thể Da cĩ chiều dày khoảng 0,07-2,5
mm, đày nhất ở vùng bàn tay, bàn chân và mỏng nhất ở vùng mi mắt, mơi Sự dày mỏng khác nhau của đa được giải thích bởi các lực tác động khác nhau của mơi trường vào từng vùng riêng rẽ trên cơ thẻ [1]
Về mặt mơ học, da cĩ hai nguồn gốc phát sinh [ 1]:
- Ngoại phơi bì: bao gồm các tế bào biểu mơ nhiều tầng thuộc lớp biểu bì và các tế bào biểu mơ thuộc các phần phụ của da
Trang 20Tang sting Tổng trong Tang hat Biểu bì Tổng goi Đướng gỡ biểu bi i
Vang mao mech Tổng sinh
Đầu dõy than kinh Biểu bì nhơ lên để lộ gai da 3⁄4 sẽ E21 WZke ) 5 _— a iim mF Sa rie tin : cia” a ớn mọch cáo da — SRA RES Ae We ar
phang Tuyến mê hơi
Dãy than kinh đến nang lơng
Hình 2.2 Cấu trúc và thành phần của đa
Trang 21
11.1.2 CẤU TRÚC DA
11.1.2.1 LOP BIEU Bi
Biểu bì là lớp ngồi cùng của đa, tiếp xúc trực tiếp với mơi trường ngồi Đây là
hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thẻ, mỏng, chia thành năm lớp nhỏ:
- Lớp đáy (tâng sinh trưởng, lớp gốc) - Lớp sợi (tang gai, hay lớp Malpighi)
- Lép hat (tang hat)
- Lép bong (tang trong) - Lép simg (tang sing)
Trong biểu mơ khơng cĩ các mạch máu và mạch bạch huyết điển hình Biểu bì
được nuơi dưỡng nhờ cơ chế khuếch tán các chất dinh dưỡng từ mơ liên kết qua
màng đáy
Xen giữa các tế bào biểu mơ cĩ các đầu mút tận cùng thân kinh trần, khơng cĩ
vỏ bọc Chúng chia nhánh nhỏ chạy luồn trong các khoảng gian bào và tiếp xúc với
Trang 22a Lop day (Stratum germinativum)
Lớp đáy được tạo bởi một hàng tế bào khối vuơng hay trụ thấp, nằm trên đáy màng, cĩ khả năng phân chia liên tục và di chuyên ra bề mặt để thay thế dần cho
các tế bào già bên trên bong ra, đĩ là các tế bào sừng (chứa nhiều sừng)
Thơng thường, trong lớp đáy chỉ cĩ khoảng 10% là tế bào sừng, 50% các tế bào
khác đang ở thời điểm giao thời của sinh trưởng 40% cịn lại là các tế bào ở hậu kỳ
của giảm phân Các tế bào của lớp đáy được gắn kết trên màng cơ bản nhờ các phân
tử đính fibronectin do nguyên bào sợi của lớp trung bì tiết ra
Ngồi ra, nằm rải rác trong lớp đáy cịn cĩ các loại tế bào khác: hắc tố bào (tơng
hợp các protein hắc tơ da), tế bào Langerhans và Merkel
b Lop soi (Stratum spinosum)
Lép soi con duge goi la l6p Malpighi 6 trén lớp đáy, chúng là tập hợp của 5-20
tầng tế bào đa điện liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối liên bào phân nhánh,
chặt chẽ (khi quan sát vi mẫu, quan sát thây nhiều sợi nỗi giữa các tế bào, do vậy
Trang 23c Lép hat (Stratum granulosum)
Lớp hạt bao gồm từ 3-5 lớp tế bào đa diện đẹp, ở trên lớp gai Các tế bào này
chứa nhiều hạt sắc tố và nhân phân thùy, chúng tự chết theo chương trình để sẵn sàng chuyển thành dạng tế bào sừng hĩa Lớp hạt gồm các hàng tế bào hình thoi,
trong bào tương cĩ chứa rất nhiều các hạt keratohyalin bắt màu bazơ khá đậm
d Lop bong (Stratum lucidum)
Lớp bĩng nằm phía trên lớp hạt là một lớp mỏng và các tế bào của chúng đã cĩ
sự biến đổi sâu sắc về bản chất Tế bào trở nên dài hon, det hơn, nhân và tất cả các
bào quan bị phân giải biến mất dần Nhìn chung, chúng đã thối hĩa khơng cịn hình dạng tế bào Tồn bộ lớp bĩng hoặc bắt màu vàng cam hoặc khơng bắt màu
e Lop sing (Stratum corneum)
Ở mặt trên biểu bì, tế bào biến thành những lá sừng mỏng, trong bào tương
chứa rất nhiều sừng nhằm ngăn cản sự thốt hơi nước, cách nhiệt và những nhân tố
bát lợi khác từ phía mơi trường ngồi xâm nhập vào cơ thê Những lá sừng từ những
tế bào đã thối hĩa tạo nên, bắt màu khơng đồng nhất Sự đổi mới hồn tồn của lớp
biểu bì tính từ khi sản sinh ra một tế bào gốc mới đến khi rụng thành vảy vào
khỏang 45 — 75 ngày Tuy nhiên quá trình này cịn phụ thuộc vào mơi trường nỘi tại của mơ cĩ thuận lợi hay khơng bao gồm các tín hiệu tiếp xúc để tế bào sao chép và di chuyển cùng các kích thích hĩa học của các nhân tố tăng trưởng Cĩ nhiều tín hiệu xuất phát từ các nhân tố của lớp trung bì, đặc biệt là các protein fibronectin nên
và các hợp chất nền khác như hyaluronic acid
f Các tế bào thuộc lớp biếu bì
Tế bào sừng
Là những tế bào cĩ nguồn gốc từ ngoại phơi bì và phân bố khắp biểu bì (chiếm
95% tơng số tế bào của lớp biểu bì), cĩ hoạt động phân bào như những tế bào gốc
của tủy xương Trong quá trình biệt hố chúng đi chuyên lên phía trên thay cho các
tế bào ở trên bị bong ra, nhờ đĩ lớp biêu bì luơn được thay mới Quá trình đi chuyên
lên trên của những tế bào thường xảy ra khoảng 25-50 ngày [19]
Trang 24
Tế bào melanin (hắc tố bào)
Là các tế bào dạng đuơi gai chứa các sắc tố melanin cĩ màu nâu đen được tìm
thấy trong da, mắt, tĩc Phân tử melanin được hình thành khi acid amin bị oxy hố
Tế bào melanin cĩ nguồn gốc từ mào thần kinh và đi chuyển đến lớp đáy của
biểu bì trong suốt quá trình phát triển bào thai, chúng năm rải rác giữa những tế bào
sừng và chiếm tỷ lệ rất nhỏ, khoảng 2% số tế bào của lớp biểu bì Tế bào melanin
giúp hình thành nên màu sắc da, hấp thu năng lượng của tia UV và bảo vệ đa tránh tác hại của tia UV [4]
Hac tổ bào (Melanocyte) Tế bào sừng đã biệt hĩa
Hình 2.5 Hắc tổ bào và tế bào sừng đã biệt hĩa
Tế bào Langerhans
Cĩ nguồn gốc từ tuỷ xương, theo máu xâm nhập vào da, Chúng chiếm tỷ lệ 2- 8% các tế bào biểu bì Langerhans cĩ cấu trúc tương tự như tế bào bạch tuột (Dendritic cell), trong bào tương tế bào cĩ chứa các sợi tơ trung gian vimentin và
các hạt hình que gọi là các hạt của tế bào Langerhans
Những tế bào này liên quan đến hệ thống miễn dịch của biểu bì Chúng phát hiện, xử lý, trình diện kháng nguyên lạ xâm nhập vào biểu bì, kích thích gây nên
đáp ứng miễn dịch [19]
Trang 25
Tế bào Merkel
Là những tế bào thần kinh nội tiết, chiếm một lượng nhỏ trong lớp đáy biểu bì,
khoảng 1%, liên kết với nhau bằng cầu nối gian bào Chúng tiếp xúc với đầu cuỗi
dầy thần kinh khơng bị myelin hố và cĩ chức năng như một thé cam thu cơ học
Té bao Merkel Té bao Langerhans
Hinh 2.6 Té bao Merkel va Langerhans
Ngồi ra, trong biểu bì cịn một số tế bào như: tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu ưa acid, tế bào lympho, hồng cầu Chúng sẽ xuất hiện và tăng lên trong trường hợp bệnh lý [19]
Trang 26
g Hình thái điển hình của các tế bào biếu bì
Biểu mơ da cĩ cấu trúc lát tầng được tạo bởi nhiều lớp tế bào, lớp trên cùng cĩ
hình dẹt đa diện, đây cĩ thé coi là loại biêu mơ bảo vệ điển hình (in 2.7)
Biểu mơ trụ tầng cĩ lớp tế bào trên cùng hình trụ, loại mơ này cĩ ít (ví đụ cĩ ở
biểu mơ mi mắt)
Loại biểu mơ vuơng tầng cĩ hàng tế bào nằm trên cùng cĩ hình khối vuơng, các
Trang 27h Một số cấu trúc đặc biệt của các tế bào biểu bì
Do đặc điểm tiếp xúc với bề mặt ngịal, luơn cĩ một mặt tự do, tế bào biểu mơ
nĩi chung và tế bào đa cĩ một số cẫu trúc liên kết đặc biệt, do vậy khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, màng của các tế bào nằm sát nhau, khơng chừa các khoảng gian bảo
Các khoảng gian bào (cĩ khi rộng tới 20-30nm) thường được lấp đây bởi lớp glycocalyx cĩ bản chất glycoprotein tạo thành cấu trúc lớp dai bit (zonula
occludens) Lớp này cĩ vai trị quan trọng trong việc gắn kết các tế bào biểu mơ với
nhau, ngăn chặn sự ngẫm của các địch chất khơng cần thiết, nhưng lại rất linh động
trong quá trình âm bào và miễn dịch tự nhiên cũng như việc lưu chuyển các chất mà cơ thể hay tế bào cần
Occludine
Hinh 2.8 Lién két chat
Vùng dính (zonula ađherens) nằm sắt bên dưới dải bịt do lớp bào tương của tế bào tiếp giáp với lớp trong trở nên đặc, kết hợp với các sợi nhỏ tạo thành một vịng liên tục bao quanh tế bào
Thê liên kết (đesrmosome) dưới kính hiển vi, quan sát thấy chúng được tạo thành
bởi hai mảnh đặc dối diện của hai màng bào tương thuộc hai tế bào nằm cạnh nhau
Tại thê liên kết, khỏang gian bào rộng ra và chứa một chất cĩ mật độ điện tử thấp
Từ vị trí thể liên kết, các sợi sừng tỏa đều ra các vùng bào tương chung quanh
Trang 28
|
Hình 2.9 Thể liên kết
Khe lién két (Gap junction, nexus) con gap & nhiéu loại tế bào khác (cơ trơn, cơ tim, mơ thần kinh ) Khoảng gian bào hẹp lại chỉ khỏang 2nm, cĩ những đơn vị kết
nối (connecxon uniís) hình ống nỗi xuyên ngang hai màng tế bào cạnh nhau Lịng
ống cho phép các ion, phân tử cĩ kích thước nhỏ (dưới 1000 Da) đi chuyển từ tế bào này qua tế bào khác Đây chính là synap điện, cơ sở cấu trúc truyền thơng tin giữa
Trang 29Sự phân cực của tế bào thể hiện rất rõ ở các tế bào biểu mơ: phần bào tương
phía trên nhân hồn tồn khác với phần phía dưới nhân Do vậy người ta quy ước gọi cực đáy tế bào là phần luơn hướng về phía màng đáy, phần phía trên là cực ngọn của tế bào Sự phân cực này cĩ liên quan mật thiết tới các chức năng của tế bào da
Mặt tự do của các tế bào biểu mơ thường tạo các khía (giống như bàn chải) để
tăng điện tích tiếp xúc, giữa các khía là những xơ actin
I.12.22 LỚP TRUNG BÌ
Trung bì là mơ liên kết vững chắc bao gồm các chất nên, các tế bào liên kết, các
sợi đàn hồi, nang lơng, mạch máu, sợi thần kinh và các thụ quan Bà đày của lớp
trung bì phát triển tùy từng vùng, nơi dày nhất cĩ thê tới 2mm (gan bàn chân)
Trung bì được phân thành hai lớp, tuy nhiên ranh giới khơng rõ ràng
H.1243 MẢNG CƠ BẢN
Là ranh giới giữa chỗ nối lớp trung bì và biểu bì, neo các tế bào biểu bì bên trên
và trung bì bên dưới
Màng cơ bản cĩ cấu trúc mơ xơ liên kết, cĩ chức năng ngăn cản sự thốt các
phân tử cĩ trọng lượng phân tử lớn hơn 40KDa nhưng vẫn cho phép tế bào
Langerhans, tế bào Merkel, các tế bào lympho và các hắc tố bao đi qua
Màng cơ bản bao gồm bốn lớp: lớp nền của tế bào gốc, lớp lá trong suốt, lớp lá đày và lớp lá dưới
Thành phần của màng cơ bản bao gồm các chất: kháng nguyên Bullous pemphigoid (là một glycoprotein 200.000Da), Laminin (glycoprotein 1 x 10Da),
Collagen IV va VII
11.1.2.4 SU PHAN BO MACH VA THAN KINH
Những tiêu động mạch đinh dưỡng cho da đến từ hai đám rối mạch, một khu trú
giữa lớp nhú và lớp lưới, đám rối cịn lại nằm giữa trung bì và hạ bì (phía dưới lớp trung bì)
Trang 30
Sự phân bố thần kinh ở đa rất phong phú nhằm tiếp nhận các kích thích của mơi trường Ước tính, mỗi cm” đa chứa tới 70cm mạch máu, 55cm day than kinh,
100 tuyén mé héi, 15 tuyén nhờn, 230 thụ quan cảm giác, và một số tuyến dịch
Trong lớp da, các đầu mút thần kinh trần đến tiếp xúc với các tế bào biểu mơ
cũng như các tuyến phụ thuộc da, quanh các nang lơng H.1.2.5 CẤU TRÚC PHU TREN DA
1 Long (pili)
Lơng phủ trên cơ thể, chúng cĩ tác dụng như một giác quan phụ, bảo vệ và điều
hịa thân nhiệt, giúp dễ thĩat mơ hơi Lơng được phát triển từ các tế bào bị sừng hĩa, chúng cĩ chiều dài tự nhiên biến động từ vài mm tới hàng mét (tĩc), tiết điện
từ 0,005 — 0,6mm tùy theo từng vùng
Về cấu tạo, lơng gồm rễ lơng (radix) nằm đưới đa và được bao bởi bao chân lơng Tại đây lơng phình ra gọi là hành lơng (bullbus pili), nơi cĩ cơ trơn vận lơng bám vào Phân trên là thân lơng và ngọn lơng
Trên tiết diện cắt nang, phần ngịai cùng mỏng bao bọc gọi là màng lơng, kế đến là vỏ lơng, nơi chứa các phân tử sác tố melanin, trong cùng là tủy lơng bị sừng hĩa dân từ dưới hành lơng tới ngọn lơng
2 Mĩng (unguis)
Đây là câu trúc đã hĩa sừng triệt để của phần thượng bì nằm ở mặt mu của các
ngĩn tay, ngĩn chân Về chức năng, mĩng chủ yếu đề bảo vệ ngĩn
Mĩng cĩ phần thân lộ ra ngồi và phần rễ ăn sâu trong lớp da Giữa da và rễ mĩng cĩ một phân rãnh gọi là lớp sừng trên mĩng và một vùng da bị sừng hĩa được
gọi là lớp sừng dưới mĩng Hai bên gờ của mĩng là lớp sừng quanh mĩng tiếp súc
với đa ít hơn
Quan sát phía trước của lớp sừng trên mĩng cĩ hình bán nguyệt màu trắng đục, đĩ là khu vực đang trong giai đoạn sừng hĩa Các chấm trăng lỗốm đốm là sự sừng
hĩa chưa hồn tồn
Trang 31
3 Các tuyến của da
Cĩ ba tuyến cơ bản: tuyến nhờn, tuyến mồ hơi và tuyến sữa
- Tuyén nhon (sebaceous gland), cịn gọi là tuyến bã đỗ vào nang tuyến (trừ các khu vực khơng cĩ lơng thì đỗ trực tiếp ra đa), sản phẩm của tuyến này giúp đa luơn
cĩ độ âm, mềm mại và chống thấm nước, thĩat hơi nước
- Tuyến mơ hơi cĩ câu trúc ỗng, phần dưới cuộn lại thành búi nằm rất sâu dưới đa, phần trên thơng ra bề mặt da Trên tịan bộ điện tích da cĩ khỏang 200 triệu
tuyến, mật độ cao nhất ở các lịng bàn tay, bàn chân, hốc nách Ở phần da mơi, da
đầu dương vật khơng cĩ tuyến mồ hơi Tuyến mơ hơi cịn là nơi khu trú chủ yếu của
các vi sinh vật cộng sinh
Sự tiết mồ hơi liên quan đến điều hịa thân nhiệt Bình thường mồ hơi tiết liên
tục nhưng ít, trung bình một ngày khoảng nửa lít Khi mơi trường nĩng bức, họat
Trang 32- Tuyên sữa (tuyên vú, mmarưna) gơm một đơi tuyên trước ngực, chúng cĩ nguơn gốc biệt hĩa từ tuyến mơ hơi Tuyến này cĩ liên quan mật thiết tới các họat động sinh đục Cĩ thể coi nĩ như một bộ phận sinh dục ngồi
H2 ĐẠI CƯƠNG VỀ DA BAO QUY ĐẦU
H.2.1 GIỚI THIỆU
Da bao quy đầu là nguồn mẫu da chính cung cấp cho các phịng thí nghiệm trên
thế giới Hiện nay, các nhà khoa học thực hiện rất nhiều nghiên cứu trên đa như: nghiên cứu thành phân, cấu trúc, quá trình biệt hĩa của các tế bào da, các ứng dụng
trong chữa bỏng của tế bào sừng và nguyên bào sợi, các liên kết giữa các tế bào da, thử nghiệm các mỹ phẩm, độc tố hay phĩng xạ trên các tế bao da [16]
Trước đây, người ta sử dụng đa của động vật như thỏ, chuột, khi hay da
người chết trong các nghiên cứu, tuy nhiên, các nhà khoa học gặp rất nhiều khĩ
khăn vì nguồn da trên rất khĩ sử dụng trong nuơi cấy vì độ nhiễm cao, tính chính
xác thấp trong các nghiên cứu thử nghiệm độc tố hay phĩng xạ trên người vì sự
khác biệt với câu trúc da người, ngồi ra, các nhà khoa học cịn gặp rất nhiều khĩ
khăn bởi vẫn đề dao lí sinh học Vì thế, yêu cầu về một nguồn mẫu da người cĩ thê tận dụng, luơn chủ động và khơng vi phạm các đạo lí trong sinh học là hết sức cấp thiết [12]
Từ những năm đầu trong thập kỷ 80 của thế kỷ XX, trên thế giới, người ta đã bắt đầu sử dụng một nguồn mẫu da rất hiệu quả và chủ động trong nghiên cứu đĩ chính là đa bao quy đầu
Cho tdi nay, trén 80% các nghiên cứu về các tế bào da được thực hiện trên
nguồn da bao quy đầu Các nhà khoa học trên thế giới tận dụng nguồn da từ bao da
qui đầu được cắt đi khi các bé trai vừa mới được sinh ra [ 14]
Bao da quy đầu tuy cĩ cấu trúc giống với da bao phủ bề mặt nhưng nĩ cũng cĩ một sơ đặc điêm và chức năng khác so với da trên bê mặt cơ thê
Trang 33
H.2.2 CẤU TRÚC DA BAO QUY ĐẦU
H.2.2.1 VỊ TRÍ DA BAO QUY ĐẦU 1:Mặt ngồi 2:Ngách đầu đương vật 3: Đầu dương vật 4:Day chang 5: Mat trong 6: Vung Ridged Band
Hình 2.12 Cấu trúc bao quy đầu
Bao đa quy đầu bắt nguồn ngay ở phía sau đầu đương vật, kéo đài lên phía
trước để bao phủ lên đầu dương vật Đĩ chính là lớp da cĩ thể di chuyên được trong
quả trình giao hợp [13 |
1.2.2.2 CẤU TRÚC DA BAO QUY ĐẦU
Da bao quy đầu khi kéo đài đến đầu đương vật, chúng tự gấp đơi lại tạo thành 2
lớp: lớp trong và lớp ngồi Lớp bên ngồi cĩ chức năng chủ yếu là bảo vệ, bao phủ đầu đương vật Lớp bên trong cĩ vùng hưng phấn tình đục rất nhạy cảm
Những rãnh gờ trải quanh đầu đương vật tập trung lại và liên kết với phần đưới của đương vật bằng dây chẳng Nếu những nếp rãnh gờ này quá ngăn, chúng sẽ hạn
chế khả năng giương ra hay thụt vào của đương vật và đễ gay rach da bao
Da bao quy đầu chiếm từ 50 - 80% diện tích da ở dương vật Một da bao quy đầu trung bình ở người trưởng thành cĩ trên 91,44 cm tĩnh mạch, động mạch và
Trang 34
mao mạch, trên 73,15 m dây thần kinh, 20.000 đầu mút đây thần kinh Nếu trải rộng
ra, bao đa quy đầu cĩ diện tích khoảng 25-38 cm”.[17]
Về cấu trúc mơ học, bao đa quy đầu cũng tương tự như ở các vùng da khác trên cơ thê Tuy nhiên, lớp trung bì của bao da quy đầu rất dày và chứa nhiều dịch nhây,
lớp biểu bì cĩ các tế bào sừng gốc chiếm tỷ lệ cao hơn và lớp sừng thì mỏng hơn ở
những vùng da khác Đây chính là lí do mà các nhà khoa học sử dụng bao da quy đầu là nguồn cung cấp các tế bào sừng hay nguyên bào sợi [18]
Trang 35H.3 ĐẠI CƯƠNG VẺ TẾ BẢO SỪNG
H.3.1 GIỚI THIỆU
Tế bào sừng (keratinocyte) 1a loai té bao chinh yếu cho lớp biểu bì Chúng chiếm 95% tổng số tế bào của lớp biểu bì Các tế bào sừng đi chuyển dần lên các
lớp trên thay thế các tế bào đã hĩa sừng bị bĩc vảy Quá trình biệt hĩa cuối cùng
của tế bào sừng bắt đầu từ các tế bào sinh ra từ tế bào sừng gốc ở lớp đáy và kết thúc là các tế bào hĩa sừng ở lớp sừng [6]
Tế bào sừng cĩ nguồn gốc từ tế bào gốc biểu mơ Tế bào gốc biểu mơ tạo nền tảng cho sự cân bằng tự nhiên và sự sửa chữa các cơ quan Tế bào gốc cĩ khả năng đặc biệt là cĩ thể tự làm mới chúng trong suốt cuộc đời của cơ quan mà chúng cư
trú, trong lúc đĩ, chúng cĩ thể sản xuất ra những tế bào chị em mà về sau cĩ thể
được biệt hĩa theo các hướng khác nhau thành các tế bào đơn dịng hay đa dịng [1]
Hình 2.14 Tế bào gốc biểu mơ nhuộm huỳnh quang
Các tế bào gốc biểu mơ được xác định cĩ hiện diện trong lớp đáy của biêu bì và
tồn tại ở xung quanh các gốc lơng, tức là quanh chỗ phình ra của gốc lơng Các tế bào gốc biểu mơ này là nguồn gốc của các tế bào gốc sừng và từ đĩ tạo ra các tế bào sừng trong các lớp của biểu bì Các tế bào gốc sừng cĩ nhiệm vụ cung cấp nguồn tế bào thay thế các tế bào da bị mất đi hằng ngày, ngồi ra, chúng cịn sản xuất nhanh
hơn nếu da bị bỏng hay bị tổn thương, từ đĩ giúp da kịp thời hồi phục [11]
Trang 36
H.3.2 CƠ CHE BIET HOA CUA TE BAO GOC BIEU Bi
Da là rào chắn đầu tiên bảo vệ cơ thể khỏi mất nước, ngăn chặn các tổn thương
và sự xâm nhiễm Để đáp ứng những yêu cầu này, da đã cĩ một quá trình biệt hĩa
phức tạp, làm cho da trở nên dai chắc, khơng thấm nước và luơn tự đổi mới
Tế bào sừng đĩng một vai trị quan trọng trong quá trình này Quá trình biệt hĩa của tế bào sừng đĩng vai trị chủ chốt trong quá trình tự đổi mới của da Các tế bào sừng gốc ở lớp đáy đi vào một chu trình biệt hĩa gọi là chu trình biệt hĩa cuối cùng (/erminal differentiation) đê tạo thành các tế bào chết hĩa sừng, hình thành
một lớp màng sừng bảo vệ cơ thé [11]
11.3.2.1 CƠ CHÉ BIỆT HOA CUA TE BAO GOC BIEU Bi
Vi tri các tế bào sừng trong quá trình biệt hĩa & biéu bi : Lớp sừng (các A =~ Sa tế bào chết) Lớp sợi (các tế bào đã biệt hĩa xong) STAT FTN TNL a Ti af "di Toe W 3N Woo) bel Wok be -Á be : LO LO My ee Lớp hạt ( các tế bào đang biệt hĩa) Tứ bảo iy ¬ ve RJ gơc \ J - Lớp đáy (các tế bào
goc và tê bào khuêch Tế bào khuếch đại chuyển)
đại chuyên Tế bào dang biét VỊ trí các tê bào trong biêu bì , : hĩa
Hình 2.15 Quá trình biệt hố từ tế bào gốc thành tế bào biểu bì da
Biểu bì gồm 5 lớp (lớp đáy, lớp hạt, lớp sợi, lớp bĩng, và lớp sừng) Các tế bào
gốc và các tế bào sừng cĩ khả năng tăng sinh mạnh chỉ cĩ trong lớp đáy (là lớp sâu
nhất của biểu bì) Các tế bào gốc bám chặt vào màng nền Khi các tế bào ở lớp đáy nhiều lên, một số tế bào rời khỏi lớp này và bắt đầu di chuyển lên bề mặt da Thời
gian để các tế bào sừng di chuyên từ màng nên lên bề mặt da là khoảng 25-50 ngày
Trang 37
Cĩ một ý kiến cho rằng, các tế bào phân chia, tăng sinh trong lớp đáy của biểu bì cĩ thê chia thành 2 quần thể khác nhau Quần thê thứ nhất chứa những tế bào cĩ
chu kì tế bào đài, pha S ngắn, những tế bào này các tế bào gốc Quân thê thứ hai
chứa các tế bào cĩ khả năng phân chia, tăng sinh thấp hơn tế bào gốc biểu mơ, được
goi la cac té bao khuéch dai chuyén (transit amplifying cell), (Johnes et al ,1995)
Khi các tế bào ở lớp đáy nhiều lên, một số tế bào rời khỏi màng nên và bắt đầu
di chuyên lên bề mặt da Sự thay đổi đầu tiên là các tế bào ở lớp đáy ngừng sản xuất chất sừng 5 và 14 ngày sau khi tách khỏi màng nên
Sự chuyền đổi trong biểu hiện gen xuất hiện khi tế bào sừng từ lớp hạt đi lên
lớp sợi và chúng bắt đầu tơng hợp protein filaggrin va loicrin Cac té bao simg khi 6 trong lớp sợi cuối cùng suy yếu đi và hoat hdéa gen transglutaminase 6 biéu bi, diéu này xúc tác các liên kết chéo của protein màng Khi các tế bào sừng ở lớp sợi chết đi, chúng để lại các vảy hay bộ xương tế bào chứa đầy chất sừng và protein liên kết (Watt et al, 1988) Các xác tế bào chết tạo thành một màng bảo vệ ở lớp sừng, màng này tạo thành các lớp đạng vay va dé bi tréc ra
11.3.2.2 CƠ CHẾ HĨA SỪNG Ở BIÊU BI DA
Cơ chế tạo lớp sừng (hay cịn gọi là hĩa sừng) ở biểu bì da người liên quan chặt
chẽ tới quá trình biệt hĩa của tế bào sừng Khi một số tế bào tách khởi màng nên,
chúng đi vào quá trình biệt hĩa và di chuyên dân lên trên
Khi tế bào sừng ở lớp hạt, chúng sản xuất hàng loạt protein sừng đạng KI và K10 cùng một số protein bao bọc khác, điều này làm vững chắc thêm mạng lưới IF ( Intermediate Filament, mang soi trung gian), va do dé lam cing cac té bao ra Cac
chất sừng sau đĩ tập trung lại và kết hợp với các sợi IF tạo thành những bĩ đàn hồi
hay cịn gọi là cac soi cap cua mang IF gan chặt các tế bào lại với nhau, tạo thành
một khối thống nhất [1 I]
Các khối tế bào hình thành ở lớp hạt đi chuyển lên trên bề mặt da, các tế bào
này ngưng phân chia hồn tồn, chúng lắng lại Các protein liên kết chéo ở dưới màng tế bào chất tạo thành một lớp vững chắc bao bọc các tế bào này, hình thành
Trang 38
nên các hạt nhỏ dẹt chứa lipit, các hạt lipit được nhơ ra trên lớp bao bọc Điều này
giải thích cho việc hình thành một lớp bảo vệ khơng thấm nước ở biểu bì, giúp ngăn chặn sự mất nước khơng điều hịa Lớp tiền bảo vệ này gồm hai thành phân chính : (1) tiền protein bao bọc hĩa sừng giàu lysine và glutamin, (2) Các hạt đẹt mỏng
chứa đầy các lớp đơi lipi
Khi các tế bào đi vào pha cuối của biệt hĩa, một dịng Ca?! đựơc tuơn ra, hoạt
hĩa enzyme chuyên hĩa glutamin, liên quan về mặt sinh học với protein biểu bì hĩa sừng thơng qua cầu nỗi isopeptide và chúng sẽ hoạt hĩa sự đây ra của các lớp đơi lipit lên trên mạng lưới
Sau khi sản xuất xong các sản phẩm trên, các tế bào ngừng sao mã và các hoạt động trao đổi chất Sau đĩ, tế bào đi vào chương trình chết tương tự như 40ò/osis Các tế bào để lại xác của mình tạo thành một lớp vảy mỏng là các tấm sừng chắc chăn, khơng thấm nước Các lớp vảy sừng này cuối cùng bị trĩc ra khỏi bề mặt da
Trang 3911.3.3 CAC PHUONG PHAP THU NHAN TE BAO SUNG
Hiện nay, cĩ nhiều phương pháp tách biểu bì ra khỏi trung bì và thu những tế
bào biểu bì đơn Sau đây là một số phương pháp thơng dung:
e Mẫu sinh thiết da khoảng 5cm” rửa trong dung địch muối và ủ bằng Dispase ở 37°C trong 30-40 phút, sau đĩ chuyên biểu bì vào dung dịch trypsin và ủ tại
37°C trong 10 phút [9]
e Mẫu đa đặt trong dung dịch Dipase, ủ trong 18 giờ tại 2-§8°C Tách biểu bì ra khỏi trung bì cho vào ơng ly tâm chứa 2ml Trypsin-EDTA (0,25%-0,02mM) ủ
ở 37C trong 10-12 phút
e Ú mẫu đa trong dung dịch Trypsin 0,25%-EDTA 0,02% tỷ lệ 1:4, ủ ở 4'C
trong khoảng 16-20h [10]
e Ủ mẫu mơ qua đêm với dung địch Trypsin 0,17%, sau đĩ xử lý tiếp trong dung
dịch Trypsin-EDTA (0,25%-0,02mM) để tách thành những tế bào đơn [5]
e Ủ mẫu mơ với dung dich Trypsin 0,25%-EDTA 0,02% tỷ lệ 1:4 ở 37°C trong
2 giờ, sau đĩ tách phân trung bì và biêu bì, thu nhận tế bào sừng [4]
11.3.4 MỖI TRƯỜNG NUƠI TẾ BÀO SUNG
Mơi trường nuơi tế bào sừng đã được phát triển cách đây gần 25 năm từ khi hệ thống nuơi tế bào sừng được thiết lập
Mơi trường cơ bản đầu tiên được sử đụng để tạo địng tế bào bất tử và nuơi cấy sơ cấp và thứ cấp tế bào sừng trên lớp nâng đỡ nguyên bào sợi cĩ bơ sung huyết
thanh động vật Trong hệ thống cơ bản này, tế bào sừng cĩ thể được cấy chuyền cho
đến khi chúng được 20-50 thế hệ
Gan đây cĩ một số mơi trường cải tiến từ mơi trường cơ bản, nhưng vẫn dựa trên huyết thanh động vật và lớp nâng đỡ nguyên bào sợi [4]
Trang 40
11.3.4.1 MOI TRUONG CO HUYET THANH
Huyết thanh động vật thường bố sung vào mơi trường nuơi cấy như một nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển Nguồn huyết thanh tốt nhất là huyết thanh bao thai bị (FCS), huyết thanh bị mang thai (FBS) Trong mơi trường nuơi cấy, huyết thanh hoạt động như một đệm pH; cung cấp hormon, nhân tố tăng trưởng cần cho chức năng tế bào; chứa những protein cần cho sự ơn định và phân tán hormon, chất dinh dưỡng đến tế bào; cung cấp chất ức chế các protease
Tuy nhiên huyết thanh khơng được xem là chất tốt nhất để tạo nên một mơi
trường tối ưu cho sự tăng trưởng và biểu hiện chức năng của tế bào do chúng ta khĩ
xác định được nguồn gốc tự nhiên của huyết thanh, dé bị biến đổi thành phân, dễ bị
nhiễm các tác nhân vi nắm, virus, cĩ thể gây hại đến sức khoẻ người nghiên cứu lẫn bệnh nhân được chữa trị Ngồi ra, một vài nhân tố trong huyết thanh (như lipoprotein cĩ tỷ trọng cao (HDL), lipoprotein cĩ tỉ trọng thấp (LDL), vitamin C )
khơng bền khi bảo quản lâu đài ở nhiệt độ thấp Huyết thanh cịn kích thích sự biệt
hố của những tế bào tiến tới trạng thái khơng phân bào nguyên nhiễm, làm cho những tế bào này khơng duy trì như một dịng tế bào bất tử Nồng độ huyết thanh thường bồ sung vào mơi trường nuơi cấy tế bào sừng là 5%, 10%, và 20% [25]
I3.4.2 FEEDER NGUYÊN BÀO SỢI
Phương pháp này đầu tiên được mơ tả bởi Rheinwald và Green (1979), dựa trên sự nuơi cây đồng thời tế bào sừng với nguyên bào sợi bị chiếu xạ Nguyên bao
sợi chuột của dịng tế bào 3T3 lấy từ khối u của chuột nhất bị chiếu xạ liều cao để
các tế bào này khơng tăng sinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giúp cho sự tăng trưởng của tế bào sừng
Nguyên bào sợi chuột được nuơi cấy trong mơi trường D'MEM (Dulbecco's Modified Eagle’s medium) cĩ nồng độ glucose cao, b6 sung 10% FBS, Penicillin/
Streptomycin (100 UI/ml-100 ug/ml), dung dich dém bicarbonate sodium 1N với
một lượng phù hợp tế bào được chiếu xạ Khi những tế bào này tạo được 50% mật độ trong đĩa nuơi cây, được sử dụng như một giá thê trực tiêp cho việc nuơi cây tê