TRUONG DAI HOC CAN THO
KHOA THUY SAN
TRAN THI KIEU PHUONG
ANH HUONG CUA THOI GIAN TIEP XUC MALACHITE GREEN LEN MOT SO CHi TIEU HUYET HOC VA Ti LE
SONG CUA CA TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIONG
LUAN VAN TOT NGHIEP DAI
HOC NGANH NUOI TRONG THUY SAN
CAN BO HUONG DAN PGS.TS
NGUYEN THANH PHUONG
Trang 2LOI CAM TA
Qúa trình thực hiện luận văn tốt nghiệp ựã giúp tôi có ựược những kinh nghiệm và kỹ năng bô ắch, thiệt thực cho công việc sau này đê có ựược những kêt quả trên, tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn ựên:
Thầy Nguyễn Thanh Phương, Cô Đỗ Thị Thanh Hương Trong khoảng thời
gian làm luận văn dưới sự chỉ dẫn, dạy bảo tận tình của Thay, Cô ựã giúp tôi nhận
thấy ựược những khoảng trống kiến thức cần phải củng cố, ựồng thời Thầy, Cô còn cho tôi những kinh nghiệm quý báu ựễ luận văn có thể hoàn thành theo ựúng muc tiêu
Xin chân thành cám ơn tất cả Thây, Cô, cán bộ Khoa Thủy Sản ựã giúp ựỡ và tạo
ựiêu kiện tôt cho tôi trong suôt thời gian học tập cũng như thực hiện ựê tài
Xin chân thành cám ơn chị Nguyễn Thị Kim Hà và chị Nguyễn Hương Thùy ựã giúp ựỡ và chỉ dẫn tôi rất nhiệt tình trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cám ơn các anh chị học viên cao học, các bạn sinh viên lớp nuôi trồng
thủy sản K33, lớp bệnh học K32 ựã ựộng viên,quan tâm, giúp ựỡ tôi trong những lúc
tôi gặp khó khăn
Xin chân thành cám ơn gia ựình ựã quan tâm, chăm sóc, tạo ựiêu kiện cho tôi trong
Trang 3TOM TAT
Nghiên cứu ỘẢnh hưởng của thời gian tiếp xúc Malachite Green lên một số chỉ
tiêu huyết học và tỉ lệ sống của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)Ợ ựược thực
hiện từ tháng 04/2009 fién 06/2009 nhằm mục tiêu ựánh giá mức ựộ thay ựôi và khả năng phục hồi của các chỉ tiêu huyết học cũng như tỉ lệ sống của cá Tra theo thời gian tiếp xúc với MG ở các nồng ựộ và thời gian khác nhau ựê làm cơ sở cho quản lý và sử dụng hợp ly MG trong những trường hợp cân thiết Thắ nghiệm gồm 3 nồng ựộ
MG gay nhiễm: 0.15 ppm, 0.3 ppm, 0.45 ppm Kết quả của thắ nghiệm 1 cho thấy có những thay ựỗi lên các chỉ tiêu huyết học: Số lượng hồng
cầu (nghiệm thức ựối chứng khoảng 2,5 x10 tế bào/mmỢ, nghiệm thức có thuốc khoảng 2,5 Ở 29x10Ợ tế bào/mm?), số lượng bạch cầu (nghiệm thức ựối chứng khoảng 1,49x10Ợ tế bào/mm, nghiệm thức có thuốc khoảng I,Ix10-1,9x10" tế bào/mm), tỷ lệ huyết cầu ( nghiệm thức ựỗi chứng khoảng 31,8%, nghiệm thức có thuốc khoảng 29-33%),thể tắch hồng cầu (ở nghiệm thức ựối chứng khoảng 136
uỢ, ở nghiệm thức có thuốc khoảng 114 Ở 149 uỢ) Kết quả của thắ nghiệm 2 cho thấy có những thay ựôi lên các chỉ tiêu huyết học: Số lượng hồng cầu (nghiệm
Trang 4MUC LUC
20171180 000 424 1
9001.) 1
1.1 Gil thiGu 1 1.2 Mục tiêu dé tai eseecsessssssscsseccssecssnecessccsssccsssccsncesnecessecsssccsssecsuscessecessecesnecsanceesseesses 2 I9) (0 Noìiii-0i140i: i03: 010707078 2
1.4 Thai gian và dịa điểm thực hiện dề tài - - s- se skeEskeEsveEsgvezsgxecse 2
1102000 .HảHHỤH)HẬHÂ})HằH 3
TỎNG QUAN TÀI LIỆU - 2= SE EặE8+Eặ E9 E8 EEE E996 EkEE 919211119 5 59111552 3
2.1 đặc diễm sinh học của cá Tra (Pangasianodon hypophthaliius) 5-cscscca 3 2.2 Ảnh huang của hóa chất lên sinh lý ca cá - 2 - << sEặEsEeEsEezsversreers 4 2.3 Ảnh huang của hóa chất lên chỉ tiêu huyết học của cá Ư- 5-5 < sccscscescscsee 5 2.4 Ảnh huang của nong duqc lên ti lệ sống cữia cá fOim - 2-2 se ặxereeszed 6
2.5 Khái quát về một số chỉ tiêu sinh lý và huyết học - s- s ssexsxsexsexscxsced 6
Ộhy (-o 192 6 "hy i8 90902 6
2.5.3 Các chi tiêu huyẾt HỌC ề6 < ke ke E999 6
2.6 Khai quat vé Malachite Green (MG) .ccscscscsessessssssssssscsssesscsssesscscsesscssscsssasessseeees 10
Ộ0N i0 0/06 10
2.6.2 đại cuang về ÌMG - <5 s19 99 9191 ưa 11
2.6.3 Anh huang cilia MG wu eccscssscsesscsssscsesscsesssscssssssssssssssesessesesassussesessesessesesaeeess 11
2.6.4 Ứng dụng ciia ÌMG <5 Hưng 13
2.6.5 Tình hInh su dụng MG trên thế giâi . 2- - <s kặ * + ẠEặEặEeEe se 8ặ 13 2.6.6 Tĩnh hInh su dụng thuốc và hóa chất trong nuoi cá tra a ỷBSCL 14
2.6.7 Khâ nang tồn luu ciia ÌMC 2 - se skeESkE 4k kg xgveEgkersei 14 0n 16 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIEN CUU .essssssssssssssssssessesssssssecsssessncssneesseessesses 16 S4 8i i07 0o 16 3.2 Bố trl thỳ nghiệm - ẹ9999 voi 18 3.2.1 ThI nghiệm: Xác dịnh sự ânh huang cũa MG lên các chi tiêu sinh lý(tiêu hao 0D A:811⁄400111519)928vì 8v ba 18 3.2.2 ThI Nghiệm: : Xác dịnh sự ânh huang của MG lên các chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, bạch cầu, hematorite, M CC ) G G0000 HH9 005555 me see 19 3.3 Phuang pháp thu mẫu - 2-2 SE E99 E999 E99 cư cư cưng ki 20 3.3.1 Theo dO1 M01 trang 0170576 20 3.3.2 Phuang pháp thu mẫu CÁ - - <2 ồ << s5 s4 E33 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 55 xe 21 3.4 Phuang pháp pha dung dịch MG thỳ nghiỆm << =5 S533 55555552 21 3.5 Phuang pháp phân tlch mẫu huyết học s- 2s s * ặsEặsxezsxezszeezs 21 3.5.1 Phuang pháp dếm hồng cầu - - 2 SE kặ SE ve 21
3.5.2 Phuang pháp xác dịnh tế bào bạch cầu - - 2s s se se sEsxcs2 22
3.5.3 Phuang pháp do Hematocrit (ti lệ huyết SAC tO 6) ch tk gkerees 23
Trang 53.6 Phuang pháp xu lI số liỆU - 2 ệ ặ ệ ặE* ặEặEEEặ SE E4 cvee 23
PHAN 4: PT 24
KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN - << SE tk S193 g9 g9 cv 24
4.1 ThI nghiệm ânh huang của MG lên các chi tiêu sinh lý (tiêu hao oxy và nguàng oxy)
JìSv Mà 24
4.1.1 Ảnh huang của MG lên tiêu haO OXY Ư- 2 << EExEEEkEExErerkrrkrrerkee 24 4.1.2 Ảnh huang của MG lên nguàng OX ồ 5 << Sex xeEsvxeesreersrxee 25 4.2 ThI Nghiệm: Xác dịnh sự ânh huang cũa MG lên các chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, bach cau, hematorite, MCV ) .cccccccscsssscecececscsesecececesscsesesecesesscsescsesesesseseaesesesecseseaeaeeeees 26
Trang 6DANH SACH BANG
Bang 2.1: Giá trị LCso của MG dối vâi 1 số loài cá a nhiệt độ và pH khác nhau 12
Báng 4.1: Biến động nhiệt độ, pH của các bề thỳ nghiệm . - 2-5-5555: 26 Bang 4.2: Số luang hồng cầu (10Ợ tb/mmỢ) của cá trong quá trlnh thl nghiệm 29
Bảng 4.3: Số luạng bạch cầu (10Ợ tb/mmỢ) của cá trong quá trlnh thI nghiệm 30
Bảng 4.4: Sự biến dộng ty lệ huyết cầu (%Hct) của cá trong quá trlnh thỳ nghiệm 3 I Bang 4.5: Thé tIch hong cau (MCV) (uồ) của cá trong quá trlnh thI nghiệm 31
Báng 4.6: Biến dộng nhiệt dộ, pH của các bề thỳ nghiệm . - 5-5-5555: 32 Bang 4.7: Sé luqng hồng cầu (10 tb/mmỢ) của cá trong quá trinh thl nghiệm 34
Bang 4.8: Số luang bạch cầu (10Ợ tb/mmỖ) của cá trong quá trlnh thl nghiệm 35
Bang 4.9: Sự biến dộng ty lệ huyết cầu (%Hct) của cá trong quá trlnh thI nghiệm 36 Bang 4.10: Thé tIch héng cau (MCV) (1ồ) ciia c4 trong qua trInh thI nghiém 36
Bang 4.11: S6 luqng héng cau (10ồ tb/mmỖ) của cá sau 2 ngày tiếp xúc thuốc 37
Bang 4.12:Số luạng bạch cầu (10Ợ tb/mmỢ) của cá sau 2 ngày tiếp xúc thuốc 38
Bảng 4.13: Số luang ty lệ huyết cầu (%Hct) của cá sau 2 ngày tiếp xúc thuốc 38
Bang 4.14: Thể tÍch hồng cầu (IỢ) của cá sau 2 ngày tiếp xúc thuốc 39
Bang 4.15: S6 luqng héng cau (10ồ tb/mmỖ) của cá sau 2 tuần tiếp xúc thuốc 39
Bang 4.16: Số luạng bạch cầu (10Ợ tb/mmỢ) của cá sau 2 tuần tiếp xúc thuốc 40
Bảng 4.17: Số luang ty lệ huyết cầu (%Hct) của cá sau 2 tuần tiếp xúc thuốc 40
Trang 7DANH SACH HINH
Hh 2.1: Bach Cau .ccccccccccccsscscscecescccscsescececcscecscscececsesesascscecscsesacacacaceravacseacaceususasaees 9 Hlnh 2.3: Ti lệ hu yẾt cầU - + - SE SkEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEESEEEEEEEEEErkrkrkrkrerkee 10
Hinh 3.1: Cá Tra giống (Pangasianodon hypophthaÌf3) - cá ccccecxeccreo 17
Hinh 3.2: Hệ thống thI nghiệm - - - 3E +kẬEEESEESESEEESEESEEEEESEEEkrkrkererkrerkee 17
Hinh 3.3: Hệ thống thI nghiệm tiêu hao oxy và nguàng oXy - - -5csscsƯ 18 Hinh 3.4: Vị trl dễm hồng cầu - (+69 EETEEgtT HETkchrtregrrychư: 21
HInh 4.1: Tiêu hao oxy (mgO;/kg/g1a) của cá trong quá trlnh thĩ nghiệm 24
HInh 4.2: Nguàng oxy (mg/L) của cá trong qua trInh thỳ nghiệm 25
Hinh 4.3: Biến dộng hàm luạng TAN a các nghiệm thức theo lần thu 27
Hinh 4.4: Biến dộng hàm luqng nitrite a các nghiệm thức theo lần thu 28
Hinh 4.5: Biến dộng hàm luqng nitrate a các nghiêm thức theo lần thu 28
Hinh 4.7: biến dộng hàm luqang TAN a các nghiệm thức theo lần thu 33
Hinh 4.8: Biến dộng hàm luqng nitrite a các nghiệm thức theo lần thu 33
Hinh 4.9: Biến dộng hàm luqng nitrate a các nghiêm thức theo lần thu 34
Hinh 4.10: Ty lệ sống giữa 2 thI nghiệm - - SE ẬEặkeEEExrkekerkrerrxrkd 42
CAC TU VIET TAT
Malachite green: MG
Leuco Malachite green: LMG
Đông Bằng Song Cuu Long: ĐBSCL Thể
Trang 8PHANI
DAT VAN DE 1.1 Giới thiệu
Hiện nay ngành thủy sản là 1 trong những ngành kinh tế mũi nhọn của quốc
gia Theo Cooksey (2008) thì Việt Nam (VN) là 1 trong những nước trên thế giới có
tiềm năng và phát triển nhanh nhất về sản lượng thủy sản do ỘVN có nhiều nguồn nước tốt như: nguồn nước ngọt, nước lợ, nước mặn, ựiều này cung cấp cho VN nhiều thuận lợi ựê phát triển thủy sảnỢ Theo Hiệp hội Chế biến và xuất khâu
thủy sản VN (VASEP), 10 tháng ựầu năm (2008) xuất khẩu các tra, ba sa các loại ựạt trên
1,24 tỉ USD, vượt qua mức dự kiến gia tri xuất khẩu của cả năm 2008
đồng Bằng Sông Cửu Long (đBSCL) là vùng trọng ựiễm về sản xuất thủy sản của VN Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn
(10/06/08) tổng diện tắch có khả năng nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở đBSCL hơn
1.200.000 ha chiếm gần 60% diện tắch nuôi trồng thủy sản của cả nước Trong ựó diện tắch có khả năng nuôi thủy sản nước ngọt khỏang 600.000 ha ựược xác ựịnh là
có ựiều kiện rất thuận lợi và phân bố chủ yếu ở các tỉnh: Tiền Giang, Long An, Bén Tre, Tra Vinh, Soc Trang, Bac Liéu, Ca Mau, Kién Giang, An Giang, Séng Thap,
Can Tho va Vinh Long Vì thế đBSCL có nhiều ựối tượng nuôi khác nhau như: Cá
tra, Cá Basa, Cá Hú, Cá Vồ đém ửặc biệt trong những năm gần ựây Cá Tra là một
ựối tượng nuôi quan trọng của đBSCL và là 1 trong số các loài cá nước ngọt ựược nuôi phố biến nhất ở nước ta hiện nay với các hình thức nuôi bè, nuôi ựăng quằng,
nuôi ao Mỗi năm diện tắch nuôi Cá Tra ựều tăng, theo số liệu thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (2008) tắnh ựến tháng 8/07 thì tất cả các tỉnh ở đBSCL có tông diện tắch nuôi cá tra trên 5.600 ha so với năm 2000 thì diện tắch này tăng trên 10 lần, sản lượng ựạt khỏang 1.200.000 tấn và kim ngạch xuất khẩu gan 1 ty USD
Với những thuận lợi về ựiều kiện sinh thái môi trường, kỹ thuật nuôi, nghề nuôi Cá Tra ựã phát triển rất nhanh Người nuôi cá muốn gia tăng năng suất và sản
lượng nên tăng mật ựộ thả nuôi từ 20-30 con lên ựến 50-70 con/m)ỳ ựối với nuôi ao
(Vietlinh) trong khi trình ựộ kỹ thuật và các biện pháp quản lý còn hạn chế nên vẫn fié ô nhiễm môi trường và vấn ựè dịch bệnh xảy ra là ựiều tất yếu Bệnh Cá Tra hiện fiang 1a 1 trong những vấn ựề lớn, bệnh xảy ra ngày càng nhiều ảnh hưởng ựến sự
Trang 10kiểm sóat dịch bệnh ngày càng trở nên phổ biến và sử dụng sai liều, lọai thuốc va
hóa chất cũng phố biến hơn nên ựã gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho những người
nuôi cá Mặc dù MG ựã bị cấm sử dụng trên thế giới từ năm 1992 (thanhnien) và MG cũng bị cấm sử dụng tại VN theo quyết ựịnh số 07/2005/Qđ-BTS ngày 24 tháng 02 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy Sản Tuy nhiên, MG ựôi khi vẫn còn ựược sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới vì giá thành thấp và hiệu quả cao (Schnick,
1988) Vì thế ựã gây ra các băng khoăn về tác hại của MG cũng như dẫn xuất của
MG (LMG) ựối với hệ sinh thái trên cạn và dưới nước, chất này cũng ựược xem như là chất gây ô nhiễm (Burchmore and Wilkinson, 1993) và là mối nguy lớn ựối với sức khỏe con người
Vì vậy, tìm hiểu ỘẢnh hướng của thời gian tiếp xúc Malachite Green lên
một số chỉ tiêu huyết học và tắ lệ sống của cá Tra (Pangasianodon
hypophthalmus)Ợ ựược ựÈ xuất thực hiện
1.2 Mục tiêu ựề tài
Nhằm ựánh giá mức ựộ thay ựỗi và khả năng phục hồi của các chỉ tiêu huyết học cũng như tỉ lệ sống của cá Tra theo thời gian tiếp xúc với MG ở các nồng ựộ
và thời gian khác nhau ựÊ làm cơ sở cho quản lý va sir dung hop ly MG trong
những trường hợp cần thiết
1.3 Nội dung nghiên cứu
- đánh giá sự ảnh hưởng của các nồng ựộ MG khác nhau lên các chỉ tiêu
sinh lý (tiêu hao oxy, ngưỡng oxy) của cá tra
- _ đánh giá sự thay ựôi các chỉ tiêu huyết học, sự phục hồi và tỉ lệ sống của
cá Tra khi tiếp xúc với MG ở các nông ựộ và thời gian tức thời (ngăn) - _ đánh giá sự thay ựôi các chỉ tiêu huyết học, sự phục hồi và tỉ lệ sống của
cá Tra khi tiếp xúc với MG ở các nồng ựộ và thời gian dài
1.4 Thời gian và ựịa ựiễm thực hiện ựè tài
- _ Thời gian: từ tháng 04 fiến tháng 06/2009
Trang 11TONG QUAN TAI LIEU
2.1 Sac fiém sinh học của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.1.1 Phân loại
Bo ca nheo Siluriformes Họ cá tra Pangasiidae
Giống cá tra dầu Pangasianodon
Loai ca tra Pangasianodon hypophthalmus
2.1.2 Phan bé
Cá Tra phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt
Nam, Campuchia và Thái lan Ở Thái Lan còn gặp cá Tra ở lưu vực sông Mekloong và Chao Phraya (fistenet) Ở nước ta những năm trước ựây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống của cá Tra và cá ba sa ựược vớt trên sông Tiền và sông Hậu (Nguyễn Văn Kiểm,2004) Cá trưởng thành chỉ thấy trong
ao nuôi, rất ắt gap trong tự nhiên ự1a phận Việt nam, do cá có tập tắnh di cư ngược dòng sông Mê kông ựê sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên Khảo sát chu kỳ di cư của cá tra ở ựịa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng tử tháng 10 ựến tháng
5 và di cư về hạ lưu từ tháng 5 ựến tháng 9 hàng năm (Dương Nhựt Long, 2003) 2.1.3 Hình thái, sinh lý
Cá Tra là cá da trơn (không vây), thân dài, lưng xám ựen, bụng hơi bạc, miệng
rộng, có 2 ựôi râu dài Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống ựược ở vùng nước hơi lợ (nồng ựộ muối 7-10 ), có thể chịu ựựng ựược nước phèn với
pH
>5, dễ chết ở nhiệt ựộ thấp dưới 15C, nhưng chịu nóng tới 39ồC (khoa học thủy
sản) Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các lòai cá khác Cá có cơ quan hô hấp phụ là da và bong bóng khắ nên chịu ựựng ựược môi trường nước thiếu oxy hòa tan Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng (agriviet)
Trang 13hết nỗn hồng cá thể hiện rõ tắnh ăn thịt và ăn lẫn nhau Trong quá trình ương nuôi thành cá giống trong ao, chúng ăn các loại phù du ựộng vật có kắch thước vừa cỡ miệng của chúng như luân trùng, trứng nước, thậm chắ cá tra bột còn ăn thịt lẫn nhau trong bể ương nuôi và các thức ăn nhân tạo Khi cá lớn thể hiện tắnh ăn rộng,
ăn ựáy và ăn tạp thiên về ựộng vật nhưng dễ chuyển ựỗi loại thức ăn Trong ựiều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các lọa1 thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, cám, rau, ựộng vật ựáy, thức ăn hồn hợp, phân ựiộng vật (Phạm Văn Khánh,
1996)
2.1.5 Đặc ựiễm sinh trưởng
Theo Nguyễn Văn Kiểm (2004) Cá tra có tốc ựộ tăng trưởng tương ựối nhanh,
còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều đài Cá ương trong ao sau 2 tháng ựã ựạt chiều đài 10-12 cm (14-15 gam) Từ khỏang 2,5 kg trở ự1, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể Cỡ cá trên 10 tuổi trong tự nhiên (ở Campuchia)
tăng trọng rất ắt Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cá
trong tự nhiên 18 kg hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m Trong ao nuôi vỗ, cá bố mẹ cho ựẻ flat toi
25 kg ở cá 10 năm tuổi Nuôi trong ao 1 năm cá fiat 1-1,5 kg/con ( nim fiau tién ),
những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi ựạt tới 5-6 kg/năm tùy thuộc môi trường sống và sự cung cấp thức ăn cũng như loại thức ăn có hàm lượng ựạm nhiều hay ắt Độ béo Fulton của cá tăng dần theo trọng lượng và nhanh nhất ở những năm ựầu, cá ựực thường có ựộ béo cao hơn cá cái và ựộ béo thường giảm ựi khi vào mùa sinh sản
2.2 Ảnh hưởng của hóa chất lên sinh lý của cá
Theo nghiên cứu của đỗ Thị Thanh Hương & ctv (1997) thì ngưỡng oxy và
cường ựộ hô hấp của cá rô phi gia tăng khi tiếp xúc với thuốc ở nồng ựộ LCso
96 giờ Tiêu hao oxy của cá miệng mit trang (Catostomus commersoni) tang 2-3 lần khi tiếp xúc môi trường có chứa 0,1 mg/I methoxychlor (Waiwood & ctv,1974) Tử những cơ sở trên có thể kết luận rằng cá sống trong môi trường có thuốc trừ sâu thì ngưỡng oxy và tiêu hao oxy luôn cao hơn cá sống trong ựiều kiện không có
Theo đỗ Thị Thanh Hương Và Châu Tài Tảo (2004) khảo sát thay ựỗi 1 số chỉ tiêu
sinh lý của tôm sú (Penzews monodon) trong môi trường nuôi có nồng ựộ muối
thấp 0Ợ7qg
và 15s cho thấy tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của tôm lúc 7; 45 và 60 ngày nuôi ở các nồng ựộ muối thấp không có khác nhau Khi hóa chất tiếp xúc trực tiếp với cá tôm thì làm cản trở hô hấp của cá tôm do chúng ngăn cản hemoglobine trong tế bào
máu kết hợp với Oxy của môi trường nên không lấy ựược oxy từ môi trường
Trang 15vào cơ thể Ngoài ra chúng còn làm cho cá ắt ăn, các chỉ tiêu sinh lý và huyết học
của cá cũng bị biến ựồi (Theo đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh
Hién,2000)
2.3 Ảnh hưởng của hóa chất lên chỉ tiêu huyết học của cá
MG cũng ảnh hưởng lên chỉ tiêu huyết học như giãm tỉ lệ huyết săc tố và
cơ thể sẽ phải ựấp ứng với tình trạng thiếu máu ở cá hồi và cá trê phi (Clarias gariepinus) (Tanck và ctv, 1995) nhiều hơn so với cá không có bị thuốc Kết quả nghiên cứu của Grizzle (1977) trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm, ở nồng ựộ MG 0,1 mg/1 làm gia tăng số lượng hồng cầu và hemoglobin sau 3 ngày, hồng cầu
gidm sau
7 ngày, hematorite giàm sau 14 ngày và bạch cầu giãm sau 21 ngày (Trắch bởi đỗ
Thị Thanh Hương, 1997) Lượng hồng cầu và bạch cầu trong máu lươn ở các nghiệm thức thắ nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ gia tăng cao hơn lô fidi chứng, và mức gia tăng vẫn giữ cao thậm chắ khi cá ựược thả trở lại môi trường nước không có thuốc (Murty, 1988)
Theo kết quả nghiên cứu của đõ Thị Thanh Hương (1997) thì trong ựiều kiện
bình thường (không có thuốc) số lượng hồng câu, tỷ lệ huyết cầu và hemoglobin của
3 loài cá rô phi, mè vinh, chép có khác nhau và có thể xếp cá rô phi < mè vinh < chép Một trong những nguyên nhân có thể gây nên sự biến ựỗi hồng cầu là ựiều kiện sinh lý cơ thể cá bị thay ựỗi Khi môi trường thiếu oxy hay cá bị nhiễm ựộc thì
lượng hồng cầu từ kho dự trữ sẽ ựược huy ựộng nhằm ựảm bảo cung cấp ựủ oxy cho cơ thể hoạt ựộng Ngoài ra khi môi trường bị thay ựỗi hàm lượng huyết sắc tố,
thé tắch hồng cầu, nồng ựộ huyết sắc tố trong hồng cầu cũng phải thay ựỗi (Trắch
bởi đỗ Thị Thanh Hương, 1997)
Hồ Thị Thanh Tuyến (2008) khảo sát sự biến ựồi sinh lý, sinh hóa của cá tra
nuôi ở 2 mật ựộ khác nhau khi sử dụng kháng sinh Enrofloxacine Kết quả cho thấy số lượng hồng cầu và bạch cầu tăng sau khi cho ăn kháng sinh và trở lại bình thường sau khi cho ăn kháng sinh 7 ngày Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa
thống kê (p> 0,05)
Các chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, hemoglobin, hematocrit) của cá rô phi và cá mè vinh có sự thay ựỗi theo hướng tăng số lượng trong các nghiệm thức có thuốc
ở bể kắnh cũng như trong bể ximang sau 24h tiếp xúc với thuốc trừ sâu
Trang 16đối với cá tra bị bệnh vàng da, số lượng hồng cầu ở cá bệnh giảm hơn 50% so với cá khỏe, hồng cầu ở cá bệnh bị thoái hóa khó phân biệt tế bào chất và nhân, hoặc có những tế bào chỉ còn nhân (Phan Thị Hừng, 2004)
2.4 Ảnh hưởng của nông dược lên tắ lệ sống của cá tôm
Theo đỗ Thị Thanh Hương (1997) sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên tôm, cá rất khác nhau Cá bị chết là dấu hiệu dễ nhận biết nhất về ựộc tắnh của thuốc, tuy
nhiên nguyên nhân của nó có thể là do trực tiếp hoặc gián tiếp qua giãm khả năng bắt môi, giãm khả năng chống chịu với các thay ựôi bình thường của môi trường như: nhiệt ựộ, oxy hòa tan Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá cũng khác nhau
theo kắch cỡ, theo Mout và ctv (1992) cho biết LCso 96-giờ của ca Pimeohales
notatus ựại với Endrin là 0,27 mg/1 ựối với cá có chiều đài 30mm và 0,47 mg/I ựối với cá 60mm (trắch bởi đỗ Thị Thanh Hương,1997)
2.5 Khái quát về một số chỉ tiêu sinh lý và huyết học
2.5.1 Nguéng Oxy
Là hàm lượng oxy trong nước thấp nhất trong ựó cá có thể sống ựược đơn vị tắnh là mg oxy/I hoặc ml oxy/l Ngưỡng oxy có liên quan với cường ựộ trao ựỗi
chất, cá có cường ựộ trao ựỗi chất lớn thì ngưỡng oxy cũng cao (trắch trong bài giảng sinh lắ ựộng vật thủy sinh của đỗ Thị Thanh Hương, 2000) Thông thường cá
có cơ quan hô hấp phụ thì ngưỡng oxy sẽ thấp hơn cá không có cơ quan hô hấp phụ
2.5.2 Tiéu hao Oxy
La lượng oxy cần thiết cung cấp cho co thể cá trong một thời gian nào ựó Oon vi tinh la mg oxy/kg/h
Say là một chỉ tiêu quan trọng fié fidnh gid cuwdng ựộ trao fidi chat cha cd, khi
tiêu hóa thì oxy tăng nhưng cường fié trao fidi chat gidm (trich trong bai giang sinh lắ ựộng vật thủy sinh của đỗ Thi Thanh Huong, 2000)
Những cá có cơ quan hô hấp phụ : cá tra, trê, rô thì lượng oxy cần thiết cung
cấp cho các loài cá này sẽ thấp hơn các lồi cá khơng có cơ quan hô hấp phụ
2.5.3 Các chỉ tiêu huyết học 2.5.3.1 Hồng cau (Erythrocyte)
Trang 17thé tắch càng lớn Tuy nhiên số lượng hồng cầu biến ựộng theo tình trạng sinh lý, theo giống loài, theo chế ựộ dinh dưỡng, theo giới tắnh, theo tuổi cũng như sự biến ựộng của các yếu tố môi trường (theo S6 Thị Thanh Hương và Trần Thị
Thanh Hién, 2000)
Nhiém vu cua héng cau
Chuyển oxy từ môi trường bên ngoài vào cơ thể bằng cách Hb của tế bào máu
kết hợp với oxy tạo thành oxyhemoglobine (HbO;), nó sẽ theo ựộng mạch ựi khắp cơ thể Khi HbO; ựến tế bào, áp suất riêng phần của oxy tại tế bào thấp hon ở ựộng mạch nên oxy dễ dàng tách khỏi Hb và thắm qua màng tế bào Khả năng kết hợp của Hb với oxy khác nhau tùy loài mặc dù cùng áp suất oxy Ngoài ra sự kết hợp
này còn phụ thuộc vào áp suất COs, nhiệt ựộ, pH
Chuyển CO; từ tế bào ra môi trường bên ngoài bằng các con ựường sau:
- _ CO; trực tiếp hòa tan vào huyết tương theo nguyên tắc thâm thấu rồi thẫm ra ngoài Con ựường này chiếm 5-10%
- CO, két hop véi géc amin cua Hemoglobin hay của protein trong máu ựỂ tạo thành carbomine-hemoglobin rồi ựưa ra ngoài Con ựường này chiếm 20%
- ỷđa phân CO; ựược ựưa ra ngoài dưới dạng H-CO; theo 2 con ựường sau:
Ở các mô: CO; vào huyết tương nhanh chóng kết hợp với nước tạo ra H;COa
đưới tác dụng của men carboanhydraza phần nhỏ H;CO; phân li thành HỢ và HCO;'
Trang 18O mang: NaHCO, tach khoi hong cau va tro lai huyét tuong, H,CO; dudi
tác dụng nghịch của men carboanhydraza sẽ tạo thành CO; ựưa ra ngoài Ngoài
ra HHbO; sẽ tác dụng với KHCO: tạo ra KHbO; và H;CO; ựễ tiếp tục chu trình 2.5.3.2 Bạch cau (Leucocyte)
Bach cau là loại tế bào có nhân, kắch thước lớn hơn hồng cầu, dựa vào ựặc tắnh
bắt màu với thuốc nhuộm mà người ta chia làm 2 nhóm:
Bạch cầu có hạt: Nhân có nhiều thùy, nguyên sinh chất có hạt bắt màu, tùy theo loại màu nhuộm mà người ta chia thành các dạng như:
Bạch câu trung tinh (neutrophil leucocyte): Có nhiều trong máu ngoại vi,
giữ vai trò chủ chốt trong phản ứng viêm, có khả năng ăn những tế bào nhỏ nên
ựược gọi là tiêu thực bào
Bach câu ưa kiềm (basodophil leucocyte) Bach cau wa axid (acidophil leucocyte)
Bạch cầu không hạt: Là loại nhân không chia thành thùy, không bắt màu thuốc nhuộm, có hai loai:( 66 Thi Thanh Huong va Trần Thị Thanh Hiền, 2000)
Monocyte: Có một nhân, liên kết với các mô của cơ quan ựắch (thận, tỳ tạng,
ống tiêu hóa, ) ựể thực hiện chức năng thực bào, chỉ tồn tại vài ngày trong tuần
hoàn máu, tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên.( Ooan Nhat Phuong,
một số vẫn ựè về huyết học trên cá)
Trang 19Lymphocyte
Trang 20Chức năng của bạch câu
Bảo vệ cơ thể chống sự xâm nhập của vi khuẩn bằng phương thức thực bào (do
monocyte và neutrophil leucocyte) và tạo kháng thể (do lymphocyte) Ở các nơi
viêm nhiễm sinh ra chất polypeptide gọi là leucotaxin có tác dụng hấp dẫn bạch cầu ựiến, ngoài ra loại protein này làm tăng tắnh ngắm của mao quảng khiến cho bach cầu tập trung nhanh vào vị trắ tác dụng Ngoài ra có tác giả cho răng KỢ ở dịch tế
bào tăng mạnh khi viêm nhiễm sẽ là tắnh hiệu thong báo cho bạch cầu
Góp phân vào quá trình rụng trứng: Bạch cầu chui vào màng folicul làm cho tế bào trở nên xốp hơn, tiếp theo chúng tiết ra enzyme phân giải protein làm protein tế bào kẻ trở nên lỏng lẻo và cuối cùng mang nhây vỡ ra và trứng rụng
Góp phần vào quá trình tiêu hóa: Khi cá ăn bạch cầu tập trung ở mao quản thành ruột, chúng tiết ra men phân giải protein, lipid, glucid Ngoài ra chúng còn
thực bào các hạt mỡ chưa ựược nhủ tương rôi ựưa vào máu 2.5.3.3 Hematocrit (tắ lệ huyết cầu)
Là tỉ lệ về thể tắch giữa tế bào máu và huyết tương Tỉ lệ huyết cầu thay ựồi
theo giống loài và ựiều kiện dinh dưỡng Thông thường chiếm 27% (biến ựộng 16-
36%) (trắch trong bài giảng sinh lý ựộng vật thủy sinh của đõ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền,2000) Ý nghĩa của việc xác ựịnh hematorite là ựể biết có hay
không có sự tăng, giãm hay bình thường của tế bào hồng cầu Hematorite ựặc trưng
cho số lượng hồng cầu Vì thế ựo hematorite ựê biết ựược tình trạng sinh lý của cơ
thé cá: Cá bệnh thì ty lệ hematorite thấp hơn cá khỏe do số lượng hồng câu giãm
Hình 2.3: Cách xác ựịnh tỉ lệ huyết cầu 2.6 Khái quát về Malachite Green (MG)
2.6.1 Khái niệm MG
Malachite Green (MG) có tên hóa học là Triphenylmethan MG là một loại
bột rất mịn, có màu xanh ựược dùng ựê nhuộm tơ, vải, giẫy và da trong ngành công
Trang 21nghiệp MG cũng ựược dùng trong phòng thắ nghiệm ựể nhuộm vi trùng và bào tử
của nó (fistenet)
2.6.2 đai cương về MG
Tên quốc tế: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl methyl]-N, N-dimethyl-aniline Công thức phân tử: C;;H;zC1N;
Công thức cấu tạo
Source: http://chemistry, tidalswan.com
Cấu trúc cia MG giải thắch những tắnh chất hóa học và sinh học của chúng,
như là: Chúng có thể hấp thụ vào trong cơ thé và những phản ứng của chúng như
thế nào
MG thì thường ựược biết ựến như 1 loại phẩm nhuộm màu xanh Tuy nhiên khi ựược hấp thụ vào trong cơ thể dưới tác ựộng của các cơ chế của cơ thể nó sẽ bị biến ựồi thành 2 dạng quan trọng Dạng ựầu tiên là Carbinol, dạng này rất quan
trọng bởi vì nó che phủ màng tế bào rất nhanh Khi vào bên trong tế bào thì nó sẽ
kết hợp với quá trình trao ựỗi chất và biến thành dạng Leuco MG (LMG) Dạng này
có ựộc tắnh và tồn lưu trong cơ thể lâu hơn so với dạng phẩm nhuộm MG (wikpedia) 2.6.3 Ảnh hưởng của MG
Một nghiên cứu về ựộc tắnh của MG và LMG ựược tiến hành trong thời gian 2 năm của Trung tâm nghiên cứu độc tố Quốc gia Hoa kỳ cho thấy có biểu hiện gây ung thư của LMG trên chuột nhất cái độc tố của các sản phẩm MG chịu ảnh hưởng
của nhiêu yếu tố khác như: nhiệt ựộ, pH, ựộ cứng va oxy hòa tan của nước MG còn
Trang 22giãm khả năng sinh sản cua cd héi (Oncorhynchus mykiss) (Amlacher,1961) Bill etal (1977) fia lam 1 nghiên cứu chỉ tiết về LCso của MG trên nhiều loài cá ở giai ựoạn giống và trưởng thành và quan sát ảnh hưởng của pH, nhiệt ựộ, và thời gian gây nhiễm lên ựộ ựộc của loại hoá chất này
Bảng 2.1: Giá trị LCso của MG ựối với 1 số loài cá ở nhiệt ựộ và pH khác nhau Loài cá LC50 (mg/1) pH TC Thời gian (h) Channel catfish 0.238 7.5 22 6 0.960 7.5 12 6 0.4 7.5 22 6 0.519 9.5 12 6 1.72 8.0 12 6 1.3 8.0 12 6 0.286 8.0 12 24 Rainbow trout 1.4 7.5 12 3 2.35 8.0 12 3 6.8 8.0 12 6 Freshwater catfish 5.60 7.7 22 24 1.40 7.7 22 48 1.25 7.7 22 72 1.0 7.7 22 96
Nghiên cứu này cho rang ựộc tắnh của Malachite Green sẽ tăng lên khi nhiệt
ựộ cao Sự quan sát tương tự cũng ựược tiễn hành bởi Alderman and Polglase
(1984) Srivastava et al (1995a) cũng quan sát sự thay ựỗi của giá trị LC50 của Malachite Green ở những loài cá da trơn ở nước ngọt Heferopneustes Ặossilis tại những khoảng thời gian khác nhau và tuyên bố rằng ựộ ựộc của Malachite Green sẽ tăng theo thời gian gây nhiễm
Trang 23Một vài nghiên cứu ựã cho thấy rằng Malachite Green cé tinh fidc cao fiéi voi những loài cá nước ngọt, ở cả tình trạng cấp tắnh và mãn tắnh (Steffens et al., 1961) MG cũng là I chất ựộc ựối với ựường hô hấp (Wcrth, 1985)
2.6.4 Ứng dụng của MG
2.6.4.1 Trong ngành công nghiệp
MG ựược dùng ựễ nhuộm các nguyên vật liệu như da,tơ,vải,sợi và giấy Ngoài
ra MG cũng ựược dùng trong phòng thắ nghiệm ựỂ làm dung địch nhuộm vi
khuẩn,và bào tử của nó,làm chỉ thị màu pH; chuyển màu ở pH = I: vàng (axit), xanh
lục (kiềm)
2.6.4.2 Trong thủy sản
MG ựược xem là chất sát trùng, diệt nam (loai saprolegnia ssp) va sat kắ sinh trùng nhóm nguyên sinh ựộng vật (protzoa), tăm cá, sát trùng ao hồ MG ựược sử
2 `
ot Oo 9
punctatus) (Leteux and Meyer, 1972;2001) Theo kết quả nghiên cứu cla Molnar
(1995) MG fiuoc st dung fié tri bénh nhiém tring do giun sdn (Dactylogyrus
vastator) 6 cd chép (Cyprius carpio) MG là 1 hóa chat có hiệu quả trong việc ựiều
trị bệnh cá và rẻ tiền nên MG luôn ựược các hộ nuôi thủy sản sử dụng nhiều dẫn ựến việc hóa chất này ựã bị phát hiện còn tồn lưu bên trong cơ thể của 1 số loài thủy sản 2.6.5 Tình hình sử dụng MG trên thề giới
MG là 1 chất rẻ tiền, dễ tìm mà lại cho kết quả rất tốt trong nuôi thủy sản Các
chất thay thế MG thì hiếm thấy, khó mua va fiat tién cho nén 1 số người nuôi cá ở các quốc gia Á châu và VN vẫn còn sử dụng chất xanh Malachite một cách bất hợp pháp Ngoài ra sự kiện dùng cá và mỡ cá ựã bị nhiễm MG ựê làm thức ăn cho nuôi
thủy sản cũng là l trong nhiều nguyên nhân làm lây nhiễm MG ở các lòai cá tôm
nuôi
Hiện nay trên thế giới, chất ựược cho phép thay thế MG là chất Bronopol (Pyceze, Onyxide 500) đây là 1 chất diệt khuẩn, sát nắm nhưng không gây ung thư
Không có giới hạn về dư lượng của Bronopol Tại Âu châu và Bắc Mỹ, Bronopol phải cần có toa của bác sĩ thú y mới mua ựược Tại Canda, ngoài chất Pyceze cũng
có 1 vài chất khác cũng ựược cho phép sử dụng như là dung dịch formaldehyde có chứa methalnol ựễ ngừa sự tạo ra paraformaldehyde rất ựộc cho cá, dùng tắm cá fié
ngừa ký sinh trùng trên da hay trên mang cá, Perox-Aid (peroxide hydrogene) có tắnh diệt nắm nhiễm trứng cá, Ovadine dùng như 1 chất sát trùng cho trứng cá
Trang 24Tại Canada trước 1992, các trại sản xuất cá giống cũng thường sử dụng MG
ựễ ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nắm Ngày nay, Canada cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong ựó có Trung quốc và Việt Nam ựều cắm nghiêm ngặt
việc dùng chất MG trong NTTS Chloramphenicol, Nitrofuran, xanh Malachite ựược thấy liệt kê trong danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản VN (fistenet)
2.6.6 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi cá tra ở OBSCL
Về tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra theo nghi nhận của Phạm Thanh Tuấn (2004) thì có 90 loại thuốc, hóa chất ựược sử dụng trong nuôi
trồng thủy sản với các mục ựắch như diệt tạp, xử lý nước và trộn vào thức ăn ựễ
phòng và trị bệnh đối với các kháng sinh trị bệnh cho tôm ,cá có 58 loại thì hầu hết năm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại hạn chế sử dụng và nguồn gốc
không rõ ràng, riêng MG là chất nằm trong danh mục cẫm nhưng vẫn ựược người nuôi sử dụng Theo ựiều tra của Phạm Thanh Tuấn (2004) thì ở đồng Tháp người
dân sử dụng MG làm chất cải tạo hệ thống nuôi, với bè thì chiếm 23,3%, với ao ựến
32% Trong trị bệnh thi MG ựược sử dụng 17,5% ựồi với cá nuôi bè và 24% ựồi với
cá nuôi ao Một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang thì cho
biết không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tắch thì phát hiện 10/64 mẫu cá thương phẩm và nồng ựộ tôn lưu là 2-4,9 ppb và ựối với cá ựang nuôi
thì phát hiện 9/30 mẫu kiểm tra với nồng ựộ tồn lưu là 2,4Ở4,8 ppb ( Nguyễn Chắnh,
2005)
2.6.7 Khả năng tồn lưu của MG
Theo quy ựịnh của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng
sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên Quá trình theo dõi sự tồn lưu và phân tắch sự tồn lưu MG trị bệnh kắ sinh trùng cho thấy (theo Dương Hải Toàn, trắch dẫn: www.vietlinh.com.vn)
- Sau 1 thang str dung MG con tén luu trong co thé 35 ppb - Sau 2 tháng sử dụng MG còn tôn lưu trong cơ thể 10 ppb
- _ Sau 3 tháng sử dụng MG còn tồn lưu trong cơ thé 0 ppb nhưng dẫn xuất
của MG là Leucomalachite green thì vẫn còn
Theo kết quả nghiên cứu của Lương Thị Diễm Trang (2009) hàm lượng MG
phát hiện trong cá ở nông ựộ: 0,1 và 0,15 ppm cho thấy sau 28 ngày gây nhiễm nồng
ựộ MG thão hơn mức ấn ựịnh dư lượng tối ựa của MG và LMG (không ựược vượt quá hai phần tỉ) trong sản phẩm thủy sản của các quốc gia trong khối Liên
Trang 25hiệp
Trang 26Chau Au va Chau Uc (Quyét fiinh s6 2002/657/EC ngày 22/12/2003) Trong khi ựó
ở Hoa Kỳ Cânda thì áp dụng cho nguyên tắc Ộzero toleranceỢ nghĩa là không chấp
nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG trong
sản phẩm (khoahoc)
Trang 27Phan 3:
VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Dụng cụ
-_ Bể hình chữ nhật 500 lắt
- - Máy sục khắ, máy ựo oxy, bình 2 vòi
- _ Kim tiêm Iml, ống ựong, bình ựịnh mức
- Lame, lamel
- Pipet
- Lo nhuodm tiéu ban
- Kinh hién vi, ống hematorite, cuvet - May so mau quang pho
- May li tam Sigma 201m
- Budng ựếm hồng cầu Neubauer cai tién
Các hóa chất dụng cụ và phương tiện sử dụng trong phòng thắ nghiệm bộ môn
Trang 283.1.3 ỏối Tượng Nghiên Cứu
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thắ nghiệm mua từ trại cá giống ở Cần
Thơ có khối lượng từ 25-30g/con Chọn cá có màu sắc tươi sáng tự nhiên, hoạt ựộng khỏe mạnh, không bị dị tật và không có dấu hiệu bệnh tật ựễể bố trắ cho các thắ nghiệm
Cá khi mua về sẽ ựược giữ lại trong bể từ 7-10 ngày cho quen với ựiều kiện
sống trong bể và môi trường nước mới Chọn ra những cá thể ựồng cỡ ựể
thắ nghiệm
Hình 3.1: Cá Tra giỗng (Pangasianodon hypophthalmus) 3.1.4 Thức ăn
Thức ăn sử dụng trong thắ nghiệm là viên dạng nỗi có hàm lượng ựạm 30%,
Trang 293.2 Bồ trắ thắ nghiệm
3.2.1 Thắ nghiệm: Xác ựịnh sự ảnh hưởng của MG lên các chỉ tiêu sinh lý(tiêu hao oxy và ngưỡng oxy) của cá Tra
Thắ nghiệm ựược tiến hành trong bình kắn 2 vòi với thể tắch là 2 lắt
Hình 3.3: Hệ thống thắ nghiệm tiêu hao oxy và ngưỡng oxy
Tiến hành cho cá vào bình kắn 2 vòi (1 con/bình ựối với thắ nghiệm tiêu hao
oxy, 2 con/bình ựối với thắ nghiệm ngưỡng oxy) ựược ựặt trong bể nước MG
ựược cho vào hệ thống với các nồng ựộ thắ nghiệm Nước có chứa MG từ bể ựược bơm qua vòi của bình sao cho nước trong bề chứa và bình kắn chảy tuần hoàn trong vòng
1 giờ Sau ựó bịt kắn các ống dây của bình ựê tiến hành xác ựịnh tiêu hao oxy và
ngưỡng oxy của cá
Thắ nghiệm gồm có 4 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức ựược lặp lại 6 lần
- _ Nghiệm thức 1: Cá không tiếp xúc MG (ựối chứng)
- _ Nghiệm thức 2: Cá ựược tiếp xúc MG với nông ựộ 0,15ppm
- _ Nghiệm thức 3: Cá ựược tiếp xúc MG với nông ựộ 0,3ppm
- - Nghiệm thức 4: Cá ựược tiếp xúc MG với nồng fi6 0,45ppm
Xác ựịnh ngưỡng oxy: Khi cá chết 50% thì tiến hành thu nước trong bình
kắn cho vào chai nút mài 125ml Hàm lượng oxy hòa tan ựược phân tắch theo
phương pháp Winlers Hàm lượng oxy xác ựịnh ựược chắnh là ngưỡng oxy của cá Xác ựịnh tiêu hao oxy: Hàm lượng oxy hòa tan trong bình kắn ựược xác ựInh trước khi tiến hành thắ nghiệm và sau khi bịt kắn vòi của bình 30 phút Tiêu hao oxy
của cá ựược tắnh băng công thức sau:
THO (mgOz/Kg/giờ) = [(O;ự Ở O;c) x (Vb~ Ve)]/(P x Đ
Trang 30VỚI:
- THO: Tiêu hao oxy
- O;ự: Hàm lượng oxy trong nước trước thắ nghiệm (mg/L)
- O;c: Hàm lượng oxy trong nước cuối thắ nghiệm (mg/L) - Vb: Thể tắch bình (L)
- Vc: Thể tắch cá (L)
- M: Khối lượng cá thắ nghiệm (kg)
- t: Thời gian thắ nghiệm (g1ờ)
3.2.2 Thắ Nghiệm: : Xác ựịnh sự ảnh hưởng của MG lên các chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, bạch cầu, hematorite, MVC )
3.2.2.1 Thắ nghiệm 1: Cá Tra tiếp xúc với MG ở các nồng ựộ và thời gian dài Thắ nghiệm ựược bố trắ trong hệ thống bể composite loại 500 lắt, mỗi bề bố trắ ngẫu nhiên 50 cá thể Cá thắ nghiệm ựược thuần dưỡng trong bề từ 7-10 ngày Sau ựó
chọn cá ựều cỡ và không cho cá ăn l ngày trước khi chuyên vào hệ thống thắ
nghiệm Cá ựược xác ựịnh khối lượng và chiều dài trước khi thắ nghiệm
Thắ nghiệm bao gồm 3 nghiệm thức gây nhiễm MG với nồng ựộ khác nhau và
I nghiệm thức ựối chứng, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Các nghiệm thức thắ
nghiệm gồm:
- - Nghiệm thức 1: Cá không gây nhiễm MG (ựối chứng)
- _ Nghiệm thức 2: Cá ựược gây nhiễm MG với nông ựộ 0,15ppm - _ Nghiệm thức 3: Cá ựược gây nhiễm MG với nồng ựộ 0,3ppm - _ Nghiệm thức 4: Cá ựược gây nhiễm MG với nông ựộ 0,45ppm Phương pháp gây nhiễm MG
Tiến hành cho MG vào bể thắ nghiệm với mực nước ban ựâu là 300L ựễ ựạt các nồng ựộ thắ nghiệm Sau 2 ngày thì tiễn hành thu mẫu lần 1 và thay 30% thể tắch
nước Hai tuần sau khi thu mẫu lần 1 thì tiến hành thu mẫu lần 2 Mỗi lần thu ngẫu
nhiên 3 cá/bễ Sau khi thu mẫu máu tiến hành xác ựịnh khối lượng và chiều dài từng
mẫu cá
Trang 313.2.2.2 Thắ nghiệm 2: Cá Tra tiếp xúc với MG ở các nồng ựộ và thời gian tức thời
Thắ nghiệm ựược bố trắ trong hệ thống bể composite loại 500 lắt, mỗi bề bố trắ
ngẫu nhiên 50 cá thể Cá thắ nghiệm ựược thuần dưỡng trong bề từ 7-10 ngày Sau ựó
chọn cá ựều cỡ và không cho cá ăn l ngày trướckhi chuyển vào hệ thống thắ
nghiệm Cá ựược xác ựịnh và chiều dài trước khi thắ nghiệm
Thắ nghiệm bao gém 3 nghiệm thức gây nhiễm MG với nồng ựộ khác nhau và l nghiệm thức ựói chứng, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Các nghiệm thức thắ nghiệm gồm:
- _ Nghiệm thức 1: Cá không gây nhiễm MG (ựối chứng)
- _ Nghiệm thức 2: Cá ựược gây nhiễm MG với nông ựộ 0,15ppm - _ Nghiệm thức 3: Cá ựược gây nhiễm MG với nồng ựộ 0,3ppm - _ Nghiệm thức 4: Cá ựược gây nhiễm MG với nông ựộ 0,45ppm Phương pháp gây nhiễm MG
Ha 30% thể tắch nước ban fidu (với thể tắch nước ban ựầu là 300L) va cho MG vao fié fiat các nồng ựộ thắ nghiệm Sau 6 giờ thì nang mực nước lên bình thường Sau 2 ngày thì tiến hành thu mẫu lần l và thay 30% thể tắch nước Hai tuần sau khi thu mẫu lần 1 thì tiễn hành thu mẫu lần 2 Mỗi lần thu ngẫu nhiên 3 cá/bề Sau khi thu mẫu máu tiến hành xác ựịnh khối lượng và chiều dài từng mẫu cá 3.3 Phương pháp thu mẫu
3.3.1 Theo dõi môi trường
- _ Nhiệt ựộ, pH trong bỂ ựược ựo 2 lần /ngày vào các thời ựiễm 8 giờ và 14 gio
- _ Các yếu tố môi trường TAN, Nitrite, Nitrate thu I lần/tuần - NO; : Được phân tắch theo phương pháp griess llosvay - NO; : Được phân tắch theo phương pháp salyc1late
- _NH//NH;: được phân tắch theo phương pháp indophenol blue - - Thay nước: Nước ựược thay 30%, 2 ngày I lần
Trang 323.3.2 Phuong phap thu mau cá
C4 fiwoc thu ngau nhién tir cdc bé thi nghiém, méi lan thu 3 con/bé
Thu mẫu phân tắch huyết học: Thu mẫu máu ựê phân tắch các chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, bạch cầu, hematorite, MVC ) Máu ựược lẫy ở ựộng mạch chủ
bằng ống tiêm Iml sau ựó cho máu vào ống eppendorf và trữ lạnh trong suốt thời
gian thu mẫu Mẫu máu sau ựó ựược dùng ựê xác ựịnh số lượng hồng cầu; làm tiêu
bản ựễ xác ựịnh số lượng bạch câu; và xác ựịnh tỉ lệ huyết sắc tố 3.4 Phương pháp pha dung dịch MG thắ nghiệm
- Chuẩn bị dung dịch gốc (20.000 ppm): Cân 2g MG pha vào 100ml nước cất khuấy ựiều cho ựến khi MG tan hòan tòan trong nước
- _ đÊ pha ựược các nồng ựộ thắ nghiệm từ dung dịch gốc thì áp dụng công thức sau: C;Vị =C;V; Với: C¡: Nong ựộ MG ban ựầu C,: Nong ựộ MG cần pha Vị: Thể tắch nước cất ban ựầu V;: Thể tắch nước cần pha 3.5 Phương pháp phân tắch mẫu huyết học 3.5.1 Phương pháp ựếm hồng cầu
Lẫy 5 uL máu pha lõang 200 lần bằng dung dich Natt & Herrick trong 3 phút Số lượng hồng cầu ựược xác ựịnh bằng buồng ựếm Neubauer cải tiến
Hình 3.4: Vị trắ ựếm hồng cầu
Trang 33Công thức tắnh mật ựộ hồng cầu H (ế bào) = (C x 200)/(80 x 0,00025 x 10ồ) Với: H: Là mật ựộ hồng cầu (tế bào) C: Tổng số hồng cầu ựếm ựược 80: Số ô ựế 0,00025: Thể tắch mỗi ô ựếm
3.5.2 Phương pháp xác ựịnh tế bào bạch cầu
Cho một giọt máu lên góc lame va dung lamel ựễ dàn ựều mẫu máu về phắa
trước Nhanh chóng làm khô mẫu máu bằng cách ựặt trước gió Mẫu ựược cố
fiinh bằng cách ngâm lame mẫu trong methanol 1 phút và sau ựó ựễ khô tự nhiên
trong 15 phút Mẫu ựược nhuộm theo phương pháp của Humason, 1979 (trắch dẫn bởi Rowley, 1990) với qui trình như sau:
- Nhuộm voi dung dich Wright trong 3 phtt
- Nhúng qua nước cất
- Ngâm trong dung dịch pH 6.2-6.8 trong 5 phút - Nhúng qua nước cất
- Nhuộm trong Giếma trong 10 phút
- Ngâm trong dung dịch pH 6.2 trong 10 phút
- Nhúng qua nước cất 3 lần
Phương pháp ựém số lượng bạch cầu
Sau khi nhuộm, tiêu bản ựược quan sát dưới kắnh hiển vi ở vật kắnh 100X, các loại tế bào bạch cầu sẽ ựược xác ựịnh theo mô tả các loại bạch cầu của Chibabut et al (1991) Số lượng bạch cầu ựược xác ựịnh bằng tỉ lệ bạch cầu ựễm ựược trên 1500
tế bào hông cầu có trên tiêu bản sau ựó nhân cho tông số hồng cầu có trong l ựơn vị
thể tắch máu (Hrubec et al., 2000)
Công thức tắnh các tế bào bạch cầu Tổng số bạch cầu/mmỳ = (C* A )/1500
Trong ựó: C: là số lượng bạch cầu ựếm ựược A: số lượng héng cau trong 1 mmỢ
Trang 343.5.3 Phuong phap fio Hematocrit (ti lệ huyết sắc tố %)
Mẫu máu ựược cho vào Hematocrit tube, sau ựó ly tâm Hematocrit tube bằng máy ly tâm Sigma 201m trong 2 phút với tốc ựộ 12.000 vòng/phút Dùng thước ựo
có chia vạch ựỂ xác ựịnh tỉ lệ huyết sắc tố 3.5.4 Công thức tắnh thế tắch hồng cầu (MCV)
MCV(_ Ỳ): 10 x [t lệ huyết cầu (%)/số lượng hồng cầu (10Ợ/mm?)]
3.6 Phương pháp xứ lắ số liệu
Các số liệu ựược tắnh giá trị trung bình, tắnh ựộ lệch chuẩn và sai số chuẩn Sự
khác biệt giữa các nghiệm thức ựược phân tắch bằng ANOVA 1 nhân tố theo sau là
phép thử DUCAN sử dụng phần mềm Exel và SPSS
Trang 35Phan 4:
KET QUA VA THAO LUAN
4.1 Thắ nghiệm ảnh hướng của MG lên các chỉ tiêu sinh lý (tiêu hao oxy và ngưỡng oxy) của cá Tra
4.1.1 Ảnh hướng của MG lên tiêu hao oxy
Cường ựộ hô hấp của cá có sự thay ựỗi khi cá tiếp xúc với MG ở các nồng
ựộ khác nhau Kết quả cho thấy cường ựộ hô hấp trung bình của cá ở nghiệm thức
0,15 ppm 1a 154,45 mgO;/kg/piờ, nghiệm thức 0,3 ppm 1a 115,68 mgQO,/kg/gio, nghiệm thức 0,45 ppm là 108,65 mgO;z/kg/giờ Như vậy cường ựộ hô hấp của cá ở nghiệm thức có hóa chất giảm so với nghiệm thức ựối chứng là 158 mgO;z/kg/giờ
Tuy nhiên ở nghiệm thức 0,3 và 0,45 ppm thì sự suy giảm có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 0,15 ppm và nghiệm thức ựối chứng điều này có thể lý giải là do
MG là 1 hóa chất cản trở hô hấp của cá nên nông ựộ càng cao thì sự cản trở hô hấp
càng tăng vì thế cá tăng cường trao ựỗi oxy ựÊ có ựủ oxy cung cấp cho cơ thể nên
tiêu hao nhiều
Trang 364.1.2 Ảnh hưởng của MG lên ngưỡng oxy
Kết quả ở hình 4.2 cho thấy ngưỡng oxy của cá khi tiếp xúc với MG có xu hướng tăng lên theo sự gia tăng nồng ựộ trong khi ựó cường ựộ hô hấp của cá lại giảm theo sự gia tăng nồng ựộ thuốc (hình 4.1) Kết quả cho thẫy ngưỡng oxy trung bình của nghiệm thức 0,15 ppm 1a 2,08 mg/l, nghiém thitc 0,3 ppm là 1,62 mgi], nghiêm thức 0,45 ppm 1a 2,37 mg/l Nhu vay ngưỡng oxy của cá ở nghiệm thức có thuốc tăng dần so với nghiệm thức fidi chimg 14 1,92 mg/l Tuy nhiên ở nghiệm thức
0,45 ppm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 0,15 ppm và nghiệm
thức ựối chứng Sỡ dĩ nghiệm thức 0,3 ppm là do trong quá trình thắ nghiệm ở
nghiệm thức này thì nhiệt ựộ ựã giãm xuống chỉ còn 26ồC, trong khi ựó các nghiệm
Trang 374.2 Thắ Nghiệm: Xác ựịnh sự ảnh hướng của MG lên các chắ tiêu huyết hoc (hong cau, bach cầu, hematorite, MCV )
4.2.1 Thắ nghiệm 1: Cá Tra tiếp xúc với MG ở các nồng ựộ và thời gian dài 4.2.1.1 Các chỉ tiêu môi trường
a) Nhiệt ựộ, pH
Các yếu môi trường như nhiệt ựộ, pH của các bể thắ nghiệm không biến fidng
lớn và nằm trong giới hạn thắch hợp cho cá tra (bảng 4.1) Nhiệt ựộ tương ựối 6n ựịnh, nhiệt ựộ trung bình giữa các nghiệm thức ở fiot 1 dao ựộng từ 28,31-28,59ồC
và ựợt 2 dao ựộng từ 27,65-27,8ồC ựối với buổi sáng đối với buổi chiều, ựợt I dao
ựộng từ 28,94-29,46ồC và ựợt 2 dao ựộng từ 28,48-28.71ồC, pH nhìn chung không có sự khác biệt lớn, vẫn nằm trong khoảng thắch hợp của cá Ở ựợt l dao ựộng từ 7,93-7,99 va fiot 2 dao ựộng từ 7,87-8,06 ựối với buổi sáng đối với buổi chiều ở fiot 1 pH dao ựộng từ 7,93-7,95 và ựợt 2 dao ựộng từ 7,76-7,89 Sự dao ựộng của các yếu tố môi trường không lớn là do thắ nghiệm ựặt trong nhà có mái che và ựược sục khắ liên tục Bảng 4.1: Biến ựộng nhiệt ựộ, pH của các bể thắ nghiệm Nhiệt ựộ pH Nghiệm thức | Tuân Sáng Chiêu Sáng Chiêu 1 28,37+0,34 | 29,18+40,75 | 7,9940,14 | 7,95+0,20 Oppm 2 27,8+0,51 | 28,71+0,61 | 7,87+0,31 7,83+0,21 1 28,33+0,32 | 28,94+0,62 | 7,96+0,18 | 7,93+0,15 0,15ppm 2 27,65+0,52 | 28,68+0,56 | 8,06+0,39 | 7,89+0,28 1 28,31+0,37 | 29,18+0,73 | 7,93+0,20 | 7,95+0,19 0,3ppm 2 27,6640,49 | 28,48+0,62 | 7,9+0,34 7,76+0,26 0,45ppm 1 28,59+0,25 | 29,46+0,53 | 7,93+40,26 | 7.,93+0,20
Ghỉ chú: Tuần 1 là trung bình của 7 lân ựo từ ngày 1 ựên 7 và tuần 2 là trung bình cua 7
lan ựo từ ngày 8 ựễn 15
Trang 38b)Oam TAN
Kết quả ở hình 4.3 cho thấy hàm lượng t6ng fiam ammonia của các nghiệm
thức trong suốt quá trình thắ nghiệm dao ựộng trong khoảng 0,24-3,07ppm Theo
Trương Quốc Phú (2006) thì nông ựộ TAN ựược coi là an toàn cho ao nuôi là 0,13mg/I và nồng ựộ N-NH; từ 0,6-2,0 ppm gây ựộc ựối với cá Hàm lượng TAN trong bể qua các lần thu của thắ nghiệm là cao hơn giới hạn thuận lợi cho cá Tuy nhiên ở nồng ựộ 0,45 ppm lần thu 2 và 3 không có số liệu là do cá chết Á - 3.5 - q- = 25 4 H Lần 1 E 2] @ Lan2 = À = 15 4 Lân 3 RE HH Sete eee L1 k 1 Lt ae eee ee ee nnmm" ẹ 0,15 0,3 0,45 Nông ựộ MG Hình 4.3: Biến ựộng hàm lượng TAN ở các nghiệm thức theo lần thu ((lan 1: ngay thứ 7, lần 2 là ngày thứ 14 và lần 3 ngày thứ 21) Nitrite
Hình 4.4 cho thấy hàm lượng N-NO; trung bình theo nghiệm thức qua các lần
thu dao ựộng từ 0-0,59mụg/I đạm nitrite rất ựộc ựối với vật nuôi và hàm lượng ựạm
nitrite qua các lần thu cũng tương ựối thấp do hàm lượng oxy hòa tan tương ựối
cao Theo Lê Văn Cát và ctv (2006) khi hàm lượng oxy ựủ thì nông ựộ cua nitrite
it khi vot qué 0,5mg/l Tuy nhién ở nồng ựộ 0,45 ppm lần thu 2 và 3 không có số
liệu là do cá chết
Trang 39_ + pf | <= 0.8 + ẹ Lan 1 E x 5 0.6 Lân 2 =a Lần 3 = 0.4 0.2- 0 4 0 0,15 0,3 0,45 Nông ựộ MG Hình 4.4: Biến ựộng hàm lượng nitrite ở các nghiệm thức theo lần thu (lần 1: ngày thứ 7, lần 2 là ngày thứ 14 và lần 3 ngày thứ 21) Nitrate
Trang 404.2.1.2 Sự biến ựỗi các chắ tiêu huyết học của cá trong quá trình thắ nghiệm a) Biến ựộng số lượng hồng cầu
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức trong cùng lần thu mẫu tăng dân theo nồng ựộ nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê
Số lượng hồng cầu trong cùng nghiệm thức cũng có chiều hướng tăng dân theo lần thu và khác biệt không có ý nghĩa thống kê Thế nhưng ở lần thu mẫu thứ 3 nghiệm thức 0.3 ppm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lần thu mẫu thứ nhất Theo
Grizzle (1977) thì ở nồng ựộ MG 0.1 ppm sẽ làm gia tăng số lượng hồng cầu sau 3
ngày (trắch dẫn bởi đỗ Thị Thanh Hương, 1997) Theo đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền (2000) chất ựộc hóa học có trong nước ảnh hưởng ựến quá trình hô hấp của cá vì thế ngăn cản quá trình trao ựỗi khắ giữa nước và máu nên cá sẽ gia tăng hoạt ựộng hô hấp dẫn ựến tăng cường ựộ trao ựồi oxy vì vậy
lượng hồng cầu tăng lên ựễ có thể lẫy oxy từ môi trường nước vào cơ thé Theo
Nguyễn Văn Công (2000) cá hô hấp càng nhiều thì sẽ hấp thu nhiều chất ựộc vào máu nên cá chết ở nồng ựộ cao Ở nghiệm thức 0,45 ppm không có số liệu ở lần thu thứ 3 do cá chết Bảng 4.2: Số lượng hồng cầu (10Ợ tb/mm?) của cá trong quá trình thắ nghiệm Lần thu Nghiệm thức 0 ppm 0,15 ppm 0,3 ppm 0,45 ppm Trước thuốc Ở-2s34+0,51ồ* Ở-2,5740,71"" Ở-2,42+0,5%* 2/39+0,78ồ* 2 ngày txthuốc 2.4lẬ0,912ồ 2,320,822" 2,220,612*ồ -2,20,99"" 16 ngày tx thuốc 2:9+0,43''Ợ 340,082 2,98+0/33"
Số liệu trình bày trung bình + ựộ lệch chuẩn
Các giá trị cùng hàng theo cùng chữ cái (a, b, c, d) thì khác biệt không có ý nghĩa thông kê (p> 0,05) Các giá trị cùng cột theo cùng chữ cái (A, B, C, D) thì khác biệt không có ý nghĩa thông kê (p> 0,05)
b) Biến ựộng số lượng bạch cầu
Trong cùng lần thu mẫu giữa các nghiệm thức có thuốc thì số lượng bạch cầu
nghiệm thức ựối chứng nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê Nghiệm thức
0,3 ppm giãm nhiều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức ựối chứng và nghiệm thức 0,15 ppm Theo Lê Nguyễn Hạnh đoan (2008) ựã nghiên cứu và kết