Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K44 CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Văn Hạnh Phịng Cơng nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp với nỗ lực cá nhân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: TS Nguyễn Văn Hạnh, Th.S Vi Đại Lâm, Th.S Đỗ Trung Kiên Th.S Lê Bắc Việt, người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc phịng Cơng nghệ phôi - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên,20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Đình Duy Khanh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 15 Bảng 3.2: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-2 18 Bảng 3.3: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 P2 tạo đoạn gene P1-2 18 Bảng 3.4: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P5-6 20 Bảng 3.5:Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P5 P6 để tạo đoạn gene P5-6 21 Bảng 3.6: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt sản phẩm tinh PCR đoạn gene P1-2 P5-6 21 Bảng 3.7: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-6 22 Bảng 3.8: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 P6 để tạo đoạn P1-6 23 Bảng 3.9: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P3-4 23 Bảng 3.10: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P3 P4 để tạo đoạn P3-4 24 Bảng 3.11: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt sản phẩm tinh PCR đoạn gene P1-6 P3-4 24 Bảng 3.12: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt vector pTet-Dual OFF hai enzyme BamHI HindIII 25 Bảng 3.13: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt P16-34 pTRE-Tight-BI hai enzyme BamHI HindIII 26 Bảng 3.14: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 27 Bảng 3.15: Chu trình nhiệt PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 27 Bảng 3.16: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt DNA plasmid pTet-Dual OFF sản phẩm PCR pTRE-Tight-BI hai enzyme PspXI XhoI 28 Bảng 3.17: Tỉ lệ thành phần PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp 30 Bảng 3.18: Tỉ lệ thành phần phản ứng nối sau cắt enzyme cắt 32 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc vector pTet-Dual-OFF (Catalog No 631113) Hình 2.2: Cơ chế hoạt động pTet-Dual-OFF Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI (Catalog No 631068) Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết tinh DN muỗi Aedes aegypti 33 Hình 4.2a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P1-2 34 Hình 4.2b: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P1-234 Hình 4.3a: Kết giải trình tự đoạn gene P1-2 35 Hình 4.3b: Kết so sánh giải trình tự đoạn gene P1-2 với đoạn gene Tra-2 RNAi35 Hình 4.4a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 36 Hình 4.4b: Kết tinh sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 36 Hình 4.5a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P5-6 37 Hình 4.5b: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P5-6 37 Hình 4.6a: Kết điện di sản phẩm cắt P1-2 P5-6 enzyme SalI 38 Hình 4.6b: Kết điện di sản phẩm tinh P1-2 P5-6 sau cắt enzyme SalI 38 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm cắt P3-4 P5-6 Acc65I 39 Hình 4.8a: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P1-2 P5-6 40 Hình 4.8b: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P3-4 P5-6 40 Hình 4.9a: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P1-6 enzyme HindIII Acc65I41 Hình 4.9b: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I 41 Hình 4.10a: Kết tinh sản phẩm cắt vector pJET P1-6 pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I 42 Hình ảnh 4.10b: Kết tinh sach DNA plasmid pJET P16-34 sau biến nạp 42 iv Hình 4.10c: Kết điện di sản phẩm pJET P16-34 sau cắt enzyme HindIII BamHI 43 Hình 4.10d: Kết tinh đoạn P16-34 (Tra-2 RNAi) sau cắt HindIII BamHI từ DNA plasmid pJET P16-34 43 Hình 4.11a: Kết kiểm tra sản phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI pJET p1634 enzyme BamHI HindIII 44 Hình 4.11b: Kết tinh sản phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI P16-34 enzyme BamHI HindIII 44 Hình 4.12a: Kết biến nạp vector pTRE-Tight-BI P16-34 tạo vector pTRETight-BI-P16-34 vào tế bào khả biến E.coli DH5α 45 Hình 4.12b: Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc biến nạp tạo vector pTRE-TightBI-P16-34 45 Hình 4.13: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid pTRE-TightBI-P16-34 sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34 46 Hình 4.14a: Khuẩn lạc E.coli mang vector pTet-Dual OFF 47 Hình 4.14b: Kết điện di tinh DNA plasmid pTet-Dual OFF 47 Hình 4.15: Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pTet-Dual OFF BamHI XhoI 47 v DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Ampr Kháng kháng sinh Ampicillin Bp Base pair – Cặp bazơ nitơ cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid DNA Deoxyribonucleic Acid Dox Doxycyline E.coli Escherichia coli Kb Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB Lauria Broth miRNA Micro Ribonucleic Acid mRNA Messenger Ribonucleic Acid– RNA thông tin MSC I Multiple cloning site I MSC II Multiple cloning site II PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp RIDL Release of Insects carrying a Dominant Lethal RNA Ribonucleic Acid RNAi Interference Ribonucleic Acid– RNA can thiệp SIRM Sterile Insect Release Method SiRNA Smal interfering Riboncleic Acid SIT Sterile Insect Techmique – Kĩ thuật vô trùng côn trùng TAE Tris-acetate-EDTA Tet Tetracyline Tet-OFF pTet-Dual OFF tTA Tetracycline-repressible transactivato Tra-2 RNAi Transformer-2 Interference Ribonucleic Acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside vi MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: 1.3 Mục đích nghiên cứu: 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiến đề tài: 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Bối cảnh thực ý tưởng đề tài 2.1.2 Genee biểu tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti ( Transformer-2 RNAi) 2.1.3 Vector Tet-OFF (pTet-Dual OFF) 2.1.4 Vector pTRE-Tight-BI 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 13 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 13 3.2 Vật liệu nghiên cứu 13 3.2.1 Hóa chất 13 3.2.2 Thiết bị 15 3.2.3 Vật liệu 15 vii 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 16 3.4 Nội dung nghiên cứu 16 3.5 Phương pháp nghiên cứu 16 3.5.1 Tách chiết tinh DNA muỗi Aedes aegypti 16 3.5.2 PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 17 3.5.3 Thiết kế vector pTet-Dual-OFF mang gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti (Tra-2 RNAi kẹp tóc) 25 3.5.4 Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến để chọn dịng, ni sinh khối tách DNA plasmid 28 3.5.5 Phương pháp nối Kit Ligation (M0202) 32 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết tách chiết tinh DNA muỗi Aedes aegypti 33 4.2 Kết PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 33 4.3 Kết thiết kế vector pTET-Dual-OFF, lai ghép chèn đoạn DNA quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector 43 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 I Tài liệu Tiếng Việt 49 II Tài liệu Tiếng Anh 50 III Tài liệu Internet 50 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Trên giới, theo Tổ chức Y tế giới (WHO), ước tình năm có khoảng 2,5 – tỷ người có nguy mắc bệnh muỗi truyền nhiễm sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue), đặc biệt cuối năm 2015 đầu 2016 đến suất bệnh virus Zika Trong 50- 100 triệu người mắc bệnh muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh muỗi Aedes aegypti phải điều trị, 90% trẻ em 15 tuổi, tỉ lệ tử vong muỗi Aedes aegypti 5% Bệnh lưu hành nhiều vùng Đơng Nam Á Thái Bình Dương 100 nước thuộc khu vực khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới [8], [1] Hiện Việt Nam nước có bệnh dịch lưu hành, bệnh chiếm tỉ lệ cao bệnh truyền nhiễm Việt Nam, nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ tình trạng tải cho bệnh viện mùa dịch Từ năm 1960 đến dịch có xu hướng lan rộng phát triển Ở Tây Nguyên năm có dịch lớn 1983, 1987,1988, 1991, 1995 2004 với số mắc từ 54,80 đến 553,38/100.000 dân số chết từ 0,08 – 1,34/100.000 dân [6], [4], [5],[3] Năm 2008, tỉnh phía Nam, 78.414 trường hợp mắc, 85 trường hợp chết, tỉnh Cà Mau có số bệnh nhân 8.284, tử vong trường hợp [20] Năm 2009 nước có số bệnh nhân chết 105.370/87 [21] Để giải vấn đề trên, nhiều hướng nghiên cứu thử nghiệm áp dụng Các nhà khoa học giới thành công việc tạo muỗi biến đổi gene kĩ thuật DNA tái tổ hợp Những muỗi đực biến đổi gene thả ngồi mơi trường giao phối với muỗi tự nhiên tạo hệ muỗi bị khiếm khuyết chết trước trưởng thành [19], [20] Các nhà khoa học Mỹ Đại học Rocckefeller nghiên cứu tạo muỗi biến đổi gene không phát mùi người, hạn chế q trình lây truyền bệnh tật qua lồi trung gian [19] Ở Việt Nam nay, ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp khơng cịn vấn mẻ, có nhiều cơng trình nghiên cứu áp dụng Công nghệ Sinh học để tạo sinh vật biến đổi gene nhằm tạo sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn Xuất phát từ tính cấp thiết bệnh nguy hiểm lây truyền qua muỗi 36 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR, sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P3-4 hình 4.4a hình 4.4b : Hình 4.4a: Kết điện di kiểm tra sản Hình 4.4b: Kết tinh sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 phẩm PCR đoạn gene P3-4 Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1:PCR đoạn gene P3-4 Đường chạy 1: P3-4 tinh Tại nhiệt độ gắn mồi 650C, đoạn gene P3-4 tạo với kích thước theo lý thuyết khoảng 240bp Sản phẩm PCR giải trình tự để kiểm tra giống đoạn P1-2 Kết kiểm tra giải trình tự đoạn gene P3-4 với trình tự cần phân lập từ đoạn gene Tra-2 RNAi 37 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR, sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P5-6 hình 4.5a hình 4.5b Hình 4.5a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P5-6 Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 6: P5-6 Hình 4.5b: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P5-6 Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: P5-6 Sau điện di sản phẩm PCR tinh sản phẩm PCR, đoạn gene P5-6 tạo với kích thước theo lý thuyết khoảng 150bp nhiệt độ gắn mồi 550 C Cũng giống đoạn gene P1-2 P3-4, đoạn gene giải trình tự để so sánh với trình tự lý thuyết Kết giải trình tự với trình tự đoạn gene Tra-2 RNAi 38 Kết điện di sản phẩm cắt, tinh sản phẩm cắt đoạn gene P1-2 P5-6 sau cắt enzyme SalI hình 4.6a hình 4.6b: Hình 4.6a: Kết điện di sản phẩm cắt Hình 4.6b: Kết điện di sản phẩm P1-2 P5-6 enzyme SalI tinh P1-2 P5-6 sau cắt enzyme SalI Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1và 2: Sản phẩm cắt P1-2 Đường chạy 1: P5-6 tinh Đường chạy 4: Sản phẩm cắt P5-6 Đường chạy 2: P1-2 tinh Sử dụng enzyme SalI để cắt hai đoạn gene P1-2 P5-6, mục đích tạo đầu nối gắn kết P1-2 P5-6 Kết theo lý thuyết tạo band vạch kèm theo mẩu DNA ngắn kích thước khơng đáng kể Theo hình ảnh điện di, cho thấy cắt tinh sản phẩm cắt hai đoạn gene P1-2 P5-6 Kết điện di sản phẩm cắt tinh sản phẩm cắt hai đoạn gene P3-4 P5-6 enzyme Acc65I, hình 4.7: 39 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm cắt P3-4 P5-6 Acc65I Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 2: sản phẩm cắt P3-4 Đường chạy 4: sản phẩm cắt P5-6 Sử dụng enzyme Acc65I để cắt hai đoạn gene P3-4 P5-6, mục đích tạo đầu nối gắn kết P3-4 P5-6 Kết theo lý thuyết tạo band vạch kèm theo mẩu DNA ngắn kích thước khơng đáng kể Theo hình ảnh điện di, cho thấy cắt tinh sản phẩm cắt hai đoạn gene P3-4 P5-6 40 Kết điện di sản phẩm nối đoạn gene P1-2 với P5-6 P3-4 với P5-6 T4 ligase hình 4.8a hình 4.8b: Hình 4.8a: Kết điện di sản phẩm Hình 4.8b: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P1-2 P5-6 nối đoạn P3-4 P5-6 Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1,2 3: Sản phẩm nối Đường chạy 1: Sản phầm nối P3-4 với P1-2 với P5-6 P5-6 Sau tiến hành cắt đoạn P1-2 với P5-6 enzyme SalI, hai sản phẩm nối lại với T4 ligase Theo lý thuyết sản phẩm điện di cho ba band vạch với kích thước tương ứng là: 150bp, 240bp, 390bp Band vạch quan tâm band P1-6 tạo có kích thước khoảng 390bp Kết thực tế sau điện di kiểm tra sản phẩm nối cho hai band vạch kích thước 150bp 240bp Quá trình nối tạo đoạn gene P1-6 khơng thành cơng (hình 4.8a) Thay đổi quy trình tạo đoạn gene Tra-2 RNAi, tiến hành nối đoạn P3-4 với P5-6 trước để tạo đoạn P3456 nối lại P1-2 để tạo đoạn P16-34 hoàn chỉnh (Tra-2 RNAi) Kết nối P3-4 với P6 cho hai band vạch kích thước 150bp 240bp Q trình nối tạo đoạn P34-56 khơng thành cơng (hình 4.8b) 41 Do khơng sử dụng phương pháp nối trực tiếp để nối đoạn P1-2, P3-4, P5-6 tạo đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính Chúng tơi chuyển sang phương pháp khác tổng hợp gene cắt nối thông qua vector Đoạn gene P12-56 (P1-6) đoạn gene P3-4 đặt sẵn đưa vào vector pJET 1.2 tạo thành vector pJET P1-6 pJET P3-4 Sau đó, vector pJET P1-6 vector pJET P3-4 cắt hai enzyme HindIII Acc65I Khi cắt hai enzyme, hai hệ thống pJET P1-6 pJET P3-4 cho hai band vạch với kích thước tương ứng vào khoảng 284bp 3000bp; 284bp 3000bp Thu nhận band vạch khoảng 3000bp đường chạy pJET P1-6; đường chạy pJET P3-4 thu nhận band vạch khoảng 284bp Hai hệ thống nối lại T4 ligase biến nạp vào E.coli khả biến để nhân dòng chọn khuẩn lạc Kết điện di sản phẩm cắt tinh sản phẩm cắt hai hệ thống pJET P1-6 pJET P3-4 hình 4.9a hình 4.9b: Hình 4.9a: Kết điện di sản phẩm Hình 4.9b: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P1-6 enzyme HindIII cắt pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I Acc65I Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: Sản phẩm cắt pJET P1-6 Đường chạy 1: Sản phẩm cắt pJET P34 nhuộm với Ethidium Bromide Đường chạy 3: Sản phầm cắt pJET P3-4 không nhuộm Ethidium Bromide 42 Sản phẩm cắt hai hệ thống pJET P1-6 pJET P3-4 sau điện di cho hai band vạch với kích thước tương ứng lý thuyết Sản phẩm cắt tinh với band vạch quan tâm dùng để làm nguyên liệu nối Kết tinh sản phẩm cắt vector pJET P1-6 pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I (hình 4.10a); Sản phẩm tinh DNA plasmid pJET P16-34 sau biến nạp (hình 4.10b); Điện di sản phẩm pJET P16-34 sau cắt enzyme HindIII BamHI (hình 4.10c); Sản phẩm tinh P16-34 (Tra-2 RNAi) sau cắt BamHI HindIII từ DNA plasmid pJET P16-34 (hình 4.10d): Hình 4.10a: Kết tinh sản Hình ảnh 4.10b: Kết tinh sach DNA phẩm cắt vector pJET P1-6 pJET plasmid pJET P16-34 sau biến nạp P3-4 enzyme HindIII Acc65I Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: Đoạn gene P3-4 từ Đường chạy 1: DNA plasmid pJET P16-34 pJET P3-4 cắt enzym HindIII Acc65I Đường chạy 2: pJET P1-6 sau cắt enzyme HindIII Acc65I 43 B ằng phươ ng pháp tổng hợp gene cắt nối thông qua hai vector pJET Hình 4.10c: Kết điện di sản phẩm Hình 4.10d: Kết tinh đoạn pJET P16-34 sau cắt enzyme P16-34 (Tra-2 RNAi) sau cắt HindIII BamHI HindIII BamHI từ DNA plasmid Đường chạy M: DNA ladder pJET P16-34 Đường chạy 4: pJET P16-34 cắt Đường chạy M: DNA ladder enzyme HindIII BamHI Đường chạy 1:Tinh pTRE-Tight BI sau cắt BamHI HindIII P1-6 Đường chạy 2: Tinh P16-34 pJET P3-4 thiết kế thành cơng đoạn gene quy định tính trạng giới tính P16-34 (Tra-2 RNAi) với kích thước khoảng 630bp 4.3 Kết thiết kế vector pTET-Dual-OFF, lai ghép chèn đoạn DNA quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector Đoạn gene Tra-2 RNAi sau thiết kế thành công, tiến hành thiết kế vector pTET-Dual-OFF mang đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính Kết bước thiết kế vector pTet-Dual-OFF đưa sau: Kết kiểm tra sản phẩm cắt tinh sản phẩm cắt vector pTRETight-BI pJET P16-34 enzyme BamHI HindIII, hình 4.11a 4.11b: 44 Hình 4.11a: Kết kiểm tra sản phẩm Hình 4.11b: Kết tinh sản cắt vector pTRE-Tight-BI pJET phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI p16-34 enzyme BamHI và P16-34 enzyme BamHI HindIII HindIII Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 2: sản phẩm cắt pTRETight-BI Đường chạy 4: Sản phẩm cắt pJET Đường chạy M:DNA ladder Đường chạy 1: Sản phẩm tinh vector pTRE-Tight-BI sau cắt Đường chạy 2: Sản phẩm tinh P16-34 sau cắt P16-34 Kết kiểm tra PCR sản phẩm biến nạp tạo vector pTRE-Tight-BI-P16-34 từ vector pTRE-Tight-BI đoạn gene Tra-2 RNAi (P16-34) hình 4.12a hình 4.12b: 45 Hình 4.12a: Kết biến nạp vector Hình 4.12b: Kết PCR kiểm tra pTRE-Tight-BI P16-34 tạo vector khuẩn lạc biến nạp tạo vector pTRE- pTRE-Tight-BI-P16-34 vào tế bào khả Tight-BI-P16-34 biến E.coli DH5α Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy đến 9: PCR khuẩn lạc tạo đoạn P3-4 Hình 4.12b cho kết điện di PCR khuẩn lạc tạo đoạn gene P3-4 với kích thước 240bp để kiểm tra sản phẩm nối có thành cơng hay khơng Trong đường chạy từ đến 9, có đường chạy số khuẩn lạc số cho kích thước 240bp Kết luận khuẩn lạc số chứa vector biến nạp pTRE-Tight-BI-P16-34 (hình 4.12a) 46 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid pTRE-Tight-BIP16-34 từ sinh khối khuẩn lạc số kết kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34, hình 4.13: Hình 4.13: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid pTRETight-BI-P16-34 sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34 Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII Đường chạy 2:Sản phẩm DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 tinh Tại đường chạy số hình 4.13, kích thước band vạch khoảng 3442bp khớp với lý thuyết Ngoài đường chạy số 1, cắt DNA plasmid hai enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34; kết cho hai band vạch kích thước khoảng 630bp 2814bp với kích thước đoạn chèn P16-34 vector pTRE-Tight-BI cắt enzyme bamHI HindIII Biến nạp tinh DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 thành công Kết biến nạp, nuôi sinh khối vector pTet-Dua OFF tinh DNA plasmid pTet-Dual OFF để làm nguyên liệu cho trình thiết kế vector mang gene điều khiển tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti, hình 4.14a hình 4.14b: 47 Hình 4.14a: Khuẩn lạc E.coli Hình 4.14b: Kết điện di tinh DNA mang vector pTet-Dual OFF plasmid pTet-Dual OFF Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy đến 6: Vector pTet-Dual OFF Kết điện di sản phẩm cắt vector pTet-Dual OFF enzyme BamHI XhoI để kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid hình 4.15: Hình 4.15: Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pTet-Dual OFF BamHI XhoI Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1:DNA pTet- Dual OFF Đường chạy 2: pTet-Dual OFF cắt MscI ClaI Đường chạy 3: pTet-Dual OFF cắt BamHI XhoI Kết thúc q trình biến nạp, ni sinh khối khuẩn lạc để nhân dòng pTetDual OFF với số lượng lớn Kích thước lý thuyết vector pTet-Dual OFF vào khoảng 4903bp Theo kết điện di hình 4.14b sản phẩm tinh cho band vạch kích thước khoảng 4903 bp kiểm tra lại enzyme cắt BamHI XhoI cho hai band vạch kích thước 4296bp bà 607bp (hình 4.15) Kết luận tinh DNA plasmid pTet-Dual OFF dùng cho bước thí nghiệm sau Do thời gian thực đề tài nghiên cứu có hạn; chúng tơi tạm thời dừng lại q trình thiết kế vector pTet-Dual OFF 48 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tách chiết tinh DNA tổng số loài muỗi Aedes aegypti Đã phân lập đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti có kích thước khoảng 630bp Đã thành cơng q trình gắn lõi Tra-2 RNAi vào vector pTre-Tight-BI tạo vector pTre-Tight-BI-P16-34 với kích thước khoảng 3442bp để đưa vào vector pTet-Dual OFF Tinh số lượng lớn DNA plasmid pTet-Dual OFF sau biến nạp nuôi sinh khối để làm nguyên liệu cho bước nghiên cứu sau Đã nắm phương pháp PCR; phương pháp thiết kế tạo vector; phương pháp cắt nối đoạn DNA vào vector; phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nối vector pTre-Tight-BI-P16-34 vào vector pTet-Dual OFF để tạo vector pTet-Dual OFF mang gene điều khiển tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti hoàn chỉnh 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tế (2006), Giám sát, chẩn đoán điều trị bệnh sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008), Báo cáo tổng kết hoạt động 2007 kế hoạch 2008, phòng chống sốt xuất huyết khu vực phía Nam, Dự án quốc gia phịng chống sốt xuất huyết khu vực phía Nam TP.Hồ Chí Minh, tr.1-15 Hồng Anh Vường CS (2006), Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt ñộng năm 2001-2005 dự án phòng chống SD/SXHD khu vực Tây Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, 2/2006, tr.1-16 Hoàng Anh Vường, Nguyễn Ái Phương CS (1993), “Đặc ñiểm dịch tễ học Dengue xuất huyết Tây Ngun, từ 1983-1993”, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học 1993, Hội nghị khoa học Y- dược Viện Trường Tây NgunKhánh Hịa, tr 338-345 Hồng Anh Vường, Vũ Thị Hồng Gấm (1998), “ Đặc ñiểm dịch tễ học SD/SXHD Đắc Lắc, năm 1995-1997”, Tập san Vệ sinh phòng dịch Tây Nguyên, (9), tr.16-27 Huỳnh Thị Đoan Dung (1999), Dịch tễ học vụ dịch sốt xuất huyết TP Buôn Ma Thuột năm 1998”, luận văn tốt nghiệp bác sĩ Y khoa Tây Nguyên, khóa 19931999 Nguyễn Nhật Cảm, Vũ Sinh Nam, Nguyễn Thuý Hoa, Nguyễn Thị Yên, Nguyễn Thị Lan Anh, Phan Trọng Lân, Hilary Ranson, Emma Warr, “Khảo sát đột biến gene kháng hóa chất diệt côn trùng KDR-VAL1016GLY số quần thể muỗi Aedes Aegypti kỹ thuật HOLA Việt Nam” (2009) Tạp trí Y học dự phịng, tập XIX,số 7(106),tr.10-115 Tổ chức Y tế Thế giới (2001), Tài liệu hướng dẫn phòng chống sốt Dengue sốt xuất huyết dengue, Nhà xuất Y học, Hà Nội Trung tâm Y tế dự phòng Cà Mau (2008), Hội nghị Tổng kết hoạt động phòng chống SXHD tỉnh Cà Mau từ 2004-2008 50 II Tài liệu Tiếng Anh 10 Boggs,R.T., Gregor,P., Idriss,S., Belote,M.J and McKeown,M (1987) Cell, 50, 749-757 11 Burtis,K.C and Baker,B.S (1989) Cell, 56, 997-1010 12 Clontech Laboratories, Inc (2010), "pTet-DualOFF Vector Information" Catalog No 631113: 1-2 13 Clontech Laboratories, Inc (2010), "pTRE-Tight-BI Vector Information" Catalog No 631068: 1-2 14 Duong Thanh Hoang, Kim Phuc Hoang, (2015), “Culicinae mosquito tra-2 rna interference technique to geneetically produce maleness population”, (WO2012129577 A1) 15 Kupferschmidt, K (2013) "A Lethal Dose of RNA" Science 341 (6147): 732–3 16 Nagoshi,R.N., McKeown, M., Burtis,K.C., Belote,J.M and Baker,B.S (1988) Cell, 53, 229-236 17 Saurabh Satyajit, Vidyarthi AS, Prasad D (2014) "RNA interference: concept to reality in crop improvement" Planta 239 (3): 543–564 18 Wang et al, 2006.Cell 127, 803-815; Hammond et al, 2001 Nat Rev Geneet, 2(2):110-9 III Tài liệu Internet 19 http://khoahoc.tv/doisong/yhoc/suc-khoe/31626_muoi-bien-doi-gene-co-trothanh-cuu-tinh-cua-nganh-y-te.aspx 20 http://khoahoc.tv/khampha/sinh-vat-hoc/vikhuan-contrung/40481_muoi-biendoi-genee-ngan-benh-sot-xuat-huyet.aspx 21 http://khoahoc.tv/khampha/sinh-vat-hoc/vikhuan-contrung/46805bien-doigenee-de-muoi-khong-ngui-duoc-mui-nguoi.aspx