Khảo sát khả năng tạo phôi soma của cây sâm việt nam (panax vietnamensis ha et grushv) trong nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  NGUYỄN THANH HOÀI KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  NGUYỄN THANH HOÀI KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN THỊ QUỲNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác NGUYỄN THANH HOÀI Lời cảm ơn Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học trường Đại Học Sư phạm Tp.HCM tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em suốt trình học tập hoàn thành luận văn Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Quỳnh, người cô kính mến hết lòng dạy bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến TS Lê Thị Trung, người cô hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện cho em suốt trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, thầy cô, đặc biệt thầy cô tổ Sinh – Công nghệ trường THPT Võ Thị Sáu, quận Bình Thạnh động viên, giúp đỡ nhiều để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô hội đồng chấm luận văn cho em đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn Xin chân thành cảm ơn chị Vân, anh Hiến, chị Hạnh, Nhung, Duy, Duyên phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới nhiệt tình giúp đỡ trình thực nghiên cứu luận văn Xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị, bạn phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh học trường Đại Học Sư phạm Tp.HCM bạn lớp Cao học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm khóa 20, đặc biệt “ột” Thư động viên, giúp đỡ lúc gặp khó khăn Và cuối cùng, xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ông bà, bố mẹ, em trai “người dưng khác họ” thân thương bên cạnh chia sẻ, động viên hỗ trợ suốt trình học tập, làm việc hoàn thành luận văn Ngày 30 tháng 03 năm 2012 NGUYỄN THANH HOÀI MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM 1.1.1 Đặc điểm sinh học sâm Việt Nam 1.1.1.1 Phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.1.3 Phân bố đặc điểm sinh thái 1.1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.2 Nguồn gốc, lịch sử phát triển trồng khai thác sâm Việt Nam 11 1.1.3 Tác dụng dược lý sâm việt Nam .13 1.1.3.1 Bộ phận dùng làm thuốc 13 1.1.3.2 Tính tác dụng dược lý 14 1.1.4 Bảo tồn nhân giống 14 1.1.5 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống sâm Việt Nam nước giới .16 1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống sâm Việt Nam nước .16 1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống sâm Việt Nam giới 19 1.2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG 20 1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 1.2.2 Sự phát sinh mô sẹo .21 1.2.3 Sự phát sinh quan nuôi cấy in vitro 22 1.2.3.1 Sự phát sinh rễ .22 1.2.3.2 Sự phát sinh chồi .23 1.2.4 Sự phát sinh phôi soma 25 1.2.4.1 Khái niệm phôi soma 25 1.2.4.2 Sự phát sinh phôi soma 27 1.2.4.3 Vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật phát sinh phôi soma .30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .39 2.1 VẬT LIỆU .40 2.1.1 Nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu 40 2.1.2 Các thiết bị dụng cụ 41 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.2.1 Thí nghiệm 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro vị trí cắt khác môi trường MS có bổ sung NAA, IBA TDZ .42 2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả phát sinh phôi soma lớp mỏng phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 44 2.2.3 Thí nghiệm 3: Vai trò ánh sáng lên phát sinh phôi soma nuôi cấy lớp mỏng phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 48 2.2.4 Thí nghiệm 4: Sự tăng trưởng cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng MS loại vitamin .50 2.2.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng thành phần khoáng đa lượng, vi lượng nồng độ đường sucrose lên khả tăng trưởng cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 52 2.3 PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ LIỆU 53 2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 55 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 3.1 THÍ NGHIỆM 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro vị trí cắt khác môi trường MS có bổ sung NAA, IBA TDZ 57 3.2 THÍ NGHIỆM 2: Ảnh hưởng loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả phát sinh phôi soma lớp mỏng phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 67 3.3 THÍ NGHIỆM 3: Vai trò ánh sáng lên phát sinh phôi soma nuôi cấy lớp mỏng phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro .83 3.4 THÍ NGHIỆM 4: Sự tăng trưởng cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng MS loại vitamin 88 3.5 THÍ NGHIỆM 5: Ảnh hưởng thành phần khoáng đa lượng, vi lượng nồng độ đường sucrose lên khả tăng trưởng cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 94 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 4.1 KẾT LUẬN 100 4.2 ĐỀ NGHỊ .101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Acid 2,4-diclorophenoxyacetic 2iP : N6-[2-isopentenyl] adenosine ABA : Acid abscisic BA : N6-Benzyladenine CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật CLC : Môi trường khoáng nuôi cấy mô sẹo sinh phôi từ khoai lang Cheé cs đề xuất năm 1992 Môi trường cho tăng trưởng mô sẹo sinh phôi (CP) cs : cộng IAA : Acid indol-3-acetic IBA : Acid indolbutyric GA : Gibberellin Kin : Kinetin (6 – furfurylaminopurin) MS : Môi trường khoáng Murashige & Skoog đề xuất năm 1962 MS1/2 : Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm nửa MS2/3 : Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm 2/3 NAA : Acid α-naphthalenacetic NT : nghiệm thức SH : Môi trường khoáng Schenk & Hildebrandt đề xuất năm 1972 TDZ : Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) TLK : Trọng lượng khô TLT : Trọng lượng tươi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Phân biệt phôi soma với phôi hợp tử 25 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm 1a .42 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm 1b 43 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 2a .45 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm 2b 45 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm 3a .48 Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm 3b 49 Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm 50 Bảng 2.8 Bố trí thí nghiệm 52 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ phiến sâm Việt Nam in vitro ngày nuôi cấy thứ 56 58 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro ngày nuôi cấy thứ 56 62 Bảng 3.3 Ảnh hưởng loại auxin cytokinin lên phát sinh hình thái từ lớp mỏng phiến sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ngày thứ 84 68 Bảng 3.4 Ảnh hưởng loại auxin cytokinin lên phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ngày thứ 84 .75 Bảng 3.5 Ảnh hưởng CĐHSTTV ánh sáng lên phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ngày thứ 35 .85 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng MS loại vitamin lên khả tăng trưởng cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ngày thứ 42 90 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thành phần khoáng đa lượng, vi lượng nồng độ đường sucrose lên khả tăng trưởng cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ngày thứ 49 95 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Đặc điểm hình thái sâm Việt Nam Hình 1.2 Đặc điểm hình thái số loài sâm chi Panax Hình 1.3 Vị trí địa lý núi Ngọc Linh Hình 1.4 Cấu trúc hóa học Majonoside-R 10 Hình 1.5 Rễ củ khô sâm Việt Nam 13 Hình 1.6 Viên ngậm sâm Việt Nam (Vinaginseng pastilles) 13 Hình 1.7 Sắc kí đồ sinh khối sâm Việt Nam in vitro nuôi cấy Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới .19 Hình 1.8 Sự phát triển rễ phụ từ trụ bì rễ 24 Hình 1.9 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo sâm Việt Nam in vitro 24 Hình 1.10 Sự phát triển phôi hợp tử Capsella .26 Hình 1.11 Sự phát sinh phôi soma xoài (Mangifera indica L.) 26 Hình 1.12 Sự phát sinh phôi soma trực tiếp từ Phalaenopsis ‘Little Steve’ 27 Hình 1.13 Các giai đoạn phát sinh phôi soma dịch treo tế bào cà rốt 29 Hình 1.14 Cấu trúc auxin tự nhiên (IAA) auxin tổng hợp (2,4-D, NAA IBA) 31 Hình 1.15 Các giai đoạn thu nhận phôi soma .31 Hình 1.16 Cấu trúc số dạng cytokinin .34 Hình 1.17 Cấu trúc GA 35 Hình 1.18 Cấu trúc ABA .35 Hình 1.19 Cấu trúc ethylene 36 Hình 2.1 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 40 Hình 2.2 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy tủ điều khiển khí hậu Percival .40 Hình 2.3 Thân khí sinh phiến sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 43 Hình 2.4 Mẫu cấy lớp mỏng phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro 47 Hình 2.5 Cách bố trí mẫu cấy phiến đoạn thân khí sinh đĩa petri 47 Hình 2.6 Cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 51 Hình 3.1 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy lớp mỏng phiến sâm Việt Nam in vitro 57 Hình 3.2 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ lớp mỏng phiến sâm Việt Nam in vitro ngày thứ 56 59 Hình 3.3 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro 61 Hình 3.4 Các thể giống phôi hình cầu hình tim phôi soma hình thành vị trí thứ thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro nghiệm thức có mg l-1 NAA 0,2 mg l-1 TDZ .61 Hình 3.5 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro sau 56 ngày nuôi cấy .63 Hình 3.6 So sánh tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ mẫu cấy phiến đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro ngày thứ 56 65 Hình 3.7 Chồi rễ bất định hình thành đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro sau 4,5 tháng nuôi cấy 66 Hình 3.8 Hình thái mô sẹo từ đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro môi trường mg l-1 NAA sau tuần cấy chuyển 66 Hình 3.9 Hình thái mô sẹo rễ hình thành từ lớp mỏng phiến sâm Việt Nam in vitro vị trí khác môi trường MS1/2 bổ sung mg l-1 2,4-D 0,2 mg l-1 Kin ngày thứ 84 70 Hình 3.10 Rễ hình thành từ vị trí thứ lớp mỏng phiến sâm Việt Nam in vitro môi trường MS1/2 bổ sung mg l-1 IBA 0,2 mg l-1 BA ngày thứ 84 70 Hình 3.11 Mẫu cấy vị trí thứ phiến sâm Việt Nam in vitro sau 84 ngày nuôi cấy 72 Hình 3.12 Cụm phôi soma vị trí gốc lớp mỏng phiến sâm Việt Nam in vitro sau 84 ngày nuôi cấy môi trường ban đầu có mg l-1 IBA 0,2 mg l-1 Kin .73 Hình 3.13 Số rễ hình thành thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro .76 Hình 3.14 Sự hình thành mô sẹo, chồi rễ bất định mẫu cấy vị trí thứ thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro ngày thứ 84 77 Hình 3.15 Đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro môi trường MS1/2 bổ sung mg l-1 NAA 0,2 mg l-1 BA mang phôi hình tim ngày nuôi cấy thứ 84 81 Hình 3.16 Phôi soma nẩy mầm thành hoàn chỉnh có chồi rễ từ vị trí thứ thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro môi trường bổ sung mg l-1 IBA 0,2 mg l-1 Kin ngày thứ 84 81 Hình 3.17 Chồi bất định hình thành từ vị trí thứ thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro ngày thứ 84 82 Hình 3.18 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ phiến sâm Việt Nam in vitro vào ngày thứ 35 .84 Hình 3.19 Mẫu cấy từ vị trí thứ phiến sâm Việt Nam in vitro ngày thứ 35 84 Hình 3.20 Mẫu cấy từ vị trí thứ thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro ngày thứ 35 .86 Hình 3.21 Số rễ hình thành từ đoạn thân khí sinh sâm Việt Nam in vitro nghiệm thức khác theo thời gian nuôi cấy 86 Hình 3.22 Gia tăng số chồi/mẫu theo thời gian nuôi cấy cụm chồi sâm Việt Nam in vitro nghiệm thức khác .89 Hình 3.23 Số rễ hình thành từ cụm chồi sâm Việt Nam in vitro nghiệm thức khác theo thời gian nuôi cấy 91 Hình 3.24 Cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 42 ngày nuôi cấy với ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng MS loại vitamin 92 Hình 3.25 Cụm chồi sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 49 ngày nuôi cấy với ảnh hưởng thành phần khoáng đa lượng, vi lượng nồng độ đường sucrose 96 MỞ ĐẦU Tại nước châu Á, nhân sâm coi vị thuốc quý đứng đầu vị thuốc đông y “sâm nhung quế phụ”, thuốc bổ tăng lực có nhiều tác dụng dược lý khác Cây sâm Việt Nam loại nhân sâm thứ 20 tìm thấy giới Các nhà khoa học Nhật Bản Hàn Quốc đánh giá cao xếp sâm Việt Nam vào năm loại sâm quý giới với sâm Hàn Quốc, sâm Nhật Bản, sâm Mỹ, sâm Trung Quốc Một số nghiên cứu cho thấy số lượng hàm lượng ginsenoside sâm Việt Nam vượt trội loài sâm khác (Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Nguyễn Thượng Dong, 2007) Hiện nay, sâm Việt Nam bán thị trường với giá ngày cao, cao sâm Triều Tiên nhiều lần, dẫn đến tình trạng bị khai thác mức Cây sâm Việt Nam nằm số 250 loài thực vật quý có nguy bị tuyệt chủng Sách đỏ Việt Nam Vì vậy, việc bảo tồn phát triển loài thực vật quý đòi hỏi quan tâm nhà khoa học nhà quản lý nhiệm vụ vừa quan trọng vừa cấp bách phương diện khoa học lẫn kinh tế, xã hội Trong thời gian qua, số công trình nghiên cứu nhân giống nuôi trồng sâm Việt Nam điều kiện tự nhiên công bố, song kết thu nhiều hạn chế Cây sâm trồng từ hạt sinh trưởng chậm phải – năm tạo củ có hoạt chất Hạt sâm gieo khoảng tháng nẩy mầm, tỷ lệ nẩy mầm thấp, lại bị dịch bệnh, chuột bọ phá hoại, sâm cho hoa đậu hạt ít, có – hạt mà sau năm hoa Do đó, nhu cầu kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng nhân nhanh sinh khối từ sâm Việt Nam trở nên thiết (Đỗ Huy Bích cs., 2004) Nghiên cứu nhân giống vô tính đường nuôi cấy mô tế bào thực vật mở hướng sản xuất nguyên liệu từ sâm Việt Nam: chủ động nguồn nguyên liệu dồi thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc sản phẩm thực phẩm chức Một số phòng thí nghiệm nước chứng minh việc nuôi cấy mô sâm tạo hợp chất thứ cấp trồng tự nhiên, hạn chế ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy khách quan bên (Nguyễn Ngọc Dung, 1995) Sự phát sinh phôi soma đường quan trọng nuôi cấy mô tế bào thực vật Đây phương pháp ưu việt sử dụng để sản xuất nhiều loại trồng (Ammirato cs., 1983) Ứng dụng đường phát sinh phôi soma thực vật không phục vụ công tác vi nhân giống mà phát huy lĩnh vực nghiên cứu di truyền học, sinh học phân tử chuyển gen thực vật (Nguyễn Hữu Hổ, 2009) Vì vậy, đề tài “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG NUÔI CẤY IN VITRO” thực Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới nhằm mục đích tìm hiểu xây dựng nên quy trình tạo phôi soma sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro, từ nhân giống vô tính loài sâm quý góp phần bảo tồn loài sâm đặc hữu Việt Nam GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài tập trung khảo sát hai nguồn vật liệu từ sâm Việt Nam in vitro phiến thân khí sinh, ảnh hưởng số CĐHSTTV ánh sáng đến cảm ứng phát sinh phôi soma Đồng thời, đề tài nghiên cứu tìm hiểu loại môi trường nuôi cấy nhằm tăng khả phát triển thành in vitro sau hình thành phôi soma, nhằm tăng số lượng khả sống sót trước chuyển trồng bầu đất CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM 1.1.1 Đặc điểm sinh học sâm Việt Nam 1.1.1.1 Phân loại Theo Hoàng Thị Sản (2003), Đỗ Huy Bích cs (2004), sâm Việt Nam phân loại sau: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta (Ngọc Lan) Lớp : Magnoliopsida (Ngọc Lan) Bộ : Araliales (Nhân sâm) Họ : Araliaceae (Nhân sâm) Chi : Panax (Sâm) Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv (Thực vật) Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng Tên khác: Sâm Việt, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Sâm trúc, Sâm đốt trúc, Trúc tiết nhân sâm, Củ ngải rọm con, Thuốc dấu (dân tộc Xê Đăng) 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây sâm Việt Nam loài thân thảo đa niên (thậm chí 100 năm), cao 40 – 100 cm, sinh trưởng chậm (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích cs., 2004) Cây sâm Việt Nam có hai loại thân thân khí sinh (mọc mặt đất) thân rễ (nằm mặt đất) (Hình 1.1a) Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng, màu lục tím, nhỏ, đường kính – mm, thường tàn lụi hàng năm, tồn vài thân vài năm Lá sâm Việt Nam thuộc loại kép chân vịt, mọc vòng (Hình 1.1b) Cuống kép dài – 12 mm, mang – chét thân khí sinh, chét lớn với chiều dài 10 – 15 cm, chiều rộng – cm Phiến chét hình trứng ngược hình mác, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía cưa nhỏ Gân hình lông chim, thường có 10 cặp gân phụ hình mạng Phiến màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông tơ hai mặt, mặt Cây sâm Việt Nam từ – năm tuổi có kép nhất, từ năm tuổi thứ trở có đến Hình 1.1 Đặc điểm hình thái sâm Việt Nam (a) Cây sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha et Grushv.; (b) Lá sâm Việt Nam Tu Mơ Rông (Kon Tum); (c) Hoa; (d) Quả (Nguồn: Sách đỏ Việt Nam; http://www.tienphong.vn/VungsamNgocLinhlonnhatthe-gioi.html; http://samngoclinh.com; http://tuoitre.vn/Sam-Ngoc-Linh.html) Cụm hoa hình thành sâm Việt Nam – năm tuổi, mọc thành tán đơn thân khí sinh, cuống hoa dài 10 – 20 cm, kèm – tán phụ hay hoa riêng lẻ phía tán (Hình 1.1c) Mỗi tán có 60 – 100 hoa, cuống hoa ngắn từ – 1,5 cm, đài có dài, hoa có cánh, màu lục vàng với nhị, nhị hình sợi, màu trắng; bầu ô với vòi nhụy Hoa nở từ tháng đến tháng 7, từ tháng – 10 hàng năm Quả hạch, hình trứng, màu đỏ thắm, có chấm đen đỉnh (Hình 1.1d) Quả mang – hạt hình thận, màu trắng ngà, có vân, trung bình có khoảng 10 – 30 Quả chín rụng xuống đất, tồn qua mùa đông nẩy mầm vào đầu mùa xuân năm sau (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích cs., 2004) Thân rễ (căn hành) nạc, mọc bò ngang củ gừng, mặt đất khoảng – cm, đường kính – cm, dài 30 – 40 cm, mang nhiều rễ phụ, có nhiều đốt cong ngoằn ngoèo, không phân nhánh, dài – 15 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm Vỏ thân rễ có màu nâu nhạt hay màu vàng xám, ruột màu trắng ngà, phần cuối thân rễ có củ hình cầu Thân rễ cứng, giòn, có mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị đắng, Mỗi năm, từ đỉnh chồi thân rễ (kể phần thân rễ phân nhánh) mọc lên thân khí sinh Thân rễ mang vết sẹo thân khí sinh rụng hàng năm để lại Mỗi vết sẹo tương đương năm tuổi sâm Căn vào vết sẹo thân rễ, người ta tính tuổi sâm (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích cs., 2004) Rễ củ có dạng hình quay dài 2,4 – cm, đường kính 1,5 – cm, thường hợp thành bó – rễ củ hình thoi Rễ củ có màu nâu nhạt, có vân ngang nốt rễ (Hình 1.1a) Thể chất củ nạc, chắc, khó bẻ gãy, củ có vị đắng, (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích cs., 2004) Cây sâm Việt Nam có đặc điểm hình thái tương tự với sâm khác chi Panax (Hình 1.2) [...]... khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy 86 Hình 3.22 Gia tăng số chồi/mẫu theo thời gian nuôi cấy của cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau .89 Hình 3.23 Số rễ hình thành từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy 91 Hình 3.24 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro. .. Hình 2.1 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 40 Hình 2.2 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy trong tủ điều khiển khí hậu Percival .40 Hình 2.3 Thân khí sinh và phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 43 Hình 2.4 Mẫu cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro 47 Hình 2.5 Cách bố trí mẫu cấy phiến... hình thành từ vị trí thứ 4 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 84 82 Hình 3.18 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro vào ngày thứ 35 .84 Hình 3.19 Mẫu cấy từ vị trí thứ 5 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 35 84 Hình 3.20 Mẫu cấy từ vị trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 35 ... sinh trên đĩa petri 47 Hình 2.6 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 51 Hình 3.1 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro 57 Hình 3.2 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 5 của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56 59 Hình 3.3 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của đoạn thân khí sinh cây. .. xây dựng nên quy trình tạo phôi soma của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro, từ đó có thể nhân giống vô tính loài sâm quý hiếm này và góp phần bảo tồn loài sâm đặc hữu của Việt Nam GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài chỉ tập trung khảo sát hai nguồn vật liệu từ cây sâm Việt Nam in vitro là phiến lá và thân khí sinh, ảnh hưởng của một số CĐHSTTV và ánh sáng đến sự cảm ứng và phát sinh phôi soma Đồng thời, đề tài... hình thái của cây sâm Việt Nam 5 Hình 1.2 Đặc điểm hình thái của một số loài sâm trong chi Panax 7 Hình 1.3 Vị trí địa lý của núi Ngọc Linh 8 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của Majonoside-R 2 10 Hình 1.5 Rễ củ khô của cây sâm Việt Nam 13 Hình 1.6 Viên ngậm sâm Việt Nam (Vinaginseng pastilles) 13 Hình 1.7 Sắc kí đồ của sinh khối cây sâm Việt Nam in vitro nuôi cấy tại Phòng... phát sinh phôi soma ở thực vật không chỉ phục vụ công tác vi nhân giống mà còn được phát huy trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về di truyền học, sinh học phân tử và chuyển gen ở thực vật (Nguyễn Hữu Hổ, 2009) Vì vậy, đề tài “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG NUÔI CẤY IN VITRO được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học... nuôi cấy 72 Hình 3.12 Cụm phôi soma tại vị trí gốc lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro sau 84 ngày nuôi cấy trên môi trường ban đầu có 2 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 Kin .73 Hình 3.13 Số rễ hình thành trên thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro .76 Hình 3.14 Sự hình thành mô sẹo, chồi và rễ bất định trên mẫu cấy tại vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro. .. hình thái của cây sâm Việt Nam (a) Cây sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha et Grushv.; (b) Lá cây sâm Việt Nam ở Tu Mơ Rông (Kon Tum); (c) Hoa; (d) Quả (Nguồn: Sách đỏ Việt Nam; http://www.tienphong.vn/VungsamNgocLinhlonnhatthe-gioi.html; http://samngoclinh.com; http://tuoitre.vn/Sam-Ngoc-Linh.html) Cụm hoa được hình thành ở cây sâm Việt Nam trên 4 – 5 năm tuổi, mọc thành tán đơn ở ngọn thân khí sinh, cuống... sinh cây sâm Việt Nam in vitro 61 Hình 3.4 Các thể giống phôi hình cầu và hình tim của phôi soma hình thành tại vị trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở nghiệm thức có 2 mg l-1 NAA và 0,2 mg l-1 TDZ .61 Hình 3.5 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro sau 56 ngày nuôi cấy .63 Hình 3.6 So sánh tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo