Nghiên cứu một số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglycone

Nghiên cứu số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglycone Nguyễn Thị Việt Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: TS Trương Hương Lan Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone trình thủy phân -glucosidase thương mại Nghiên cứusữa đậu tương với chế phẩm enzyme nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone trình lên men sữa đậu tương với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 Keywords: Sinh học thực nghiệm; Cây đậu tương; Hiệu suất chuyển hóa; Isoflavone; Glycoside; Aglucone Content ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết luận văn: Từ nhiều kỷ nay, đậu tương trở thành trồng chiếm vị trí quan trọng đời sống người nguồn thực phẩm Các sản phẩm từ đậu tương sử dụng rộng rãi toàn giới với diện tích canh tác sản lượng đậu tương hàng năm liên tục tăng Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu tương tốt cho sức khỏe người nhờ có chứa thành phần isoflavone Một số hoạt tính sinh lý isoflavone tìm thấy liên quan đến điều chỉnh hormone cải thiện hội chứng tiền mãn kinh tăng mật độ xương phụ nữ mãn kinh Isoflavone làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch mãn tính người cách làm giảm nồng độ LDL-cholesterol huyết nhờ hoạt tính chống oxi hóa chúng Ngoài ra, nghiên cứu ung thư, isoflavone tìm thấy có khả làm giảm tỷ lệ tử vong ung thư vú hữu ích điều trị ung thư tiền liệt tuyến Hàm lượng isoflavone đậu tương nằm khoảng từ 50 – 3,000µg/g tồn hai dạng glycoside aglucone Dạng glycoside cho hấp thụ hạn chế hệ tiêu hóa người có trọng lượng phân tử lớn lại chiếm tới 90% isoflavone tổng số Trong đó, dạng aglucone hấp thụ nhanh với hàm lượng lớn so với dạng glycoside tương ứng chiếm nồng độ thấp (từ – 5% isoflavone tổng số) Mặc dù, isoflavone dạng glycoside thủy phân phần thành aglucone nước bọt sau vi sinh vật đường ruột hiệu suất chuyển hóa thấp, phụ thuộc lớn vào tình trạng sức khỏe, chế độ ăn, giới tính,… Trong đó, nhiều nghiên cứu chuyển hóa isoflavone dạng glycoside sang aglucone thực nhờ trình nảy mầm đậu tương, thủy phân enzyme thương mại trình lên men với vi sinh vật Enzyme -glucosidase coi enzyme chìa khóa, chịu trách nhiệm cho trình chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglucone Chính vậy, nâng cao hàm lượng isoflavone dạng aglucone sản phẩm từ đậu tương trở thành hướng nghiên cứu thu hút nhiều quan tâm ngành công nghiệp thực phẩm Mục đích nghiên cứu nhiệm vụ đề tài Mục đích luận văn: tạo giải pháp nâng cao hàm lượng isoflavone dạng aglucone có hoạt tính sinh học cao sữa đậu tương Sau đó, sữa đậu tương giàu isoflavone dạng aglucone sấy phun tạo thành dạng bột làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức giàu isoflavone có tác dụng giảm nồng độ cholesterol máu, cải thiện sắc đẹp sức khỏe cho phụ nữ đặc biệt phụ nữ thời kỳ mãn kinh, NỘI DUNG: Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone trình thủy phân sữa đậu tương với chế phẩm enzyme -glucosidase thương mại Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone trình lên men sữa đậu tương với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 Những đóng góp luận văn - Đã đưa giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glucoside sang dạng aglucone sữa đậu tương phương pháp thủy phân với chế phẩm enzyme thương mại với thông số công nghệ tối ưu cho nguyên liệu đậu tương Việt Nam Dịch sữa đậu tương thủy phân trực tiếp với Sumizyme FP có hàm lượng cao isoflavone dạng aglucone protein - Đã nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang aglucone phương pháp lên men với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 Khác với nghiên cứu trước, trình lên men đậu tương với Bacillus hầu hết tiến hành theo phương pháp lên men bề mặt với chất đậu tương dạng rắn Còn nghiên cứu lên men sữa đậu tương có chủng vi sinh vật sinh axit lactic Lactobacillus, bifidobacterium sử dụng Đây luận văn Việt Nam nghiên cứu trình lên men sữa đậu tương với Bacillus subtilis theo phương pháp lên men chìm với ưu điểm dễ dàng kiểm soát yếu tố công nghệ sản phẩm lên men sản phẩm không tạo vị chua Cả hai giải pháp đạt hiệu suất chuyển hóa isoflavone cao Tuy nhiên, phụ thuộc vào điều kiện thiết bị mục đích sản xuất, lựa chọn hai giải pháp Bố cục luận văn Luận văn dày 90 trang bố cục sau: Mở đầu trang, tổng quan 30 trang, nguyên liệu phương pháp nghiên cứu trang, kết thảo luận 25 trang, kết luận trang Có 19 hình, 21 bảng, 78 tài liệu tham khảo phụ lục CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đậu tương 1.1.1 Nguồn gốc sản lượng 1.1.2 Thành phần giá trị dinh dưỡng 1.2 Isoflavone đậu tương 1.2.1 Cấu trúc 1.2.2 Hàm lượng isoflavone thực phẩm từ đậu tương 1.2.3 Quá trình trao đổi chất hấp thụ isoflavone người 1.2.4 Lợi ích isoflavone sức khỏe 1.2.5 Tính an toàn isoflavone đậu tương 1.3 Sự chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglucone đậu tương 1.3.1 Sự chuyển hóa isoflavone kiềm axit 1.3.2 Sự chuyển hóa isoflavone bằng enzyme  – glucosidase 1.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.4.1 Nguồn gốc phân loại 1.4.4 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis lên men đậu tương 1.5 Một số thực phẩm giàu isoflavone thị trường giới Việt Nam CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu - Đậu tương giống ĐT84 Viện Khoa học Nông nghiệp cung cấp - Chế phẩm Enzyme Lactozym (công ty Novo Nordisk, Đan Mạch), Novozyme 188 (công ty Novozymes, Đan Mạch) Sumizyme FP (công ty Shin-nihon Kagaku, Nhật Bản) - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 phân lập từ sản phẩm natto vùng Nagoya (Nhật Bản) - Các hóa chất phân tích sử dụng Merck (Đức), Sigma (Mỹ), BDH (Anh) A.R (Trung Quốc) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu - Các phương pháp công nghệ: Phương pháp chuẩn bị sữa đậu tương, phương pháp thủy phân sữa đậu tương chế phẩm enzyme thương mại, phương pháp lên men sữa đậu tương - Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn - Các phương pháp phân tích lý hóa: Phương pháp đo pH, xác định nồng độ chất khô, xác định hàm lượng protein, xác định hàm lượng lipid, xác định hàm lượng carbohydrate, xác định hàm lượng isoflavone sắc kí lỏng cao áp (HPLC), xác định hoạt tính enzyme glucosidase, xác định hiệu suất chuyển hóa isoflavone CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tƣơng từ dạng glycoside sang dạng aglucone chế phẩm enzyme 3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm enzyme thích hợp Sử dụng ba chế phẩm enzyme phổ biến công nghiệp thực phẩm enzyme Novozyme 188 có hoạt tính -glucosidase , enzyme Sumizyme FP có hoạt tính -glucosidase protease, enzyme Lactozym có hoạt tính -galactosidase để nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone dịch sữa đậu tương Kết phân tích cho thấy hàm lượng isoflavone tổng số mẫu dịch sữa đậu tương thủy phân không khác nhiều Tuy nhiên, hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone thay đổi mẫu xử lý enzyme khác Trong đó, chế phẩm enzyme Sumizyme FP có khả chuyển hoá isoflavone cao đạt 78,51% Do vậy, lựa chọn enzyme Sumizyme FP để nâng cao hàm lượng aglucone sữa đậu tương nghiên cứu 3.1.2 Nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu enzyme Sumizyme FP thủy phân sữa đậu tương 3.1.2.1 Xác định nồng độ tối ưu enzyme Sumizyme FP Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ enzyme Sumizyme FP đến chuyển hoá isoflavone Nồng độ Hàm lƣợng aglucone (mg/100g) enzyme (%) Daidzein Genistein 0,62 1,06 0,5 4,56 6,33 1,0 7,84 8,27 1,5 7,88 8,51 2,0 7,63 8,18 Kết bảng 3.2 cho thấy nồng độ daidzein genistein đạt cao nồng độ enzyme 1,5% theo trọng lượng (là 7,88 mg/100g 8,51 mg/100g tương ứng), giá trị aglucone không khác nhiều so với nồng độ enzyme 1,0% (là 7,84 mg/100g 8,27 mg/100g tương ứng) Tiếp tục tăng nồng độ enzyme lên 2,0% hàm lượng aglucone lại giảm xuống Do vậy, lựa chọn nồng độ chế phẩm Sumizyme FP sử dụng 1,0% để trình thủy phân sữa đậu tương đạt hiệu suất chuyển hoá isoflavone cao 3.1.2.2 Xác định pH tối ưu chế phẩm enzyme Sumizyme FP Các giá trị pH từ 3,5 – 7,0 khảo sát để xác định khả chuyển hoá tối ưu isoflavone từ dạng glucoside sang dạng aglucone dịch sữa đậu tương chế phẩm enzyme Sumizyme FP Kết phân tích hàm lượng isoflavone sữa đậu tương cho thấy chuyển hoá isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone đạt cao pH 5,0 (daidzein có hàm lượng 8,11 mg/100g genistein có hàm lượng 8,45 mg/100g) Ở khoảng pH 5, hàm lượng genistein daidzein giảm Như vậy, giá trị pH sữa đậu tương thích hợp cho enzym Sumizyme FP 5,0 3.1.2.3 Xác định nhiệt độ tối ưu enzym Sumizyme FP Các mẫu sữa đậu tương sau thuỷ phân điều kiện nhiệt độ khác thời gian 180 phút phân tích hàm lượng daidzein genistein Kết thu cho thấy hàm lượng daidzein genistein đạt cao nhiệt độ 500C (8,11mg/100g 8,45mg/100g tương ứng) Nhiệt độ cao 50 oC bất hoạt phần enzyme khiến hàm lượng aglucone giảm xuống Như vậy, nhiệt độ 50 0C tối ưu cho hoạt tính thuỷ phân enzyme -glucosidase chế phẩm Sumizyme FP 3.1.2.4 Xác định thời gian tối ưu cho trình thủy phân sữa đậu tương chế phẩm enzyme Sumizyme FP hiệu suất chuyển hóa isoflavon (%) 100 88.25 89.26 92.61 90 80 65.78 70 49.63 60 50 40 30 20 Thời gian (h) Hình 3.2 Hiệu suất chuyển hóa isoflavone sữa đậu tƣơng thủy phân enzyme Sumizyme FP theo thời gian Kết hình 3.2 cho thấy hiệu suất chuyển hóa isoflavone tăng lên theo tỷ lệ thuận với thời gian thủy phân từ đến h Tuy nhiên, kéo dài thủy phân kéo dài thời gian thủy phân 4h sữa đậu tương xảy tượng đông tụ phân lớp, biểu sữa đậu tương bị hư hỏng Do vậy, thời gian thủy phân sữa đậu tương thích hợp 4h Sữa đậu tương thủy phân enzyme Sumizyme FP với điều kiện tối ưu có hàm lượng aglucone 17,67 mg/100g (daidzein genistein tương ứng 8,52mg/100g 8,87mg/100g) với hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 88,25% 3.2 Nghiên cứu nâng cao hàm lƣợng isoflavone aglucone sữa đậu tƣơng phƣơng pháp lên men 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ chất dịch sữa đậu tương đến chuyển hóa isoflavone Hiệu suất chuyển hóa (%) 100 90 80 65.69 70 60.01 60 51.34 50 40 32.5 30 20 10 Hình 3.4 Hiệu suất chuyển hóa glycoside sang aglucone nồng độ chất lên men Nồng độ chất (oBx) ban đầu khác Hình 3.4 cho thấy nồng độ chất ban đầu 4, 8% tỷ lệ chuyển hóa tương ứng 51,4%; 60,1% 65,7% Điều đáng lưu ý nồng độ chất ban đầu 10%, hiệu suất chuyển hóa daidzin genistin thấp, đạt 32,5%, số lượng tế bào trình lên men khác biệt nhiều so với mẫu có nồng độ chất ban đầu 4,6, 100Bx Từ kết trên, lựa chọn nồng độ chất 80Bx cho nghiên cứu 3.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ giống vi khuẩn đến khả chuyển hóa isoflavone Hàm lƣợng isoflavon (mg/100g) 16 14 12.85 11.45 11.31 12 10.5 10 9.26 7.94 7.2 7.07 Hình 3.5 Hàm lƣợng isoflavone glucoside isoflavone aglucone sau lên men với 0.5 1.0 1.5 2.0 tỷ lệ giống khác nhauTỷ lệ giống (%) Glycoside Aglucone Căn vào kết minh họa hình 3.5 cho thấy rõ ràng mẫu lên men với tỷ lệ giống khác nhau, hàm lượng isoflavon dạng aglucone thấp mẫu cấy giống 0,5% (7,20mg/100g) Khi tăng tỷ lệ giống cấy lên 1%, hàm lượng aglucone tăng lên 11,31mg/100g Tuy nhiên, tiếp tục tăng tỷ lệ cấy giống lên 1,5% hàm lượng aglucone không tăng lên lên nhiều (11,45mg/100g) tăng tỷ lệ tiếp giống lên 2% hàm lượng aglucone không tăng lên mà giảm đi, xuống 10,50mg/100g Điều chứng tỏ tỷ lệ cấy giống thấp cao giá trị 1,0-1,5% ảnh hưởng không tốt đến khả chuyển hóa glycoside sang aglucone vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 trình lên men dịch sữa đậu tương 3.2.3 Ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả chuyển hóa isoflavone Kết minh họa hình 3.6 cho thấy khả chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglycone vi khuẩn B.subtilis LH10 đạt hiệu cao khoảng pH dịch lên men ban đầu từ 6,0-7,0, nhiên, hàm lượng aglucone đạt cao pH 6,5, 11,92mg/100g Tại giá trị pH 7,0, số lượng tế bào đạt cao (18,5 x 108CFU/ml) hàm lượng isoflavone aglucone lại thấp so với hàm lượng aglucone pH 6,5 (chỉ đạt 10,73mg/100g) Do vậy, pH 6,5 giá trị tối ưu cho trình lên men sữa đậu tương để nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone 14 9.30 9.25 10 9.20 Log (tế bào/ml) Hàm lƣợng isoflavone (mg/100g) 12 9.15 9.10 6.0* 6.5 7.0 7.5 8.0 pH dịchđối lên men Ghi chú: * giá trị pH mẫu chứng, không điều chỉnh pH Hình 3.6 Hàm lƣợng isoflavone glycoside, aglucone số lƣợng tế bào sau lên men Glycoside Aglucone Log (tế bào/ml) giá trị pH ban đầu khác 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chuyển hóa isoflavone Hàm lƣợng isoflavone (mg/100g) 14 Glycoside Aglucone 12 10 Hình 3.7 Hàm lƣợng isoflavone dạng glycoside dạng aglucone dịch sau lên men điều kiện nhiệt độ khác 37 40 42 45 Nhiệt độ lên men (oC) Hình 3.7 cho thấy yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến hàm lượng aglucone tạo thành trình lên men Nhiệt độ 40 - 42oC cho kết lên men tốt, với hàm lượng aglucone dịch sau lên men 12,16 mg/100g 12,47mg/100g tương ứng 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả chuyển hóa isoflavone Theo dõi chuyển hóa isoflavone thông qua hàm lượng aglucone tạo thành hàm lượng glycoside giảm xuống suốt trình lên men điều kiện xác định nồng độ chất 8oBx, pH 6,5, tỷ lệ tiếp giống 1,0% nhiệt độ lên men 42 0C Kết trình bày hình 3.8 Hàm lƣợng isoflavon (mg/100g) 25 23.5 21.84 20 16.9 15 11.54 12.89 10 12.76 8.9 12.45 12.58 10.21 7.15 9.03 4.94 6.82 Hình 3.8 Hàm lƣợng isoflavone glycoside aglucone sau lên men thời gian khác 1.49 1.6 4.71 4.52 28 32 12 16 20 24 Kết minh họa trênThờihình gian (h)3.8 cho thấy hàm lượng aglucone tăng nhanh giai đoạn từ 4-12h trình lên men Hàm lượng aglucone tăng từ 1,49 mg/100g lên 7,15 mg/100g, gấp gần lần Tuy nhiên, sau thời điểm 12h hàm lượng aglucone tăng chậm đạt 12,18mg/100g sau 28h lên men Đặc biệt sau 28h hàm lượng algucone tăng không đáng kể, tăng 0,13mg/100g thời điểm 32h Chính vậy, cho nên kéo dài thời gian lên men vi khuẩn B.subtilis LH10 đến 28 h với hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 79,95% phù hợp 3.2.6 Ảnh hưởng tốc độ sục khí vô trùng đến khả chuyển hóa isoflavone Glycoside Aglucone Bảng 3.9 Ảnh hƣởng sục khí vô trùng đến hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglucone trình lên men Tốc độ sục khí vô trùng (v.v.m) Số lƣợng tế bào sau 12 h Hiệu suất chuyển hóa lên men (tế bào/ml) isoflavone (%) x105 37,2 16 x 10 56,4 19,1 x 10 69,8 14,5 x 108 80,5 16,9 x 10 74,9 Kết bảng 3.9 cho thấy hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone tất mẫu có sục khí vô trùng trình lên men cao nhiều so với mẫu đối chứng không sục khí Hiệu suất chuyển hóa đạt cao mẫu có tốc độ sục khí 1,5 v.v.m (là 80,5%) Ở điều kiện này, số lượng tế bào sau 12 h lên men đạt cao, 14,5 x 108 tế bào/ml Tốc độ sục khí cao 2,0 v.v.m dịch có làm tăng số lượng tế bào sau 12h lên men đến 16,9x108 tế bào/ml lại không làm tăng hiệu suất chuyển hóa isoflavone, lựa chọn tốc độ cấp khí cho trình lên men 1,5 v.v.m 0,5 1,0 1,5 2,0 Tiến hành lên men chất sữa đậu tương 8oBx vi khuẩn B.subtilis LH10 thiết bị lên men lít Labo-controller MDL-8C với điều kiện tối ưu xác định Dịch sữa đậu tương lên men giàu isoflavone thu có hàm lượng isoflavone tổng số aglucone 17,03 mg/100g 12,34 mg/100g, tương ứng Hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone đạt 79,91% Dịch sữa lên men đậu tương sấy phun tạo thành Bột đậu tương lên men giàu isoflavone dạng aglucone phục vụ cho công nghiệp chế biến thực phẩm công nghiệp dược phẩm sản xuất thực phẩm chức giàu isoflavone có hoạt tính sinh học cao với tác dụng chống loãng xương, giảm cholesterol máu,… CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, đề tài đưa giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone sau: Thủy phân sữa đậu tương với chế phẩm enzyme Sumizyme FP Điều kiện tối ưu trình thủy phân xác định pH sữa đậu tương: 5,0; Nhiệt độ thủy phân: 500C; Nồng độ enzyme: 1,0% thời gian thuỷ phân: h Hiệu suất chuyển hóa isoflavone sau qúa trình thủy phân đạt 88,25% Dịch sữa đậu tương thủy phân thu có hàm lượng protein cao (7,84%) hàm lượng isoflavone dạng aglucone 17,67 mg/100g Lên men sữa đậu tương với chủng vi khuẩn B.subtilis LH10 Điều kiện lên men tối ưu xác định nồng độ chất: oBx; tỷ lệ cấy giống: 1,0%; pH sữa đậu tương ban đầu: 6,5; tốc độ khuấy: 150 vòng/phút; tốc độ sục khí vô trùng: 1,5 v.v.m, nhiệt độ lên men 42 oC thời gian 28h Sữa đậu tương lên men thu đạt hàm lượng isoflavone dạng aglycone 12,34mg/100g hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 79,91% Tùy theo điều kiện thiết bị mục đích sản xuất mà lựa chọn hai giải pháp Sữa đậu tương giàu isoflavone dạng aglucone chế biến thành dạng bột để làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thực phẩm dược phẩm Kiến nghị Do thời gian thực tập có hạn, đề tài nghiên cứu số giải pháp nâng cao hàm lượng isoflavone dạng aglucone lên men với vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 thực quy mô phòng thí nghiệm Nếu có thêm điều kiện, tiếp tục thực nghiên cứu xác định điều kiện lên men tối ưu cho trình lên men sữa đậu tương chủng Bacillus subtilis LH10 quy mô pilot References Tài liệu tiếng Việt Niên giám thống kê (2011), Nhà xuất thống kê, Tổng cục thống kê Trương Hương Lan, Trần Thị Minh Hà, Lại Quốc Phong, Dương Văn Đồng, Ngô Anh Tuấn (2006), Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm isoflavon có hoạt chất sinh học cao, ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng, Báo cáo Đề tài cấp Bộ Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất Xây dựng Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Adlercreutz H., Fotsis T., Heikkinen R., et al (1982), “Excretion of the lignans enterolactone, enterodiol and equol in omnivorous and vegetarian women and in women with breast cancer”, Lancet, 2, pp 1295-9 Adlercreutz H., Van der Wildt J., Attalla H., Wahala K., Makela J., Hase T., & Fotsis T (1995), ”Lignan and isoflavonoid conjugates in human urine”, J Steroid Biochem Mol Biol., 52, pp 97 – 103 AOAC (1990), Official Methods of Analysis, Arling ton, VA Arijmandi B.H., Alekel L., Hollis B.W., et al (1996), “Dietary soybean protein prevents bone loss in an ovariectomized rat model of osteoporosis”, J Nutr., 126, pp.161-167 Axelson M., Kirk D.N., Fairant R.D., Cooley G., Lawsin A.M., & Setchell K.D.R (1982), “The identification of the weak oestrogen equol 7-hydroxyl-3-(4’-hydroxyphenyl) chroman in human urine”, Biochem J., 201, pp 353-357 Bannwart C., Adlercreutz H., Fotsis T., Wahala K., Hase T., Brunow G (1984), “Identification of O-desmethylangolensin, a metabolite of daidzein, and of matairesinol, one likely plant precursor of the animal lglycosidnan enterolactone, in human urine”, Finn Chem Lett., 4-5, pp 120-5 10 Bayer T.A., Wirths O., Majtenyi K., Hartmann T., Multhaup G., Beyreuther K., Crech C (2001), “Key factors in Alzheimer’s disease:  – amyloid presursor protein processing metabolism and intaneuronal transport”, Brain Pathol., 11, pp 1-11 11 Bhathena S.J., Valasquez M.T (2002), “Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes”, Am J Clin Nutr., 76, pp 1191 – 1201 12 Buchanan R.E., et al (1974), Bergey’ manual of determinative bacteriology (Eighth edition), Waverly press, USA, pp 529 – 551 13 Cassidy A (1996), “Physiological effects of phytoestrogens in relation to cancer and other human health risks”, Proc Nutr Soc., 55, pp 399 – 417 14 Carmignani L.O., Pedro A.O., Costa-Paiva L.H., Pinto-Neto A.M (2010), “The effect of dietary soy supplementation compared to estrogen and placebo on menopausal symptoms: a randomized controlled trial”, Maturitas, 67(3), pp.262-269 15 Chien H.L., Huang H.Y., & Chou C.C (2006), “Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentations of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria”, Food Microbiol., 23, pp.772-778 16 Chiou T.Y., Lin Y.H., Su N.W., Lee M.H (2010), “Beta-glucosidase isolated from soybean okara shows specificity toward glucosyl isoflavones”, J Agric Food Chem., 58(15), pp 8872-8 17 Choi Y.B., Kim K.S., Rhee J.S (2002), “Hydrolysis of soybean isoflavone glycosides by lactic acid bacteria”, Biotechnol Lett., 24, pp 2113 – 2116 18 Chun J., Kim G.M., Lee K.W., Choi I.D., Kwon G.H., Park J.Y., Jeong S.J., Kim J.S., & Kim J.H (2007), “Conversion of isoflavone glucosides to aglycones in soymilk by fermentation with lactic acid bacteria”, J Food Sci., 72, pp.39-44 19 Chun J., Kim J.S., & Kim J.H (2008), “Enrichment of isoflavone aglycones in soymilk fermented with single and mixed cultures of Streptococcus infantarius 12 and Weissella sp.4, Food Chem., 109, pp.278-284 20 Delmonte P., Perry J., Rader J.I (2006), “Determination of isoflavones in dietary supplements containing soy, Red Clover and kudzu: extraction followed by basic or acid hydrolysis”, J Chromatogr A., 1107(1-2), pp 59-69 21 Donkor O.N., Nilmini S.L I., Stolic P., et al (2007), “Survival and activity of selected probiotic organisms in set-type yoghurt during cold storage”, Int Dairy J., 17, pp.657665 22 Elkind-Hirsch K (2001), “Effect of dietary phytoestrogens on hot flushes can soy based proteins substitute for traditional estrogens replacement therapy”, Arch Int Med., 161, pp 1161 – 72 23 Food and Agriculture Organization, 2011 24 Fundamental Concepts in the safety assessment of foods containing soy isoflavones for purpose of specified health use Food Safety Commission of Specified Health Use, Food Safety Commission Novel Foods Expert Commitee, May, 2006 25 Hammond E.G., Johnson L.A., et al (2005), Composition of Soybean: Soybean Oil, Iowa State University Ames, Iowa, pp 579 26 Han Y., C.M Parsons, and T Hymowitz (1991), “Nutrional Evaluation of Soybeans Varying in Trypsine Inhibitor Content”, Poultry Sci., 70, pp 896-906 27 Hemion S.M., et al (2002), “Metabolism of isoflavones in human subjects”, Phytochem Rev., 1, pp.175-182 28 Howes J.B., Sullivan D., Lai N., Nestel P., Pomeroy S., West L., Eden J.A., & Howes L.G (2000), “The effects of dietary supplementation with isoflavones from 10 menopausal women with mild to moderate hypercholesterolaemia”, Atheroaclerosis, 152, pp 143 – 147 29 Ibe S., Kumada K., Yoshiba M., Onga T (2001), “Production of natto which contains a hglycosidh level of isoflavone aglucones”, Nipp Shok Kag Kog Kai., 48, pp 27 – 34 30 Izumi T., Piskula M.K., Osawa S., Obata A., Tobe K., Saito M., Kataoka S., Kubota Y., Kikuchi M (2000), “Soy isoflavone aglucones are absorbed faster and in higher amounts than theirs glycosides in humans”, J Nutr., 130, pp 1695-1699 31 Katekan D., Enkachai C., Arunee A and Richard A (2009), “Enhanced aglucone production of fermented soybean products by Bacillus species”, Acta Biol Szeged., 53(2), 93 – 98 32 King R A., & Bignell C M (2000), “Concentrations of isoflavone phytoestrogens and their glucosides in Australian soya beans and soya foods”, Aust J Nutr Diet., 57, pp 70 – 78 33 Klump S P., Allred M C, MacDonald J L., Ballam J M (2001), “Determination of isoflavones in soy and selected foods containing soy by extraction, saponification, and liquid chromatography: Collaborative study”, J AOAC Int., 84, pp 1865 – 1883 34 Kudou S., Flueury Y., Welti D., et al (1991), “Malonyl isoflavone glycosides in soybean seeds (Glycine max MERILL)”, Agric Biol Chem., 55, pp 2227-33 35 Kumar S., Rekha and Sinha L.K (2010), “Evaluation of quality characteristics of soy based millet biscuits”, Adv Appl Sci Res., 1(3), pp 187-196 36 Kuo L.C., Cheng W.Y., Wu R.Y., Huang C.J and Lee K.T (2006), “Hydrolysis of black soybean isoflavone glycosides by Bacillus subtilis natto”, Appl Microbiol., 73, pp 314 – 320 37 Kurzer M.S (2000), “Hormonal effects of soy isoflavones: Studies in premenopausal and postmenopausal women”, J Nutr., 130, pp 660-661 38 Lim J.S., Jang C.H., et al (2009), “Biotransformation of Free Isoflavones by Bacillus species isolated from traditional Cheonggukjang”, Food Sci Biotechnol., 8(4), pp.1046-1050 39 Liu K.S., F.T Ortheofer, and E.A Brown (1995), “Association of Seed Size with Genotypic Variation in the Chemical Constituents of Soybeans”, J Am Oil Chem Soc., 72, pp 189-192 11 40 Liu K.S (1999), Soybeans: Chemistry, Technology, and Utilization, Klewer Academic Publishers, New York 41 Liu K (2004), Soybean as functional foods and ingredients: AOCS Press., Champaign, Illinois, USA 42 Ma D.F., Quin L.Q., Wang P.Y., Katoh E (2008), “Soy isoflavones intake increases bone mineral density in the spine of menopausal women: meta-analysis of randomized controlled trials”, Clin Nutr., 27, pp 57-64 43 Miura T., Yuan L., Sun B., Fujii H., Yoshida M., Wakame K., Kosuna K (2002), “Isoflavone aglucone produced by culture of soybean extracts with Basisiomycetes and its anti-angiogenic activity”, Biosci Biotechnol Biochem., 66, pp 2626-2631 44 Murkies A.L., Wilcox G., Davis S.R (1998), “Phytoestrogens”, J Clin Endocrinol Metab., 83, pp 297 – 303 45 Murphy P.A., Song T., Buseman G., Barua K (1997), “Isoflavones in soy-based infant formula”, J Arg Food Chem., 45, pp 4635 – 4638 46 Nagata C., Tatatsuka N., Kurisu Y., Shimizu H (1998), “Decreased serum total cholesterol concentration is associated with high intake of soy products in Japanese men and women”, J Nutr., 128, pp 209 – 13 47 Nagata C., Shimizu H., Takami R., Hayashi M., Takeda N., Yasuda K (2003), “Hot flushes and other menopausal symptoms in relation to soy product intake in Japanese women”, Climateric, 6, pp – 12 48 Nestel P (2003), “Isoflavones: their effects on cardiovasculas risk and functions”, Cur Opinion Lipodol, 14, pp – 49 Obata A, et al (2001), Process for production isoflavone aglycone – containing composition, United States Patent No 0010930, Aug.2, 2001 50 Orf J.H (1988), Modifying Soybean Composition by Plant Breeding, in Proceeding: Soybean Utilization Alternatives, edited by L McCann, University of Minnesota, St Paul, pp 131 51 Otieno D.O., Ashton J.F., and Shah N.P (2006), “Evaluation of enzymic potential for biotransformation of isoflavone phytoestrogen in soymilk by Bifidobacterium animalis, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei”, Food Res Int., 39, pp 394-407 12 52 Otien D.O., Ashton J.F & Shah N.P (2007), “Isoflavone phytoestrogen degradation in fermented soymilk with selected beta-glucosidase producing L.acidophilus strains during storage at different temperatures”, Int J Food Microbiol., 115, pp 79 -88 53 Pham T.T., & Shah N.P (2009), “Hydrolysis of isoflavone glycosides in soymilk by galactosidase and -glucosidase”, J Food Biochem., 33, pp.38-60 54 Piskula M.K., Yamakoshi J., & Iwai Y (1999), “Daidzein and genistein but not their glucosides are absorbed from the rat stomach”, FEBS Lett., 447, pp 287 – 291 55 Potter S M., Baumm J A., Teng H., Stillman R J., Shay N.F., and Erdman J W Jr (1998), “Soy protein and isoflavones: their effects on blood lipids and bone density in postmenopausal women”, Am J Clin Nutr., 68, pp 1375 – 1379 56 Shelef L A., Bahnmiller K R., Zemel M.B., & Monte L.M (1998), “Fermentation of soymilk with commericial free – dried starter lactic cultures”, J Food Process Preservation, 12, pp 187-195 57 Setchell K D R., Brown N M, Desai P., Zimmer – Nechemias L., Wolfe B E., Brasheas W T., Kirschner A S., Cassidy A., & Heubi J E (2001), “Bioavailability of pure isoflavones in healthy humans and analysis of commerial soy isoflavone supplements”, J Nutr., 131, pp.1362 – 1375 58 Shen J.L, et al (1994), Aglucone isoflavone enriched vegetable protein fiber, United States Patent No.5,352,384, Oct.4, 1994 59 Simopoulos A.P., Leaf A., Salem N (1999), “Essentiablity of recommended dietary intakes for omega – and omega-3 fatty acids”, Ann Nutr Metab., 43, pp 127 – 130 60 Song T., Barua K., Buseman G., Murphy P.A (1998), “Soy isoflavones analysis: Quality control and a new internal standard”, Am J Clin Nutr., 68, pp 1474 – 1479 61 Raimodi S., Roncaglia L., De Lucia M., Amaretti A., et al (2009), “Bioconversion of soy isoflavones daidzin and daidzein by Bifidobacterium strains”, Appl Microbiol Biotechnol., 81, pp.943-950 62 Ribeiro M.L.L., Mandarino J.M.G., Panizzi M.C.C., Oliveira M.C.N., Campo C.B.H., Nepomuceno A.L., (2007), “Isoflavone content and beta glucosidase activity in soybean cultivars of different maturity groups”, J Food Compos Anal., 20(1), pp 1924 63 Ryowon C., Lee J.Y., Lee H.O., Chung S.J., Cho M.R., Kim J.Y., Lee I.H (2004), “The long term effects of soy-based formula on isoflavone concentration of plasma and 13 urine, and growth and recognition development at 10 and 20 months old infants”, Asia Pac J Clin Nutr., 13, pp.123 64 Teede H.J., Dalais F.S., Kotsopoulos D., Liang Y.L., Davis S., Mc Grath B.P (2001), “Dietary soy has both beneficial and potentially adverse cardiovascular effects: a placebo-controlled study in men and postmenopausal women”, J Clin Endocrinol Metab., 86, pp 3053 – 60 65 Tsanglis D., Ashton J.F., Mc Gill A.E.J., & Shah N.P (2002), “Enzymic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by beta-glucosidase producing Bifidobacteria”, J Food Sci., 67, pp 3104-3113 66 USDA National Nutrient Database for Standard Reference Release 22 Nutrient Data Laboratory home page, USDA, Agricultural Research Service; 2009 67 Wang H.J., Murphy P.A (1994), “Isoflavone content in commercial soybean foods”, J Agric Food Chem., 42, pp 1666 – 1673 68 Wang H.J and Murphy P.A (1996) “Mass balance study of isoflavones during soybean processing”, J Agric Food Chem., 44, pp 2377-2383 69 Wang G., Kuan S.S., Francis O.J., Ware G.M., & Carman A.S (1990), “A simplified HPLC method for the determination of phytoestrogens in soybean and its processed products”, J Agric Food Chem., 38, pp.185-190 70 Wei Q.K., Chen T.R., & Chen J.T (2007), “Using of Lactobacillus and Bifidobacterium to product the isoflavone aglucones in fermented soymilk”, Int J Food Microbiol., 117, pp 120-124 71 Wei Q.K,, Chen T.R and Chen J.T (2008), “Use of Bacillus subtilis to enrich isoflavone aglucones in fermented natto”, J Science Food Agric., 88, pp 1007 – 1011 72 Wu A.H., Yu M.C., Tseng C.C., Pike M.C (2008), “Epidemiology of soy exposures and breast cancer risk”, Br J Cancer, 98, 9-14 73 Xu X., Wang H.J., Murphy P.A., Cook L., Hendrich S (1994), “Daidzein is more bioavailable soymilk isoflavone than is genistein in adult women”, J Nutr., 124, pp 825 – 823 74 Xu D H., J Abe J Y., Gai and Y Shimamoto (2002), “Diversity of chloroplast DNA SSRx in wild and cultivated soybeans Evidence for multiple origins of cultivated soybean”, Theor Appl Genet, 105, pp 645 – 653 14 75 Yamabe S., Kazuo kobayashi-Hattori K., Kaneko K., Endo H., Takita T (2007) “Effect of soybean varieties on the content and composition of isoflavone in ria-koji miso”, Food Chem., 100, pp 369-374 76 Yin, L J., Li, L T., Li, Z G., Tatsumi, E., & Saito, M (2004) “Changes in isoflavone contents and composition of sufu (fermented tofu) during manufacturing”, Food Chem., 87(4), pp 587-592 77 Zhang Y., Wang G., et al (1999), “Urinary disposition of the soybean isoflavones daidzein, genistein and glycitein differs among humans with moderate facel isoflavone degredation activity”, J Nutr., 129, 957-962 78 Zhou X G., Melby M.K., Watanabe S (2004) “Soy isoflavone intake lowers serum LDL- cholesterol: A meta-analysis of randomized controlled trials in humans”, J.Nutr., 134, pp 2395-2400 15