Luận văn một số đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn MỞ ĐẦU Virus suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus - HIV) nguyên nhân gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome AIDS) virus gây bệnh nguy hiểm Theo tài liệu công bố, có hai type HIV gây nên AIDS HIV type (HIV-1) HIV type (HIV-2), HIV-1 nguyên nhân gây AIDS toàn giới Theo số liệu Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3 triệu người sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người chết AIDS có thêm 2,6 triệu trường hợp bị nhiễm virus Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc phát người nhiễm HIV 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện 63/63 tỉnh/thành phố Tổng số trường hợp nhiễm HIV 235.535 người, số bệnh nhân AIDS 94.613 người, số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo 49.912 người Trong chu trình sống HIV-1, protease enzyme thiếu Enzyme cắt chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) vị trí định để tạo thành protein cấu trúc chức cần thiết cho virus hoàn chỉnh Vì protease xem đích tác động quan trọng cho liệu pháp tìm thuốc điều trị HIV/AIDS Tuy nhiên, HIV chép nhanh, enzyme phiên mã ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo biến đổi liên tục cấu trúc hệ gen nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc Mặc dù ngày nhiều chất ức chế protease chống HIV sản xuất thương mại hóa việc tìm chất ức chế protease quan tâm Bên cạnh đó, đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho loại thuốc riêng biệt, thay loại thuốc khác trước có tích lũy đột biến phác đồ sau thành công (Hoffmann tập thể, 2007)§ Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo hướng phát đột biến gen mã hóa protease HIV có vai trò quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc vấn đề nghiên cứu Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu người Việt Nam tìm số đột biến liên quan kháng thuốc Đặc biệt, chưa có nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân lập từ bệnh nhân người Việt Nam Đề tài nghiên cứu đặt nhằm phát số đột biến kháng thuốc gen mã hóa protease HIV, đồng thời bước đầu biểu gen vi Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn khuẩn E coli để làm sở cho nghiên cứu Các nghiên cứu luận văn thực Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung HIV 1.1.1 HIV/AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải gọi tắt AIDS, virus HIV gây suy giảm miễn dịch người phát Mỹ năm 1981, đến trở thành “căn bệnh kỷ” toàn giới Về phân loại, HIV Retrovirus có máy di truyền thuộc họ Retroviridae với hai type HIV type (HIV-1) HIV type (HIV-2), HIV-1 gây 98% lan truyền HIV-2 chiếm ưu vùng tây châu Phi, lan truyền giới [1, 15] Vì vậy, HIV-1 xem nguyên nhân gây nên AIDS HIV-1 chia thành nhóm M (main), O (outlier), nhóm N (new) 90% lây nhiễm HIV thuộc nhóm M Trong nhóm M gồm phân nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating recombinant form-CRF) Các phân nhóm khác chủ yếu cấu trúc protein vỏ đặc trưng cho truyền nhiễm theo khu vực địa lý Đây đặc điểm đáng lưu ý nghiên cứu để tìm thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS theo khu vực [14] Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, mô tả hình Lớp vỏ virus HIV bao gồm lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào chủ, lớp vỏ có chứa khoảng 72 protein env virus, protein env lại chứa mũ tạo thành từ phân tử gp120 thân tạo thành từ phân tử gp41 có chức neo giữ lõi virus với vỏ bao Lõi virus có dạng hạt đậu tạo thành từ 2.000 protein p24 Trong lõi bao gồm hệ gen HIV hai sợi RNA (+) đơn, sợi có kích thước khoảng 10 kb gồm gen mã hóa cho 15 protein khác Cuối chuỗi RNA trình tự gọi trình tự lặp lại tận dài (LTRs) đóng vai trò việc kiểm soát nhân lên điều hòa trình tổng hợp protein virus Giống retrovirus khác, HIV có gen gag, pol env mã hóa cho protein tham Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn gia vào trình chép trưởng thành virus Sản phẩm ban đầu gen gag protein 56 kDa, sau chế biến thành sản phẩm p17, p24 p15 protein cấu trúc virus Gen pol mã hóa cho enzyme reverse transcriptase (RT), intergrase protease enzyme RT có chức phiên mã ngược RNA virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễm sắc thể tế bào chủ protease tham gia vào trình cắt phân tử protein tiền thân dạng polypeptide thành protein cấu trúc chức cần cho hình thành thể virus Gen env mã hóa cho glycoprotein capsid virus; sản phẩm gen env (gp160) cắt protease tế bào chủ thành gp120 gp41 sau lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân lớp vỏ virus Ngoài gen chính, HIV có gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr vpu) chứa thông tin mã hóa cho protein có khả kiểm soát tái bản, cách lây nhiễm khác nguy nhiễm loại bệnh khác [5, 17, 22] Hình 1: Cấu tạo HIV [40] Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn HIV truyền nhiễm theo đường, bao gồm đường tiêm truyền dùng chung kim tiêm, lây nhiễm truyền máu sản phẩm máu, từ mẹ bị nhiễm bệnh sang thai nhi qua quan hệ tình dục không an toàn [1, 15] Quá trình tiến triển bệnh chia thành thời kì Sự lây nhiễm HIV ban đầu gọi trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, sau virus khắp thể, nhân mạnh đáp ứng miễn dịch thích hợp phát [1, 7, 15] Người bệnh sốt nhẹ, có triệu chứng cảm cúm, hạch lympho sưng to, có không thấy triệu chứng Tiếp theo giai đoạn tiềm ẩn kéo dài từ đến 12 năm (tùy theo người nhiễm) Trong giai đoạn này, trình chép virus giảm số lượng tế bào lympho T CD4+ tăng lên, virus HIV phát PCR RT-PCR lympho máu mô bạch huyết [1] Khoảng vài năm sau, mật độ virus máu tăng nhanh giữ mức lúc chết, kháng thể kháng virus giảm dần Giai đoạn gọi giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối Lúc hội chứng lâm sàng bệnh suy giảm miễn dịch xuất hiện, vi sinh vật hội có điều kiện công, người bệnh chết dần [7, 16, 28] Chính đặc trưng phân tử cách công hệ thống miễn dịch HIV mà AIDS trở thành bệnh nguy hiểm lịch sử loài người 1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS Đại dịch HIV/AIDS thách thức to lớn tiến trình phát triển xã hội Sau gần thập kỷ phát hiện, bắt đầu nước phát triển, HIV/ AIDS lan rộng toàn giới, đặc biệt phát triển khu vực châu Phi nước châu Á Đến chưa có vaccine phòng ngừa HIV thuốc chữa trị đặc hiệu Theo thông báo Tổ chức y tế giới (WHO) Chương trình phối hợp phòng chống AIDS Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tính khoảng 33,3 triệu người mang bệnh HIV/AIDS, số đối tượng 2,6 triệu người có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân chết AIDS Tại khu vực châu Á, có khoảng 4,87 triệu người sống với HIV/AIDS khu vực Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn Đông Nam Nam Á; tình hình phát triển bệnh ngày tăng với diễn biến phức tạp Theo dự đoán, khu vực trở thành trung tâm đại dịch HIV/AIDS vài thập kỉ tới [37] Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 nước có 180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS, có 42.339 bệnh nhân AIDS tổng số người chết AIDS báo cáo 48.368 Cho đến nay, có 74% xã, phường 97,8% quận, huyện toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS Thành phố Hồ Chí Minh địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao với 23% tổng số bệnh nhân nước Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy, số người phát nhiễm HIV quí đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - 10% không rõ đường lây Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% nữ giới chiếm 29,2% Phần lớn người nhiễm HIV phát tháng qua tuổi từ 20-39 (chiếm 82%), trẻ em 15 tuổi chiếm gần 3% Theo đánh giá chung, tình hình nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm đại dịch HIV/AIDS giai đoạn tập trung – xảy chủ yếu nhóm có hành vi nguy cao, đặc biệt nhóm tiêm chích ma túy nhóm người mại dâm Do hậu to lớn đại dịch HIV/AIDS phát triển xã hội phạm vi toàn cầu, việc tìm vaccine phòng ngừa hiệu thuốc đặc trị cho bệnh vấn đề cấp thiết nhà khoa học y học sinh học phân tử 1.1.3 Phương pháp điều trị HIV/AIDS Cách điều trị HIV/AIDS phổ biến dùng thuốc chống virus, thuốc có tác dụng ức chế phát triển nhân lên HIV giai đoạn khác vòng đời virus Hiện có số nhóm chất chống HIV sử dụng dựa chế tương đồng cấu trúc dẫn đến cạnh tranh hoạt động Chúng chia thành nhóm gồm: chất có chất nucleoside (NRTI) ức chế enzyme phiên mã ngược RT, chất ức chế protease (PI), chất ức chế enzyme phiên mã ngược loại nucleoside (NNRTI), chất ức chế Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn enzyme phiên mã ngược dạng nucleotide (NTRTI) chất ức chế hòa nhập không cho virus nhân HIV/AIDS điều trị thuốc điều hòa miễn dịch alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác dụng tăng cường khả bảo vệ hệ miễn dịch Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS điều trị với số thuốc phòng ngừa bệnh hội [15] Tuy nhiên, HIV có tỷ lệ đột biến cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc việc sử dụng thuốc điều trị thời gian dài dẫn đến tác dụng phụ Chính vậy, hướng nghiên cứu tìm loại thuốc chống HIV/AIDS liệu pháp điều trị cách kết hợp loại thuốc khác vấn đề cấp bách 1.2 Protease HIV-1 (gọi tắt protease HIV-1) Protease HIV-1 enzyme thiếu chu trình sống virus Protease cần thiết để phân cắt tiền chất polyprotein virus gag gag-pol thành protein cấu trúc chức trình trưởng thành virus [39] Các nghiên cứu cho thấy, ức chế hoạt tính protease gây đột biến gen mã hóa cho protease, hạt virus hình thành khả xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19] Với vai trò đặc biệt quan trọng trên, protease HIV-1 đích nghiên cứu nhằm tìm loại thuốc ngăn chặn nhân lên HIV 1.2.1 Gen mã hóa protease HIV- Hệ gen HIV-1 nằm phần lõi virus bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb có gen mã hóa cho 15 protein khác Trên sợi RNA có gen cấu trúc gag, pol env; gag có nghĩa “groupantigen” (kháng nguyên nhóm), pol “polymerase” env “envelope” (vỏ) Các gen gag env mã hóa cho nucleocapsid glycoprotein màng virus; gen pol mã hóa cho enzyme: reverse transcriptase, integrase protease Ngoài ra, HIV-1 có gen (vif, vpu, vpr, tat, rev nef) vùng RNA kb (Hoffmann tập thể, 2007)§ Do tốc độ sinh sản nhanh HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus tạo Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn ngày tỷ lệ sai sót cao enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến bệnh nhân nhiễm bệnh chí chưa dùng thuốc Nghiên cứu bệnh nhân nhiễm chủng CRF01_AE thất bại điều trị HAART Nonthaburi, Thailand đăng ký GenBank với số hiệu từ FJ463512FJ463596, phát đột biến phụ (minor) kháng thuốc PI M36I H69K hầu hết bệnh nhân, I13V, E35D L89M 84% bệnh nhân điều trị ATV, ATV/r, IDV/r, NFV, TPV/r Các nghiên cứu gen mã hóa protease HIV-1 Việt Nam chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu người Việt Nam tìm số đột biến liên quan đến tính kháng thuốc Năm 2003, Nguyễn Hoàng Lan tập thể [21] tiến hành đọc trình tự gen mã hóa RT, protease env bệnh nhân nhiễm HIV-1 miền Nam, chủ yếu thành phố Hồ Chí Minh 198 số 200 bệnh nhân nghiên cứu thuộc phân nhóm CRF01_AE Nghiên cứu xác định 6,5% đột biến kháng thuốc sử dụng HAART 200 bệnh nhân Ishizaki tập thể [15] tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease RT đối tượng bệnh nhân nhiễm HIV-1 Hải Phòng Phân tích hình thái di truyền 1.000 bệnh nhân cho thấy phân nhóm HIV-1 gây bệnh yếu CRF01_AE (chiếm 98,3%) Phân tích đột biến kháng thuốc 294 bệnh nhân có 0,3% đột biến liên quan đến kháng thuốc ức chế protease vị trí M46I Trong đột biến kháng thuốc phổ đột biến kháng PI rộng đa hình xảy 49 gốc axit amin tổng số 99 axit amin protease Mặc dù có kháng chéo từ mức độ vừa đến mức độ cao PI, đột biến tương đối đặc hiệu cho thuốc riêng biệt Phần lớn liệu đột biến phát sinh từ bệnh nhân điều trị PI không tăng cường (PI hệ thứ nhất) Đột biến gặp phác đồ điều trị PI tăng cường (Hoffmann tập thể, 2007)§ Khi điều trị saquinavir không tăng cường chủ yếu xảy đột biến G48V làm giảm độ nhạy với saquinavir 10 lần; kèm thêm đột biến L90M, mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ 100 lần (Jacobsen tập thể, 1995) Trong đó, phải cần số đột biến L10I/R/V, G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V L90M làm giảm hiệu lực Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn saquinavir tăng cường (Valer tập thể, 2002) 1.2.2 Cấu trúc protease HIV-1 Có nhiều cách phân loại protease, dựa vào vị trí cắt chuỗi polypeptide, protease chia thành hai nhóm chính: exopeptidase endopeptidase Exopeptidase cắt liên kết peptide gần đầu N đầu C chất, endopeptidase cắt liên kết peptide nội chuỗi Dựa vào cấu trúc “nhóm chức” có mặt trung tâm hoạt động, protease lại chia thành bốn nhóm chính: protease serine, protease aspartyl, protease cysteine/thiol protease chứa kim loại (metallo protease), tiếp protease lại tiếp tục phân chia thành nhiều họ khác dựa vào trình tự axit amin [34] Theo cách phân loại này, protease HIV-1 protease aspartyl hay protease axit Navia tập thể phòng thí nghiệm Mecrk [27] nhóm tạo cấu trúc tinh thể protease HIV-1 vào năm 1989, kể từ cấu trúc protease nghiên cứu rộng rãi chức năng, tính đặc hiệu chất liên kết với chất ức chế Protease HIV-1 dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt xếp gần theo kiểu đối xứng, tiểu phần có khối lượng khoảng 11 kDa gồm 99 axit amin (Hình 2) Sự tương tác chúng tạo thành cấu trúc không gian với miền (domain) định chức tính chất khác protease HIV-1 [39] Đầu tiên miền kết thúc (terminal domain) gồm phiến gấp nếp β tạo thành từ đầu cuối tiểu phần (axit amin 1-4 90-95 tiểu phần), vòng quay tạo thành từ axit amin 4-9 vòng xoắn α (các axit amin 86-94 tiểu phần) Miền quan trọng việc hình thành ổn định dạng dimer protease có hoạt tính Tiếp theo miền lõi (core domain) với tham gia axit amin từ 10-32 63-85 tiểu phần Trung tâm hoạt động enzyme với trình tự bảo thủ cao Asp25-Thr26-Gly27 tạo thành mặt phân giới miền lõi từ tiểu phần Miền lõi có tính định ổn định dimer hoạt tính xúc tác protease Miền cuối gọi “mũ” (flap domain) gồm vòng tiếp xúc Lớp Cao học K18 2011 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn phần lớn với dung môi (gốc 33-43) trước cấu trúc cặp tóc có chứa mũ (các axit amin 44-63) Các chất ức chế chất liên kết hai tiểu phần liên kết hydro tương tác Van der Waals với vị trí hoạt động gồm hai ba đặc trưng hai mũ linh hoạt Các mũ gấp xuống chất chất ức chế hoạt động suốt trình xúc tác với việc liên kết chất loại trừ phân tử nước từ vị trí hoạt động Có phân tử nước giữ lại hình thành nên cầu nối chất ức chế nhóm –NH- Ile 50/50’ –NH- mũ Phân tử nước thiết yếu cho thủy phân protease bị thay nhóm cacbonyl có chất ức chế thích hợp Các nghiên cứu chứng minh mũ protease thực mềm dẻo tính chất mềm dẻo quan trọng hoạt tính enzyme Nếu đột biến xuất vị trí mũ làm giảm mạnh hoạt tính enzyme [11, 39] Lớp Cao học K18 2011 10 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn ProtHA (hình 14); trình tự gen mã hóa protease HIV-1 pET32-ProtHA giống 100% với trình tự gen mã hóa protease HIV-1 vector pGEM-ProtHA (hình 15) Như vậy, khẳng định chắn gắn thành công đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu pET32a Hình 15: Kết so sánh trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vector pET32-ProtHA vector pGEM-ProtHA 3.2.4 Cảm ứng biểu protease HIV-1 mang đột biến N83T vi khuẩn E coli BL21 (DE3) RIL Để biểu gen mã hóa protease HIV-1, plasmid tái tổ hợp pET32-ProtHA sau đưa vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α tinh biến nạp vào tế bào E coli BL21 (DE3) RIL Một khuẩn lạc tế bào E coli chủng BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA nuôi cấy qua đêm môi trường LB lỏng Tế bào trẻ hóa 150 ml LB lỏng nuôi cấy mật độ tế bào A600 đạt đến khoảng 0,7, tiến hành cảm ứng IPTG 0,1 mM Sau Lớp Cao học K18 2011 39 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn 3h nuôi cấy, tế bào ly tâm để loại bỏ dịch nuôi cấy siêu âm để thu dịch chiết đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa NaCl 100 mM, PMSF 1mM Tương tự, protein tổng số phân đoạn kết tủa thu nhận cách hòa tủa tế bào đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có ure M Protein tổng số phân đoạn dịch chiết phân đoạn tủa tế bào sau điện di gel SDSPAGE 15% thẩm tách miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 Kết điện di protein tổng số hình 16 cho thấy phân đoạn tủa (đường chạy 1) dịch chiết (đường chạy 2) tế bào E coli BL21 (DE3) mang pET32a-ProtHA cảm ứng IPTG xuất băng kích thước khoảng 19 kDa, mẫu không cảm ứng băng protein (đường chạy 4) Kết điện di cho thấy protein tái tổ hợp có mặt phân đoạn kết tủa nhiều dịch chiết Tuy vậy, băng protein tái tổ hợp 19 kDa không tương đương với KLPT protease HIV-1 tái tổ hợp dạng dung hợp gắn với thioredoxin (KLPT tổng cộng 31 kDa) hay dạng tự cắt khỏi thioredoxin (12 kDa) Lớp Cao học K18 2011 40 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn Hình 16: Kết điện di protein tổng số có chứa protease HIV-1 tái tổ hợp mang đột biến N83T phân đoạn dịch chiết tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL Đường chạy 1: Phân đoạn tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA cảm ứng IPTG 0,1 mM Đường chạy 2: Dịch chiết tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA cảm ứng IPTG 0,1 mM Đường chạy 3, 4: Phân đoạn tủa dịch chiết tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA không cảm ứng IPTG Đường chạy 5; 6: Phân đoạn tủa dịch chiết tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-Prot cảm ứng IPTG 0,1 mM (đối chứng dương) Đường chạy 7: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn Đường chạy 8: Phân đoạn tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32a nguyên cảm ứng IPTG 0,1 mM (đối chứng âm) Lớp Cao học K18 2011 41 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn 3.2.5 Tinh protein tái tổ hợp cột sắc ký lực His-bind Để có thêm sở thể lý giải băng protein tái tổ hợp thu có KLPT không phù hợp với tính toán lý thuyết, tiến hành tinh protein sắc ký qua cột lực hisbind Cụ thể, siêu âm phá vỡ màng tế bào, sau loại bỏ dịch thu tủa tế bào Kết tủa rửa đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa Triton X-100 1%, ure M kết hợp lắc nhẹ 30 phút nhiệt độ phòng, sau ly tâm để loại bỏ dịch Bước thực lặp lại lần nhằm loại bỏ phần lớn protein không mong muốn khác Protein tái tổ hợp kết tủa hòa tan đệm Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, ure M, imidazol mM (đệm A), sau cho lên cột hisbind cân với đệm A Protein gắn cột rửa chiết đệm A có chứa imidazol 250 mM Các phân đoạn không hấp thụ cột phân đoạn protein rửa chiết imidazol 250 mM kiểm tra độ tinh điện di protein gel SDS-PAGE 15% thẩm tách miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 Kết điện di protein thể hình 17 cho thấy phân đoạn không hấp thụ cột có chứa số băng protein khác (hình 17, đường chạy 2), phân đoạn rửa chiết imidazol gần có băng protein khoảng 19 kDa (hình 17, đường chạy 1), chứng tỏ protein tinh Kết phân tích thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (hình 18) cho thấy kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 không nhận biết băng protein 19 kDa dịch hòa tan kết tủa tế bào băng protein tái tổ hợp tinh Chúng thử khả phân cắt chất đặc hiệu chế phẩm protein tái tổ hợp thu được, nhiên kết qủa cho thấy protein thu hoạt tính Kết khẳng định protein mà thu protease HIV-1 chứa phần nhỏ protein nên tính kháng nguyên hoạt tính xúc tác protease HIV-1 Tóm lại, phát đột biến kháng nhẹ thuốc PI gen mã Lớp Cao học K18 2011 42 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn hóa protease HIV-1 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam điều trị thuốc kháng virus bước đầu đưa gen vào hệ thống vector biểu pET32a dạng dung hợp với gen mã hóa cho thioredoxin với trình tự nhận biết phân cắt protease HIV-1 Tuy chưa thành công việc biểu gen mã hóa protease HIV-1 để tạo protein có hoạt tính Hình 17: Điện di protein kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột His-bind Đường chạy Phân đoạn rửa chiết cột His-bind imidazil 250 mM Đường chạy Phân đoạn không gắn cột His-bind Đường chạy Protein tổng số tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA Đường chạy Thang chuẩn protein nhuộm sẵn Hình 18: Kết thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh phân đoạn qua cột Hisbind Đường chạy Lớp Cao học K18 2011 43 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn Thang chuẩn protein nhuộm sẵn Đường chạy Protein tổng số tủa tế bào E coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA Đường chạy Protease HIV-1 (Đối chứng dương) Đường chạy Phân đoạn không gắn cột His-bind Đường chạy Phân đoạn rửa chiết cột His-bind imidazil 250 mM Lớp Cao học K18 2011 44 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn KẾT LUẬN Từ kết thu trình nghiên cứu, rút số kết luận sau: Đã nhân bản, nhân dòng xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 thu nhận Việt Nam phát đột biến thay nucleotide A C vị trí 248 (A248C), dẫn đến thay asparagine (N) trí 83 threonine (T) protein Đột biến xác nhận có tính kháng nhẹ thuốc ức chế protease Đã đưa gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vào vector biểu pET32a dạng dung hợp với thioredoxin với trình tự nhận biết phân cắt protease HIV-1 biến nạp vào tế bào E coli BL21 (DE3) RIL Protein biểu từ tế bào mang vector tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 19 kDa, tinh qua cột sắc ký lực hisbind không nhận biết kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 hoạt tính phân cắt chất đặc hiệu enzyme KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu cách có hệ thống diện rộng gen mã hóa protease HIV để phát đột biến kháng PI phục vụ công tác điều trị nghiên cứu Nghiên cứu biểu gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T đột biến kháng PI khác để tìm hiểu đặc trưng xúc tác ảnh hưởng thuốc ức chế protease lên hoạt độ chúng, góp phần làm sáng tỏ tính chất kháng thuốc điều trị bệnh AIDS Lớp Cao học K18 2011 45 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Hồng Loan, Hồ Xuân Hùng, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), “Nhân dòng bước đầu biểu gen mã hóa protease HIV type phân lập Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), tr 227-233 Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Thị Trang Huyền, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2011), “Một số đột biến gen mã hóa protease HIV type phân lập Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Công nghệ (ĐHQGHN) (đang in) Tài liệu tiếng Anh Alastair, J J., Wood, M D (1998), “HIV protease inhibitors”, Engl J Med, 338, pp 1281-1292 Chen, H., Xu, Z., Yin, X., Cen, P (2007), “Cloning and expression of the HIV protein in Escherichia coli cell-free system”, Appl Micrbiol Biotechnol, 77, pp 347–354 Cheng, Y S E, McGowan, M H, Kettner C A, Schloss, J V., Erickson, S., Yin F H (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active enzyme from inclusion bodies”, Gene, 87, pp 243-248 Daar, E S., Little, S., Pitt, J., Santagelo, J., Ho, P., Harawa, N., Kemdt, P., Giogi, J V., Bai, J., Gaut, P., Richman, D A., Mandel, S., Nicholas, S (2001), “Diagnosis of primary HIV-1 infection”, Ann Int Med, 134, pp 25-29 Darke, P L., Leu, C T., Davis, L J., Heimbach, J C., Diehl, R.E., Hill, W S., Dixon, R A , Sigal, I S (1989), “Human immunodeficiency virus protease: bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J Biol Chem, 264, pp 2307-2312 Debouck, C., Gorniak, J G., Strickler, J E., Meek, T D., Metcalf B W., Rosenberg, M (1987), “Human immunodeficiency virus protease expressed in Lớp Cao học K18 2011 46 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn Escherichia coli exhibit autoprocessing and specific maturation of the gag precursor”, Proc Natl Acad Sci USA, 84, pp 8903-8906 10 Dergousova, N L., Amerik, A Y., Volynskaya, A M., Rumsh, A D (1996), “HIV-1 protease cloning, expression, and purification”, Appl Biochem Biotechnol, 61, pp 97-108 11 Francessca, C., Gago, F., Bertoli, A., Forbici, F (2004), “Identification of the minimal conserved structure of HIV-1 protease in the presence and absence of drug pressure”, AIDS, 12, pp 9-11 12 Geoghegan, K F., Spender, R W., Danley, D E., Contillo, L G., Andrews, G C., (1990), “Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human immunodeficiencyl virus HIV-1”, FEBS Lett, 262(1), pp 119-122 13 Graves, M C., Lim J J., Heimer, E P (1988) “An 11-kDa form of human immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli is sufficient for enzymatic activity”, Proc Natl Acad Sci USA, 85, pp 2449-2453 14 Hare, B C (2006), “Clinical overview of HIV”, HIV Insite Knowledge Base Chapter Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu 15 Hoffman, C., Rockstroh, J., Kamps, B S., HIV Medicine (2006) from www HIVMedicine.com 16 Ishizaki, A., Cuong, N H., Thuc, P V., Trung, N V., Saijoh, K., Kageyama, S., Ishigaki, K., Tanuma, J., Oka, S., Ichimura, H (2009), “Profile of HIV type infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in treatment-naive HIV type 1-infected individuals in Hai Phong, Viet Nam”, AIDS Res Hum Retrovir., 25, pp 175-182 17 Janeway, C (2001), Immunobiology, Garland Science, USA 18 Komai, T., Ishikawa, Y., Yagi, R., Suzuki-Sunagawa, H., Nishigaki ,T., Handa, H (1997), “Development of HIV-1 protease expression methods using the T7 phage promoter system”, Appl Microbiol Biotechnol., 47, pp 241-245 19 Krauslicht, H G., Ingrahams, R H., Skoog, M T.,Wimmert, E., Pallait, P V., Cartert, C A (1989), “Activity of purified biosynthetic proteinase of human Lớp Cao học K18 2011 47 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn immunodeficiency virus on natural substrates and synthetic peptides”, Proc Natl Acad Sci USA, 86, pp 807-811 20 Laemmli, U K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature.227, pp: 680-685 21 Lan, N T., Recordon-Pinson, P., Hung, P V., Uyen, N T., Lien, T T (2003), “HIV type isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam): ANRS 1257 study, Large predominance of CRF01_AE and presence of major resistance mutations to antiretroviral drugs”, AIDS Res Hum Retrovir., 19, pp 925–928 22 Lech, W J., Wang, G., Yang, Y L., Chee, Y., Dorman, K., McCrae, D., Lazzeroni, L C., Erickson, J.W., Sinsheimer, J S., Kaplan, A H (1996), “In vivo sequence diversity of the protease of human immunodeficiency virus type 1: presence of protease inhibitor-resistant variants in untreated subjects”, J Virol., 70, pp 2038–2043 23 Leuthardt, A., Roesel, J L (1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant poly-histidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 326 (1, 2,3), pp 275-280 24 Louis, J M., Mcdonald, R A., Nashed, N T., Wondraku, E M., Jerina, D M., Oroszilan S., Mora, P T (1991), “Autoprocessing of the HIV-1 protease using purified wild-type and mutated fusion proteins expressed at hing level in Escherichia coli”, Eur J Biochem., 199, pp 361-369 25 Louis, J M., Nashed, N T., Parris, K D., Kimmel, A R., Jerina D M (1994), “Kinetics and mechanism of autoprocessing of human immunodeficiency virus type protease from an analog of the Gag-pol protein”, Proc Natl Acad Sci USA, 91, pp 7970- 7974 26 Nashed, N T., Louis, J M., Sayer, J M., Wondrak, E M., Mora, P T., Oroszlan, S., Jerina, D M (1989), “Continuos spectrophotometric assay for retroviral protease of HIV-1 and AMV”, Biochem Biophys Research Commun., 163(2), pp 1079-1085 27 Navia, M A., Fitzgerald, P M., McKeever, B M., Leu, C.T., Heimback, J C., Herber W K., Sig, I S., Darke P.L., Springer J P (1989), “Three-dimensional Lớp Cao học K18 2011 48 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn structure of aspartyl protease from human immunodefiency virus HIV-1”, Nature Rev., 337 (6208), pp 615-620 28 Nijhuis, M., Maarseveen, N M., Lastere, S., Schipper, P., Coakley, E., Glass, B (2007), “A novel substrate-based HIV-1 protease inhibitor drug resistance mechanism”, Plos Med., pp 152-163 29 Nutt, R F., Brady, S F., Darke, P L., Ciccarone, T M., Nutt, E M., Rodkey, J A., Bennett, C.D., Waxman, L H., Sigal, I S., Anderson, P S., Veber D F (1988), “Chemical synthesis and enzymatic activity of a 99-residue peptide with a sequence proposed for the human immunodeficiency virus protease”, Proc Natl Acad Sci USA, 85, pp 7129-7133 30 Rao, M., Tanksale, A., Ghatge, M S., Deshpande, V V (1998), “Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases”, Microbiol Mol Biol Rev., 62, pp 600-601 31 Richards, A D., Phylip, L.H., Farmerie, W G., Scarborough, P E., Alvares, A., Dunn, B M., Hirel, H., Konvalinka, J., Strop, P., Pavlickova, L., Kostla, J., Kay V (1990), “Sensitive, soluble chromogenic substrates for HIV-1 Proteinase”, J Biol Chem USA, 265 (14), pp 7733-7736 32 Rangwala, S H., Finn, R F., Smith, C.E., Berberich, S A., Salsgiver, W J., Stallings, W C., Glover, G I., Olins, P O (1992), “High-level production of active HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gene, 122, pp 263-269 33 Sambrook, J., Russell, D W (2000), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp 15-22 34 Shedlock, D J., Daniel H., Andy, Y C., Christopher, W C., Karuppiah, M., David, B W (2008), Apoptosis, Spingerlink, USA 35 Taylor, A., Brown, P D., Kadam, S., Maus, M., Kohlbrenner, E W., Weigl, D., Turon, C M., and Katz, L (1992), “High-level expression and purification of mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter”, Appl Microbiol Biotechnol., 37, pp 205-210 36 UNAIDS in Vietnam, from www.unaids.org.vn 37 United nations program on HIV/AIDS, UNAIDS/WHO AIDS, Epidemic Lớp Cao học K18 2011 49 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn update: December 2010 38 Wan, M., Takagi, M., Loh, N B., Xu, X Z., Imanaka T (1996), “Autoprocessing: an essential step for the activation of HIV-1 protease”, Biochem J., 316, pp 569-573 39 Yunfeng, T (2006), “Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1 protease and drug-resistant mutants”, pp 25-34 Chemistry Dissertations Paper (from http://digitalarchive.gsu.edu/chemistry_diss/2) 40 http://www.aids-india.org/hivbasics2.htm 41 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU518273 42 http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra?action=sequenceInput Lớp Cao học K18 2011 50 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Kết phân tích thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (hình 18) cho thấy kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 không nhận biết băng protein 19 kDa dịch hòa tan kết tủa tế bào băng protein tái tổ hợp tinh Chúng thử khả phân cắt chất đặc hiệu chế phẩm protein tái tổ hợp thu được, nhiên kết qủa cho thấy protein thu hoạt tính Kết khẳng định protein mà thu protease HIV-1 chứa phần nhỏ protein nên tính kháng nguyên hoạt tính xúc tác protease HIV-1 .42 Tóm lại, phát đột biến kháng nhẹ thuốc PI gen mã hóa protease HIV-1 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam điều trị thuốc kháng virus bước đầu đưa gen vào hệ thống vector biểu pET32a dạng dung hợp với gen mã hóa cho thioredoxin với trình tự nhận biết phân cắt protease HIV-1 Tuy chưa thành công việc biểu gen mã hóa protease HIV-1 để tạo protein có hoạt tính 42 KẾT LUẬN 45 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Lớp Cao học K18 2011 51 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ suốt trình làm đề tài Hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hồng Loan tận tình bảo, giúp đỡ động viên suốt trình làm thực nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, đặc biệt Phòng Protein tái tổ hợp, người giúp đỡ nhiều để hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp, người tạo điều kiện tốt cho để hoàn thành luận văn Luận văn thực với kinh phí đề tài mã số KLEPT.09.01 Hà Nội, ngày 17 tháng 12 năm 2011 Học viên Nguyễn Văn Dũng Lớp Cao học K18 2011 52 Khóa 2009- Luận văn Thạc sĩ Khoa học Dũng Nguyễn Văn BẢNG CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium Persulphate bp Cặp bazo (base pair) BSA Albumin huyết bò (Bovine Serum Albumin) CBB Coomassie Blue Brillant dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate dd H2O Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H2O) E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa Kilodalton LB Luria Bertani MCS Multiple Cloning Sequence OD Mật độ quang học (Optical Density) PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polmerase Chain Reaction) PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride PVDF Polyvinylidene fluoride SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris base-Acetic-EDTA TEMED N, N, N’, N’-Tetramethyl-Ethylenediamine Lớp Cao học K18 2011 53 Khóa 2009-