Slide SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh học phân tử là gì? Một bộ phận của sinh học, khoa học về sự sống,  Đối tượng nghiên cứu là sự sống ở cấp độ phân tử,  Tập trung vào các khía cạnh về cấu trúc,  Sự sao chép và

Sinh học phân tử Nhập môn

-vuthao910@gmail.com

biology · Genetics · Genomics ·

Human biology · Immunology ·

Marine biology · Mathematical

Bào quan

Sinh học phân tử là gì?

 Một bộ phận của sinh học, khoa học về sự sống,

 Đối tượng nghiên cứu là sự sống ở cấp độ phân tử,

 Tập trung vào các khía cạnh về cấu trúc,

 Sự sao chép và biểu hiện của gen;

 Sự tương tác và chức năng sinh lý của các sản phẩm của gen

 Di truyền học / Hĩa sinh

 chức năng sinh học của gen

 sản phẩm của gen

Chức năng

Gen Protein

Di truyền học

Hóa sinh học

Sinh học phân tử

Lược sử phát triển

 Giai đoạn tiền đề

 Miescher khám phá acid nucleic vào năm 1869.

 Mendel khám phá qui luật di truyền năm 1865

 Đầu TK 20, Sutton và Boveri thiết lập mối quan hệ giữa di truyền học và sinh học khi quan sát sự phân ly của NST ở

tế bào

 Griffith có hiện tượng biến nạp

 1944, công bố bằng chứng thực nghiệm đầu tiên rằng

chính ADN là vật liệu di truyền

 1951, Erwin Chargaff, đã chứng minh trong ADN tỷ lệ A=T

và C=G

 1952, Hershey và Chase sử dụng KT đánh dấu phóng xạ chứng minh vai trò di truyền của ADN

Lược sử phát triển

 Giai đoạn sinh học phân tử ra đời

 1953: mô hình cấu trúc ADN của Watson-Crick

 1961: bộ 64 codon (bộ 3 mã hóa), Nirenberg và Matthei

 1961: Jacob và Monod, cơ chế điều hòa tổng hợp protein.

 1962: Arber phát hiện ra enzym cắt giới hạn trong VK

 1967: enzym ADN ligase được chiết xuất

 1970: Smith chiết enzym cắt giới hạn

Lược sử phát triển

 Sinh học phân tử hiện đại

 Kỹ thuật di truyền tạo nên cách mạng mới cho SHPT

 1973: Chang và Boyer tạo plasmid tái tổ hợp đầu tiên.

 1983: Saiki và Mullis: PCR để khuếch đại các đoạn gen globin in vitro

Học thuyết trung tâm (1958)

 Thông tin khi đã chuyển sang protein thì không thể lấy

ra lại được

Phương pháp nghiên cứu

 Tạo dòng biểu hiện

 Cô lập gen để nghiên cứu sự biểu hiện, điều hòa,…

 PCR

 Khuếch đại gen thu nhiều bản sao, đưa đột biến vào ADN

 Điện di gel

 Phân tách các gen, protein

 Lai vết Southern và Northern

 Phát hiện gen, nghiên cứu sự biểu hiện

 Lai vết Western / hóa miễn dịch

 Phát hiện protein, nghiên cứu chức năng protein

Đóng góp của SHPT

 Genomics: giải mã bộ gen và ngành hệ gen học

 Hệ thống máy mao mạch có thể xác định tự động đồng thời 96 phản ứng với độ dài trên 1000 bp/phản ứng

 Giải bộ gen người, ruồi giấm, giun trơn, chuột và các vi sinh vật khác như E coli, Saccharomyces cerevisae, C briggsae, Drosophila pseudobsura , lúa nước

 Genomics (bộ gen học) là khoa học nghiên cứu một cách

hệ thống các trình tự ADN đầy đủ (genome) của sinh vật Genomics thiết lập thông tin về sự sống bằng các tiếp cận một cách hệ thống và có thể tiến hành ở qui mô công

nghiệp

Đóng góp của SHPT

 Proteomics:

 Phân tích biến động protein và ngành hệ protein học

 Proteomics: khoa học nghiên cứu ở qui mô lớn về protein nhằm thiết lập các nhận dạng, số lượng, cấu trúc và chức năng sinh hóa TB của tất cả protein trong cơ thể, cơ quan hoặc tiểu cơ quan cũng như sự thay đổi các đặc tính này theo không gian, thời gian và trạng thái sinh lý

Đóng góp của SHPT

 Genomics, proteomics và sự phát triển thuốc

 Cho các thuốc công hiệu hơn Các thuốc mới dựa trên các phân tử protein, enzym, và RNA liên quan đến các gen và bệnh được chế tạo

 Cho các thuốc tốt hơn, an toàn hơn ngay từ đầu

 Xác định liều thuốc thích hợp bằng phương pháp chính xác hơn

 Tiến xa trong sàng lọc bệnh

 Cải tiến trong phát minh, phát triển thuốc

 Giảm chi phí trong chăm sóc sức khỏe

 Sản xuất và sử dụng chip ADN

 Chuyển gen cây trồng

 Tin sinh học và công nghệ nano sinh học

Sao chép ADN

Khái niệm

 Tế bào vi khuẩn: 2.000 protein, các tế bào nhân thật

chứa 50.000 protein, mã hóa trong acid nucleic

 ADN hay ARN (ở virus) là nơi cất giữ thông tin di truyền

 ADN: khác nhau về thành phần, trật tự sắp xếp các

nucleotid

 Đột biến di truyền = sự thay đổi trình tự ADN

 Tế bào phân chia, ADN phải được sao chép để đảm bảo thông tin di truyền được chuyển cho tế bào con

Sao chép bán bảo tồn

 Cơ chế sao chép:

 Cơ chế bảo tồn: ADN con gồm hai chuỗi hồn tồn mới

 Cơ chế bán bảo tồn: ADN con gồm một chuỗi mẹ kết hợp với một chuỗi mới được tổng hợp

 Thí nghiệm Meselson-Stahl 1958: sao chép bán bảo tồn

ADN nặng N15

ADN ADN

N14

Thế hệ O

Thế hệ 2 Thế hệ 1

Thế hệ 3

Các yếu tố tham gia

 Khuôn mẫu

 4 loại deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP): A, T, G, C

 DNA Polymerase

 Mg++

 Topoisomerase I: tháo xoắn ADN và II: siêu xoắn (ATP)

và tháo xoắn (không có ATP)

 Helicase: cần ATP như cofactor, sử dụng E tự do khi ATP thủy phân ATP đi dọc sợi ADN

 SSB (single strain DNA binding protein)

 Primase: kết hợp với polypeptide để tạo primosome có chức năng

 ADN ligase

O Base

OH

CH2O

P O

OO P O P O O

O Base

OH

CH2O

ADN Polymerase

 Xúc tác thành lập LK phosphodiester (polymerase)

 Hoạt tính khác: 3’5’ exonuclease (sửa sai), 5’ 3’ exonuclease

 Polymerase dùng trong sao chép là ADN polymerase phụ thuộc ADN

 E coli: I, II và III, gần đây phát hiện thêm IV và V

 ADN polymerase I: sửa sai, vai trò phụ trong sao chép

 ADN polymerase III: sao chép ADN nhiễm sắc thể

 ADN polymerase II: tái khởi động chạc ba sao chép khi tổn thương

 ADN polymerase IV và V: loại bỏ một số tổn thương trong ADN

 Cấu tạo ADN polymerase III

 2 lõi xúc tác: Tiểu đơn vị  (HT polymerase),  (sửa lỗi exonuclease 3’-5’),

 (kích hoạt hoạt tính exonuclease)

 2 tiểu đơn vị nhị trùng : liên kết 2 lõi xúc tác

 2 phức kẹp: giữa lõi xúc tác trên sợi khuôn, mỗi kẹp gồm hai tiểu đơn vị 

 Phức  gồm 5 protein, phức tải kẹp giúp kẹp lên sợi ADN.

ADN Polymerase

 Nhân thật: α, β, γ, δ và ε

 ADN polymarese α: khởi đầu sao chép, tổng hợp mồi ARN trong sao chép các đoạn Okazaki

 ADN polymarese δ, ε : sao chép DNA nhân

 ADN polymarese β: sửa sai

 ADN polymares γ: sao chép ADN ty thể

Các bước sao chép

1 Tạo “chẻ ba sao chép” sao chép tại Ori 254 cặp base (giàu A,T):

a Protein B nhận biết điểm khởi sự sao chép Ori C

b Helicase cắt đứt liên kết hydro (+ATP)

c Các SSB gắn vào để giữ sợi đơn không nhập lại

b Các trình tự ARN được tạo ra bởi primosome là những

đoạn ngắn khoảng 5 - 10 base đặc hiệu

c Các protein nhận diện được gọi là N-protein, chọn các

điểm (origin) trên ADN, tại đó primase có thể hoạt động

Mồi

Các bước sao chép

3 Polymerase gắn vào và kéo dài mồi theo hướng 5'-3‘ bằng cách

gắn các nucleotid mới theo nguyên tắc bổ sung:

a sợi dẫn được tổng hợp liên tục

b sợi chậm được tổng hợp gián đoạn (đoạn Okazaki 1000-2000 nu),

mồi được loại bỏ nhờ Pol I, khoảng trống được lấp và ligase nối

các đoạn Okazaki lại

Polymerase

Polymerase Sợi chậm

Sợi dẫn

4 Kết thúc khi sự kéo dài được giáp vòng hay đến đầu mút của DNA

ADN vòng cần topoisomerase II để tách 2 DNA bị lồng vào nhau

Chức năng protein sao chép

Protein B Nhận biết điểm Ori

N-protein Cho phép primase hoạt động

Primase Tổng hợp mồi ARN

Rep protein Tháo xoắn sợi sớm

Helicase Tháo xoắn sợi chậm

SSB-protein Ổn định sợi ADN đơn

ADN polymerase III Tổng hợp ADN

ADN topoisomerase I Cắt khía một sợi đơn ADN

ADN topoisomerase II Cắt khía cả hai sợi đơn ADN

ADN ligase Nối các đầu của polynucleotid đã hình

thành

Cấu trúc thetha

 Hình thành 2 chạc 3 sao chép từ 1 vị trí ori

 Tổng hợp ADN tiến hành theo 2 chiều cùng 1 lúc

 10 base sao chép ADN tháo xoắn một vòng

Cấu trúc thetha

 Dạng siêu xoắn

 Siêu xoắn âm: xoắn ngược chiều và làm giảm số vịng

 Siêu xoắn dương: xoắn kép cùng chiều, số vịng tăng

ADN đã tháo xoắn

Siêu xoắn dương Siêu xoắn âm

Cấu trúc thetha

 Sau sao chép: đòi hỏi các điểm cắt ở một sợi hay ở cả hai sợi ADN để tách chuỗi

 Enzyme topoisomerase

 Topoisomerase II- gyrase tạo ra các dạng siêu xoắn âm

 Topoisomerase I gắn với ADN, cắt một sợi, cho phép ADN xoắn kép quay quanh một điểm làm mất đi sự xoắn

 Hai sợi ADN lồng vào nhau được gọi là vòng lồng ghép (catena), topoisomerase II thường làm mất đi vòng

catena, cắt một sợi ADN kép và để phân tử ADN sợi kép còn lại đi xuyên qua điểm cắt, sau đó sợi kép ban đầu được nối lại

Cấu trúc thetha

Sao chép ở tế bào nhân thật

Replicon : đơn vị sao chép

DNA eukaryote gồm nhiều replicon, DNA prokaryote là 1 replicon

Sao chép ở tế bào nhân thật

 Cơ chế tương tự nhân nguyên thủy.

 Tốc độ di chuyển của ADN polymerase chậm: do ADN đóng cuộn trong nhiễm sắc thể và dài hơn.

 Tốc độ sao chép nhanh: chứa lượng lớn enzym và điểm replicon (ori).

 Ví dụ: ruồi giấm: tốc độ sao chép là 3 phút nhanh gấp 6 lần E coli, ADN gấp 100 lần E coli

 Đoạn Okazaki: 40 – 300 base.

 Xảy ra trong pha S của chu kỳ tế bào

Sao chép ở ADN ty thể và lạp thể

 ADN polymerase γ: tham gia sao chép

 Sao chép bắt đầu từ một sợi ADN gốc

 Sự sao chép tiến hành ½ vòng thì sự sao chép của sợi kia bắt đầu, tạo nên cấu trúc D.

 Hình thành sự lồng ghép của 2 vòng ADN

 Topoisomerase II: tách đôi 2 vòng kép ADN

Sao chép ở phage và virus

 ADN dạng vòng đôi: sao chép bình thường

 ADN dạng thẳng hay ADN sợi đơn hay ARN thì cần có cơ chế sao chép đặc biệt

Sự sao chép các DNA thẳng ở virus và phage

Hủy mồi

Khuôn mẫu ban đầu

Sản phẩm

Sao chép ở phage T7

 Phage T7 có bộ gen là dsADN thẳng, dài 39.937 bp

 Sự sao chép bắt đầu tại một điểm cách đầu tận 5’ khoảng

5900 bp và diễn ra theo cả hai hướng

 Bộ gen có 160 bp đầu bên trái giống 160 bp cuối bên phải

 Phần ssADN ở phía phải (3') của một phân tử con có thể gắn

bổ sung với phần phía trái (cũng là 3') của phân tử khác

 Khoảng trống được lấp bởi ADN polymerase và được nối lại bởi ADN ligase

 Phân tử nhị trùng thu được có thể được cắt ra trở lại, nhưng khi đó sẽ tạo ra đầu dính 5’ thay vì 3’, đầu dính 5’ có thể dùng làm khuôn mẫu để hoàn chỉnh ADN sợi đôi

 T7 có gen mã hóa cho ADN ligase (gen 1.3), SSB (gen 2.5) và ADN polymerase (gen 5) của riêng nó.

Sự sao chép các DNA thẳng ở virus và phage

Sao chép theo kiểu lăn vòng

 Sao chép theo kiểu lăn vòng: sản phẩm tạo ra không phải là ADN vòng mà là ADN dạng thẳng.

 ADN vòng: cắt khía ở 1-2 LK phosphodiester 3' OH tự do, khuôn mẫu để sao chép bởi ADN polymerase

 Đầu 3' OH kéo dài, đầu 5' bị đẩy ra khỏi vòng dạng sợi đơn, vòng ADN lăn để tiếp tục kéo dài đầu 3’ theo kiểu sợi sớm

 Đầu 5’ bị đẩy ra dùng làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi đôi theo kiểu sợi muộn.

Phage M13

 ADN sợi đơn vòng, thích hợp làm khuôn mẫu tổng hợp ADN

 Không có gen mã hóa ADN polymerase riêng, lệ thuộc vào bộ máy của tế bào chủ để sao chép

 Một phần của bộ gen có dạng kẹp tóc sợi đôi: đóng vai trò promoter cho ARN polymerase phiên mã mồi ARN ngắn

 Phiên mã làm mất cấu trúc kẹp tóc ADN Polymerase III tổng hợp ADN sợi đôi, gọi là thể sao chép I (RFI)

Phage M13

 RFI: sao chép theo kiểu lăn vòng:

 gp2 endonuclease cắt khía ADN của RFI tại vị trí đặc hiệu

 Sao chép lăn vòng diễn ra

 gp2 endonuclease cắt phân tử một lần nữa để hoàn tất bản sao.

 Sản phẩm: một phân tử ADN vòng đơn (sợi bị thế ra được nối lại thành vòng) và một phân tử ADN sợi đôi là RFI

Phage Lambda

 ADN sợi đôi thẳng

 Tận cùng gen là đoạn sợi đơn dài 12 nucleotid - vị trí

cos, hai đoạn đơn ở vị trí cos có thể gắn bổ sung với

nhau để biến bộ gen thẳng thành dạng vòng đôi.

 Sau khi phage nhiễm tế bào và tiêm ADN vào, nhiễm sắc thể của nó vòng hóa nhờ các vị trí cos Nhờ đó nó tránh

bị cắt bởi các exonuclease của vi khuẩn

Phage Lambda

 Giai đoạn sớm

 Khởi đầu sao chép theo mô hình theta

 Ðiểm gốc sao chép (ori) nằm ở gen O

 Phân tử này gắn trình tự lặp ở điểm gốc và khởi đầu việc tách hai sợi ADN tại chỗ

 Gen P (yếu tố nạp helicase) giúpDnaB (helicase) gắn vào ADN

đã tách mạch các thành phần khác của bộ máy sao chép của

VK gắn vào và bắt đầu việc sao chép (5 – 15’)

Phage Lamda

 Giai đoạn muộn

 Chuyển sang kiểu sao chép lăn vòng

 ADN sao chép thành một ADN kép thẳng chứa nhiều bản sao liên tiếp, cách nhau bằng các trình tự cos

 Phage có gen mã hóa cho một enzym

là Terminase,

 Nhận diện vị trí cos (ở dạng sợi kép)

 Cắt tại đó để biến phân tử ADN dài thành các bản sao đơn của bộ gen phage với các vị trí cos ở hai đầu

Quá trình sửa sai

 Sửa sai trong sao chép:

 ADN polymerase: sai sót 10-5

 E coli có 3.106.000 cặp base, mỗi lần sao chép: 30 sai sót

 Tần số khi sao chép in vivo là 10-9 E coli: mỗi lần sao

chép chỉ có 3 sai sót.

 Mức chính xác cao của sao chép trong cơ thể sinh vật có được nhờ các cơ chế sửa sai:

 Hướng sao chép là 5’ → 3’ để việc sửa sai chính xác.

 ADN polymerase: có hoạt tính exonuclease 5’→ 3’ và 3’ → 5’ Nếu trên đường di chuyển để polymer hóa gặp base sai, ADN-polymerase sẽ lùi lại cắt bỏ theo hướng 3’ → 5’ (hoạt tính exonuclease 3’ → 5’)

Quá trình sửa sai

 Sửa sai trong sao chép

 Nhân nguyên thủy: ADN

polymerase I và III nhờ hoạt tính exonuclease

 Nhân thật: polymerase α, β, 

và : sửa sai

 Ty thể: polymerase  không

có hoạt tính exonuclease

 Sửa sai khi không sao chép:

 ADN có thể bị biến đổi ngay

cả khi không sao chép.

 Enzym chuyên biệt làm nhiệm

vụ dò tìm và sửa sai

Tóm tắt

 Phản ứng sao chép

 Tiến trình sao chép

 Sao chép ADN nhân thật

 Sao chép ADN phage và virus

 Quá trình sửa sai

• Các loại ARN

• Cấu tạo chức năng ARN ribosom

• Cấu tạo chức năng ARN vận chuyển

• Cấu tạo chức năng ARN thông tin

ARN

Vì sao ADN mang thông tin di truyền, nhưng không

trực tiếp chỉ huy quá trình sinh tổng hợp protein

 ADN nhiễm sắc thể chỉ mang một bản sao duy nhất cho mỗi gen

 Các gen khác nhau sẽ biểu hiện khác nhau

 Việc biểu hiện gen cần đáp ứng các điều

kiện môi trường

 Cần cơ chế trung gian để khuếch đại và

kiểm soát

ARN

 Các base nitơ Adenin, Guanin, Cytosin và

Uracil (ở ADN là Thymin)

Vai trò của ARN

 Tham gia cấu tạo ribosom

 Vận chuyển acid amin đến ribosom trong

quá trình sinh tổng hợp protein

 Trung gian truyền thông tin di truyền đến

bộ máy sinh tổng hợp protein

 Chất xúc tác RNAse P

 ARN tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein

Các loại ARN trong tế bào

tARN)

 hnARN - ARN nhân không đồng nhất

(heterogeneous nuclear ARN).

 snARN - ARN nhân nhỏ (small nuclear ARN).

 scARN - ARN tế bào chất nhỏ

(small cytoplasmic ARN).

ARN ribosom: cấu trúc, vai trò

 Ribosom: 2 tiểu đơn vị, tách ra và gắn lại thuận nghịch tùy theo [Mg 2+ ]

 Tiểu đơn vị: rARN + protein

 Ribosom

 Vi khuẩn và lục lạp = 70S (Svegbergs)

 Nhân thật = 80S

 Ty thể = 50S

ARN ribosom - E coli

ARN ribosom

rARN làm biến đổi bản sao sơ cấp của rARN

Methionin (SAM)

base khởi đầu (5-methylcytosin)

Sự biến đổi của rARN ở tb nhân nguyên thủy (E.coli)

23S 16S

Sự biến đổi của rARN ở tb nhân nguyên thủy

ARN ribosom - Nhân thật

 Có nhiều bản sao của rRNA gen

 NST có 100-1000 vùng mã hóa của

18S-5.8S-28S theo thứ tự

 Gen mã hóa cho 5S nằm riêng

 Cấu tạo ribosom: 60S + 40S

Sự biến đổi của rARN ở tb nhân thật

Sự biến đổi của rARN ở tb Hela

Nhân

32 S 28 S

45S pre- rARN 20 S 18 S

5S Các r- protein

5S

5.8S 28S

Tiểu đơn vị 60S

18S Tiểu đơn vị 40S 5,8S

ARN vận chuyển

 Vị trí gắn acid amin Vòng DHU

 Vòng Anticodon Vòng TψC

 Vòng phụ

N

N Ribose

N2,N2,-Dimethylguanosine N6,N6,-Dimethyladenine

Cấu trúc của ARN vận chuyển

A C C A C C U G C U

A G C Ψ T

A G G C

G

C C U

C G

C

D A

G

G A G G C

U C C

G C

G G

C G G

G

U U

G C G

C

C C

G C

Vòng D m2 G

m 1 G Nhánh D

5’

Ψ

C G I U U