sinh hoc phan tu

• I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR • II. Nguyên lí hoạt động của PCR • III. Một số ứng dụng của PCR trong y học • Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích • 1. Xác định quan hệ huyết thống • 2. Xác định bệnh lao nhờ vsv • 3. Xác định bệnh HIV, HBV, HCV, KST, Dengue virus • 4. Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định thành phần , cơ cấu ký sinh trùng sốt rét I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR • Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. • Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì: - Giai đoạn biến tính (denaturation) - Giai đoạn bắt cặp (annealing) - Giai đoạn kéo dài (elongaction) Chu kì này được lặp đi lặp lại từ 20 - 40 lần và cho ra các sản phẩm cuối cùng của PCR là các đoạn DNA hoặc RNA phiên bản. Số lượng các bản sao này được tính theo hàm số mũ. Máy PCR II.Nguyên lí hoạt động của PCR 1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix): • - DNA khuôn • - Taq. DNA polymerase. • - d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). • - Primer ( oligonucleotide). • - PCR buffer. 2. Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles) - Giai đoạn biến tính (denaturation): 92 – 98 độ C - Giai đoạn bắt cặp (annealing) 45 thoi gian 20s-2phut - Giai đoạn kéo dài (elongaction) nhiệt độ 68-72 Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích Các bệnh phẩm y học ↓ Ly trích pre - nucleic acide ↓ Ly trích acide nucleic tinh khiết ↓ PCR ( RT - PCR) ↓ Phân tích phát hiện sản phẩm PCR bằng quang phổ hay điện di Thực hiện xét nghiệm chẩn đoán bằng PCR Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR • 1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, da, phân, v.v . Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng nghìn kilômet, mất nhiều ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu điện, không cần bảo quản lạnh. Lấy mẫu đem phân tích • 2. Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện nước ta. Do vậy, góp phần giảm giá thành, tiết kiệm kinh phí. Với mỗi loại mẫu có một quy trình tách chiết thích hợp riêng. Đảm bảo chất lượng và số lượng ADN từ những lượng mẫu nhỏ. Tách chiết ADN • 3. Nhân ADN đặc hiệu: Đây là khâu quan trọng nhất của quy trình. Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử nghiệm cho từng cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên thị trường trong nước Nhân ADN đặc hiệu • 4. Điện di: Điện di được dùng để tách biệt các đoạn ADN có độ dài ngắn khác nhau. Độ tách biệt này phụ thuộc nhiều yếu tố. Các yếu tố đã được lựa chọn và tối ưu hoá trên cơ sở vật liệu sẵn có, hạ giá thành đáng kể và tăng độ phân giải lên hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn nucleotid. Điện di [...]... sinh thiết mô gan • 2 Xử lí bệnh phẩm: Bệnh phẩm phải đựng trong biopure hay PCR tube • Sau khi lấy để ngay ở nhiệt độ 40C hay - 200C • Bệnh phẩm phải lấy đúng vị trí, đúng phương pháp và đúng thời gian Đờm và dịch nhầy Dịch cơ thể khác Mẫu sinh thiết Làm đồng nhất, khử tạp Xử lí với proteinase K và thuốc tẩy rửa Ly trích DNA, RNA tinh khiết 4 Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định thành phần , cơ cấu ký sinh. .. giữa miếng vải Sau đó, phơi hoặc hong khô  Sau khi khô, mỗi mẫu được cho vào một túi nylông sạch, mới 2 Xách định bệnh lao nhờ vsv Phát hiện M tuberculosis: • Lao phổi: tốt nhất là đờm (được lấy vào buổi sáng sớm sau khi súc miệng thật sạch với nước muối sinh lý hay nước lọc, tránh lấy quá nhiều bọt) • Lao ngoài phổi: lao màng não (dịch não tủy), lao màng phổi (dịch màng phổi), lao màng bụng (dịch... giemsa phát hiện KST SRcòn có nhiều kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như : nhuộm Acridine Orange (AO), Paracheck, Para-sight F …và đặc biệt là kỹ Cách lấy mẫu phân tích Tu theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu nhiên về giới tính, tu i, nghề nghiệp, ….mẫu được lấy khác nhau Thường thì mẫu được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên giấy thấm Whatman 3MM (thể tích máu 30-50µl) để khô ở môi trường thực địa và cho . phần , cơ cấu ký sinh trùng sốt rét I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR • Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry. vsv . Phát hiện M. tuberculosis: • Lao phổi: tốt nhất là đờm (được lấy vào buổi sáng sớm sau khi súc miệng thật sạch với nước muối sinh lý hay nước lọc,