NGHIÊN CỨU TẠO CỤM CHỒI IN-VITRO TỪ HẠT LÚA LAI VÀ SỰ DI TRUYỀN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ CỦA MỘT SỐ DÒNG LÚA LAI Ở THẾ HỆ F1

HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Mỹ Trúc NGHIÊN CỨU TẠO CỤM CHỒI IN-VITRO TỪ HẠT LÚA LAI VÀ SỰ DI TRUYỀN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ CỦA MỘT SỐ DÒNG LÚA LAI Ở THẾ HỆ F1 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Mỹ Trúc

NGHIÊN CỨU TẠO CỤM CHỒI IN-VITRO TỪ HẠT LÚA LAI

VÀ SỰ DI TRUYỀN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ CỦA

MỘT SỐ DÒNG LÚA LAI Ở THẾ HỆ F1

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Mỹ Trúc

NGHIÊN CỨU TẠO CỤM CHỒI IN-VITRO TỪ HẠT LÚA LAI

VÀ SỰ DI TRUYỀN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ CỦA

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Mong Tất cả các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả

Nguyễn Thị Mỹ Trúc

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành là do những nỗ lực cá nhân của tôi cũng như

sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các Thầy Cô, gia đình và bạn bè

Xin được gởi lời tri ân sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Mong, người Cô thân

thương đã gắn bó với tôi từ những năm tháng đại học cho đến nay, vì những kiến

thức quý báu Cô đã cung cấp, cũng như sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của Cô

trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong khoa Sinh học, đặc biệt là các cán

bộ của phòng Sinh lý Thực vật, trường Đại học Sư phạm TP HCM, đã giúp đỡ và

tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực nghiệm đề tài

Cảm ơn các Cán bộ của phòng Sau đại học, trường Đại học Sư phạm TP

HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

vừa qua

Cảm ơn gia đình bác Thế (Trảng Bom- Đồng Nai) đã giúp đỡ tôi địa điểm

thực hiện đề tài

Cảm ơn các anh chị và các bạn học viên cao học K19- chuyên ngành Sinh

học thực nghiệm, đã đồng hành, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong khoảng thời

gian học tập và thực hiện đề tài

Xin cảm ơn gia đình yêu thương đã luôn ủng hộ, tin tưởng và chia sẻ mọi

khó khăn với tôi trong suốt hành trình vất vả vừa qua

Bằng lòng biết ơn sâu sắc và những tình cảm yêu thương nhất, kính chúc quý

vị sức khỏe và thành công

Tác giả

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

M Ở ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nguồn gốc thực vật và tầm quan trọng của cây lúa trồng trong chi Oryza 3

1.1.1 Nguồn gốc thực vật của cây lúa trồng 3

1.1.2 Nguồn gen cây lúa trồng 3

1.1.3 Tầm quan trọng của cây lúa trong chi Oryza 4

1.1.4 Lúa lai và an ninh lương thực thế giới 5

1.2 Đặc điểm di truyền một số tính trạng hình thái, sinh lý của cây lúa 6

1.2.1 Đặc điểm di truyền chiều cao cây lúa 6

1.2.2 Đặc điểm di truyền kích thước lá đòng và lá công năng 8

1.2.3 Đặc điểm di truyền chiều dài bông lúa 9

1.2.4 Đặc điểm di truyền kích thước hạt lúa 9

1.2.5 Đặc điểm di truyền màu sắc hạt thóc 11

1.2.6 Đặc điểm di truyền thời gian sinh trưởng 12

1.2.7 Đặc điểm di truyền khả năng đẻ nhánh 15

1.3 Những vấn đề cơ bản trong nhân giống in-vitro thực vật 15

1.3.1 Khái niệm 15

1.3.2 Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy in-vitro 16

1.3.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô thực vật 16

1.3.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 17

1.3.5 Một số vấn đề trong nuôi cấy tạo cụm chồi in-vitro 18

1.3.6 Ý nghĩa của nhân giống in-vitro 21

1.3.7 Ứng dụng và thành tựu nhân giống in-vitro thực vật tại Việt Nam 23

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Bố trí thí nghiệm lai tạo hạt F1 28

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy cụm chồi in-vitro 31

2.2.3 Phương pháp theo dõi các đặc tính nông học 33

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả nuôi cấy tạo cụm chồi in-vitro các hạt lúa lai F1 36

3.1.1 Kết quả khử trùng hạt lúa lai F1 36

3.1.2 Kết quả nuôi cấy tạo cụm chồi in-vitro 38

3.1.3 Kết quả tạo rễ cho các chồi in-vitro 45

3.1.4 Tỉ lệ sống sót của cây in-vitro khi đem trồng trong chậu đất 47

3.2 Đặc điểm di truyền một số tính trạng hình thái, sinh lý của các con lai F1 so với cha mẹ 51

3.2.1 Đặc điểm di truyền chiều cao cây lúa 51

3.2.2 Đặc điểm di truyền kích thước lá đòng 54

3.2.3 Đặc điểm di truyền kích thước lá công năng 57

3.2.4 Đặc điểm di truyền chiều dài bông lúa 60

3.2.5 Đặc điểm di truyền kích thước hạt gạo 63

3.2.6 Đặc điểm di truyền màu sắc hạt thóc 69

3.2.7 Đặc điểm di truyền thời gian sinh trưởng 71

3.2.8 Đặc điểm di truyền khả năng đẻ nhánh 72

K ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIA : Acid Indol Acetic

BA (6-BA) : Benzyl Adenin

BT7 : giống lúa Bắc Thơm 7

F : thế hệ con cái

HT1 : giống lúa Hương Thơm dòng số 1

HT2 : giống lúa Hương Thơm dòng số 2

IRRI : International Rice Research Institute – Viện nghiên cứu lúa quốc tế

JAS : giống lúa Jasmine 85

KT1 : môi trường khử trùng 1

KT2 : môi trường khử trùng 2

MĐT : mức độ trội

MS : Murashige và Skoog

NC1 : môi trường nhân chồi 1

NC2 : môi trường nhân chồi 2

NHĐB : dòng lúa Nàng Hương đột biến

NST : nhiễm sắc thể

NT1 : dòng lúa lai giữa Nàng Thơm chợ Đào và Nàng Thơm đột biến

NTD2 : dòng lúa lai giữa Nàng Thơm đột biến và Nàng Thơm chợ Đào

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khử trùng hạt lai F1 của các tổ hợp lai 36

Bảng 3.2 Kết quả nuôi cấy in-vitro tạo cụm chồi hạt lai F1 39

Bảng 3.3 Tỉ lệ sống sót của các cây lúa in-vitro khi trồng trong chậu đất 48

Bảng 3.4 Chiều cao cây của F1 so với dạng P (cha – mẹ) 51

Bảng 3.5 Chiều dài lá đòng của F1 so với P 54

Bảng 3.6 Chiều rộng lá đòng của F1 so với P 56

Bảng 3.7 Chiều dài lá công năng của F1 so với P 57

Bảng 3.8 Chiều rộng lá công năng của F1 so với P 59

Bảng 3.9 Chiều dài bông lúa của F1 so với P 60

Bảng 3.10 Chiều dài hạt gạo của F1 so với P 63

Bảng 3.11 Chiều rộng hạt gạo của F1 so với P 64

Bảng 3.12 Hình dạng hạt gạo của F1 65

Bảng 3.13 Độ bạc bụng của các hạt lai F1 67

Bảng 3.14 Màu sắc hạt thóc của thế hệ F1 so với P 69

Bảng 3.15 Thời gian sinh trưởng của F1 so với P 71

Bảng 3.16 Khả năng đẻ nhánh của F1 so với P 73

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lúa là loại cây lương thực chính và cung cấp lương thực cho hơn một nửa dân số thế giới

Dân số hiện nay của thế giới đã là hơn 6 tỷ người Con số này sẽ đạt tới 8 tỷ vào năm 2030 Trong khi dân số tăng thì diện tích đất canh tác bị thu hẹp dần do đất được chuyển sang các mục đích sử dụng khác Áp lực của tăng dân số cùng với áp lực từ thu hẹp diện tích đất trồng trọt lên sản xuất lương thực của thế giới ngày càng tăng

Chính phủ các nước châu Á- nơi được mệnh danh là “vựa lúa của thế giới” - đang phải gồng mình chống lại cơn “khủng hoảng” lương thực Việt Nam cũng không nằm ngoài “cuộc chiến” này

Người ta ước tính đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới phải tăng thêm 60% so với sản lượng năm 1995 Về mặt lý thuyết, lúa có khả năng cho sản lượng cao hơn nếu điều kiện canh tác như hệ thống tưới tiêu, chất lượng đất, biện pháp thâm canh và giống được cải thiện Phương pháp hiệu quả nhất để con người giải quyết vấn đề này là ứng dụng khoa học kỹ thuật tìm cách nâng cao năng suất các loại cây trồng, trong đó, cải tạo giống đóng vai trò rất quan trọng [40], [43]

Có nhiều phương pháp có thể cải tạo các giống lúa ban đầu, ở nước ta hiện nay sử dụng phổ biến các đột biến thực nghiệm kết hợp với lai tạo truyền thống, tạo

ra các dòng lúa lai mang nhiều ưu điểm Việc đánh giá đúng mức các đặc điểm này trên cơ sở khoa học có ý nghĩa lý luận và thực tiễn đáng kể cho công tác chọn tạo giống mới Tuy nhiên với phương pháp lai tạo mang tính chất thủ công, số lượng hạt lai tạo ra rất hạn chế, gây khó khăn không nhỏ cho công tác nghiên cứu các đặc điểm của thế hệ lai

Xuất phát từ thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“NGHIÊN CỨU TẠO CỤM CHỒI IN-VITRO TỪ HẠT LÚA LAI VÀ SỰ DI

TRUYỀN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ CỦA MỘT SỐ DÒNG LÚA

LAI Ở THẾ HỆ F1”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Nghiên cứu môi trường nhân nhanh các cá thể lai F1 bằng con đường nuôi cấy cụm chồi từ hạt lai F1, tạo nguồn vật liệu cho những hướng nghiên cứu khác

- Bước đầu đánh giá một số đặc điểm hình thái, sinh lý quan trọng của các hạt lai ở thế hệ F1 so với dạng bố mẹ ban đầu, cũng như sự biểu hiện của chúng trong các tổ hợp lai khác nhau làm cơ sở phân lập các thể tái tổ hợp có triển vọng trong công tác tạo giống mới

3 Nội dung nghiên cứu

- Tiến hành các phép lai giữa các giống, dòng lúa ban đầu để tạo các hạt lai thế hệ F1

- Sử dụng các hạt lai F1 làm nguyên liệu bước đầu thực hiện nuôi cấy cụm chồi lúa

để nhân nhanh thế hệ F1, tạo vật liệu cho những nội dung nghiên cứu tiếp theo

- Nghiên cứu sự di truyền các đặc điểm về hình thái, sinh lý quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và phẩm chất lúa gạo của các tổ hợp lai ở F1 nói trên so với dạng bố mẹ ban đầu làm cơ sở cho việc chọn lọc các tổ hợp lai ưu tú nhất

4 Giới hạn phạm vi nghiên cứu

- Đề tài chỉ nghiên cứu thế hệ F1 của các tổ hợp lai về một số tính trạng hình thái, sinh lý quan trọng: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, hình thái lá, hình thái hạt, hình thái bông lúa, đặc điểm hạt lúa

- Tiến hành nuôi cấy tạo cụm chồi từ hạt lai F1 của các tổ hợp lai đến giai đoạn cây F1 hoàn chỉnh có khả năng thích nghi với môi trường tự nhiên

5 Ý nghĩa của đề tài

- Góp phần chọn lọc một số tổ hợp lai có triển vọng trong chọn tạo giống lúa mới có năng suất cao, phẩm chất tốt đáp ứng nhu cầu tiêu dùng

- Về mặt lý thuyết, góp phần tìm hiểu và khai thác nguồn gen của các giống, dòng lúa là đối tượng của đề tài

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc thực vật và tầm quan trọng của cây lúa trồng trong chi Oryza 1.1.1 Ngu ồn gốc thực vật của cây lúa trồng

Cây lúa thuộc họ Hòa Thảo (Poacae-Graminae), chi Oryza Trong chi Oryza

có 23 loài, trong đó chỉ có 2 loài lúa trồng là Oryza sativa L và Oryza glaberrima

Oryza sativa L phổ biến ở Châu Á, chiếm đại bộ phận diện tích trồng lúa, có nhiều giống có đặc tính tốt cho năng suất cao, được chia thành 2 loài phụ là Indica và

Japonica Loài lúa trồng Oryza glaberrima, hạt nhỏ, năng suất thấp, chỉ trồng trên

diện tích nhỏ ở Tây Phi [7], [15]

Về phương diện thực vật học thì lúa trồng hiện nay là do lúa dại qua chọn lọc

tự nhiên và chọn lọc nhân tạo lâu đời hình thành

Tuy có nhiều ý kiến chưa thống nhất về thời gian và địa điểm xuất hiện của cây lúa, nhưng căn cứ vào các tài liệu lịch sử, di tích khảo cổ, đặc điểm sinh thái học của cây lúa trồng và sự hiện diện rộng rãi của các loài lúa hoang dại trong khu vực, nhiều người đồng ý rằng nguồn gốc cây lúa là ở vùng đầm lầy Đông Nam Á, rồi từ đó lan dần đi các nơi [8]

Chang (1976), nhà di truyền học cây lúa của Viện Nghiên Cứu lúa Quốc Tế (IRRI), đã tổng kết nhiều tài liệu khác nhau và cho rằng việc thuần hóa lúa trồng có thể đã được tiến hành một cách độc lập cùng một lúc ở nhiều nơi, dọc theo vành đai trải dài từ đồng bằng sông Ganges dưới chân phía đông của dãy núi Himalayas - Ấn

Độ, ngang qua Bắc Myanma, Bắc Thái Lan, Lào và Việt Nam, đến Tây Nam và Nam Trung Quốc [2]

1.1.2 Ngu ồn gen cây lúa trồng

Tất cả các loài lúa trồng thuộc chi Oryza đều có bộ NST lưỡng bội 2n= 24

Về kích thước của bộ gen, theo nghiên cứu của Viện nghiên cứu di truyền Bắc Kinh (Beijing Genomic Institute, viết tắt là BGI) và Công ty sinh học Syngenta (San Diego, Mỹ), bộ gen lúa trồng có kích thước nhỏ nhất trong nhóm cây ngũ cốc Trong đó, kích thước bộ gen của nhóm lúa Indica lớn hơn nhóm lúa Japonica Số

lượng gen của nhóm lúa Indica cũng nhiều hơn số lượng gen của nhóm lúa Japonica, hơn 99% các gen của hai nhóm lúa này là giống nhau [31], [39]

Theo tạp chí Nature, các nhà khoa học tham gia trong dự án giải mã trình tự

bộ gen lúa (2005) thông báo đã giải mã thành công bộ gen của cây lúa ước tính có tới 37.544 gen so với 20.000-25.000 gen ở cơ thể con người Trên thực tế, nhóm nghiên cứu trên mới chỉ giải mã được 95% bộ gen của cây lúa [44]

Việc giải mã bộ gen lúa có ý nghĩa vô cùng quan trọng vì nó sẽ giúp cho con người tạo ra nhiều giống lúa cao sản, giàu dinh dưỡng, kháng chịu sâu bệnh tốt hơn

và chịu được những điều kiện thời tiết ngày càng khắc nghiệt

Đồng thời việc giải mã trình tự bộ gen lúa cũng được xem như thiết lập một

“tiêu chuẩn vàng” trong việc phân lập những gen nông học quan trọng và có thể cung cấp chìa khóa cho việc nghiên cứu mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các bộ gen ngũ cốc với nhau vì bộ gen lúa trồng và các loại cây ngũ cốc khác như ngô, lúa

mì, lúa mạch cũng có độ tương đồng rất lớn, khoảng 98% [36], [39]

1.1.3 T ầm quan trọng của cây lúa trong chi Oryza

Cây lúa trồng là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới: lúa, lúa

mì, ngô Khoảng 40% dân số thế giới coi lúa gạo là nguồn lương thực chính, 25%

sử dụng lúa gạo trên ½ khẩu phần lương thực hàng ngày Như vậy lúa gạo có ảnh hưởng tới đời sống ít nhất 65% số dân thế giới [8], [9]

Theo số liệu của Bộ Nông Nghiệp Mỹ (USDA, 2007), tổng nhu cầu tiêu thụ gạo trung bình hằng năm của cả thế giới ước từ 410 triệu tấn (2004-2005), đã tăng lên đến khoảng 424,5 triệu tấn (2007), trong khi tổng lượng gạo sản xuất của cả thế giới luôn thấp hơn nhu cầu này Cũng theo cơ quan này, hàng năm thế giới thiếu khoảng 2-4 triệu tấn gạo, đặc biệt năm 2003-2004 sự thiếu hụt này lên tới 21 triệu tấn Đối với một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan, Miến Điện, Ai Cập lúa gạo chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là nguồn lương thực mà còn là nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần thiết cho sự phát triển của đất nước [2]

Lịch sử cũng cho thấy kinh tế lúa gạo đã và đang góp phần xứng đáng vào thắng lợi của quá trình công nghiệp hoá ở nhiều nước

Lúa gạo còn có ý nghĩa chính trị khá sâu sắc Ở Mỹ, gạo được coi là “nông phẩm chính trị” quan trọng phục vụ đắc lực cho chính sách đối ngoại của Nhà Trắng suốt nhiều đời tổng thống vừa qua [19]

1.1.4 Lúa lai và an ninh lương thực thế giới

Do bản chất của con lai F1 là sự tổ hợp giữa hai dòng bố mẹ có đặc tính di truyền khác nhau nên cho ưu thế lai cao hơn các giống bố mẹ và các giống lúa thuần khác trong cùng điều kiện canh tác

Thực tế sản xuất cũng cho thấy lúa lai có ưu thế về nhiều mặt so với các giống lúa thuần: sức sinh trưởng mạnh, hiệu suất quang hợp cao hơn, thời gian sinh trưởng ngắn, cây cứng khỏe, kháng đạo ôn tốt, sử dụng phân bón tiết kiệm, trong điều kiện khí hậu thời tiết khó khăn thì lúa lai chống chịu tốt hơn lúa thường nên năng suất ổn định hơn Theo tổng kết chung của các nước trồng lúa lai trên thế giới thì năng suất lúa lai cao hơn lúa thường 20- 30% Năng suất trung bình của lúa lai là

7 tấn/ha trong khi năng suất trung bình của lúa thuần là chỉ là 5,6 tấn/ha [4]

Với quy trình công nghệ tối ưu sẽ khai thác tối đa tiềm năng năng suất của giống, nâng cao năng suất và tổng sản lượng để có thể thu hẹp diện tích gieo cấy mà vẫn đảm bảo nguồn lương thực cần thiết cho an ninh lương thực quốc gia [10], [34]

Ở Việt Nam, lúa lai được gieo trồng từ năm 1991 Hiện nay, diện tích lúa lai

là hơn 600.000 ha hằng năm với năng suất trung bình từ 6-6,3 tấn/ha, cao hơn lúa thuần từ 15-20% Việc sử dụng lúa lai đã góp phần nâng cao năng suất, sản lượng lúa và tạo thêm việc làm, tăng thu nhập cho nông dân thông qua việc sản xuất hạt lai Lúa lai góp phần bảo đảm an ninh lương thực ở nhiều tỉnh phía Bắc và Trung

Bộ

Chọn giống lúa lai là một phương pháp tạo giống rất hiệu quả ở nước ta đối phó với sự đa dạng cả về địa lý, khí hậu và xã hội Phương pháp này làm giảm thời gian chọn giống và mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi các nguồn di truyền của cây lúa [38]

Thành công trong sản xuất lúa lai góp phần giúp Việt Nam trở thành nước đứng thứ hai trong xuất khẩu gạo tại châu Á

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã lai tạo ra giống Việt Lai 20 vào năm

2004 đã được công nhận là giống quốc gia đầu tiên của Việt Nam Từ đó đến nay,

có nhiều giống lúa lai khác được ra đời như TH3-3, TH5-1, TH 3-4 và Việt Lai 24,

những giống này cũng đã được công nhận là giống quốc gia và đang được sản xuất trên diện tích hàng chục nghìn héc-ta là những thành công ban đầu của công tác tự lai tạo và sản xuất hạt giống lúa lai tại Việt Nam Ngoài các nghiên cứu cho ra đời các giống lúa lai thì công tác phổ biến các giống lai, hoạt động khuyến nông, sự hỗ trợ về chính sách và tài chính của nhà nước đóng vai trò quan trọng trong ứng dụng đưa vào sản xuất các giống lúa lai mới

Lúa lai đã và đang giúp Trung Quốc giải quyết vấn đề lương thực và là nước

có khả năng tự cung cấp lương thực lớn nhất thế giới Thành công và đóng góp từ nghiên cứu lúa lai ở Trung Quốc mở ra một triển vọng mới giúp thế giới có một cái nhìn lạc quan hơn về an ninh lương thực trong tương lai

Ngoài ra, Philippines, Bangladesh, Indonesia, Pakistan, Ecuador, Guineas và

Mỹ cũng là những nước đạt được thành công trong sản xuất lúa lai và đang đưa vào sản xuất nhiều giống lúa lai ở cả hai mức độ khảo nghiệm và sản xuất đại trà [14], [29], [42]

1.2 Đặc điểm di truyền một số tính trạng hình thái, sinh lý của cây lúa

1.2.1 Đặc điểm di truyền chiều cao cây lúa

Chiều cao cây là một trong những tính trạng nông học quan trọng, liên quan đến tính chống đổ và trực tiếp ảnh hưởng đến năng suất Thân rạ thấp và cứng quyết định tính kháng đổ ngã, tỉ lệ hạt và rơm, tính cảm ứng với phân đạm và tiềm năng cho năng suất cao Thân rạ cao, ốm yếu, dễ đổ ngã sớm làm rối nùi bộ lá, tăng hiện tượng bóng rợp, cản trở sự chuyển vị các dưỡng liệu và các chất quang hợp làm hạt

bị lép và giảm năng suất

Tính kháng đổ ngã có liên hệ phần lớn đến tính thấp cây, còn phụ thuộc vào một số đặc tính khác như đường kính thân, độ dày thân rạ, mức độ bẹ lá ôm lấy các lóng [12]

Theo IRRI, có thể phân loại chiều cao cây lúa như sau:

Foster K.W và cộng sự (1978) cho biết đột biến nửa lùn cũng di truyền theo định luật Mendel trong phép lai đơn Nhiều công trình nghiên cứu về bản chất các gen lùn ở các giống lúa đột biến thấp cây đều cho thấy chúng thuộc cùng một locus gây tính lùn, đa số kiểu hình thấp cây được điều khiển bởi 1 gen lặn đơn [24]

Kikuchi (1986) [27] đã đưa ra nhận xét rất đáng chú ý khi nghiên cứu bản chất các gen lùn thuộc các giống khác nhau, đó là: đa số các giống lúa thấp cây đều

có cùng gen gây tính lùn, các dòng đột biến thuần chủng đồng gen về tính lùn, khi lai với dạng gốc cao cây đều thu được ở F1 kiểu hình đồng nhất cao cây, nhưng thấp hơn so với dạng gốc, F2 phân ly theo tỉ lệ phép lai đơn 3 cao : 1 thấp Điều này cho thấy tuyệt đại đa số kiểu hình thấp cây (lùn và nửa lùn) ở các giống đột biến đều được điều khiển bởi 1 gen lặn đơn [18]

Khush và Toenniessen (1991) đã thống kê tới hơn 50 gen liên quan đến tính lùn hoặc rút ngắn bộ phận nào đó của cây lúa, hầu hết các gen này đều là gen lặn, chúng phân bố trên 11 NST (trừ NST số 7) Do vậy trong điều kiện tự nhiên cũng như khi xử lý đột biến, tần số xuất hiện các alen đột biến làm thay đổi chiều cao cây

là rất cao

Theo nghiên cứu của Đào Xuân Tân (1995) và Đỗ Hữu Ất (1997) trên một

số giống lúa tẻ đặc sản (loại hình Indica cao cây) đều kết luận: đột biến lặn về chiều cao cây có thể xuất hiện theo 2 hướng: dạng thấp cây hơn giống gốc (lùn và nửa lùn), dạng cây cao hơn giống gốc, là tùy thuộc vào đặc điểm của giống, tùy thuộc vào thời điểm và liều lượng chiếu xạ Đột biến chắc chắn làm phá vỡ sự cân bằng giữa các locus kiểm soát chiều cao cây, đặc biệt là sự biến đổi ở I và T, hoặc trong các locus D sẽ tạo ra các dòng đột biến có chiều cao cây khác nhau và khác với giống gốc [dẫn theo 11]

1.2.2 Đặc điểm di truyền kích thước lá đòng và lá công năng

Trong đời sống cây lúa, lá thứ 2 tính từ trên xuống luôn luôn hoạt động mạnh nhất nên được gọi là lá công năng

Lá đòng là lá cuối cùng và trên một nhánh lúa là lá trên cùng, vì vậy tiếp nhận được nhiều ánh sáng nhất Từ khi trổ, lá đòng hoạt động không kém lá công năng, do ra sau, trẻ hơn và ở phía trên nên có vai trò lớn nhất trong nuôi dưỡng bông lúa

Chiều dài của lá lúa thay đổi rất nhiều Góc lá lúa liên hệ trực tiếp đến chiều dài lá nên lá ngắn thường thẳng đứng hơn lá dài Lá ngắn phân bố đều hơn trong tán

lá vì vậy bóng rợp bị giảm bớt và ánh sáng được sử dụng hữu hiệu hơn

Chiều rộng lá ít biến đổi hơn so với chiều dài Lá hẹp thường được cho là góp phần tạo năng suất cao vì nó phân bố đều hơn lá rộng ít gây bóng rợp trong tán

Kramer (1974) sử dụng phép lai diallel giữa 7 giống lúa khác nhau về chiều dài và chiều rông phiến lá, kết quả cho thấy: lá đòng thường ngắn hơn lá công năng, đối với cả 2 lá trên thì đều có hiện tượng siêu trội Tuy nhiên đối với lá đòng, hầu

hết các gen trội tác động theo hướng làm cho phiến lá dài, trong khi đó ở lá công năng thì số gen trội và số gen lặn với số lượng tương đương tác động theo cách tương tự như trên [28]

Về chiều rộng lá, người ta cho thấy lá đòng và lá công năng được kiểm soát bởi hệ thống di truyền khác nhau Gen trội hoàn toàn đã có tác động làm cho phiến

lá đòng rộng, còn gen trội không hoàn toàn tác động làm phiến lá rộng ở lá công năng

Kikuchi và cộng sự (1978) đã kết luận rằng: phiến lá rộng là trội không hoàn toàn, tính trạng này được kiểm soát bởi nhiều gen [dẫn theo 11]

1.2.3 Đặc điểm di truyền chiều dài bông lúa

Chiều dài bông là một trong những yếu tố đảm bảo cho sức chứa hạt của bông.Chiều dài bông thay đổi từng giống

Chiều dài bông chia thành 3 cấp:

• Bông ngắn: chiều dài bông < 20 cm

• Bông dài trung bình: chiều dài bông từ 20- 25 cm

• Bông dài: chiều dài bông > 25 cm [20]

Khush (1991) đưa ra kết luận: gen lặn đột biến đánh dấu “sp” xác định bông dài ở dạng ban đầu Dưới tác dụng của tia phóng xạ, locus Sp (hay còn gọi là locus Lp) có thể phát sinh đột biến lặn theo nhiều hướng khác nhau, có hướng tăng cường chiều dài bông (ví dụ: Sp1>sp1, sp2, sp3) ở các mức độ khác nhau [26]

Theo nghiên cứu của Vanderstok J.E (1910), Jones (1928) và Ramiah (1930), kiểu hình bông dài là trội so với bông ngắn và phân ly theo kiểu đa phân, chứng tỏ có nhiều gen chi phối tính trạng chiều dài bông

Năm 1958, Syakudo đề xuất: tính trạng chiều dài bông do 6 gen đa phân chi phối nhưng chưa rõ các gen cụ thể, chỉ cho biết tính trạng này phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường [dẫn theo 11]

1.2.4 Đặc điểm di truyền kích thước hạt lúa

Theo IRRI, chiều dài hạt gạo (L) được chia thành 4 mức độ:

• Rất dài: L > 7,5mm

Theo Jenning và cộng sự (1979), chiều rộng và độ dày hạt rất ít thay đổi so với chiều dài Ảnh hưởng của môi trường đối với chiều dài hạt nói chung là nhỏ hơn

so với khối lượng hạt vì hệ số di truyền của chiều dài hạt là tương đối cao Chiều dài hạt là đặc điểm tốt nhất để phân tích sự di truyền kích thước hạt (Takeda, 1991) [25]

Chiều dài và hình dạng hạt được di truyền độc lập nhau và độc lập với những tính trạng phẩm chất gạo khác Chiều dài hạt là tính trạng số lượng, được kiểm soát bởi nhiều gen, có thứ tự mức độ trội: hạt dài > hạt trung bình > hạt ngắn > hạt rất ngắn

Chiều rộng hạt được điều khiển bởi đa gen (Chang 1974, Bollich 1957) Hạt

có kích thước hẹp có tính chất trội không hoàn toàn so với hạt có kích thước rộng (Bollich 1957, Lin 1978) [12]

Takeda và Saito (1977) phát hiện một gen trội Mi quy định tính trạng hạt nhỏ, ngắn Gen này cũng có tác động đa hiệu làm giảm 1/3 trọng lượng hạt [25]

Takeda (1984) phát hiện gen Lk-f quy định chiều dài hạt gạo của giống lúa địa phương Nhật Bản Fasayoshi trội không hoàn toàn, ở quần thể F2 của phép lai giữa giống Fusayoshi hạt dài với giống hạt trung bình có tỉ lệ phân ly 1 ngắn: 2 trung bình: 1dài Gen Lk-f có tác dụng làm tăng kích thước hạt khoảng 1,4 lần so với bình thường [dẫn theo 11]

Ramiah (1993) phát hiện một gen lặn (ký hiệu lk) quy định tính trạng hạt dài Một số công trình nghiên cứu khác trên loài phụ Indica (Takamure I và cộng

sự, 1995) lại phát hiện được các alen thuộc locus LK kiểm tra chiều dài hạt gạo, trong đó dạng hạt ngắn là trội so với dạng hạt dài

Trong số 10 locus kiểm tra kích thước và hình dạng hạt gạo, có 5 locus chính thường gặp ở các giống lúa hiện nay (thuộc 2 loài phụ Indica và Japonica), trong đó locus Lk-f được nghiên cứu nhiều nhất Lk-f là một locus dễ bị đột biến và có tác dụng đa hiệu

Các alen đột biến làm thay đổi hình dạng hạt gạo và chiều dài hạt gạo, phát sinh ở một số giống lúa, di truyền theo phép lai đơn, có quan hệ trội lặn hoàn toàn hoặc không hoàn toàn so với alen kiểu dại

Takeda (1991) đã nhận xét kích thước hạt của hầu hết các giống lúa hiện nay đều được kiểm soát bởi nhiều gen Kato (1989), Murai và Kinoshita (1985), Tseng (1977) đều kết luận chiều dài hạt gạo biến đổi theo kiểu biến dị liên tục, chứng tỏ nó được kiểm soát bởi nhiều gen [dẫn theo 11]

Sự tổ hợp theo các cách thức khác nhau của các nhóm gen thuộc các locus khác nhau, biểu hiện tác động cộng gộp hoặc bù trừ làm cho độ dài hạt gạo ở các giống lúa không giống nhau

1.2.5 Đặc điểm di truyền màu sắc hạt thóc

Màu sắc hạt thóc không ảnh hưởng đến năng suất hoặc các đặc tính về chất lượng quan trọng khác, nhưng vẫn được coi là một tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, đánh giá độ thuần chủng của giống và dòng (Jenning và cộng sự, 1979) [12]

Ngoài ra trên thị trường, màu sắc của hạt thóc, gạo và hình dạng của nó cũng hấp dẫn và tạo ra thị hiếu riêng của người tiêu dùng Cũng theo các tác giả trên, màu sắc vỏ trấu là tính trạng di truyền đơn gen, hai màu cơ bản khá phổ biến ở các giống lúa trồng hiện nay là màu vàng rơm và màu vàng, trong đó màu vàng rơm là tính trội so với màu vàng Vì sự di truyền khá đơn giản này mà màu sắc vỏ trấu còn được sử dụng làm tiêu chuẩn để kiểm tra và phát hiện các cá thể F1 tự thụ trong các phép lai nghiên cứu di truyền các tính trạng ở cây lúa, khi cây có hạt màu vàng dùng làm mẹ

Theo thống kê của Nguyễn Văn Hiển, Trần Thị Nhàn (1982) có tới 26 kiểu màu khác nhau Phan Khải và cộng sự (1986) phát hiện được một số đột biến trội

vỏ trấu màu tím đen di truyền đơn gen, do gen Pr nằm trên NST 11 thuộc nhóm liên

kết 4 quy định Theo Khush và Oka (1984), Khush và Toeniessen (1991) có tới 13 locus khác nhau thuộc 7 NST chi phối tính trạng màu sắc vỏ trấu , trong đó có 8 locus chính:

- Gen Bf, quy định tính trạng rãnh màu nâu trên vỏ trấu

- Gen I-Bf ức chế gen Bf

- Gen Bh quy định vỏ trấu màu đen thuộc NST 11, có 3 alen Bh-a, Bh-b, Bh-c

- Gen Wh nằm trên NST 11 xác định tính trạng vỏ trấu màu trắng

- Gen Pr trên NST 11 xác định tính trạng vỏ trấu màu tím

- Gen gf nằm trên NST 6 quy định tính trạng vỏ trấu màu vàng

- Gen Bp nằm trên NST 10 quy định vỏ quả (vỏ cám) màu nâu

- Gen Rd nằm trên NST 3 quy định vỏ trấu và vỏ quả màu đỏ

- Gen gh1 trên NST 2, gen gh2 và gh3, nằm trên NST 8, cả 3 gen này đều quy định tính trạng vỏ trấu màu vàng

Sự tương tác bổ trợ giữa các gen quy định màu sắc vỏ trấu làm cho nó có nhiều màu sắc khác nhau [dẫn theo 18]

1.2.6 Đặc điểm di truyền thời gian sinh trưởng

Thời gian sinh trưởng của cây lúa tính từ nảy mầm cho đến chín (85% số hạt trên bông đã chín), thay đổi từ 90 đến 180 ngày tuỳ theo giống và điều kiện ngoại cảnh [3]

Theo IRRI, các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa như sau:

Thời gian sinh trưởng của một giống chuyên biệt cao theo vùng và theo mùa

vì những tương tác giữa sự mẫn cảm quang chu kỳ và nhiệt độ của giống với điều kiện thời tiết Do đó, những thuật ngữ như chín sớm, chín vừa, chín muộn chỉ có ý nghĩa ở những vùng và mùa đặc biệt

Ở miền Bắc, các giống lúa ngắn ngày có thời gian sinh trưởng 90 - 120 ngày, giống lúa trung ngày là 140 - 160 ngày Các giống lúa chiêm cũ, do thời vụ gieo cấy

có điều kiện nhiệt độ thấp nên thời gian sinh trưởng kéo dài 180 - 200 ngày

Ở đồng bằng sông Cửu Long, các giống lúa địa phương có thời gian sinh trưởng 200 -240 ngày ở vụ mùa, cá biệt những giống lúa nổi có thời gian sinh trưởng đến 270 ngày [46]

Các giống có thời gian sinh trưởng quá ngắn có thể không cho năng suất cao

vì sự sinh trưởng dinh dưỡng hạn chế, và những giống có thời gian sinh trưởng quá dài cũng có thể không có năng suất cao vì sự sinh trưởng dinh dưỡng dư thừa có thể gây đổ ngã Thời gian sinh trưởng khoảng 120 ngày từ khi gieo đến khi chín dường như là tối hảo cho năng suất tối đa ở mức đạm cao trong vùng nhiệt đới Những giống chín sớm cho phép thâm canh và hiệu suất dùng nước cao, đặc tính này cho phép nâng cao tiềm năng năng suất của một giống lúa [13]

Lê Vĩnh Thảo và cộng sự (1993) cho rằng tính chín sớm hay muộn có liên quan đến tuổi thọ bộ lá và khả năng làm hạt Sự khác nhau của các giống về thời gian sinh trưởng chủ yếu là ở giai đoạn sinh trưởng cơ bản, các giống chín sớm đều

có thời gian sinh trưởng cơ bản ngắn [dẫn theo 18]

Theo Chang (1964), tính chín sớm hay muộn của các giống lúa thuộc loại hình Indica là do một locus trực tiếp xác định Tuy nhiên các tác giả Kuo-Hai-Tsai (1986) Khush và Toenniessen (1991) Dung và Sano (1997) đều cho rằng có 2 nhóm gen điều khiển tính trạng thời gian sinh trưởng của lúa:

• Nhóm gen điều khiển pha sinh trưởng cơ bản (Basic Vegetative Phase- BVP)

• Nhóm gen điều khiển pha cảm ứng quang chu kỳ (Photoperiod-sensitive Phase- PS)

Theo Kuo-Hai-Tsai (1997) có 3 gen điều khiển pha sinh trưởng cơ bản của lúa là Ef-1(E1), mEf-1(m) và Lf-1(E2)

Locus Ef-1 (viết tắt là E1) có ít nhất một alen lặn (ký hiệu là e) và 5 alen trội (E1, Ea, Eal, Eb, Eγ) Hiệu quả trội của mỗi alen nói trên là rút ngắn thời gian sinh trưởng khoảng vài ngày

Khush và cộng sự (1991) cho rằng rất có thể Ef-1 nằm trên NST số 10,

mEf-1 nằm trên NST số 7 và Lf-mEf-1 nằm trên NST số 3

Kuo-Hai-Tsai (1987) đã nghiên cứu và khẳng định, chính alen E1 cũng như tính át chế mạnh của nó đối với alen E2 trong điều kiện ánh sáng ngày ngắn đã rút ngắn thời gian sinh trưởng [22], [26], [32]

Theo Okumoto và cộng sự (1996), tập hợp các locus E1, E2, E3 và Se1 điều khiển phản ứng quang chu kỳ, còn locus Ef-1 thì chỉ điều khiển pha sinh trưởng cơ bản Ở mỗi nhóm giống này đều có những kiểu gen chính đối với những locus E1,

Se1, Ef-1 [dẫn theo 11]

Theo Trần Duy Quý và cộng sự (1978), có 5 alen quy định tính chín sớm

Efm, Efk, Efg, Efo và Eff, các alen này có biểu hiện trội hoàn toàn hoặc không hoàn toàn Các giống có thời gian sinh trưởng trung bình mang tổ hợp 5 alen Efm, Efg,

Efk, Efo và Eff trong đó Efm có hiệu quả ức chế các alen còn lại Các dạng chín muộn mang 6 alen Efz

, Efm, Efg, Efk, Efo, Eff trong đó có 2 alen Efz

và Efmức chế hiệu quả chín sớm và kiểm tra tính chín muộn

Khush và Toenniessen (1991) [26] đã kết luận rằng: có 10 locus kiểm tra thời gian sinh trưởng của lúa và chia làm 2 nhóm:

• Nhóm gen điều khiển pha sinh trưởng cơ bản chủ yếu bị chi phối bởi các locus Ef-1, mEf-1, Ef-2 (hay lf-1), Ef-3(t) (hay lf-2), Ef-4(t) (hay lf-3(t))

• Nhóm gen điều khiển pha cảm ứng quang chu kì bao gồm các locus E1, E2,

E3 phối hợp với các locus Se-1, I-Se-1, Se-2 và Se-3

Sự phối hợp tác động giữa các locus thuộc hai nhóm gen trên gây nên sự biến đổi về thời gian sinh trưởng ở các giống lúa khác nhau

1.2.7 Đặc điểm di truyền khả năng đẻ nhánh

Đẻ nhánh là một đặc tính sinh học của cây lúa, liên quan chặt chẽ đến quá trình hình thành số bông và năng suất sau này

Khả năng đẻ nhánh của cây lúa phụ thuộc vào phạm vi mắt đẻ và điều kiện ngoại cảnh Sau một thời gian đẻ nhánh số nhánh tăng lên, trong quần thể ruộng lúa

có hiện tượng tự điều tiết, do sự cạnh tranh về ánh sáng và dinh dưỡng nên số nhánh không tăng lên nữa [3]

Để đánh giá khả năng đẻ nhánh, IRRI đã đưa ra thang điểm sau:

• Trên 25 nhánh/cây: rất cao

khả năng đẻ nhánh ở loài lúa trồng Oryza sativa L Các alen tác động theo kiểu cộng

tính Giống lúa đẻ nhánh rất khỏe có 3 cặp gen lặn ti1ti1ti2ti2ti3ti3 Tùy theo số cặp alen lặn có trong kiểu gen nhiều hay ít mà khả năng đẻ nhánh nhiều hay ít Sự có mặt của 3 cặp gen trội làm cho lúa có khả năng đẻ nhánh yếu nhất

Maekawa và cộng sự, Takamure (1991) cũng đã đề cập đến các gen đột biến lặn khác được phát hiện có hiệu quả làm giảm khả năng đẻ nhánh ở một số giống lúa [dẫn theo 18]

1.3 Những vấn đề cơ bản trong nhân giống in-vitro thực vật

1.3.1 Khái ni ệm

Nhân giống in-vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các

mô như lá, thân, hoa hoặc rễ [7]

1.3.2 Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy in-vitro

1902, Gottlieb Haberlandt, nhà thực vật học người Đức, đã đặt nền móng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

1922-1954: nhiều công trình nghiên cứu trên các đối tượng như rễ ngô, cà chua, cà rốt cũng như những phát hiện quan trọng về vai trò của các nhóm chất khác nhau trong nuôi cấy mô thực vật

1957, Skoog và Miller chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nuôi cấy

mô phụ thuộc nồng độ tương đối của auxin/ cytokinin, từ đó đưa ra quan điểm điều khiển hormone trong quá trình hình thành cơ quan thực vật

1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, từ kết quả đó lan được xem là cậy nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa

1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu bước tiến trong kĩ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay

Từ những năm 1970 trở đi, hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy, lai tế bào trần, chuyển gen thực vật trên các đối tượng thực vật khác nhau phát triển với tốc độ nhanh chóng và được ứng dụng thương mại hóa Ngày nay, nuôi cấy mô

tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen vào cây trồng…[7], [21]

1.3.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô thực vật

Cơ sở sinh lý của nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào Theo ông mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh

Biểu hiện tính toàn năng của tế bào thực vật thể hiện rõ nét thông qua quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Sự phân hóa tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa

Sự phản phân hóa tế bào là quá trình diễn ra ngược với sự phân hóa tế bào.Các tế bào đã phân hóa trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình mà trong các điều kiện nhất định chúng có thể quay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới Do đó, có

thể lấy một mẫu mô nào đó của cây (đã phân hóa) cho vào nuôi cấy trong môi trường thích hợp, chúng lại phân chia để cho ra các tế bào mới, hình thành mô sẹo

rồi từ đó phân hóa thành các cơ quan như rễ và chồi [5], [6], [37]

1.3.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.4.1 Nuôi c ấy đỉnh sinh trưởng

Trong khuôn khổ nhân giống in-vitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi

hoặc đỉnh sinh trưởng Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh [5]

1.3.4.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Phương pháp này thường áp dụng cho những đối tượng thực vật không có khả năng nhân giống thông qua đỉnh sinh trưởng

1.3.4.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Khi môi trường nuôi có tỉ lệ cytokinin và auxin thích hợp sẽ có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh

1.3.4.4 Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

Tế bào trần là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ chức năng sẵn có Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào trần có thể

phân chia và tái sinh cây hoàn chỉnh Nuôi cấy và dung hợp tế bào trần được ứng dụng trong lai xa, cho phép cải thiện giống cây trồng

1.3.4.5 Nuôi c ấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn của thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo, mô sẹo này được tái sinh tạo cây hoàn chỉnh là cây đơn bội[7]

1.3.5 Một số vấn đề trong nuôi cấy tạo cụm chồi in-vitro

1.3.5 1 Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

• Các muối khoáng đa lượng (C, N, P, S, K, Ca, Mg…) và vi lượng (Fe, B,

Co, Cu, Mn, Mo, Zn…)

• Các vitamin: vitamin xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol

• Các chất điều hoà sinh trưởng

Các dạng auxin đang được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật hiện nay là 2,4 D (acid 2,4 dichrolophen-oxyacetic), AIA (acid indol acetic), AIB (acid indol butyric), ANA (acid naphtylacetic)

 Cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô.Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ Các dạng cytokinin phổ biến trong nuôi cấy hiện nay: zeatin, kinetine, BA (benzyl adenine)…

Ngoài ra, tùy mục đích nuôi cấy mà có thể sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng khác như gibberellin, abcisic acid (ABA), ethylene

• Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

• Các chất kháng sinh

• Các chất khử trùng

Môi trường Murashige-Skoog (MS) là một trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Môi trường MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm Hiện nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công

bố năm 1962 như môi trường B5, môi trường Chu (N6), môi trường Nitsch…[5], [7]

1.3.5 2 Quy trình nuôi cấy cơ bản

Quá trình vi nhân giống thông thường gồm năm giai đoạn chính, mỗi một giai đoạn có những yêu cầu riêng

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

- Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao

- Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non v.v…

- Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

- Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính

- Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau:

tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

- Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

- Nhân nhanh là giai đoạn kích thích sự phân hóa các chồi từ một hay vài chồi ban đầu

- Thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích nhân nhanh

- Cấy chuyển để nhân nhanh chồi, giai đoạn này không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị sôma Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa

cơ quan, đặc biệt là chồi như:

• Bổ sung tổ hợp hormone thực vật mới (tăng cytokinin giảm auxin) Tăng tỷ

lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi

• Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1000 lux

• Bảo đảm nhiệt độ trong khoảng 20-30o

C

- Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích

Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu tiên, trong đó cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây cần sự chăm sóc đặc biệt

Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo bệ trước những yếu tố bất lợi sau: mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn, cháy lá do nắng…[5]

1.3.6 Ý nghĩa của nhân giống in-vitro

1.3.6 1 Ưu điểm của vi nhân giống

- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

- Sản phẩm cây giống đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng, tạo ra quần thể có độ đều cao

- Tiết kiệm không gian: hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

- Nâng cao chất lượng cây giống: nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc

- Lợi thế về vận chuyển: các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận

là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế

- Sản xuất quanh năm: quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [5], [7]

1.3.6 2 Hạn chế của vi nhân giống

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất

cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen

- Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo, do

đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng [5], [7]

1.3.6.3 Nhân giống in- vitro và việc sử dụng giống ưu thế lai

Ở ngành trồng trọt, giống ưu thế lai mới chỉ được ứng dụng ở một số đối tượng như: ngô, cà chua, lúa, cải dầu, bắp cải, hành tây, măng tây, đặc biệt là các giống hoa…

Sử dụng ưu thế lai không những làm tăng năng suất từ 20-40%, mà giống lai còn có đặc điểm là rất đồng đều so với giống bố mẹ Vì vậy, phương pháp nhân giống và bảo quản giống trong ống nghiệm đối với một số giống rau và giống hoa

có một ý nghĩa kinh tế cao

Vấn đề đặt ra hiện nay là phải nghiên cứu các quy trình nhân giống in-vitro

tối ưu cho từng loài cây trồng và cải tiến quy trình đó để giảm tới mức đối đa các tốn kém về nhân công lao động trong các công đoạn nuôi cấy và đưa cây con ra ngoài đất trồng [5]

1.3.7 Ứng dụng và thành tựu nhân giống in-vitro thực vật tại Việt Nam

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học, đặc biệt trong kĩ thuật chuyển gen tạo ra những giống cây trồng mới đều cần đến kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô được ứng dụng để:

• Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn

• Tạo ra dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền

• Tạo ra các dòng cây sạch bệnh (loại bỏ virus, vi khuẩn) từ cây mẹ nhiễm bệnh

Ở nước ta, việc nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật mới chỉ bắt đầu từ những năm 1975 nhưng đã gặt hái những thành tựu không nhỏ trong chọn giống và nhân giống cây trồng trong nông nghiệp với những cây quan trọng như mía, lúa, cà phê, khoai tây, chuối, dứa Cayenne

Trường Đại học Đà Lạt đã nhân được gần 30 loài lan đặc hữu của Vườn Quốc gia Cát Tiên bằng biện pháp nuôi cấy mô sau hơn 1 năm tiến hành nghiên cứu Trong số đó, có nhiều loài rất quý được nước ngoài đặt mua với số lượng lớn như lan hài Hồng, kim hài, vân hài, lan gấm, A Rích Một số loài như Ludisia discolor, Kim tuyến còn có tác dụng làm thuốc chữa bệnh Việc nhân nhanh các loài lan quý này không chỉ phục vụ cho mục đích kinh tế, phục vụ khách du lịch, mà còn góp phần bảo vệ sự đa dạng sinh học của nước ta

Kĩ thuật nuôi cấy bao phấn đơn bội cây lúa, ngô đã được hoàn chỉnh về quy trình, kết hợp với các kĩ thuật chuyển gen, lai xa đã và đang hứa hẹn tạo ra những giống mới mang nhiều đặc điểm ưu thế: sinh trưởng mạnh, chống chịu tốt, kháng đạo ôn, sâu bệnh, năng suất cao Các dòng, giống lúa có triển vọng gồm: DT26, DT29, DT32, J1, AC22, AC23, AC24, AC25 đang được khảo nghiệm Nhờ nuôi cấy bao phấn lúa có thể rút ngắn thời gian chọn giống mới xuống từ 4 - 6 thế hệ Kỹ

thuật đơn bội in- vitro cũng đang được triển khai mạnh trong chọn giống ở Viện lúa

Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện Công nghệ sinh học,

Giống AC5 là giống lúa quốc gia đầu tiên được tạo ra bằng kết hợp lai hữu tính với kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam và đã sử dụng để sản xuất lúa hàng hóa, chất lượng cao tại các vùng đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ

Một số công trình nuôi cấy nhiều giống cây dược liệu quý như Sâm Ngọc Linh, các loại nấm dược liệu quý hiếm, cây lô hội, vù hương cũng đã hoàn chỉnh, đáp ứng nhu cầu khai thác nguồn dược liệu cũng như lưu giữ và nhân nhanh các nguồn gen quý

Nuôi cấy mô còn đem lại nhiều lợi ích trong việc nhân nhanh các giống cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao như dó trầm, cây Đăng, bạch đàn, keo, lát hoa, neem, bông

Viện công nghệ sinh học và viện nghiên cứu cây bông và cây có sợi cũng đã xây dựng thành công quy trình tái sinh cây bông phù hợp với điều kiện Việt Nam, giúp nhân nhanh các giống cây bông có năng suất cao, cung cấp nguyên liệu cho ngành dệt may hiện nay, và hạn chế việc nhập khẩu bông [5], [7], [33], [41], [45]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

1 Giống lúa Bắc Thơm số 7

- Nguồn gốc: là giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc, được công nhận giống

theo quyết định số 1224 QĐ/BNN-KHCN (Bộ nông nghiệp- khoa học công nghệ), ngày 21 tháng 4 năm 1998

- Đặc điểm: Bắc Thơm 7 là giống lúa có thể gieo cấy được trong cả 2 vụ, thời gian

sinh trưởng ở vụ Xuân muộn là 135- 140 ngày, ở vụ Mùa sớm là 115- 120 ngày Chiều cao cây: 90- 95 cm Đẻ nhánh khá, trỗ kéo dài Hạt thon nhỏ, màu vàng sẫm Chiều dài hạt trung bình: 5,86 mm Tỷ lệ chiều dài/ chiều rộng hạt là 2,95 Trọng lượng 1000 hạt: 19– 20g Gạo có hương thơm Cơm thơm, mềm [47]

2 Gi ống lúa Hương Thơm số 1

- Ngu ồn gốc: là giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc, được công nhận giống

theo Quyết định số 123 QĐ/BNN-KHCN, ngày 16 tháng 1 năm 2004

- Đặc điểm: Hương Thơm số 1 là giống lúa thơm ngắn ngày, gieo cấy được ở cả 2

vụ Thời gian sinh trưởng ở vụ Xuân muộn là 130– 132 ngày, ở vụ Mùa là 105– 110 ngày Chiều cao cây: 95- 105 cm Dạng cây gọn, có mùi thơm, đẻ nhánh khá, trỗ tập trung Bông dài 22– 25 cm, 110– 120 hạt chắc/bông Hạt nhỏ, màu vàng sẫm Chiều dài hạt trung bình: 5,32 mm Tỷ lệ chiều dài/ chiều rộng hạt là: 2,75 [47]

3 Dòng lúa lai Tám Xoan 1-2

- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 giống Tám Xoan đột biến 1 và Tám Xoan đột biến 2, được Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt

giống

Gi ống lúa Tám Xoan đột biến 1 (đột biến từ Tám Xoan Hải Hậu)

- Nguồn gốc: do bộ môn lúa, Viện Khoa học nông nghiệp miền Nam xử lý bằng tia

phóng xạ và chọn đến M6

- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 95-100 ngày, chiều cao cây 93-95 cm, dạng cây

gọn, bẹ tím, lá xanh đậm, dày, đứng, bông dài 22-24 cm, hạt bầu, màu vàng sáng, có chấm đen ở đầu hạt, mất tính cảm quang chu kỳ

Gi ống lúa Tám Xoan đột biến 2 (đột biến từ Tám Xoan Hải Hậu)

- Nguồn gốc: do bộ môn lúa, viện khoa học nông nghiệp miền Nam xử lý bằng tia

phóng xạ và chọn đến M6, đã thuần

- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 90-100 ngày, cao cây 90-93 cm, dạng cây trung

gian, đẻ nhánh trung bình, lá hơi cong, màu xanh đậm, bông dài 23-24 cm, hạt khá dài, màu vàng sáng, mất tính cảm quang chu kỳ

4 Dòng lúa lai Nàng Hương đột biến x Tám Xoan 93 (NHĐB x TX93)

- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 dòng Nàng Hương đột biến và Tám Xoan 93, được Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt giống

Gi ống lúa Nàng Hương

- Nguồn gốc: là giống lúa đặc sản địa phương lâu đời, trồng nhiều ở Long An, An

Giang, thành phố Hồ Chí Minh

- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 155-165 ngày, cảm ứng chặt với quang chu kỳ,

trổ bông tháng 11-12, cây cao 130-180 cm, dài bông 23,5 cm, hạt thóc nhỏ và thon,

có mỏ, hạt gạo dài 6,21 mm, gạo đục, lá dài, rủ Cây hơi xòe, đẻ nhánh trung bình Năng suất 3-3,2 tấn/ha Có mùi thơm nhẹ, khối lượng 1000 hạt là 22g Cơm dẻo, mềm [35]

Gi ống lúa Tám Xoan 93

- Nguồn gốc: do viện lúa đồng bằng sông Cửu Long chiếu xạ bằng tia Gamma Co60

vào hạt khô của giống lúa Tám Xoan Hải Hậu- Nam Định, được chọn ở thế hệ M3

và nhân thành dòng ở thế hệ M6

- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 95-100 ngày, cao cây 95-100 cm, khả năng đẻ

nhánh khỏe Dạng cây đứng, chụm, lá đứng, bản lá tương đối rộng Hạt thóc dài, màu vàng sáng, hạt gạo ít bạc bụng, thơm nhẹ, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Không còn cảm ứng quang chu kỳ, cấy được các vụ trong năm, kháng được rầy nâu và đạo ôn

5 Dòng lúa lai Nàng Thơm đột biến x Nàng Thơm chợ Đào (NTD2)

- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 dòng Nàng Thơm đột biến và Nàng Thơm chợ Đào, do Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt

giống

Gi ống Nàng Thơm chợ Đào

- Nguồn gốc: là giống lúa đặc sản địa phương được trồng tại xã Mỹ Lệ nên còn gọi

là Nàng Thơm Mỹ Lệ, thuộc tỉnh Long An, do nông dân ở Long An chọn lọc và giữ giống

- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 155-165 ngày, cảm ứng quang chu kỳ, cây cao

145 cm, bông dài 24-24,6 cm, lá dài thon, hạt thóc nhỏ thon, có mỏ, hạt gạo dài 6,3

mm, gạo đục, mùi thơm nhẹ [35]

6 Dòng lúa lai Nàng Thơm chợ Đào x Nàng Thơm đột biến (NT1)

- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 dòng Nàng Thơm chợ Đào và Nàng Thơm đột biến, là kết quả phép lai nghịch của tổ hợp NTD2 nêu trên, được Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt giống

7 Giống lúa Jasmine 85 (JAS)

- Nguồn gốc: giống lúa Jasmine 85 là giống lúa thơm có nguồn gốc từ giống IR841

của Viện Lúa Quốc tế do Bộ Nông Nghiệp Mỹ chọn lọc lại với dòng Jasmine 85 Giống này được du nhập vào Việt Nam trong những năm đầu của thập niên 1990, trồng nhiều các tỉnh Đồng Tháp, An Giang, Long An và một số vùng khác

- Đặc diểm: thời gian sinh trưởng 105-110 ngày Chiều cao cây 110-115 cm và độ

dài bông 26,2 cm Trọng lượng 1000 hạt 26g, thuộc nhóm hạt to, chiều dài hạt 6,9

cm, tỉ lệ dài/ rộng là 3,05 Tán lá đứng, đẻ nhánh trung bình, mùi thơm nhẹ, mềm cơm, ngon ngọt cơm, không bạc bụng Đây là thành tựu khá nổi bật của các nhà chọn giống, bởi vì trên 20 năm lai tạo và chọn lọc, người ta đã thất bại trong phát triển giống lúa thơm có dạng hình cải tiến, ngắn ngày, năng suất cao [35]

8 Dòng lúa lai Tám- Dự 1 (TD)

- Nguồn gốc: Tám- Dự 1 được tạo ra từ tổ hợp lai giữa Dự đột biến số 2 và Tám

Xuân Đài đột biến số 3, chọn lọc theo phương pháp phả hệ, có những đặc điểm ưu việt hơn so với 2 dạng bố mẹ, được đưa vào khảo nghiệm cơ bản trong mạng lưới khảo nghiệm quốc gia ở vụ Xuân năm 2005 Dự đột biến số 2 và Tám Xuân Đài đột biến số 3 là các dòng đột biến của 2 giống lúa tẻ thuần chủng là Dự Hải Hậu và

Tám Xuân Đài Hạt giống do Tiến sĩ Nguyễn Minh Công- Bộ môn Di truyền học, Đại học Sư phạm Hà Nội cung cấp

Gi ống lúa Dự Hải Hậu

- Nguồn gốc: là giống đặc sản do Sở nông nghiệp Nam Định tuyển chọn, được công

nhận năm 1995

- Đặc điểm: đây là giống lúa mùa phản ứng chặt với quang chu kì, có thời gian sinh

trưởng 160-165 ngày, cây cao 145-150 cm, thường trổ bông vào tháng 10, chín vào tháng 11 Chiều dài bông 24-25 cm, năng suất 30-40 tạ/ha, tỉ lệ hạt lép 11-15%,

khối lượng 100 hạt 19-20g Phẩm chất hạt gạo: trắng, bạc bụng ít, cơm dẻo, hơi thơm

Gi ống lúa Tám Xuân Đài

- Nguồn gốc: là giống lúa đặc sản cổ truyền được tạo ra từ xã Xuân Đài, huyện

Xuân Trường, tỉnh Nam Định, được bộ công nghiệp và thực phẩm cho phép đưa vào sản xuất năm 1995

- Đặc điểm: đây là giống lúa mùa phản ứng chặt với quang chu kỳ, có thời gian sinh

trưởng dài hơn các giống lúa Tám khác, thường là 170-180 ngày, thường trổ bông vào tháng 10, chín vào tháng 11 Cây cao 155-165 cm, bông dài, tỉ lệ hạt lép tương đối cao 17-20% Phẩm chất hạt gạo: trắng, bạc bụng ít, cơm dẻo, ngon, rất thơm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 B ố trí thí nghiệm lai tạo hạt F1

 Chu ẩn bị chậu trồng lúa: 50 chậu đất, đường kính 40cm, chiều cao 35 cm

 Chu ẩn bị đất: đất được lấy từ ruộng về, phơi 1 tuần, sau cho cho vào chậu

ngâm nước 1 tuần, trộn đều với phân bò khô Tháo nước sấp, trộn đều và gieo hạt

 Chuẩn bị giống: các giống, dòng lúa vật liệu được phơi nhẹ, ngâm 24 giờ

trong nước 3 sôi 2 lạnh, ủ 2 ngày 2 đêm Hạt giống cho vào các túi nilon có đục lỗ riêng biệt, trên túi có ghi nhãn nhận diện

 Gieo mạ: sau khi hạt giống nảy mầm, gieo dày trong các chậu riêng biệt có

đánh dấu tên từng giống, dòng Khi mạ được 25 ngày, chọn các cây mạ khỏe,

cứng cáp, rễ trắng, dài, nhiều, mang cấy vào các chậu đã chuẩn bị sẵn Mỗi giống, dòng được trồng trong 5 chậu, mỗi chậu 4 cây

 Chăm sóc: chăm sóc mạ theo quy trình trồng lúa thông thường

 Chế độ nước: mực nước trong chậu phải đảm bảo từ 5-7 cm

 Lai tạo hạt giống F1

Khảo sát sự chênh lệch về thời gian sinh trưởng của các giống và dòng đột biến ban đầu để chuẩn bị cho lai

Thực hiện các phép lai gồm các cặp cha mẹ từ các giống và dòng ban đầu bằng phương pháp cắt vỏ trấu để khử nhị vào lúc 15-17 giờ ngày hôm trước và tiến hành lai vào 9-11 giờ ngày hôm sau

Sau khi khử nhị xong, bông lúa được bao lại bằng túi giấy can (6 x15 cm) để tránh sự giao phấn tự do

Cắt bông lúa đang nở của cây chọn làm bố, rũ mạnh để rắc hạt phấn lên trên bông lúa đã khử nhị của cây chọn làm mẹ Sau đó, bông lúa được bao lại

Quan sát sự hình thành và phát triển của các hạt lai đến khi chín

Hình 2.1 Các bông lúa được khử nhị và lai

Hình 2.2 Bông lúa lai và hạt lúa lai F1

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy cụm chồi in-vitro

Các dụng cụ cần thiết đều được rửa sạch, sấy khô, hấp khử trùng và bảo quản đúng cách Sau đó thực hiện theo các bước sau:

• Bước 1: Tạo vật liệu khởi đầu cho việc nuôi cấy

Hạt lúa lai F1 đã bóc sạch vỏ trấu và chú ý không làm tổn thương phôi

• Bước 3: Cấy hạt đã khử trùng lên môi trường nảy mầm

Các hạt sau khi được khử trùng đem cấy trên môi trường nảy mầm

Môi trường nảy mầm: khảo sát 2 nghiệm thức [17]

NC1: MS + 4,5 mg/l BA + 0,5mg/l AIA NC2: MS + 3,5 mg/l BA + 0,5mg/l AIA

Môi trường nuôi cấy được chứa trong bình tam giác 250ml, mỗi nghiệm thức cấy 2 bình, mỗi bình cấy 5 hạt, lặp lại 3 lần

Nuôi mẫu cấy 1- 2 tuần trong điều kiện: ánh sáng 3000 ± 500 lux; nhiệt độ

25 ± 20C Quan sát khả năng nảy mầm của hạt và mức độ nhiễm của mẫu nuôi cấy trong vòng 1– 2 tuần