CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

CễNG NGH SINH HC I CNG CHNG 1: KHI NIM C BN V CễNG NGH SINH HC 1.1 Khỏi nim v cụng ngh sinh hc Cú nhiu nh ngha v cụng ngh sinh hc (Biotechnology), tựy theo tng tỏc gi khỏc nhau, nhng tt c u thng nht v khỏi nim c bn sau õy: Cụng ngh sinh hc l s sn xut cỏc sn phm trờn quy mụ cụng nghip, ú nhõn t tham gia trc tip v quyt nh l cỏc t bo sng (vi sinh vt, thc vt, ng vt) Mi t bo sng ca c th sinh vt hot ng lnh vc sn xut ny c xem nh mt lũ phn ng nh Vo nhng nm 1980, cụng ngh sinh hc ó chuyn sang mt giai on mi l l giai on cụng ngh sinh hc hin i vi vic s dng cỏc thnh tu ca k thut gen, l lnh vc cụng nghip s dng hot ng sinh hc ca cỏc t bo ó c bin i di truyn C s sinh hc c ỏp dng õy bao gm sinh hc phõn t, sinh hc t bo, húa sinh hc, di truyn hc, vi sinh vt hc, dch hc, cựng cỏc nguyờn lý k thut mỏy tớnh Cú hai cỏch nh ngha cụng ngh sinh hc mt cỏch tng quỏt nht: - Do UNESCO (1985) nh ngha: Cụng ngh sinh hc l cụng ngh s dng mt b phn hay t bo riờng r ca c th sinh vt vo vic khai thỏc sn phm ca chỳng - Do Trng Lut Stanford (1995) nh ngha: Cụng ngh sinh hc l cụng ngh chuyn mt hay nhiu gen vo sinh vt ch nhm mc ớch khai thỏc sn phm v chc nng ca gen ú S khỏc bit rừ rt nht ca hai nh ngha trờn thuc v i tng tỏc ng ca cụng ngh sinh hc: UNESCO xem c quan, b phn, t bo v chc nng riờng r ca sinh vt l i tng, ú Trng Lut Stanford li coi gen l i tng tỏc ng ca cụng ngh T cỏc nh ngha trờn, cú th phõn bit c hai nhúm cụng ngh sinh hc l: - Cụng ngh sinh hc truyn thng (Traditional Biotechnology) Bao gm: + Thc phm lờn men truyn thng (Food of Traditional Fermentations) + Cụng ngh lờn men vi sinh vt (Microbial Fermentation Technology) + Sn xut phõn bún v thuc tr sõu vi sinh vt (Production of Microbial Fertilizer and Pesticide) + Sn xut sinh giu protein (Protein-rich Biomass Production) + Nhõn ging vụ tớnh bng nuụi cy mụ v t bo thc vt (Plant Micropropagation) + Th tinh nhõn to (In vitro Fertilization) - Cụng ngh sinh hc hin i (Modern Biotechnology) Bao gm: + Nghiờn cu genome (Genomics) + Nghiờn cu proteome (Proteomics) + Thc vt v ng vt chuyn gen (Transgenic Animal and Plant) + ng vt nhõn bn (Animal Cloning) + Chip gen (DNA chip) + Liu phỏp t bo v gen (Gen and Cell Therapy) + Cụng ngh sinh hc nano (Nanobiotechnology) + Tin sinh hc (Bioinformatics) + Hot cht sinh hc (Bioactive Compounds) + Protein bit dc (Therapeutic Protein) S phõn loi cụng ngh sinh hc cng cú th da vo cỏc tỏc nhõn sinh hc tham gia vo quỏ trỡnh cụng ngh, cú th chia thnh cỏc nhúm sau: - Cụng ngh sinh hc thc vt (Plant Biotechnology) - Cụng ngh sinh hc ng vt (Animal Biotechnology) - Cụng ngh sinh hc vi sinh vt (Microbial Biotechnology) - Cụng ngh sinh hc enzyme hay cụng ngh enzyme (Enzyme Biotechnology) Gn õy, i vi cỏc tỏc nhõn sinh hc di t bo cũn hỡnh thnh khỏi nim cụng ngh protein (Protein Engineering) v cụng ngh gen (Gen Engineering) Cụng ngh Protein v cụng ngh gen xuyờn sut v tr thnh cụng ngh chỡa khúa nm cụng ngh sinh hc thc vt, cụng ngh sinh hc ng vt v cụng ngh sinh hc vi sinh vt Nh k thut c trỡnh t gen v k thut DNA tỏi t hp, cụng ngh gen ó t c nhng thnh tu ht sc to ln mang tớnh quyt nh, m nhng giai on phỏt trin mi ú l nghiờn cu v ton b genome ca nhiu sinh vt, ú ỏng chỳ ý l vic gii mó genome ca ngi v ca cõy lỳa ú l vic hỡnh thnh c mt phng hng nghiờn cu, ng dng v kinh doanh cỏc sinh vt chuyn gen (Gentically Modified Organism-GMO) v cỏc thc phm chuyn gen (Gentically Modified Food-GMF) Cụng ngh protein cú tim nng ng dng rt ln vic sn xut cỏc protein tỏi t hp (Recombinant Protein) dựng lm dc phm iu tr cỏc bnh him nghốo nh: interferon, interleukin, insulin Mt khỏc, tựy vo i tng phc v ca cụng ngh sinh hc, cú th phõn cỏc lnh vc cụng ngh sinh hc khỏc nh: - Cụng ngh sinh hc nụng nghip (Biotechnology in Agriculture) - Cụng ngh sinh hc ch bin thc phm (Biotecnology in Food Processing) - Cụng ngh sinh hc y dc (Biotechnology in Medicine-Pharmaceutics) - Cụng ngh sinh hc mụi trng (Environmental Biotechnology) - Cụng ngh sinh hc vt liu (Material Biotechnology) - Cụng ngh sinh hc húa hc (Biotechnology in Chemical Production) - Cụng ngh sinh hc nng lng (Biotechnology in Energy Production) 1.2 Lnh vc nghiờn cu ca cụng ngh sinh hc Bn lnh vc cụng ngh sinh hc hin ang c quan tõm nhiu nht ú l: Cụng ngh sinh hc nụng nghip L lnh vc cụng ngh sinh hc cú nhiu úng gúp vic ci thin ging cõy trng, xõy dng nhng k thut canh tỏc mi, nghiờn cu quỏ trỡnh c nh m nhng cõy khụng thuc h u - Cụng ngh sinh hc ci thin v nhõn nhanh ging cõy trng Lnh vc ny cú bn ng dng chớnh: ng dng k thut chn dũng t bo bin d soma, nhõn ging ng nghim (nhõn ging in vitro), lai vụ tớnh hay cũn gi l dung hp t bo trn, k thut sn xut cõy n bi (1n) - C nh m v bin np gen nif Dựng k thut gen tỏch gen nif t cỏc c th c nh m chuyn sang cỏc cõy trng quan trng nh lỳa, ngụ l mt mụ hỡnh lý tng ca cỏc nh to ging - Cỏc phng phỏp canh tỏc mi, bao gm: Phng phỏp mng dinh dng, h thng thy canh - Cụng ngh sinh hc chn nuụi, bao gm: K thut cy chuyn phụi, to ch phm phũng trỏnh bnh cho ng vt Cụng ngh sinh hc y dc Nhiu cụng trỡnh nghiờn cu ca cụng ngh sinh hc ó c ng dng thnh cụng y dc, c bit l sn xut thuc v chun oỏn bnh Trong nhng nm qua, lnh vc ng dng cụng ngh di truyn mnh nht y t l nghnh sn xut thuc khỏng sinh, vỏc xin, khỏng th n dũng v cỏc protein cú hot tớnh sinh hc Hin nay, cỏc nghiờn cu nhm tỡm kim cỏc cht khỏng sinh mi tng mnh hin tng vi sinh vt khỏng li tỏc dng ca khỏng sinh ngy cng nhiu hn Phm vi ng dng ca khỏng th n dũng ngnh y t ngy cng tng nh phõn tớch dch, nh v cỏc u, phỏt hin mt s protein cú liờn quan n s hỡnh thnh u, xỏc nh s cú mt ca cỏc loi vi khun khỏc nhau, giỳp cho cỏc bỏc s xỏc nh bnh mt cỏch nhanh chúng v chớnh xỏc Khỏng th n dũng l hp cỏc phõn t khỏng th ng nht v mt cu trỳc v tớnh cht Khỏng th n dũng c to bng cỏch cho lai t bo lympho h dch ca ng vt hoc ca ngi vi t bo ung th Mt s th lai cú kh nng to khỏng th c hiu i vi khỏng nguyờn Chn cỏc th lai ú nhõn lờn v sn xut khỏng th n dũng Cỏc t bo lai cú kh nng tng sinh vnh vin mụi trng nuụi cy - tớnh cht ny nhn c t t bo ung th Nh cụng ngh s dng DNA tỏi t hp m ngi ta cú th sn xut mt s protein cú hot tớnh sinh hc dựng cha bnh nh insulin cha bnh tiu ng, interferon cha bnh ung th, cỏc hormon tng trng cho ngi Bn cht ca cụng ngh ny l lm thay i b mỏy di truyn ca t bo bng cỏch a gen mó húa cho mt protein c hiu v bt nú hot ng to mt lng ln loi protein m ngi cn Cụng ngh sinh hc ch bin thc phm Cụng ngh lờn men l mt lnh vc quan trng sn xut thc phm Vic tuyn chn cỏc chng vi sinh vt cú kh nng lờn men tt, em li hiu qu cao l rt cn thit Cỏc nghiờn cu s dng cụng ngh di truyn phc v cho cụng ngh lờn men ch yu i vo hai hng chớnh l: - Phõn tớch di truyn cỏc loi vi sinh vt s dng quỏ trỡnh lờn men, xỏc nh cỏc gen mó húa cho cỏc tớnh trng mong mun nhm to nng sut v cht lng sn phm lờn men - To cỏc vi sinh vt chuyn gen phc v cho cỏc qui trỡnh lờn men Vớ d sn xut ru, ngy ngi ta ó dựng cỏc chng vi sinh vt cú kh nng to ru cao v cho hng v tt Phn ln cỏc chng ú c nghiờn cu, tuyn chn, lai to bng cụng ngh di truyn sn xut ru vang, trc õy, ngi ta phi dựng hai loi vi sinh vt l S Cerevisiae to hm lng ru dch lờn men v sau ú, s dng Leuconostos lờn men ph quỏ trỡnh tng tr, nhm nõng cao cht lng ca ru Ngy nay, ngi ta tin ti dựng mt chng vi sinh vt chuyn gen thc hin c hai quỏ trỡnh i vi cỏc sn phm lờn men sa nh phomat v sa chua, trc kia, ngi ta thng s dng nhng vi sinh vt t nhiờn cú mt sa lờn men, vy, ngi ta khú lũng kim soỏt quỏ trỡnh lờn men v hiu qu khụng cao Ngy ngi ta ó to c cỏc chng mi vi cỏc tớnh cht xỏc nh v ó iu khin c quỏ trỡnh lờn men theo nh hng mong mun Bng cụng ngh vi sinh vt, cụng ngh gen ngi ta ó to nhng chng vi sinh vt cú kh nng tng hp cỏc enzyme chu nhit, chu axit, chu kim tt sn xut enzyme Enzyme -amylase chu nhit ó v ang c s dng nhiu sn xut nha, ng glucose t tinh bt Trc õy, cụng nghip thc phm cỏc nghiờn cu cụng ngh sinh hc c s dng ch yu hon thin cỏc quy trỡnh cụng ngh lờn men truyn thng Cũn hin nay, cỏc nghiờn cu cụng ngh sinh hc ch yu liờn quan n vic to cỏc chng mi cú nng sut sinh hc cao v vic ỏp dng chỳng vo cỏc cụng ngh lờn men hin i, sn xut v ch bin cỏc loi sn phm sau: - Cụng nghip sn xut sa - Cụng ngh sinh hc ch bin tinh bt - Sn xut nc ung lờn men, nh: bia, ru nho, ru chng ct - Sn phm cha protein, nh: protein vi khun n bo, protein t to lam c nh m cyanobacteria v vi to - Sn xut cỏc cht tng hng v thc phm, nh: citric acid, amino acid, vitamin v mu thc phm, cht tng v ngt thc phm, keo thc phm - Ch bin rau qu Cụng ngh sinh hc bo v mụi trng Cựng vi s phỏt trin ca khoa hc k thut, loi ngi phi bt u tỡm cỏch gii quyt ụ nhim mụi trng bng cỏc bin phỏp khỏc Trong ú, cỏc bin phỏp cụng ngh sinh hc ngy cng t u vit hn so vi cỏc bin phỏp khỏc Núi chung, hin bo v mụi trng c gii quyt theo ba hng sau: - Phõn hy cỏc c cht vụ c v hu c - Phc hi cỏc chu trỡnh trao i cht ca C, N, P v S t nhiờn - Thu nhn cỏc sn phm cú giỏ tr dng nhiờn liu hoc cỏc hp cht hu c - X lý cht thi, nh: x lý sinh hc hiu khớ, x lý bng lờn men phõn hy ym khớ - Thu nhn cỏc cht cú ớch t lờn men ym khớ, nh: x lý cỏc dng nc thi khỏc v tỏi s dng chỳng phc v cho cỏc ngnh cụng nghip nng - X lý cỏc cht thi cụng nghip, nh: x lý cht thi cụng nghip ch bin sa, x lý cht thi cụng nghip dt 1.3 Lc s phỏt trin ca cụng ngh sinh hc Lch s hỡnh thnh v phỏt trin cụng ngh sinh hc tri qua cỏc giai on sau: Giai on th nht ó hỡnh thnh t rt lõu vic s dng cỏc phng phỏp lờn men vi sinh vt ch bin v bo qun thc phm, vớ d: sn xut mỏt, dm n, lm bỏnh mỡ, nc chm, sn xut ru bia Trong ú, ngh nu bia cú vai trũ rt ỏng k Ngay t cui th k 19, Pasteur ó ch rng vi sinh vt úng vai trũ quyt nh quỏ trỡnh lờn men Kt qu nghiờn cu ca Pasteur l c s cho s phỏt trin ca ngnh cụng nghip lờn men sn xut dung mụi hu c nh aceton, ethanol, butanol, isopropanol vo cui th k 19, u th k 20 Giai on th hai Ni bt nht ca quỏ trỡnh phỏt trin cụng ngh sinh hc giai on ny l s hỡnh thnh nn cụng nghip sn xut thuc khỏng sinh penicillin, u gn lin vi tờn tui ca Fleming, Florey v Chain (1940) Trong thi k ny ó xut hin mt s ci tin v mt k thut v thit b lờn men vụ trựng cho phộp tng ỏng k hiu sut lờn men Cỏc thớ nghim x lý cht thi bng bựn hot tớnh v cụng ngh lờn men ym khớ to biogas cha ch yu khớ methane, CO2 v to ngun phõn bún hu c cú giỏ tr cng ó c tin hnh v hon thin Giai on th ba Bt u t nhng nm 50 ca th k 20, song song vi vic hon thin cỏc quy trỡnh cụng ngh sinh hc truyn thng ó cú t trc, mt s hng nghiờn cu v phỏt trin cụng ngh sinh hc ó hỡnh thnh v phỏt trin mnh m nh mt lot nhng phỏt minh quan trng ngnh sinh hc núi chung v sinh hc phõn t núi riờng ú l vic ln u tiờn xỏc nh c cu trỳc ca protein (insulin), xõy dng mụ hỡnh cu trỳc xon kộp ca phõn t DNA (1953) Tip theo l vic tng hp thnh cụng protein (1963-1965) v c bit l vic tng hp thnh cụng gen v buc nú th hin t bo vi sinh vt (1980) Chớnh nhng phỏt minh ny ó to tin cho s phỏt trin nhanh chúng ca cỏc nghiờn cu c bn v ng dng thc t sau ú lnh vc cụng ngh sinh hc hin i Giai on t t K t 1973, nhng thớ nghim u dn n s i ca k thut DNA tỏi t hp c thc hin v s xut hin insulin-sn phm u tiờn ca nú vo nm 1982, v thớ nghim chuyn gen vo cõy trng nm 1982 thnh cụng thỡ n cụng ngh sinh hc hin i ó cú nhng bc tin khng l cỏc lnh vc nụng nghip (ci thin ging cõy trng ), y dc (liu phỏp gen, liu phỏp protein, chn oỏn bnh ), cụng nghip thc phm (ci thin cỏc chng vi sinh vt ) Cụng ngh sinh hc phỏt trin cho n ngy ch yu da trờn ba cụng ngh chớnh l: - Cụng ngh vi sinh - Cụng ngh t bo (nuụi cy mụ v t bo ) - Cụng ngh sinh hc hin i, tc cụng ngh gen Cng cú tỏc gi gn quỏ trỡnh phỏt trin cụng ngh sinh hc vi ba cuc cỏch mng sinh hc - Cỏch mng sinh hc ln th nht (u th k 20): s dng quỏ trỡnh lờn men sn xut cỏc sn phm nh acetone, glycerine, citric acid, riboflavin - Cỏch mng sinh hc ln th hai (sau th chin th 2): sn xut khỏng sinh, cỏc sn phm lờn men cụng nghip nh glutamic acid, cỏc polysaccharide, ú cú thnh tu v t bin, to cỏc chng vi sinh vt cho nng sut v hiu qu cao, phỏt trin cỏc quỏ trỡnh lờn men liờn tc v phỏt hin phng phỏp mi v bt ng enzyme s dng nhiu ln - Cỏch mng sinh hc ln th ba (bt u t gia thp niờn 1970): vi cỏc phỏt hin quan trng v enzyme hn ch, enzyme gn, s dng plasmid lm vector to dũng, t nn múng cho mt nn cụng ngh sinh hc hon ton mi ú l cụng ngh DNA tỏi t hp Hai giai on u, cụng ngh vi sinh v cụng ngh t bo, s dng hot ng sinh hc ca cỏc t bo tỏch bit, nhng cha bin i c cu trỳc di truyn ca chỳng, nờn c xem l hai giai on ca cụng ngh sinh hc truyn thng Phi n cuc cỏch mng sinh hc ln th ba nh ó nờu trờn, thỡ mi i nn cụng ngh sinh hc hin i, giai on phỏt trin cao nht ca cụng ngh sinh hc, m k nguyờn mi ca sinh hc 1.4 V trớ ca cụng ngh gen cụng ngh sinh hc Cụng ngh gen l mt mi nhn ca cụng ngh sinh hc Nm 1972-1973 k thut gen i, m u cho mt giai on mi ca cuc cỏch mng cụng ngh sinh hc Con ngi ó cú kh nng vt gii hn tin hoỏ, cú th chuyn cỏc gen t mt loi ny sang mt loi khỏc, iu m khụng th thc hin c bng ng chn lc t nhiờn n ngi ta ó gii mó b gen ca mhiu sinh vt nh b gen ca vi khun E coli, ca nhiu virus, ca giun trũn, ca cõy lỳa v n nm 2003 v c bn ó gii mó c b gen ngi Trờn c s k thut gen cỏc nh khoa hc ó to nhiu ging cõy trng cú nhng c tớnh u vit nh cõy chng chu hn, chu mn, cõy cú nng sut cao gúp phn l tng giỏ tr kinh t cho xó hi Nhiu chng vi sinh vt mi cú kh nng tng hp enzym cao c to bng cụng ngh gen ó c s dng cụng nghip S hiu bit mt cỏch chi tit v cu to v hnh ca b gen cho phộp ngi cú kh nng can thip mt cỏch chớnh xỏc vo cỏc quỏ trỡnh sng phc v li ớch ca mỡnh Nhng thnh tu ca cụng ngh gen luụn gn vi ng dng thc tin nhm phc v li ớch ca ngi Túm li cú th núi cụng ngh gen l mi nhn, l trung tõm phỏt trin ca cụng ngh sinh hc 1.5 Khỏi nim v t bo gc Thỏng nm 1997, Wilmut ó cụng b cụng trỡnh nhõn bn vụ tớnh ng vt, ó to c cu Dolly, ỏnh mt du mc cho s phỏt trin v nhõn ging nhiu loi ng vt t t bo dinh dng (t bo soma) Nm 1999 t bo gc (Somatic stem cell) c phat hin T bo gc l nhng t bo gi nguyờn tớnh cht nh t bo phụi, tc l chỳng cú kh nng phỏt trin thnh nhiu loi t bo chuyờn bit khỏc nh t bo tim, t bo thn kinh, t bo thn vv v t ú cú th phỏt trin thnh mt c th Nh vy nhõn bn vụ tớnh ng vt t t bo gc s d dng hn nhiu T ú n vic nhõn bn vụ tớnh ng vt t cỏc t bo gc ó c nhiu nh khoa hc trờn th gii quan tõm Nhng thnh cụng nhõn bn vụ tớnh ng vt ó m kh nng nhõn bn vụ tớnh ngi õy l mt ó c nhiu nh khoa hc, nh qun lý, nhng ngi ng u ca quc gia quan tõm bn cói v cho n ó cú mt s nc cm khụng cho tin hnh nhõn bn ngi 1.6 Thc phm chuyn gen Cho n nhiu loi sinh vt chuyn gen (GMO) ó xut hin vi qui mụ sn xut cụng nghip, nh cõy ngụ chuyn gen, cõy u tng chuyn gen, c chua, lỳa vv Nhng cõy chuyn gen thng cú nhiu c tớnh u vit nh nng sut cao, cú th chng chu nhng iu kin ngoi cnh bt li nh chng chu sõu bnh, chng chu hn, chu mn vv Nh vy trng cõy chuyn gen thng em li hiu qu kinh t cao Cõy trng l thc phm cho ngi v ng vt nờn phi chu s giỏm sỏt ca cỏc t chc qun lý v an ton sinh hc, vỡ vy nhng loi cõy chuyn gen a sn xut phi m bo nhng tiờu chun nht nh Vớ d M ni m cụng ngh sinh hc c u t v phỏt trin mnh nht trờn th gii, qun lý cng rt cht ch H thng qun lý ca M nhm m bo an ton lng thc bao gm B Nụng nghip M (USDA), Cc Bo v Mụi trng (EPA), Cc qun lý Thc phm v Dc phm (FDA), qun lý cỏc loi lng thc cú ngun gc thc vt c to nh cụng ngh sinh hc Theo o lut Lng thc, Dc phm v M phm (FD&C), FDA cú thm quyn bo m an ton ca tt c cỏc lng thc nc v nhp khu cho ngi v ng vt trờn th trng M C quan Kim tra Sc kho Thc vt v ng vt ca USDA (APHIS) cú chc nng giỏm sỏt an ton nụng nghip v an ton mụi trng trng trt v th nghim ti hin trng cỏc ging cõy trng c to nh cụng ngh sinh hc Tuy vy cng cn lu ý rng vic to cỏc GMO, cỏc gen khỏng khỏng sinh nh kanamycine, ampicillin hoc hygromycine thng c dựng kốm lm gen ch th Chỳng tn ti sn phm ca cỏc GMO v cú th cú nh hng trc tip hoc giỏn tip thụng qua dõy chuyn thc n ca sinh quyn n ngi 1.7 Mt s khớa cnh v kinh t v khoa hc ca cụng ngh sinh hc hin i Cỏc phng tin thụng tin i chỳng ng ti khụng ớt cỏc ý kin phn i ng dng mt s thnh tu cụng ngh sinh hc sn xut, thm i vi nhng thnh tu c gii khoa hc ỏnh giỏ l sỏng chúi Tht vy, cụng ngh sinh hc cng nh khoa hc ht nhõn, bờn cnh cỏc ng dng cc k to ln cho li ớch v phỏt trin ca loi ngi, cú th cũn mang li nhiu him khụng th lng trc c hu qu Sau õy chỳng ta s tỡm hiu cỏc him tim tng ca cụng ngh sinh hc V khoa hc S dố dt s dng cỏc sn phm chuyn gen lm thc phm cho ngi v gia sỳc cú th nhiu lý khỏc nhau, nhng tu trung cú th chia thnh hai nhúm sau: - B mỏy di truyn ca sinh vt mang tớnh hon thin rt cao vỡ ó tin húa qua hng trm triu nm, nhng gen mi c lp thờm vo cho cõy trng v vt nuụi tng nng sut hoc cht lng nụng sn, bit õu cú th phỏ v tớnh hon thin, tớnh cõn bng ca s sng cỏc sinh vt ny V vỡ th ngi khụng th yờn tõm vi vic hng ngy nut vo c th mt s lng ln cỏc sn phm thiu tớgnh hon thin, cõn bng hay núi cỏch khỏc l cú th cú d tt - Cho n vic to cỏc GMO, cỏc gen khỏng khỏng sinh nh kanamycine, ampicillin hoc hygromycine thng c dựng kốm lm gen ch th Chỳng tn ti sn phm ca cỏc GMO v cú th cú nh hng trc tip hoc giỏn tip thụng qua dõy chuyn thc n ca sinh quyn n ngi Hin nay, ngi ta ang tỡm cỏch thay th cỏc gen chn lc c bng cỏc gen cú v ớt hi hn nh gen mó hoỏ protein phỏt hunh quang mu xanh lc (Green Fluorescence Protein-GFP) Gen GFP c coi l mt gen ch th tt, vỡ nú lm cho cỏc GMO phỏt sỏng xanh rc r t di tia t ngoi Nhng dự s nghi ngi cũn, vỡ gen GFP cú ngun gc t mt loi cỏ Bc Bng Dng, ch khụng t mt ng vt cú ngun gc gn vi ngi V kinh t 2.1 Nhng cụng ty a quc gia v cụng ngh sinh hc T chc quc t nụng nghip tin b RAFI (Rural Advancement Foundation International) l mt t chc quc t phi chớnh ph Canada hot ng nhm hn ch nh hng ca cỏc cụng ty a quc gia v ging Theo RAFI, th k 21 s l nhng nm tung honh ngang dc ca cỏc cụng ty a quc gia v cụng ngh sinh hc, hin nhng cụng ty ny ang phỏt trin nhanh chúng nh thõu túm cỏc cụng ty nh hn v trc ht nh li nhun khng l thu c c quyn bỏn cỏc sn phm GMO Chng hn cỏch õy hn 15 nm, cụng ty Monsanto ch chuyờn v cỏc sn phm húa du, thuc tr sõu, tr c Tuy nhiờn thi gian gn õy, Monsanto ó u t rt ln v trin khai cụng ngh gen thc vt to cỏc ging GMO v ang tr thnh cụng ty ging ln nht th gii RAFI gi Monsanto l mt "Microsoft cụng ngh sinh hc" vỡ t nm 1996 n Monsanto ó mua li nhiu cụng ty trc õy l ngi khng l trờn th trng ht ging 2.2 S l thuc vo cỏc cụng ty a quc gia v cụng ngh sinh hc RAFI tiờn oỏn ngi nụng dõn hu ht cỏc nc trờn th gii, k c cỏc nc cụng nghip phỏt trin, s dn dn s b l thuc vo mt nhúm nh cỏc cụng ty cụng ngh sinh hc a quc gia Vi quy ch ngt nghốo v quyn tỏc gi IPR (Intellectual Property Right) hin hnh quan h kinh t th gii, ngi nụng dõn s b tc b hon ton quyn t trng cõy gỡ trờn mnh t ca mỡnh v bỏn cho sn phm ca mỡnh Lý cỏc cụng ty nh Monsanto cú c nhiu quyn hn nh vy chớnh l s tin b ca cụng ngh sinh hc Chng hn, gen terminator c c quan ng ký bn quyn ca M chớnh thc cp bng phỏt minh cho cụng ty Delta Pine (3/1998) Khi chuyn gen vo bt c mt ging cõy no, ht bỏn s ch ny mm mt th h nht Nu ngi nụng dõn ly ht trng v sau, gen ny s to mt hp cht git cht mm, vỡ th ht hon ton khụng ny mm c Vi gen terminator tay, cỏc cụng ty a quc gia s bt nụng dõn cỏc nc hng nm phi mua ht ging ca h Mt khỏc, cỏc cụng ty ging ang thụn tớnh dn cỏc cụng ty ch bin lng thc, thc phm l u ca sn phm nụng nghip Mt mt c quyn ht ging GMO, mt mt nm cỏc cụng ty ch bin nụng sn, cỏc cụng ty a quc gia cụng ngh sinh hc s khụng cha mt li thoỏt no cho nụng dõn cỏc nc ang phỏt trin 1.8 Nhng phỏp lý ca cụng ngh sinh hc hin i K thut tỏi t hp DNA ó giỳp cỏc nh khoa hc thay i c ch tin húa ca t nhiờn, sỏng to sn phm ca gen, to cỏc dng sinh vt mi Ngy cng cú nhiu bng chng hin nhiờn v li ớch ca k thut DNA tỏi t hp Nhng cng phi cõn nhc n nhng nguy c tim tng ca nú, v thc t cng ó ny sinh mt s phỏp lý quan trng buc chỳng ta phi xem xột li mt cỏch thn trng Cú nhiu phỏp lý cụng ngh sinh hc, nhiờn phm vi bi ging ny ch cp ờn mt s khớa cnh sau: Vn an ton sinh hc Mc ớch ca cụng ngh sinh hc l phc v cho li ớch ca ngi Tuy vy nhiu ny sinh tỏc ng n cỏc sinh vt, mt s khụng ớt ca chỳng l nhng k thự ca ngi nh cỏc vi sinh vt gõy bnh Vn an ton sinh hc v o lý c s quan tõm ca xó hi Cụng ngh gen ó em li nhiu li ớch cho ngi, nhiờn bờn cnh ú cng khụng ớt nhng ni lo ngi, vy an ton sinh hc ó c t t nhng ngy u An ton sinh hc ú l s bo v ngi, xó hi v mụi trng tỏc ng cú hi, tỏc ng nguy him cỏc c t hay cỏc sn phm ca cụng ngh gen gõy cho hụm v cỏc th h mai sau Nú ũi hi phi ỏnh giỏ mc an ton ca tt c cỏc sn phm cng nh cỏc bin phỏp s dng i vi vt nuụi cõy trng, cỏc liu phỏp cha tr i vi ngi Ngay t nhng nm u ca cụng ngh gen (1972-1973) mi lo ngi v s xut hin mt loi vi sinh vt mi nguy him cho ngi v ng vt cú th xy ó lm cho cỏc nh nghiờn cu dng cỏc thớ nghim ca mỡnh Ngay t ú an ton sinh hc ó c t Ngy cỏc nh nghiờn cu phi tuõn th theo cỏc nguyờn tc ch o qun lớ chớnh thc c a nhm m bo cỏc vi sinh vt tỏi t hp ang nghiờn cu khụng phỏt trin bờn ngoi cỏc phũng thớ nghim, ng thi cỏc nhõn viờn phũng thớ nghim phi c bo v khụng xy bt c mt s ri ro no Cỏc sn phm chuyn gen luụn c kim tra, th nghim mt cỏch nghiờm ngt trc a vo s dng Vớ d nm 1999, cú khong 6000 th nghim ngoi thiờn nhiờn c thc hin ti M v mt s ó c chp nhn Tuy nhiờn cỏc nh mụi trng luụn lo lng vỡ cng cú nghiờn cu qu quyt rng cho chut n khoai tõy chuyn gen thỡ h thng dch ca nú b tn thng, hay ht phn t cõy bp chuyn gen Bt ó hu hoi qun th bm "hong hu", hay bi kch ca bnh viờm nóo bũ Anh v mt s nc Kt qu ca nhng thụng tin ny ó dy lờn nhng phn ng chng li nhng cõy chuyn gen Qun lý v ỏnh giỏ an ton ca thc phm Ti M v mt s nc phỏt trin qun lý v ỏnh giỏ an ton ca thc phm rt nghiờm ngt Tớnh an ton ca cỏc lng thc t cõy trng cng nh thnh phn thc phm, bao gm hng v, cht ph gia, thnh phn dinh dng, cỏc cht gõy d ng vv phi c ỏnh giỏ k trc cho phộp tiờu th Tuy vy ụi cng cú nhng l hng qun lý, cng nh li nhun cao ó lm gim i phn no tớnh nghiờm ngt, vy nhng tranh cói luụn tn ti nh vic s dng tryptophan gõy hi chng au c b nghi ng l c sn xut t dũng vi khun to bng cụng ngh gen hay vic s dng hormon tng trng bũ (Somatotropin bũ vit tc l BST) Ngi ta thy rng tiờm BST cho bũ sa thỡ s lm tng ỏng k lng sa v lng BST tn d sa khụng cao so vi i chỳng nờn khụng cú hi cho ngi, nhiờn BST t nhiờn thu nhn vi giỏ thnh cao nờn BST sn xut nng cụng ngh gen i (rBST) Cỏc nh qun lý v nh khoa hc M ó kim tra rt k v ó cú kt lun l tht v sa bũ ó c x lý vi rBST an ton cho ngi Tuy nhiờn nhng ngi phn i s dung rBST cho rng vic s dng rBST s lm gia tng nhim vi khun vo tuyn sa gõy chng viờm vỳ Tranh cói sõu hn na nh vy s dung rBST thỡ phi dựng khỏng sinh cao hn n nh sc kho ca gia sỳc dn n lm tng d lng khỏng sinh tht v sa, iu ny cú th gõy d ng nhiu ngi tiờu ng cnh (Hỡnh 6-2) Trong sinh hc phõn t, ngi ta coi DNA ligase nh mt cht keo phõn t kt dớnh cỏc mu DNA li vi 1,- Ni u bng: Ni u bng c xy hai on DNA u bng ng cnh Di tỏc dng ca enzyme ligase, liờn kt phosphodiester gia u 5(P) v u 3(OH) c hỡnh thnh v hai nucleotide c ni li vi (Hỡnh 6-3a) Kh nng ni hai on DNA u bng rt thp tng hiu sut phn ng, thng ngi ta phi tng nng ca cỏc on DNA 2,- Ni u lch: u tiờn, hai mnh DNA u lch cú nhng baz b sung nờn chỳng tin gn li to liờn kt hydro gia cỏc baz nit b sung Sau ú, hai nucleotide ca hai u ni to liờn kt este gia OH(3) v P(5) di tỏc dng ca enzyme DNA ligase Phn ng ni c thc hin theo s c biu din trờn Hỡnh 2-3b Plasmid c tỏch t t bo E Coli hoc t bo nm men theo phng phỏp chit tỏch DNA plasmid Sau ú, dựng enzyme RE II (nh EcoRI) ct to plasmid h cú hai u lch 2.3 Cỏc phng phỏp to AND tỏi t hp 2.3.1 Phng phỏp n gin dựng u lch 1,- Chn v x lý AND plasmid Plasmid c tỏch t t bo E coli hoc t bo nm men theo phng phỏp chit tỏch AND plasmid Sau ú dựng enzym RE II ct to plasmid h cú hai u lch 2,- Chn v x lớ on ci: DNA on ci c thu nhn v la chn, tinh ch theo mc ớch ca tng nghiờn cu Ct DNA bng enzyme RE loi II cựng loi vi enzyme ct plasmid (EcoRI) to cỏc vt ct ging 3,- To plasmid tỏi t hp: Ghộp on ci vo plasmid bng cỏch cỏc DNA on ci vi plasmid vi s cú mt ca enzyme DNA ligase, ta thu c DNA tỏi t hp Phn ng ni xy theo s c biu din trờn Hỡnh 2-4 Nối đầu bằng: OH C C G G P + A T T A OH P OH P C C A T T A G G DNA ligase OH P C C A T G G T A Nối đầu lệch: G C C T A G + G A T C T A Bắt cặp bazơ bổ sung P OH G G A T C T DNA ligase C C T A G A G G A T C T A C C T A G P Hỡnh 2-3: DNA v cỏc phn ng ni OH 2.3.2- Cỏc phng phỏp s dng on ni 1,- Chn v x lớ vector plasmid: (tng t nh trờn) 2,- Chn v x lớ on ci: Linker l nhng on DNA di 10 n 15 nucleotide, c tng hp bng phng phỏp húa hc, cho gia mi linker phi cú trỡnh t nhn bit bi mt enzyme ct hn ch loi II Vớ d nh EcoRI cú chui ớch l G/AATTC cDNA u bng c tng hp t mRNA nh enzyme chộp ngc theo c ch nuclease S1 Metyl húa cỏc vựng hn ch cú on cDNA si ụi c nhn bit bi enzyme EcoRI linker cú cha chui ớch G/AATTC vi cDNA v enzyme DNA ligase to phõn t lai Ct phõn t DNA lai bi enzyme EcoRI, ta c phõn t lai cú hai u lch DNA lạ Cắt Eco RI (REH ) Aatt Aatt Cắt Eco RI (REH ) TtAa TtAa a Tt Aatt a TtAa Tt aa DNA ligase Aa Aa tt tt aa Tt Tt aa DnA tái tổ hợp Hỡnh 2-4: Phng phỏp dựng u lch Điểm nhận biết Eco RI C C G A A T T C GG GG C T T A A G C C Các phân tử linker Linker DNA lạ (cDNA) DNA ligase DNA plasmid Eco RI Eco RI DnA tái tổ hợp Hỡnh 2-5: Dựng cỏc on ni linker to DNA tỏi t hp 3,- To vector tỏi t hp: to vector tỏi t hp, ngi ta ghộp phõn t DNA lai u lch vo plasmid m cng c ct bi cựng mt enzyme EcoRI Nh tỏc dng ca enzyme DNA ligase m vector tỏi t hp c to thnh (Hỡnh 6-5) 2.3.3- Phng phỏp s dng enzyme terminal transferase (ETT) Nguyờn tc: Da vo c tớnh ca enzyme terminal transferase cú kh nng gn cựng mt loi nucleotide vo u 3(OH) ca phõn t DNA Cỏch to DNA tỏi t hp bng phng phỏp ny c tin hnh theo bc sau (Hỡnh 6-6): 1,- Bc 1: Chn v phõn lp DNA l u bng v plasmid, gi s ta phõn lp plasmid cú cha chui ớch c nhn bit bi enzyme BamHI (G/GATCC) Ct plasmid bng enzyme BamHI to plasmid h cú hai u dớnh Ct DNA l bng enzyme exonuclease theo hng to DNA cú hai u lch 2,- Bc 2: DNA l vi cựng mt loi nucleotide dCTP vi s cú mt ca enzyme terminal transferase to uụi polyC u 3(OH) ca DNA l plasmid vi cựng mt loi nucleotide dGTP vi s cú mt ca enzyme terminal transferase to uụi polyG u 3(OH) ca plasmid h 3,- Bc 3: a DNA l vo plasmid vi s cú mt ca enzyme DNA ligase, cỏc u mỳt ca homopolymer cú trỡnh t b sung ( -GGGG 3/3CCCC -) s bt cp vi 4,- Bc 4: B sung enzyme DNA-polymerase I gn cỏc nucleotide tng ng vo ch trng theo nguyờn tc b sung Enzyme ligase ni liờn kt phosphodiester v cui cựng to c plasmid tỏi t hp cú hai chui ớch c nhn bit bi enzyme BamHI u im ca phng phỏp l ghộp DNA l u bng vo plasmid to DNA tỏi t hp v ch tỏc c DNA u lch t DNA u bng 5 GGA T C C C C T A GG Plasmid chứa chuỗi đích BamHI Cắt DNA E exonuclease 3 Cắt E BamHI 5 PolyC ETT (3) GA T C C G G C C T A G (3) PolyG ETT CCC CCC (3) GGGGGA T C C G C C T A GGGGG (3) G GGGGGA T C C CCC G CCC G C C T A GGGGG BamHI BamHI GGGG G A T C C C C C C C T A GG GGA T C C C C C C C T A G G GGG DNA tái tổ hợp Linker Linker DNA lạ Hỡnh 2-6: Cỏch to DNA tỏi t hp dựng enzyme terminal transferase 2.4- Mt s phng phỏp a DNA tỏi t hp vo t bo ch 2.4.1- Húa bin np Hin tng bin np l chỡa khúa giỳp ta hiu bit c s phõn t ca gen, cng l cụng c thc hin cỏc thao tỏc to tớnh di truyn ca vt sng Theo Mandel v Higa cho thy rng, E Coli tr nờn rt d b bin np bi DNA ngoi lai cỏc t bo vi khun c x lớ mụi trng cú CaCl2 v trc ú c sc nhit 42C Húa bin np l phng phỏp s dng cht húa hc, to iu kin a vector tỏi t hp vo t bo ch Quỏ trỡnh c thc hin theo hai buc sau: X lớ t bo ch dung dch CaCl2 nhit thp nhm thay i mng t bo v vector tỏi t hp vi t bo ch ó x lớ Hiu sut ca phng phỏp húa bin np ny vo khong 105 n 106 t bo bin np trờn 1mg DNA tỏi t hp Qua cỏc kt qu thc nghim, ngi ta thy rng, cỏc t bo phỏt trin pha sm n pha gia d c bin np hn Nhng nghiờn cu sau ny cho thy vic x lớ t bo bng cỏc ion kim loi húa tr hai nh Mg+2, Mn+2 v Ba+2 cng cho kh nng bin np ln Ngoi ra, hiu sut bin np cũn ph thuc vo kớch thc ca plasmid, plasmid cng nh thỡ hiu sut bin np cng cao 2.4.2- in bin np Nguyờn tc: S dng dũng in cao th cc b theo xung to l nh trờn mng sinh hc ca t bo, to iu kin cho t bo hp th DNA tỏi t hp c d dng Hiu sut: T 109 n 1010 t bo bin np cho 1mg DNA tỏi t hp, nhiờn, lng t bo bin np b cht nhiu cú lờn ti 70% Hiu sut ca phng phỏp ny ph thuc vo cỏc yu t sau: - mnh ca in trng tỏc ng khỏc i vi cỏc loi t bo khỏc nhau, - di ca hng s thi gian (thi gian ngt xung - ms) Theo nhiu nghiờn cu, hu ht i vi cỏc loi t bo sinh vt, hiu qu bin np cao hng s thi gian t c khong 6ms, - Nng t bo ch, - Nng DNA tỏi t hp, - Giai on phỏt trin ca t bo (t bo quỏ gi hoc quỏ non u khụng thớch hp), - Mụi trng dung dch m, - Cu trỳc mng t bo 2.4.3- Bin np t bo trn (p rotoplast) L phng phỏp chuyn DNA tỏi t hp vo t bo ch ó c x lớ bng polyetylen glycol (PEG) to t bo trn, ngi ta t bo vi PEG nng 30% n 40% õy l phng phỏp chuyn gen cú hiu qu cao i vi t bo thc vt Bng phng phỏp ny, ngi ta ó nhn c cỏc cõy mang gen bin np n nh v di truyn qua nhiu th h (Potrykus v cng s - 1995) u im: Tn s bin np ng thi gen ch th v gen cn bin np cao Cú th chuyn gen vo t bo protoplast ca bt k loi cõy no c bit l loi cõy cú giỏ tr kinh t cao nh lỳa, ngụ, i mch Nhc im: Vic tỏi sinh cõy protoplast cũn rt khú khn mt s loi cõy 2.4.4- Phng phỏp bn gen Nguyờn tc: Ngi ta s dng ht kim loi nng c bao bc DNA v bn trc tip vo t bo u im: Phng phỏp ny cú th bin np cho tt c cỏc loi t bo thc vt Thao tỏc d dng, bn mt ln c nhiu t bo Nhc im: Hiu sut bin np thp, thng xuyờn nhn c cõy bin np khm (cõy cú t bo bin np v t bo khụng bin np) Mt s thnh tu ó t c bng phng phỏp bn gen: Nm 1988, Mc Cabe v cng s ó nhn c cõy u tng bin np u tiờn bng phng phỏp bn gen Nm 1990, Promm, Gordon, Kamm v cng s ó nhn c cõy ngụ bin np nhiu phũng thớ nghim Nhng nm gn õy cú hng lot cụng b v bin np thnh cụng lỳa Nm 1996, Zthang v cng s ó bin np u , mớa v bụng iu ú ó khng nh tớnh u vit ca phng phỏp ny 2.4.5- Phng phỏp vi tiờm Phng phỏp vi tiờm l phng phỏp s dng vi kim v kớnh hin vi a DNA tỏi t hp vo mi t bo nht nh õy l quỏ trỡnh lai ghộp cho t bo bc cao hoc t bo hp t Tựy thuc tng trng hp c th, ngi ta cú th chn phng phỏp cho vic a DNA tỏi t hp vo t bo cú hiu qu cao u im: Cú th ti u lng DNA tỏi t hp a vo t bo v quyt nh a DNA vo loi t bo no a chớnh xỏc v thm vo tn nhõn ca t bo v cú th quan sỏt c Cỏc t bo cú cu trỳc nh nh ht phn, t bo tin phụi cng cú th tin hnh mt cỏch chớnh xỏc Cú th bin np cho mi ging cõy Nhc im: Mt phỏt tiờm ch c mt t bo v thao tỏc cn phi khộo lộo v t m 2.4.6- Ti np Ti np l hin tng chuyn vt liu di truyn qua vector l virus t vi khun cho sang vi khun nhn, ú cú quỏ trỡnh chuyn gen v tỏi t hp gen vi khun nh thc khun th (Bacteriophage) Thc nghim ó chng minh c ti np E Coli qua phage , phage P1 v Bacillus subtilis qua phage SP10 So vi cỏc phng phỏp trờn, ti np cho hiu sut cao hn Nh vy, n ó cú nhiu phng phỏp húa hc, húa lý, c hc v sinh hc a DNA tỏi t hp vo t bo ch Tựy cỏc i tng v yờu cu c th, phng phỏp ny hay phng phỏp khỏc cú hiu qu v c s dng nhiu hn 2.5- K thut tỏch dũng (to dũng) K thut tỏch dũng bao gm vic phi ci mt mnh (chui) DNA l vo mt vector (plasmide hoc phage ) bng phng phỏp húa sinh Sau ú, a phõn t lai ny vo t bo ch ó chn la bng phng phỏp bin np hoc ti np Trng hp mun to dũng tng hp enzyme thỡ mnh DNA nh ci phi mó húa cho gen cu trỳc ca mt enzyme no ú 2.5.1- Mc ớch ca s tỏch dũng - Thit lp ngõn hng b gen, - Thit lp ngõn hng cDNA, - Sn xut protein, enzyme, - Sn xut vaccine, - Sn xut khỏng sinh 2.5.2- Cỏc bc c bn ca phng phỏp tỏch dũng Quỏ trỡnh thc hin cú th thay i ph thuc vo nhõn t tham gia v mc ớch ca quỏ trỡnh tỏch dũng Tuy nhiờn to dũng, cn phi thc hin cỏc bc sau: 2.5.2.1- Tỏch lp cỏc DNA l cn to dũng Chn v ct DNA l ca t bo cho bng mt enzyme ct hn ch (RE) Phõn lp on DNA (gen quớ) phự hp vi vector v mc ớch cn to dũng Trong trng hp c bit, to dũng mt gen cha bit, ngi nghiờn cu cú th tng hp húa hc on DNA cn to dũng d oỏn cu trỳc protein gen ch huy tng hp hoc tng hp cDNA t mRNA To u dớnh cn thit 2.5.2.2- Chn v x lớ vector Chn vector cn phi chỳ ý nhng yờu cu sau: ln ca gen l (on ci), loi t bo ch tip nhn vector v phng phỏp ng dng X lớ vector: ct vector bng enzyme ct hn ch cựng loi vi enzyme ó ct DNA núi trờn ( to nhng vt ct ging nhau, thun tin cho vic ni ghộp sau ny) Kh nhúm phosphat bng enzyme alkanline phosphotase trỏnh hai u vector úng kớn tr li 2.5.2.3- To DNA tỏi t hp (Vector tỏi t hp) Vic to DNA tỏi t hp bng cỏch ghộp DNA l vo vector ó c ct cựng mt enzyme ct hn ch loi II, ú, chỳng s ghộp ụi nhng u dớnh li vi nh bt cp b sung Mt phn ng ghộp ni xy vi s cú mt ca enzyme DNA ligase ca E Coli hoc phage T4 hon chnh phõn t lai 2.5.2.4- Chuyn DNA tỏi t hp vo t bo ch bng phng phỏp bin np hoc ti np Cụng on ny nhm mc ớch s dng b mỏy ca t bo ch chộp vector tỏi t hp thnh mt s lng ln bn Vic chuyn DNA tỏi t hp vo t bo vi khun tc l lm cho vi khun tr thnh kh bin, ngha l cú kh nng thm vector tỏi t hp S thm ny cú th xy mt cỏch t nhiờn hoc c cm ng Tuy nhiờn, nú s ph thuc vo loi plasmid s dng lm vector v ph thuc vo s nh v ca vựng ci lp cha bờn vector m ngi nghiờn cu s chn phng phỏp bin np hoc ti np Bin np l hin tng chuyn vt cht di truyn trc tip t t bo th cho D (Doner) sang t bo th nhn R (Reception), khụng cn s tip xỳc gia hai t bo hoc nhõn t trung gian l phage hoc virus Bin np c thc hin vi vector chuyn gen l plasmid Cú nhiu phng phỏp bin np nh húa bin np, in bin np, bin np t bo trn, phng phỏp bn gen v phng phỏp vi tiờm Ti np l hin tng chuyn vt cht di truyn trc tip t t bo th cho D (Doner) sang t bo th nhn R (Reception) qua nhõn t trung gian l virus Ti np c thc hin vi vector chuyn gen cú ngun gc l virus nh phage, cosmid, 2.5.2.5- Phỏt hin dũng cn tỡm Cụng vic tip theo l kim tra s hin din ca gen mong mun Vic chn la nhng chng nh ý mun l khụng n gin, vỡ cỏch tin hnh thớ nghim mt hn hp khụng ng nht nờn cỏc dũng vi khun cú th mc lờn theo ba kh nng: - T bo vi khun khụng nhn plasmid tỏi t hp, - T bo nhn plasmid nhng khụng cú gen l, - T bo vi khun nhn c plasmid tỏi t hp Tựy thuc vo mc ớch nghiờn cu m ngi ta cú cỏc phng phỏp khỏc xỏc nh dũng cn tỡm Nu mc ớch l nghiờn cu on gen cha bit, ngi ta thng dựng u dũ Nu on DNA ó bit (cDNA), cụng vic s n gin v nhanh chúng 2.5.2.6- Kim tra v thu nhn sn phm ca gen tỏi t hp Tựy tng trng hp c th m ngi nghiờn cu a nhng phng phỏp kim tra thu hi sn phm ca gen tỏi t hp Nu l mc ớch thit lp ngõn hng cDNA, ta phi tin hnh cỏc bc sau: u tiờn ngi ta phi tỏch plasmid tỏi t hp dch nuụi cy, sau ú, ct plasmid tỏi t hp bng enzyme RE loi II v thu c hai bng DNA, mt cú di bng khung vector, cũn bng khỏc cú di tng ng ỳng bng cDNA Cỏch kim tra li cDNA ó c ct bng cỏch in di trờn gel agaroza 0,8% v kim tra li di ca nhng bng cDNA thu c Nhng on cú kớch thc khỏc s di chuyn nhng khong cỏch khỏc trờn gel Nu sn phm ca gen tỏi t hp l protein, enzyme, hormone, vaccine, khỏng sinh, ngi ta cú th thu nhn sn phm bng phng phỏp chit tỏch lng lc ly tõm kt ta phõn on hoc trao i ion 2.6- Mt s phng phỏp xỏc nh dũng cn tỡm 2.6.1- Phng phỏp lai axit nucleic 1,- Khỏi nim u dũ: Cỏc u dũ l nhng mnh DNA c ỏnh du, cú kh nng nhn bit mt chui DNA hoc RNA ng ng qua lai húa 2,- c im ca u dũ: L mt on axit nucleic (DNA hoc RNA) si n u dũ phi b sung cỏc baz nit, i song song vi on axit nucleic cn nhn bit u dũ phi so mc c, ú l cỏc u ỏnh du phúng x 3,- Cỏc loi u dũ: cDNA lm u dũ cc tt, ngoi ra, mRNA v oligonucleotide cng cú th lm u dũ Nu chui DNA cha bit trỡnh t, ngi ta phi tinh sch mt lng nh protein tng ng vi DNA ó nghiờn cu v t ú tng hp u dũ Cũn nu mt phn DNA phi so mc ó bit thỡ cụng vic rt d dng tng hp mt u dũ 4,- Nguyờn tc ca phng phỏp lai axit nucleic: Da vo kh nng bin tớnh nhit tng v hi tớnh h nhit t t ca DNA Khi tng nhit ca DNA lờn quỏ nhit sinh lý (thng khong 80 n 95C), hai si n DNA s tỏch ri liờn kt hydro b t Khi h nhit t t ca DNA ó bin tớnh cựng vi cỏc iu kin thớch hp khỏc, cỏc mch n bt cp tr li S bt cp ch cú th xy hai trỡnh t DNA hon ton b sung cho Tớnh c hiu cc ln ca phn ng lai ny cho phộp bt k trỡnh t mch n no cng tỡm gp mch b sung vi nú, mc dự chỳng nm hng triu cỏc trỡnh t DNA v RNA khỏc Cú th dựng ng v phúng x ỏnh du phỏt hin on lai 5,- Cỏch tin hnh: Chun b mu (u) dũ ó c ỏnh du bng ng v phúng x hoc húa cht Bin tớnh dũng cn tỡm di dng mt si, sau ú h nhit t t, cỏc si n tng ng bt cp vi S bt cp xy gia DNA v DNA, RNA v DNA, RNA v RNA 2.6.2- Phng phỏp s dng khỏng th 1,- Nguyờn tc: Da vo phn ng c trng ca mt s protein v khỏng th m chỳng ta cú th nhn bit c qua phn ng c trng ú nh phn ng to mu, phn ng kt ta 2,- Cỏch tin hnh: Chn khỏng th c trng cho protein (thuc th cho protein) Tỏch protein c biu hin quỏ trỡnh to dũng protein vi khỏng th c trng Sau ú tin hnh nhn bit thụng qua cỏc du hiu ca phn ng c trng gia protein v khỏng th 3,- ng dng: Ch yu s dng y hc vi hai yờu cu sau: DNA cn nghiờn cu c gn vo vector phi biu hin protein to dũng v ng thi, vector to dũng phi l vector biu hin (vớ d nh vector gt11) Protein biu hin cn phi cú khỏng th c trng 2.6.3- Phng phỏp phỏt hin mt hot tớnh vỡ xen on Nguyờn tc: Da vo s mt kh nng khỏng thuc ca vi khun mang vector tỏi t hp chỳng c nuụi cy mụi trng khỏng sinh Phm vi s dng: Phng phỏp ny dựng cho vector cú t hai gen khỏng thuc tr lờn, vớ d nh vector pBR322 Trong plasmid pBR322 cú hai gen khỏng thuc AmPR v TetR Trờn cỏc gen ny cú nhng im nhn bit ca cỏc RE ni ci t DNA l Khi gn DNA l vo mt hai gen núi trờn thỡ gen nhn on ci mt kh nng khỏng thuc Quan sỏt nhng khun lc b mt gen khỏng thuc, chng t nhng khun lc ú cú cha gen cn to dũng u im ca phng phỏp l ớt tn kộm so vi phng phỏp lai 2.6.4- Phng phỏp phỏt hin thay i kiu hỡnh 1,- Nguyờn tc: Da vo s thay i mu sc ca khun lc, chng t rng, khun lc ú cú cha gen l 2,- Cỏch tin hnh: Chun b hai mu th nghim m plasmid to dũng cú cha gen lacZ (vớ d nh dóy pUC), mt mu so sỏnh cũn mu ci DNA l vo gen lacZ Sau ú, nuụi cy c hai mu mụi trng cú cht cm ng X-Gal (5 brom4chloro-3indolyl D-galactopynoside) Cht cm ng ny b phõn hy bi enzyme -galactosidase to galactose v X (dn xut indol), ngoi mụi trng, dn xut ny b oxy húa cho mu xanh m Qua quan sỏt, ta thy plasmid khụng cha gen l cho khun lc mu xanh gen lacZ tng hp enzyme -galactosidase Cũn plasmid th cho khun lc mu trng, iu ú chng t nú cha DNA l c ci gen lacZ v chn nhng khun lc mu trng 2.7- Ngõn hng gen (Genomic library) Ngõn hng b gen ca mt sinh vt l hp cỏc trỡnh t DNA cu thnh b gen c gn vo vector, nú ch biu din tng s ca gen Ngõn hng ny c to t mt b su DNA tỏi t hp c cỏc chui mó húa ln cỏc chui khụng mó húa Khỏc vi ngõn hng cDNA, ngõn hng b gen cú th c thit lp bt k loi t bo no ca sinh vt nghiờn cu Cỏc bc thit lp ngõn hng gen: - Tỏch v lm sch DNA ca sinh vt, - Ct DNA thnh nhng on cú kớch thc xỏc nh bng enzyme RE loi II thụng thng, ngi ta s dng EcoRI, - Vector c chn to dũng gen thng l cosmid hoc phage cng c x lý bi EcoRI, - To vector tỏi t hp v úng gúi v phage, - a vector tỏi t hp vo t bo ch v to dũng, - Xỏc nh c tớnh v biu hin ca dũng vi khun va lp, - Tin hnh sng lc, ngha l phi tỏch nhng vector no cú on DNA a chung, t ú xõy dng ngõn hng b gen c im v ng dng: - Ngõn hng gen cha cỏc on DNA ln hn 100 ln so vi cDNA - Gii mó thụng tin di truyn cha b gen, c bit l cu trỳc intron v exon ca mt gen xỏc nh - To dũng nhng trỡnh t DNA khụng mó húa nm cnh cỏc gen mó húa v úng vai trũ quyt nh s iu hũa biu hin ca gen 2.8- Ngõn hng cDNA 2.8.1- Thit k ngõn hng cDNA Ngõn hng cDNA l hp cỏc bn cDNA t tt c cỏc mDNA ca mt t bo Nh vy, ngõn hng c thit lp t mt loi t bo xỏc nh (t bo bit húa), vỡ th, cDNA mang tớnh t bo rt cao Quỏ trỡnh chun b ngõn hng cDNA bao gm cỏc bc sau õy: - Chit tỏch RNA tng s, ta phi chn nhng t bo cú cha nhiu mRNA cn thit v sau ú, lm sch mRNA, - Chn la cỏc mRNA cha nhiu A (polyA) bng cỏch tỏch trờn ct xenlulose oligo dT, - Tng hp cDNA si kộp u bng t mRNA di tỏc dng ca enzyme chộp ngc nh k thut nuclease S1 hoc k thut Gubler-Hoffman, - Metyl húa cỏc vựng hn ch (cú on cDNA si ụi) c nhn bit bi enzyme EcoRI bo v vựng ny khụng b ct thao tỏc vi EcoRI, - To u dớnh bng cỏch s dng on ni linker cú cha trỡnh t nhn bit bi EcoRI, sau ú, ct bng enzyme EcoRI Trong trng hp ny, ch cú on ni b ct cũn cDNA cũn nguyờn (do c metyl húa) a cDNA vo vector to DNA tỏi t hp, - Ghộp cDNA u dớnh vo vector thớch hp ó c m EcoRI v ó kh nhúm phosphat, - Hn kớn mch nh enzyme phosphoryl húa v enzyme ligase to vector tỏi t hp, - a vector tỏi t hp vo t bo ch v nuụi cy cỏc iu kin thớch hp to dũng, - Xỏc nh dũng cn tỡm v thnh lp ngõn hng cDNA Mc ớch ca vic thit lp ngõn hng cDNA l nhm nghiờn cu s biu hin ca mt gen xỏc nh cựng vi nhng liờn quan n s iu hũa biu hin gen cng nh mi tng tỏc gia cỏc gen mt quỏ trỡnh sng Chỳ ý: Khi phõn tớch kt qu thu c ngõn hng cDNA, cn chỳ ý tỏc dng sinh lớ tng thi im thớ nghim 2.8.2- Sng lc ngõn hng cDNA Mt phng phỏp ph bin nhm sng lc ngõn hng cDNA c bt u t vic to canh trng nuụi cy cha ng nhiu khun lc t ngõn hng cDNA DNA plasmid t mi m cy vi khun gn vi mnh nh nitro-xenlulose (mng lai) s b bin tớnh v lai vi mRNA tng s Mi mRNA khỏc s c lai trờn nitroxelulose vi th t cDNA b sung ca nú Cỏc mRNA bỏm vo mng lc c tỏch v dựng tng hp protein m nú mó húa bng h thng dch mó invitro Protein hỡnh thnh c em phõn tớch xem cú phi l sn phm ca mRNA cn tỡm hay khụng, v t ú, xỏc nh vi sinh vt nuụi cy cha gen mong mun Sng lc tt c cỏc m nuụi cy theo cỏch trờn xỏc nh dũng n th hin gen tỡm kim CHNG I: KHI NIM C BN V CễNG NGH SINH HC (5 tit) 1.1 Khỏi nim c bn v cụng ngh sinh hc 1.2 Cỏc lnh vc nghiờn cu ca cụng ngh sinh hc 1.3 Lc s phỏt trin ca cụng ngh sinh hc 1.4 V trớ ca cụng ngh gen cụng ngh sinh hc 1.5 Khỏi nin v t bo gc 1.6 Thc phm chuyn gen 1.7 Mt s khớa cnh v kinh t, khoa hc ca cụng ngh sinh hc hin i 1.8 Cỏc phỏp lý ca cụng ngh sinh hc hin i CHNG 2: CễNG NGH DNA TI T HP 2.1- Khỏi nim DNA tỏi t hp 2.2- Cỏc cụng on chớnh to DNA tỏi t hp 2.3- Cỏc phng phỏp to DNA tỏi t hp 2.4- Mt s phng phỏp a DNA tỏi t hp vo t bo ch 2.5- K thut tỏch dũng (to dũng) 2.6- Mt s phng phỏp xỏc nh dũng cn tỡm 2.7- Ngõn hng gen (Genomic library) 2.8- Ngõn hng cDNA