Tách chiết dầu từ cám gạo bằng phương pháp enzyme

TÓM TẮT LUẬN VĂNTrong luận văn nghiên cứu này, dầu được chiết tách ra khỏi cám gạo bởi các hệ enzyme cùng với sự hỗ trợ của các phương pháp khác.. Quá trình này nhằm thaythế việc sử dụng

LỜI CẢM ƠN

Sau 5 năm học tập và thực hành tại trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng em đã tíchlũy được rất nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý giá và đặc biệt là giúp em hoàn thiện nhâncách sống tốt Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến sự giúp đỡ của tất cả các thầy cô đã

và đang công tác tại trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, các thầy cô trong khoa Hóa, đặcbiệt là thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tích cực, nhiệt tình giúp đỡ, dạy dỗ

em trong suốt thời gian ngồi trên ghế giảng đường

Trong suốt thời gian nghiên cứu và làm đề tài tốt nghiệp em xin chân thành cảm ơnthầy giáo TS.Đặng Đức Long, TS Lê Lý Thùy Trâm đã hướng dẫn tận tình giúp em cóđược cách làm việc khoa học, khuyên bảo, an ủi những lúc em gặp khó khăn nhất để giúp

em hoàn thành tốt đề tài của mình Em đã tiếp thu thêm nhiều kiến thức bổ ích và kinhnghiệm thực hành trong quá trình rèn luyện, tìm hiểu nghiên cứu; giúp em có thể tiến tớiước mơ được làm nghiên cứu sau này

Em cũng xin cảm ơn chân thành tới các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm bộ mônCông Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng là thầy Võ Công Tuấn và côPhạm Thị Kim Thảođã tạo điều kiện thuận lợi nhất, cố gắng về muộn hơn để giúp emhoàn thành thí nghiệm

Con xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ba mẹ và tất cả anh chị em trong gia đình đãluôn luôn động viên an ủi, là nguồn động lưc giúp con vượt qua khó khăn trong quá trìnhhọc tập để hoàn thành tốt công việc được giao Đồng thời mình cũng xin cảm ơn tất cả cácbạn thành viên trong lớp 10SH nói chung, những người bạn thân và các bạn làm đề tài ởphòng thí nghiệm nói riêng đã luôn ở bên cạnh mình những lúc khó khăn nhất, nhiệt tìnhgiúp đỡ trong suốt thời gian học tập và làm thí nghiệm

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Cán bộ phản biện và các thầy côtrong Hội đồng bảo vệ đã dành thời gian để xem xét đánh giá và góp ý cho đồ án của em.Chắc hẳn trong đồ án còn rất nhiều thiếu sót em mong thầy cô và các bạn thông cảm

Đà Nẵng, ngày 01 tháng 06 năm 2015

Võ Trần Khánh Huyền

MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong luận văn nghiên cứu này, dầu được chiết tách ra khỏi cám gạo bởi các

hệ enzyme cùng với sự hỗ trợ của các phương pháp khác Quá trình này nhằm thaythế việc sử dụng dung môi hữu cơ n-hexan gây độc hại cho con người và ô nhiễmmôi trường để chiết tách dầu cám gạo trong các công nghệ sản xuất hiện nay Hệenzyme được sử dụng là enzyme Cellulsase, vàenzyme Alcalase® và enzymeDextrozyme Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tốt nhất để xử lý enzyme đạthiệu suất cao là nhiệt độ 55oC; pH của dịch cám gạo là 7; tỷ lệ từng enzyme trêndịch cám gạo là 3%theo thể tích; xử lý lắc trong vòng 14 giờ Bên cạnh đó, kết hợpvới xử lý nhiệt dịch cám gạo ở 90oC trong vòng 15 phút và xử lý siêu âm phá mẫu ở

60oC, công suất 120W trong vòng 15 phút trước khi xử lý enzyme nhằm tăng hiệusuất quá trình tách chiết Hiệu suất quá trình đạt được là 45,7%

ABSTRACT

In this research, oil extracted from rice bran by an enzyme system with thehelp of other physical methods This process aims to replace organic solvent, n-hexane, a toxic chemical tohuman and environment to extract rice bran oil in thecurrent production technology A mixture of three enzymes: Cellulsase,Dextrozyme, and ALCALASE®, was used The study showed that the bestconditionfor the enzyme reaction is at 55°C,pH of 7, and the proportion of eachenzyme 3% vol of the rice bran broth; with 14 hours of reaction Furthermore, ricebran was treated in a combination of a hydrothermal process at 90oC for 15 minutesand an ultrasound process at 60°C, 120W power for 15 minutes before the enzymetreatment resulted in an increase of enzyme extraction process The extractionefficiency so far was 45.7%

LỜI MỞ ĐẦU

Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát Việt Nam làmột đất nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ hai trên thế giới nên nguồn nguyên liệucám gạo ở nước ta rất dồi dào Thế nhưng, lượng cám gạo xuất ra này chủ yếu đượcdùng làm thức ăn chăn nuôi gia súc và gia cầm Ngoài ra, cám gạo có thể ứng dụng

để chiết tách hàm lượng dầu cao có trong cám dùng làm dầu thực phẩm hằngngày.Dầu cám gạo chứa một lượng lớn các hợp chất dinh dưỡng có ích lợi tốt nhấtcho sức khỏe như Gamma-oryzanol, Vitamin E và những hợp chất có lợi khác nhưphytosterols

Hiện nay, ở nước ta đã có một số nhà máy sản xuất dầu cám gạo để tiêu thụtrong nước và xuất khẩu Tuy nhiên, phương pháp chiết tách dầu cám gạo sử dụngtrong công nghiệp, trong các cơ sở sản xuất chủ yếu dùng dung môi hữu cơ như n-hexan, ether dầu hỏa để trích ly Các dung môi này rất dễ bay hơi, dễ gây cháy nổ,ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người và ô nhiễm môi trường Do đó, công nghệchiết tách dầu từ cám gạo sao cho có hiệu quả cao và thu được lượng tối đa đã trởthành “điểm nóng” nghiên cứu trong ngành công nghiệp dầu, chất béo

Với những ý nghĩa quan trọng của dầu cám gạo, nắm bắt xu hướng thế giới

và có tầm quan trọng trong nghiên cứu khoa học, kinh tế to lớn, chúng tôi quyết

định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quá trình tách chiết dầu từ cám gạo bằng phương pháp enzyme”tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học,

Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng Mục tiêu của đề tàinghiên cứu:

- Khảo sát và tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý cám gạo bằngenzyme.Xử lý cám gạo để thu hồi được dầu cám với chất lượng tốt

- Kết hợp phương pháp enzyme với các phương pháp xử lý khác nhằm tăng hiệu suất tách chiết dầu cao nhất.Nghiên cứu phương pháp tách pha để thu hồi được lượng dầu tinh sạch

Tôi hy vọng đề tài này sẽ được ứng dụng trong công nghệ sản xuất, góp phầnlàm xanh, sạch, đẹp môi trường của chúng ta và thu được nguồn kinh tế to lớn từ ứng dụng dinh dưỡng cao cho sức khỏe con người

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cám gạo

1.1.1 Đặc điểm của cám gạo:

Trong quy trình xay xát và chế biến gạo, sau khi thu được sản phẩm chính làgạo thì còn một sản phẩm phụ có giá trị sử dụng khá cao và giá thành sản phẩmthấp, đó chính là cám gạo

Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát và thường chiếmkhoảng 10 - 12% trọng lượng lúa Cám gạo được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ vàmầm phôi của hạt, cũng như một phần từ tấm Cám gạo có màu sáng và mùi thơmđặc trưng, thường có dạng bột mịn và mềm [34]

Hình 1.1: Cấu tạo hạt gạo Hình 1.2: Cám gạo sau xay xát.

Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến động rất lớn, phụthuộc nhiều vào kĩ thuật xay xát gạo Tỷ lệ vỏ trấu sau khi xay xát ảnh hưởng nhiềutới hàm lượng protein, chất béo và xơ của cám gạo thành phẩm Theo báo cáo củaGene và cộng sự vào năm 2002 qua phân tích nhiều mẫu cám gạo thu thập được từcác nước Đông Nam Á cho thấy thành phần dinh dưỡng của chúng rất biến động.Lượng protein trong cám gạo có thể đạt 12-14% Hàm lượng chất béo nằm trongkhoảng 15-20% và hàm lượng chất xơ là 7-8% Trong cám gạo, thành phần chiếmnhiều nhất là glucid khoảng 40-42% Ngoài ra, cám gạo còn có nhiều chất khoáng

và nguyên tố vi lượng, vitamin E, B1, B2, B6, [38]

1.1.2 Công dụng của cám gạo:

Nước ta là một nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ hai trên thế giới nênnguồn nguyên liệu cám gạo rất dồi dào Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn, sản lượng gạo của Việt Nam năm 2014 đạt khoảng 28,125 triệutấn.Và riêng khu vực Đồng bằng sông Cửu Long có thể cung cấp 800.000 tấn cámgạo/năm từ 16 triệu tấn gạo [35]

Mặc dù là nước có sản lượng gạo xay xát chà bóng rất lớn, nhưng lượng cámgạo này hiện Việt Nam mới tận dụng để làm thức ăn chăn nuôi gia súc, thủy sản.Cám gạo đóng vai trò là chất dinh dưỡng chính cho cá, heo, gà, ; nó cung cấp mộtlượng lớn vitamin, khoáng, chất béo và protein

Ngoài ra, ở các nước khác trên thế giới đã tận dụng được giá trị dinh dưỡngcủa cám để sử dụng vào các lĩnh vực khác như:

- Cám chứa nhiều chất oxy hóa có lợi cho sức khỏe con người nên có tác dụngrất tốt trong việc làm đẹp da, dưỡng da trắng sáng

- Cám có chứa nhiều loại vitamin và chất béo chưa bão hòa rất tốt cho sứckhỏe Do đó, các nước phát triển đã trích ly dầu từ cám gạo và từ đó, có rấtnhiều ứng dụng khác [33]

1.2 Dầu cám gạo:

1.2.1 Đặc điểm dầu cám gạo:

Dầu cám gạo là dầu béo được chiết

tách từ cám gạo trong hạt lúa.Dầu cám gạo

có đặc điểm là có điểm bốc khói rất cao

(2540C), hương vị nhẹ, màu vàng sáng,

thích hợp cho các ứng dụng liên quan đến

nhiệt độ cao như chiên, xào, nấu [35] Loại

dầu này được sử dụng làm dầu ăn phổ biến

ở Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái

Lan,

Hình 1.3: Dầu cám gạo.

1.2.2 Thành phần và ứng dụng dầu cám gạo

Hiện nay, cám gạo không phải là nguồn chính tạo ra dầu thực phẩm mà còn

có thể chiết tách từ các nguồn khác như bắp, hạt hướng dương, đậu nành, bí đỏ, Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu hiện nay đã chứng minh rằng dầu cám gạo có thểthay thế các chất béo bão hòa trong chế độ ăn hằng ngày bởi các thành phần củachất béo không bão hòa [15] Dầu cám gạo có chứa 47% acid béo không bão hòađơn, 33% acid béo không bão hòa đa và 20% acid béo bão hòa[36]

Bảng 1.1 Đặc điểm và thành phần axit béo trong dầu cám gạo

Loại dầu

Điểm bốc khói

Axit béo không bão hòa đơn

Axit béo không bão hòa đa Axit béo bão hòa Dầu cám

Bảng 1.2 Giá trị dinh dưỡng trong dầu cám gạo

Loại dầu

VITAMIN E TOCOPHEROL

(ppm)

VITAMIN E TOCOTRIENOL

vitamin E, omega 3, 6, 9, dầu gạo có khả năng thúc đẩy tuần hoàn máu, bảo vệ vữngchắc sức khỏe tim mạch Nghiên cứu được công bố trên tạp chí Dinh dưỡng của Mỹnăm 2005 đã cho thấy lượng cholesterol đã giảm xuống trung bình 7% sau chế độ

ăn có sử dụng dầu gạo Giảm lượng cholesterol đồng nghĩa với ngăn ngừa và làmgiảm nguy cơ bị đột quỵ cũng như các bệnh về tim

Bên cạnh đó, dầu gạo có nhiệt độ bốc khói cao (khoảng 254oC) nên có khảnăng hạn chế hiện tượng cháy khét, giúp lưu giữ hương vị thơm ngon của món ăntrong tất cả hình thức chế biến như chiên, xào, trộn salad hay làm bánh Do vậy, tạicác quốc gia tiên tiến như Úc, Nhật, New Zealand, Hàn Quốc dầu gạo rất được tindùng khi đáp ứng được những yêu cầu khắt khe về một chế độ dinh dưỡng cânbằng Cụ thể, ở Nhật, dầu gạo được xem là “dầu ăn của trái tim” hay tại châu Âu và

Mỹ, dầu gạo được nhìn nhận như một biểu tượng tốt cho sức khỏe

Dựa trên những nghiên cứu khoa học gần đây cho thấy, nhờ dưỡng chấtgamma oryzanol (hiệu quả gấp 4 lần vitamin E), dầu gạo có khả năng đẩy lùi cácgốc tự do - nguyên nhân gây lão hóa da Bên cạnh đó, gamma oryzanol còn hiệuquả trong việc chống lại tia UVA (nguyên nhân khiến da bị lão hóa sớm) và tiaUVB, giúp giảm nguy cơ da bị cháy nắng, sạm nám, hoặc ung thư da

Hình 1.4: Gamma-Oryzanol chiết từ dầu cám gạo.

Cùng với vitamin E, gamma oryzanol hiệu quả trong việc ngăn chặn quátrình lão hóa diễn ra sớm trước tuổi 30, đặc biệt đối với những người sống ở khuvực thành thị bị tác động thường xuyên bởi môi trường ô nhiễm, tình trạng căngthẳng, chế độ ăn uống và nghỉ ngơi không điều độ Do đó, dầu gạo đang được phụ

nữ trên toàn thế giới tin dùng như một liệu pháp thiên nhiên cho sắc đẹp hữu hiệu

để dưỡng da mặt, dưỡng da toàn thân, chống nám, phục hồi da hư tổn, dưỡng ẩm,dưỡng tóc… [36].

1.2.3 Tình hình sản xuất dầu cám gạo:

1.2.3.1 Tình hình sản xuất trong nước:

Năm 2004, nhà máy trích ly dầu cám gạovới công nghệ cao lần đầu tiên xuấthiện ở Việt Nam Đó là nhà máy Cái Lân có công suất 400 tấn cám gạo/ngày, sẽcho ra 2 sản phẩm gồm: dầu cám có giá trị dinh dưỡng cao, nhưng chủ yếu xuấtkhẩu sang thị trường Nhật Bản, và cám gạo đã được trích ly có hàm lượng đạm caocung cấp chế biến thức ăn cho gia súc [33]

Hiện nay, ở nước ta đã có thêm một số nhà máy sản xuất dầu cám gạo để tiêuthụ trong nước và xuất khẩu Tiêu biểu là nhà máy trích ly dầu từ cám gạo có quy

mô lớn ở Đồng bằng sông Cửu Long, thuộc liên doanh giữa Vocarimex (Việt Nam)

và Siteki Investments (Singapore), có công suất 100.000 tấn cám gạo/năm sản xuất

ra 15.000 tấn dầu cám gạo chất lượng cao Ở phía Bắc nước ta cũng có các nhà máysản xuất dầu cám gạo bằng phương pháp ép cơ học

1.2.3.2 Tình hình sản xuất ngoài nước:

Theo báo cáo của Hiệp hội Solvent Extractor’s Association (SEA) năm 2014,tổng lượng dầu cám gạo được sản xuất trên toàn cầu đạt 1,2 triệu tấn dầu Trong đó,

Ấn Độ là nước xuất khẩu dầu cám gạo lớn nhất thế giới với năng suất hiện naykhoảng 900.000 tấn dầu, chiếm khoảng 75% tấn dầu so với thế giới Theo sau đó làcác nước như Nhật Bản (70.000 tấn dầu), Thái Lan (60.000 tấn dầu) và Trung Quốc(50.000 tấn dầu) [35]

1.2.4 Các phương pháp sản xuất dầu cám gạo hiện nay:

Công nghệ sản xuất dầu cám gạo ở các nước, trong đó có Việt Nam, chủ yếuvẫn theo phương pháp cổ điển là ép cơ học hoặc trích ly bằng dung môi hữu cơ, sau

đó tinh luyện bằng phương pháp hóa học.Dung môi hữu cơ thường được sử dụng làn-hexane, thuộc loại dung môi không phân cực có thể trích ly được dầu gần nhưtuyệt đối với hiệu suất 97-99% [28], dễ bay hơi và dễ thu hồi sau khi sử dụng Tuynhiên, n-hexane là dung môi có độc tính gây hại đến sức khỏe con người Nếu nhưtiếp xúc lâu dài sẽ tích lũy trong cơ thể và gây ngộ độc, chóng mặt, mệt mỏi, nặng

hơn là gây rối loạn vận động, bệnh thần kinh ngoại vi[29].Ngoài ra, công nghệ trích

ly này đang được các nước trên thế giới đánh giá là có nhiều nguy cơ cháy, nổ và ônhiễm môi trường Số liệu thống kê cho thấy trung bình mỗi năm trên thế giới có 1

vụ nổ nhà máy trích ly dầu thực vật bằng dung môi hữu cơ Và phương pháp nàyđòi hỏi vốn đầu tư cao, yêu cầu cung ứng nguyên liệu phải đủ lớn để phù hợp vớicông suất vận hành của nhà máy

Do đó, hiện nay luật lệ ở một số nước như Mỹ đã cấm xây dựng các nhà máytrích ly dầu bằng dung môi n-hexane Hơn nữa, sự quản lý và điều hành của các tổchức thế giới như FDA (US Food and Drug Administration) và WHO (World HealthOrganization) cũng đang ngày càng chặt chẽ hơn dẫn đến khả năng thu hẹp của thịtrường dầu thực vật dùng trong ngành thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, [5]

Và, công nghệ chiết tách dầu từ cám gạo sao cho có hiệu quả cao và thuđược lượng tối đa đã trở thành “điểm nóng” nghiên cứu trong ngành công nghiệpdầu, chất béo [15] Từ trước đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu phương pháp điềuchế dầu cám gạo bao gồm phương pháp cổ điển chính ép cơ học, phương pháp chiếttách bằng dung môi “xanh”, bằng hệ enzym và bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn[20].So với các phương pháp sản xuất khác, kỹ thuật chiết tách bằng hệ enzym đượcdựa trên nguyên tác đó là phá hủy thành tế bào của cám gạo bởi các hệ enzym thủyphân, vì thế mà các chất béo được thoát ra khỏi tế bào Phản ứng xảy ra trong điềukiện tương đối “ôn hòa”, thiết bị đơn giản, không sử dụng các chất độc hại chongười và môi trường, chất lượng dầu cám gạo cao[25]

1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu tách dầu bằng enzyme trong nước

• Nghiên cứu chế biến cám gạo

Hàm lượng dầu của nguyên liệu cám gạo có thể bị biến đổi trong quá trìnhbảo quản lâu dài do tác động của enzyme lipaze Cám gạo sau khi xay xát có tỉ lệaxit béo tự do khoảng 3-5% và tăng dần theo thời gian Chỉ số acid của cám khi mớixay xát là 12mg KOH/g, tăng lên đến 28,5mg KOH/g sau 5 ngày và tăng lên đến116mg KOH/g sau 60 ngày Hàm lượng dầu giảm từ 16% (lúc mới xay xát) xuốngcòn 14% sau 60 ngày [6]

Vì vậy, để hạn chế giảm chất lượng của dầu cám gạo, sử dụng phương pháp

xử lý nhiệt ẩm để tiêu diệt lipase là hiệu quả Quá trình gồm 3 công đoạn là chưng

gia ẩm đến độ ẩm 18-20%, sau đó sấy ở 100-105oC trong 60 phút cho đến khi độ ẩmcòn 4-5%, cuối cùng làm nguội đến 40-50oC Cám gạo sau khi xử lý được bảo quảntrong bao gai hoặc bao dứa ở nhiệt độ bình thường Sau 30 ngày, dầu cám ép ra cóchỉ số acid đạt giới hạn cho phép để chiết tách dầu cám có hiệu quả [4].

• Nghiên cứu phương pháp chiết tách dầu cám gạo:

Theo bài báo nghiên cứu của Tiến sĩ Nguyễn Thị Minh Nguyệt tại Việnnghiên cứu Dầu và Cây có dầu, công nghệ chiết tách bởi hệ enzyme thủy phân gồm

7 công đoạn: làm sạch, xử lý nhiệt (100oC trong 5phút), làm nguội (45-50oC), xử lýenzyme (Carbohydraze với liều lượng 0,1% trong 30phút đến 2 giờ), thay đổi môitrường pH=10 dùng NaOH.3N trong 30phút, ly tâm 5000rpm trong 20phút, thu dầu.Sản phẩm dầu thu được có màu vàng rơm hoặc xanh oliu, có mùi thơm đặc trưng,chỉ số acid thấp khoảng 2-5mg KOH/g Hiệu suất thu hồi dầu đạt 77-79% [3]

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu tách dầu bằng enzym ngoài nước:

Theo kết quả nghiên cứu của P.Hanmounggjai (2002), enzym alcalase sẽ làmtăng được lượng dầu chiết xuất cao hơn khi kết hợp với enzym Cellulase 1.5L,hemicellulase (đạt 65-70%) Hệ enzym này được xử lý với nồng độ 1% so với cámgạo trong vòng 1 giờ ở 500C Trước khi xử lý enzym, tỷ lệ cám gạo và nước đượctrộn theo 1:5, và xử lý nhiệt ở 900C trong vòng 15 phút để bất hoạt enzym lipasegây hỏng chất lượng dầu Kết quả cuối cùng thu được 80% lượng dầu có sẵn trongcám gạo [19]

Theo kết quả nghiên cứu của A.Sharma (2001), các điều kiện tối ưu đượcxác định để chiết tách dầu cám gạo là dùng hỗn hợp enzym Amylase (80U),Protease (368U) và Cellulase (380U) với tỷ lệ giữa cám gạo – nước là 1:4 (10g cámgạo : 40ml nước), pH = 7 thay đổi bằng NaOH.0,1N và nhiệt độ 650C, thời gian 18giờ, tốc độ lắc 80rpm Hiệu suất thu hồi đạt được là 77% [17] Trước khi xử lýenzym, hỗn hợp nước và cám gạo chỉ được khuấy trộn bằng máy khuấy từ 20 rpmtrong 30 phút, không qua xử lý nhiệt

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Lâm học và Khoa học củaTrung Quốc đã kết hợp giữa phương pháp enzym và siêu âm thành công Quy trìnhđược thực hiện như sau: Cám gạo làm sạch,xử lý nhiệt ( tỷ lệ cám gạo : nước= 1:5,

ở 850C trong vòng 15 phút), xử lý siêu âm ( ở 600C, trong vòng 55 phút, 120W),xử

lý enzyme (Cellulase.1,2%; Protease.0,6%; Amylase.0,3%; pH=4,5; ở 550C xử lýtrong 5,5 giờ), chiết tách bằng dung môi Hiệu suất thu hồi đạt 92,63% So với mẫuchỉ xử lý bằng enzym, màu sắc của dầu có xử lý siêu âm hơi sẫm, chỉ số acid và chỉ

số peroxid thấp hơn Nhưng c\hỉ số iot và chỉ số xà phòng hóa lại cao hơn Phươngpháp này được thiết kế nhằm cải thiện khả năng bị oxy hóa và nồng độ acid béokhông bão hòa.Chất lượng của dầu được tăng lên [15]

Nghiên cứu về chất lượng sản phẩm của dầu cám gạo, Shaker đã tìm hiểuphương pháp xử lý nhiệt cám gạo trước khi cho enzym thủy phân vào, với điều kiệngia nhiệt ở 1000C trong vòng 9 phút thì sản phẩm dầu cám gạo sẽ có chỉ số acid (1-3mgKOH/g) thấp hơn so với xử lý trong vòng 3 phút và khi không xử lý nhiệt [14]

Việc sử dụng enzym trong chiết tách dầu cám gạo là một biện pháp có triểnvọng ứng dụng vì phù hợp với quy mô vừa và nhỏ, tiết kiệm được công đoạn tinhluyện nên giảm được hao hụt

1.3 Tổng quan về Enzyme:

1.3.1 Enzyme Cellulase:

Cellulase là một hệ enzyme thủy phân phức tạp, có khả năng cắt mối liên kết

β -1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose để chuyển thành cellobiose và cuối cùngthành glucose Phức hệ enzyme này được xếp thành 3 nhóm cơ bản, đó là: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase); exo-β-1,4-glucanase haycellobiohydrolase và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase Mỗi loạienzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phốihợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạothành các sản phẩm đơn giản nhất Enzyme Cellulase thường được tổng hợp mạnh

mẽ ở các giống nấm mốc như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, và nhiều vi

khuẩn, xạ khuẩn khác cũng có khả năng tổng hợp mạnh

1.3.1.1 Cơ chế hoạt động của enzyme Cellulase:

Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của phức hệ enzyme cellulase từ nấm

mốc Trichoderma reesi xảy ra theo 3 cơ chế chủ yếu sau:

+ Endo-βglucanase (CMCase): có khả năng phân cắt liên kết β glucosedase một cách ngẫu nhiên trong phân tử cellulose.

-1,4-+ Exo-β-1,4-glucanase (Cellobiohydrolase): xúc tác việc tách ra một cáchliên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử (non-reducing end) của chuỗicellulose

+ β-glucosidase (Cellobiase): thủy phân cellobiose đến glucose[8]

Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của enyzme Cellulase.

1.3.1.2 Tính chất lý hóa của enzyme Cellulase:

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme mà hoạt tính enzyme đạtcực đại ở khoảng nhiệt độ, pH tối ưu nhất định

Sự ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lênkhi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúcenzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thíchhợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-55oC Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tínhlàm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0oC, hoạt tínhenzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp Hoạt

tính của enzyme Cellulase từ Trichoderma reesi đạt tối đa ở 55oC [24]

Đối với sự ảnh hưởng của pH: khả năng hoạt động của enzyme còn phụthuộc vào pH môi trường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pHthích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc axit Theo bài báonghiên cứu về enzyme Cellulase của Xiao-Zou Zhang, pH tối ưu cho hoạt động của

enzyme Cellulase từ Trichoderma reesi là nằm trong khoảng pH= 4 – 5 [22]

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone, và các chấttẩy rửa như Tween 20, Tween 80, đều làm giảm hoạt tính của enyme

1.3.2 Enzyme Protease:

Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO – NH) trongphân tử protein và các cơ chất tương tự đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin.Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyểnaxit amin[5]

Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của enyzme Protease.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ visinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạdày bê ) So với protease động vật và thực vật, hệ protease vi sinh vật là một hệthống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng vàhình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất [3]

1.3.2.1 Phân loại Protease:

Enzyme protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase vàexopeptidase

Hình 1.7: Sơ đồ phân loại enzyme Protease.

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được chia thành

+ Cysteine protease: các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.Bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protease động vật vàprotease ký sinh trùng Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trungtính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

+ Aspartic protease: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin, baogồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, šauk h Các asparticproteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt độngmạnh ở pH trung tính

+ Metallo protease: là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốccũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thường hoạt động vùng

pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:+ Protease acid : pH= 2-4

1.3.3 Enzyme Glucoamylase:

Glucoamylase hay còn gọi là γ-amylase, là những enzyme có thể thủy phânđược cả hai kiểu liên kết α-1,4 và α-1,6-glucoside trong tinh bột, ngoài ra còn cókhả năng thủy phân liên kết α-1,2 và α-1,3-glucoside Glucoamylase có thể phângiải hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin, maltose thành glucose, mà

không cần có sự tham gia của các enzyme khác Chúng chủ yếu được tạo ra bởi các

vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc Aspergillus, Penicillium và Rhizopu[6]

1.3.3.1 Cơ chế hoạt động của enzyme Glucoamylase:

Glucoamylase có thể giải phóng ra D-glucose bằng cách thủy phân lặp lạinhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, sau đó chúngthủy phân các mối liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10-13 lần) Tốc độ thủyphân phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucoside đượcthủy phân, cũng như kích thước và cấu trúc của cơ chất bị thủy phân Nhất là vớicác α-glucan mạch dài (amylose và amylopectin) thì bị thủy phân nhanh hơn là vớicác maltodextrin và các oligosaccaride

Hình 1.8: Cơ chế hoạt động của enyzme Glucoamylase.

1.3.3.2 Ứng dụng của enzyme Glucoamylase:

Hiện nay, enzyme Glucoamylase có vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy phântinh bột và các sản phẩm trung gian Vì thế việc sử dụng các chế phẩmGlucoamylase tách từ các chủng vi sinh vật hoạt động trong sản xuất rượu, bia,mạch nha có ý nghĩa và triển vọng vô cùng lớn Theo thời gian, enzyme côngnghiệp càng ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến như nhóm enzymeprotease, cellulase, ligase, và một trong số đó nhóm enzyme được ứng dụng rấtphổ biến ở nhiều lĩnh vực khác nhau, đó là nhóm Amylase

- Trong y học và dược phẩm: thuốc và hóa chất chứa hoạt tính enzyme Glucoamylaseđược sử dụng để chẩn đoán viêm tụy cấp và trong các sản phẩm chứa men tiêu hóa

dành cho trẻ sơ sinh, kích thích tiêu hóa, chống suy dinh dưỡng.

- Trong công nghiệp: việc sử dụng enzyme để khử mực giấy loại trên thế giới đã cóthăm dò theo nhiều chiều hướng và một số chủng vi sinh, theo công bố gần đây nhấtcho thấy enzyme Glucoamylase đang có khả năng thúc đẩy quy trình khử mực tốt.Ngoài ra, còn được sử dụng phổ biến trong công nghiệp dệt

- Trong chế biến thực phẩm gia súc: thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rấtlớn trong khẩu phần thức ăn gia súc Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từnguồn tinh bột có chủ yếu trong ngũ cốc, người ta thường cho thêm enzymeAmylase vào nhằm giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột thành dường tốt hơn

- Trong công nghiệp thực phẩm: Glucoamylase được ứng dụng nhiều trong sản xuấtcác sản phẩm quen thuộc như mì chính, bia, cồn, siro, bánh mì, bánh kẹo, [16] 1.3.3.3 Enzyme Dextrozyme GA:

Dextrozyme GA chứa enzyme Glucoamylase được sản xuất từ một chủng

loại vi sinh vật có chọn lọc tên là Aspergillus niger bằng sự lên men chìm Tùy

thuộc vào nguồn gốc thu nhận enzyme mà hoạt độ của chúng đạt cực đại ở khoảng

pH và nhiệt độ tối ưu khác nhau Đối với enzyme Glucoamylase thu nhận từ

Aspergillus nigerthì nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 45-55oC và đạt cực đại ở

50oC Loại enzyme này bền trong môi trường acid hơn α-amylase, chúng có hoạtlực cao nhất ở vùng pH= 3–5, nhưng lại kém bền hơn trong rượu, acetone và khôngđược bảo vệ bởi Ca2+

- Mẫu cám 1: được lấy từ 1 hộ gia đình ở Quảng Nam.

- Mẫu cám 2: được lấy từ 1 hộ gia đình ở Quảng Ngãi

- Mẫu cám 3: được lấy từ Nhà máy xay xát ở Quảng Nam

- Mẫu cám4: được lấy từ Nhà máy xay xát ở Quảng Ngãi

• Enzyme: 3 loại

- Enzyme Alcalase® 2,4L của Novoenzyme.

- Enzyme Cellulase: enzyme được sử dụng trong quá trình nghiên cứu

này có nguồn gốc từSinobios(shanghai)imp.&exp.co.,ltd Địa chỉ: suiteB903, Tomson centre, 188 Zhangyang Rd.,Pudong New Dist,Shanghai,China

- Enzyme Dextrozyme GA của Novoenzyme.

2.2.2 Hóa chất:

- Dung dịch NaOH, HCl, CH3COOH

- Dung dịch KMnO4,Na2CO3; nước cất, cồn 96o

- Dung dịch đệm acetat: natri acetat 0,2M và acid acetic 0,2M

- Dung dịch đệm photphate: NaH2PO4.2H2O; NaH2PO4.12H2O

- Thuốc thử Folin 1X;

- Dung dịch TCA.0,4M

- CMC; DNS; tinh bột; casein; tyrosin; D-glucose

- Phenolphtalein; Sodium Potassium tartrate

Tất cả các hóa chất đều có nguồn gốc từ Trung Quốc.

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị sử dụng:

Trong đề tài này, tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị và máy móc củaphòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách Khoa ĐàNẵng

Một số thiết bị phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học như:

- Bếp điện (Hữu Nghị, Việt Nam)

- Lò vi sóng (Sharp)

- Cân kỹ thuật (ARC 120 OHAUS – Mỹ)

- Cân phân tích điện tử (E1240-OHAUS – Mỹ)

- Máy lắc khô (SI500-Stuart)

- Máy li tâm lớn (Hettich)

- Máy siêu âm phá mẫu sử dụng đầu dò (Misonic)

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Bể lắc nước ngang

Ngoài ra, một số dụng cụ đã sử dụng trong quá trình nghiên cứu:

- Bộ Soxhlet; cốc thủy tinh (25; 250; 1000 ml); bình tam giác; ống đong; đũathủy tinh; lọ penicilin; micropipet; pipet; bình định mức và một số dụng cụkhác

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Quy trình chung tách chiết dầu từ cám gạo bằng phương pháp enzyme:

Enzyme Cellulase Enzyme Alcalase Enzyme Dextrozyme Nước cất

Cám gạo

Khuấy trộn Làm sạch

Điều chỉnh pH, nhiệt độ

Xử lý enzyme

Ly tâm

Tách pha

Hình 2.1: Quy trình chung tách chiết dầu từ cám gạo bằng enyzme

Cám gạo thu nhận về có màu vàng được làm sạch qua dụng cụ rây để loại bỏcác tạp chất như sạn, các sinh vật nhỏ (mọt) và sấy khô ở 80oC đến khối lượngkhông đổi Cám gạo trở nên mịn và có màu vàng sáng hơn Khuấy trộn cám gạo vớinước cất ở tỷ lệ nhất định (1:4) bằng máy khuấy từ Điều chỉnh pH của hỗn hợpcám gạo và nước bằng dung dịch NaOH.0,5N hoặc CH3COOH.0,5N và đưa nhiệt

độ đến điều kiện thích hợp cho enyme hoạt động Các hệ enzyme phân giải nhưCellulasesẽ phá vỡ thành tế bào, còn các enzyme protease sẽ làm nhiệm vụ thay đổi

Dầu cám

tính thấm của lớp màng liposome và dầu sẽ thoát ra khỏi thể dầu một cách dễ dàng.Sau khi xử lý enzyme, các chất hòa tan sẽ được khuếch tán vào trong nước, dầuthoát ra sẽ tạo phân lớp với dịch lỏng Nhưng giữa dịch lỏng và lớp dầu xuất hiệnmột số vi hạt, vì vậy ta cần phải ly tâm để tạo phân lớp rõ ràng, dễ dàng tách chiếtdầu ra khỏi dịch lỏng.

Để thực hiện nghiên cứu này, tôi cần phải xác định được hàm lượng dầu cótrong mỗi cám gạo thu về bằng phương pháp Soxhlet và xác định các chỉ tiêu hóahọc, vật lý của dầu cám được trích ly bằng Soxhlet nhằm tiến hành so sánh với dầucám được tách chiết bằng công nghệ enzyme sau này Sau đó, tôi tiến hành khảo sátcác yếu tố ảnh hưởng đến công đoạn xử lý enzyme như nhiệt độ, pH, liều lượngenzyme để quá trình chiết tách dầu cám gạo đạt được hiệu suất cao nhất Sau khixác định được các điều kiện tối ưu, tôi tiến hành kết hợp phương pháp enzyme vớicác phương pháp khác như xử lý nhiệt, xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm và cácphương pháp tách thu hồi dầu tốt nhất để tăng hiệu suất của quá trình

2.3.2 Khảo sát chất lượng cám gạo bằng phương pháp hóa học:

2.3.2.1 Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Soxhlet:

Theo kết quả khảo sát của Viện Công nghiệp thực phẩm, cám có tỉ lệ cácthành phần và hàm lượng chất béo thay đổi tùy theo kỹ thuật và các loại máy xayxát Do đó, ta cần phải kiểm tra và phân tích hàm lượng chất béo trong mỗi mẫucám gạo ta thu được bằng phương pháp Soxhlet

• Nguyên tắc:

Chiết tách chất béo có trong cám gạo bằng dung môi hữu cơ (ether etylichoặc ether dầu hỏa) dựa trên khả năng hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơkhông phân cực

Quá trình tách được thực hiện bằng dụng cụ Soxhlet bao gồm: 1 trụ chiết, 1ống sinh hàn và 1 bình cầu

Hình 2.2: Bộ chiết Soxhlet.

• Tiến hành:

- Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi (100-1050C) Cân chính xáckhoảng 5g nguyên liệu bằng cân phân tích, cho vào túi giấy lọc đã được sấy khô.(Túi giấy phải có đường kính nhỏ hơn đường kính trụ chiết và chiều dài phải ngắnhơn chiều cao của ống chảy tràn)

- Đặt túi giấy chứa mẫu vào ống trụ chiết

- Lắp trụ chiết vào bình cầu đã được sấy khô (xác định khối lượng) và lắpống sinh hàn)

- Cho dung môi vào trụ chiết sao cho một lượng dung môi chảy xuốngkhoảng ½ bình cầu và còn một lượng trên trụ chiết đủ ngập mẫu

- Mở nước vào ống sinh hàn

- Đặt hệ thống Soxhlet lên bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt độ sao cho chu

kỳ hoàn lưu của dung môi đạt từ 5-8 lần trong một giờ (45-500C) Chiết trong 8-12giờ cho đến khi trích ly hoàn toàn chất béo Thử thời điểm kết thúc quá trình tríchbằng cách lấy vài giọt ether từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính sạch Sau khi dungmôi bay hơi hết, trên mặt kính không để lại vết dầu loang thì được xem như chấtbéo đã được chiết tách hoàn toàn,

- Sau khi chiết xong, lấy bình cầu ra và lắp vào thiết bị cô đặc chân khôngquay để thu hồi dung môi