Nghiên cứu khả năng sử dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản

Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi .... Nghiên cứu ảnh hưởng của một

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT

ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA

CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN

ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Kim Thu

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT

ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA

CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN

ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c

Mã số : 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài , em đã nhâ ̣n được sự giúp đỡ và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến người

thầy hướng dẫn khoa ho ̣c : TS Phạm Thế Hải , người thầy tâm huyết , đã tâ ̣n tình

hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài và h oàn thành luâ ̣n văn này

Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ , tạo điều kiện của cô Đỗ Minh

Phương cùng các anh chị, các bạn thuộc phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học

trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô ta ̣i Khoa Sinh ho ̣c, đă ̣c biê ̣t là các thầy

cô ở Bô ̣ môn Vi sinh vâ ̣t ho ̣c, trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã nhiê ̣t tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích , phương pháp luâ ̣n và nghiên cứu khoa ho ̣c, làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em

Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến gia đình , người thân, bạn bè đã luôn động viên , giúp đỡ, tạo điều kiện và dành những tình cảm thân thương - đó là nguồn đô ̣ng lực ma ̣nh mẽ nhất để tôi có thể hoàn thành bản luâ ̣n văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

HỌC VIÊN

Nguyễn Thị Kim Thu

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 5

1.1.Tổng quan vi khuẩn Vibrio Error! Bookmark not defined

1.1.1 Đặc điểm chung của chi Vibrio Error! Bookmark not defined 1.1.2 Môi trường nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio Error! Bookmark not defined 1.1.3 Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio Error! Bookmark not defined 1.1.4 Một số Vibrio gây bệnh trên người và động vật thuỷ sản Error! Bookmark

not defined

1.1.5 Phân loại Vibrio bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá Error!

Bookmark not defined

1.2 Hiện tượng cảm ứng mật độ (Quorum sensing)Error! Bookmark not defined

1.2.1 Lịch sử phát hiện quá trình quorum sensing Error! Bookmark not defined 1.2.2 Khái niệm quorum sensing Error! Bookmark not defined

1.2.3 Cơ chế phân tử của quá trình QS ở một số vi khuẩn Vibrio Error!

Bookmark not defined

1.2.4 Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi

khuẩn Vibrio Error! Bookmark not defined

1.3 Các phương pháp ức chế quá trình QS được sử dụng hiện nay Error! Bookmark not defined

1.3.1 Sử dụng chất đối kháng quorum sensing Error! Bookmark not defined 1.3.2 Bất hoạt phân tử tín hiệu dựa vào enzym Error! Bookmark not defined

1.4 Nghiên cứu về vi khuẩn ức chế quorum sensing và đối kháng với một số vi

khuẩn Vibrio Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 2.NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ERROR!

2.1 Nội dung nghiên cứu ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED

2.2 Vật liệu nghiên cứu ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED

not defined

2.2.2 Hóa chất và thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2.3 Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu:Error! Bookmark not

defined

2.3 Phương pháp nghiên cứu ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED 2.3.1 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang

sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi Error!

Bookmark not defined

2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức

chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối khángError! Bookmark

not defined

2.3.3 Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, phân loại của các chủng vi khuẩn có

hoạt tính ức chế phát sáng sinh học (liên quan đến QS) của Vibrio harveyi Error!

Bookmark not defined

2.3.4 Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn Error! Bookmark not defined 2.3.5 Chỉ tiêu theo dõi chung Error! Bookmark not defined

defined

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED

3.1 Xác định mối tương quan giữa mật độ tế bào và cường độ phát quang đo

được của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểmERROR! BOOKMARK NOT

3.2 Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình

phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED 3.2.1 Phân lập các vi sinh vật ở các vùng ao nuôi tôm, rừng ngập mặn, đất, bùn

của tỉnh Nam Định và Ninh Bình Error! Bookmark not defined

3.2.2 Xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở

Vibrio harveyi của các vi sinh vật phân lập Error! Bookmark not defined

3.3 Kết quả phân tích định lượng khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến

quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập được ERROR!

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức

chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng ERROR!

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ Error! Bookmark not defined 3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH môi trường nuôi cấy Error! Bookmark not defined 3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) trong môi trường nuôi cấy Error!

Bookmark not defined

3.5 Xác định đặc điểm hình thái và một số đặc điểm phân loại học khác của các vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát quang sinh học liên quan đến quorum

sensing ở Vibrio harveyi Error! Bookmark not defined.

3.5.1 Quan sát hình dạng tế bào của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự

phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi Error!

Bookmark not defined

3.5.2 Hình thái khuẩn lạc của hai chủng vi khuẩn tuyển chọn được Error!

Bookmark not defined

3.5.3 Khả năng lên men yếm khí của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự

phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi Error!

Bookmark not defined

not defined

3.5.5 Kết quả phân tích các đặc điểm sinh hoá của XTS1.Error! Bookmark not

defined

3.6 Phân tích trình tự gen 16S rRNA của chủng XTS1ERROR! BOOKMARK NOT

3.6.1 Khuếch đại gen 16S rRNA Error! Bookmark not defined

3.6.2 Kết quả xác định loài vi khuẩn XTS1 ức chế sự phát sáng sinh học liên

quan đến quorum sensing ở Vibrio harvei bằng kỹ thuật sinh học phân tử Error!

Bookmark not defined

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED

TÀI LIỆU THAM KHẢO 9 PHỤ LỤC 58

DANH MỤC CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trường 4 Bảng 2.1 Thành phần môi trường LB 0.5% NaCl nuôi cấy các VSV phân lập 19 Bảng 2.2 Thành phần môi trường TCBS để chọn lọc vi khuẩn Vibrio 19 Bảng 3.1 Số chủng VSV phân lập được từ 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình 31

Bảng 3.2 Kết quả phân lập được một số chủng vi khuẩn nghi ngờ có hoạt

tính ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi 32

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng ức chế sự phát quang sinh

học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1 38

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng ức chế phát quang sinh

học liên quan đến QS ở Vibrio harveyi của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 39

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) đến khả năng ức chế của 2 chủng

XTS1 và CP1 tới sự phát quang sinh học(QS) của Vibrio harveyi 41

Bảng 3.6 Khả năng lên men yếm khí của một số chủng vi khuẩn có triển

vọng ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi 43

Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm MR phân loại vi khuẩn dựa vào khả năng lên men đường glucose tạo sản phẩm acid bền 45 Bảng 3.8 Kết quả thử nghiệm VP chủng vi khuẩn XTS1 46 Bảng 3.9 Kết quả thử nghiệm ONPG chủng vi khuẩn XTS1 47 Bảng 3.10 Kết quả xác định loài vi khuẩn ức chế sự phát sáng liên quan

đến QS ở Vibrio harveyi bằng kỹ thuật sinh học phân tử 49

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ phân loại các loài Vibrio bằng các phản ứng sinh hoá 7

Hình 1.2.Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri 9

Hình 1.3 Quorum sensing ở vi khuẩn Vibrio harveyi 10

Hình 1.4 Hai enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL 13

Hình 3.1 Đồ thị mô tả sự tương quan giữa giá trị OD600nm và lượng phát quang của Vibrio harveyi tại các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h 30

Hình3.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1, CP1, CP10 33

Hình 3.3 Đồ thị sinh trưởng của các chủng VSV 34

Hình 3.4 Kết quả khảo sát tính đối kháng giữa các chủng Vibrio harveyi và 3 chủng VSV phân lập được bằng phương pháp cấy vạch vuông góc 35

Hình 3.5 Kết quả khảo sát sự ức chế sinh trưởng giữa các chủng XTS1 và CP1 với V.harveyi bằng phương pháp đục lỗ thạch 36

Hình 3.6 Đồ thị biểu thị cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở các giếng thí nghiệm .37

Hình 3.7 Hiệu quả ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của hai chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 37

Hình 3.8 Hình dạng tế bào XTS1 quan sát dưới vật kính 100x 42

Hình 3.9 Quan sát hình dạng tế bào CP1 dưới vật kính 100x 42

Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn XTS1 trên môi trường LB 3% NaCl và TCBS 43

Hình 3.11 Khả năng lên men yếm khí của 2 chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi 44

Hình 3.12 Khả năng di động của XTS1 và CP1 45

Hình 3.13 Kết quả thử nghiệm MR 46

Hình 3.14 Thử nghiệm VP của chủng vi khuẩn XTS1 47

Hình 3.15 Kết quả thử nghiệm ONPG của chủng vi khuẩn XTS1 48

Hình 3.16 Kết quả quả PCR khuếch đại đoạn 16S rADN của XTS1 49

Hình 3.17 Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của XTS1 trên GenBank 50

MỞ ĐẦU

Ngành thuỷ sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của đất nước ta Quy mô của ngành thuỷ sản ngày càng mở rộng và vai trò của ngành cũng tăng lên không ngừng trong nền kinh tế quốc dân Động vật thuỷ sản là một trong những nguồn cung cấp lương thực, thực phẩm và các sản phẩm tiêu dùng phong phú cho con người Trong đó, bao gồm các loại tôm, cua, cá,…

Tuy nhiên, mỗi năm ngành thuỷ sản nước ta lại bị thiệt hại nặng nề vì dịch bệnh, chủ yếu trên tôm nước lợ, cá nước ngọt, cá biển, nhuyễn thể… Các yếu tố ngoại cảnh tác động lên động vật thuỷ sản bao gồm môi trường sống và tác nhân gây bệnh Trong đó, dịch bệnh trên động vật thuỷ sản gây thiệt hại lớn chủ yếu là do các tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm, tác nhân gây bệnh kí sinh…) Một trong những vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản điển hình đó là các vi khuẩn

thuộc chi Vibrio [2 ; 22] Thiệt hại do bệnh thủy sản, đặc biệt là tôm lên đến 60000

ha (năm 2014) ảnh hưởng rất lớn đến người nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế

Các vi khuẩn Vibrio sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và

cửa sông, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển Đối với cá,

Vibrio spp chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng máu, đối với tôm Vibrio spp gây bệnh

phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin Những vi khuẩn này thường là tác nhân gây bệnh cơ hội, khi động vật thuỷ sản chịu sự bất lợi từ yếu tố môi trường hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng Động vật thuỷ sản yếu không có

sức đề kháng, các loài vi khuẩn Vibriocơ hội gây bệnh nặng làm động vật này chết

rải rác tới hàng loạt [2]

Nhiều giải pháp để phòng, trừ bệnh do nhóm vi khuẩn này gây ra trên động vật thuỷ sản như sử dụng kháng sinh, chế phẩm sinh học Tuy nhiên, hiệu quả của các biện pháp này còn thấp Hơn nữa, do sử dụng nhiều kháng sinh mà các vi khuẩn

Vibrio đa phần đều kháng kháng sinh gây ảnh hưởng đến môi trường và càng làm

giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tập trung vào việc làm rối loạn hệ thống “quorum sensing” – một dạng “giao tiếp của vi

ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng, dò tìm các phân tử tín hiệu Vai trò của quorum sensing là điều khiển một số quá trình ở vi khuẩn gây bệnh như: sự phát sáng, sự tiếp hợp, sự hình thành biofilm, swarming… [1; 9] Việc ngăn chặn

hệ thống giao tiếp QS của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Vibrio nói riêng là hướng

đi mới nhằm ngăn ngừa khả năng gây bệnh của chúng mà không cần đặt chúng dưới áp lực chọn lọc (chẳng hạn như dùng kháng sinh hoặc chất hoá học để tiêu diệt chúng)

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu khả năng sử

dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thuỷ sản”

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1 Nguyễn Thị Hồng Vân và Bùi Thị Việt Hà (2011), Giáo trình Di truyền học ở

sinh vật nhân sơ, NXB Giáo dục Việt Nam

2 Đặng Xuân Bình, Bùi Quang Tề, Đoàn Quốc Khánh (2012) , Giáo trình Bệnh

động vật thuỷ sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội

3 Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành Vi

sinh vật học, NXB Đại học sư phạm, Hà Nội

4 Nguyễn Văn Phúc, Phan Thị Phượng Trang (2014), “Phân lập, định danh và xác

định các đặc tính có lợi của chủng Bacillus spp từ ao nuôi tôm ở tỉnh Bến Tre”, Tạp chí khoa học – Đại học Sư phạm TPHCM,64, tr 94-102

Tiếng Anh

5 R Chythanya, Indrani Karunasagar, (2002), “Iddya Karunasagar Inhibition of

shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain”, Aquaculture,208, pp 1-10

6 Alsina M & Blanch AR (1994), “A set of keys for biochemical identification of

environmental Vibrio species”, Journal of Applied Bacteriology, 76, pp

79-85

7 Alsina M & Blanch AR (1994), “Improvement and update of a set of keys for

biochemical identification of Vibrio species”, Journal of Applied Bacteriology, 76, pp.719-721

8 Simidu, U., and K Tsukamoto (1980), “A method of the selective isolation and

enumeration of marine Vibrionaceae”, Microb Ecol, 6, pp.181–184

9 Debra L Milton (2006), “Quorum sensing in vibrios: Complexity for

diversification”, Internal Journal of Medical Microbiology, 296, pp 61-71

10 Claudia Lupp & Edward G Ruby (2005),“Vibrio fischeri Uses Two

Quorum-Sensing Systems for the Regulation of Early and Late Colonization

Factors”, J Bacteriol, 187, pp 3620-3629