Nghiên cứu khả năng sử dụng vi sinh vật để ức chế quá trình Quorum Sensing của các vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản

Header Page of 27 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 Footer Page of 27 Header Page of 27 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Kim Thu NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thế Hải Hà Nội - 2015 Footer Page of 27 Header Page of 27 LỜI CẢM ƠN Trong ś t quá trình ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài , em đã nhâ ̣n đươ ̣c sự giúp đỡ và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắ c nhấ t đế n người thầy hướng dẫn khoa ho ̣c : TS Phạm Thế Hải , người thầ y tâm huyế t , đã tâ ̣n tình hướng dẫn , chỉ bảo và giúp đỡ em quá trình thực hiện đề tài và h oàn thành luâ ̣n văn này Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ , tạo điều kiện của cô Đỗ Minh Phƣơng các anh chị, các bạn thuộc phòng thí nghiệm mơn Vi sinh vật học suốt quá trình hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới quý thầ y cô ta ̣i Khoa Sinh ho ̣c , đă ̣c biê ̣t là các thầ y cô ở Bô ̣ môn Vi sinh vâ ̣t ho ̣c, trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã nhiê ̣t tin ̀ h giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức bở ích , phương pháp l ̣n và nghiên cứu khoa ho ̣c, làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em Cuố i cùng, xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắc nhấ t đế n gia đình , người thân , bạn bè đã động viên , giúp đỡ , tạo điều kiện và dành những tin ̀ h cảm thân thương - đó là nguồ n đô ̣ng lực ma ̣nh mẽ để có thể hoàn thành bản luâ ̣n văn này Hà Nội, ngày tháng năm 2015 HỌC VIÊN Nguyễn Thị Kim Thu Footer Page of 27 Header Page of 27 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1.1.Tổng quan vi khuẩn Vibrio Error! Bookmark not defined 1.1.1 Đặc điểm chung của chi Vibrio Error! Bookmark not defined 1.1.2 Môi trường nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio Error! Bookmark not defined 1.1.3 Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio Error! Bookmark not defined 1.1.4 Một số Vibrio gây bệnh người và động vật thuỷ sản Error! Bookmark not defined 1.1.5 Phân loại Vibrio các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá Error! Bookmark not defined 1.2 Hiện tƣợng cảm ứng mật độ (Quorum sensing)Error! Bookmark not defined 1.2.1 Lịch sử phát hiện quá trình quorum sensing Error! Bookmark not defined 1.2.2 Khái niệm quorum sensing Error! Bookmark not defined 1.2.3 Cơ chế phân tử của quá trình QS số vi khuẩn Vibrio Error! Bookmark not defined 1.2.4 Quorum sensing điều k�́ của chủng XTS1 và CP1 tới sự phát quang sinh học(QS) của Vibrio harveyi 41 Bảng 3.6 Khả lên men yếm khí của số chủng vi khuẩn có triển vọng ức chế phát quang sinh học Vibrio harveyi 43 Bảng 3.7 Kết thử nghiệm MR phân loại vi khuẩn dựa vào khả lên men đường glucose tạo sản phẩm acid bền 45 Bảng 3.8 Kết thử nghiệm VP chủng vi khuẩn XTS1 46 Bảng 3.9 Kết thử nghiệm ONPG chủng vi khuẩn XTS1 47 Bảng 3.10 Kết xác định loài vi khuẩn ức chế sự phát sáng liên quan đến QS Vibrio harveyi kỹ thuật sinh học phân tử 49 Footer Page of 27 Header Page 10 of 27 DANH MỤC HÌ NH Trang Hình 1.1 Sơ đồ phân loại các loài Vibrio các phản ứng sinh hoá Hình 1.2.Quá trình quorum sensing Vibrio fisheri Hình 1.3 Quorum sensing vi khuẩn Vibrio harveyi 10 Hình 1.4 Hai enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL 13 Hình 3.1 Đồ thị mơ tả sự tương quan giữa giá trị OD600nm và lượng phát quang của Vibrio harveyi các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h 30 Hình3.2 Kết thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học Vibrio harveyi của các chủng XTS1, CP1, CP10 33 Hình 3.3 Đồ thị sinh trưởng của các chủng VSV 34 Hình 3.4 Kết khảo sát tính đối kháng giữa các chủng Vibrio harveyi và chủng VSV phân lập phương pháp cấy vạch vng góc 35 Hình 3.5 Kết khảo sát sự ức chế sinh trưởng giữa các chủng XTS1 và CP1 với V.harveyi phương pháp đục lỗ thạch 36 Hình 3.6 Đồ thị biểu thị cường độ phát quang của Vibrio harveyi các giếng thí nghiệm .37 Hình 3.7 Hiệu ức chế phát quang sinh học Vibrio harveyi của hai chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 37 Hình 3.8 Hình dạng tế bào XTS1 quan sát vật kính 100x 42 Hình 3.9 Quan sát hình dạng tế bào CP1 vật kính 100x 42 Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn XTS1 môi trường LB 3% NaCl và TCBS 43 Hình 3.11 Khả lên men ́m khí của chủng vi khuẩn có khả ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi 44 Hình 3.12 Khả di động của XTS1 và CP1 45 Hình 3.13 Kết thử nghiệm MR 46 Hình 3.14 Thử nghiệm VP của chủng vi khuẩn XTS1 47 Hình 3.15 Kết thử nghiệm ONPG của chủng vi khuẩn XTS1 48 Hình 3.16 Kết quả PCR khuếch đại đoạn 16S rADN của XTS1 49 Hình 3.17 Kết so sánh trình tự 16S rDNA của XTS1 GenBank 50 Footer Page 10 of 27 Header Page 11 of 27 MỞ ĐẦU Ngành thuỷ sản đóng vai trò quan trọng sự phát triển kinh tế của đất nước ta Quy mô của ngành thuỷ sản ngày càng mở rộng và vai trò của ngành tăng lên khơng ngừng nền kinh tế quốc dân Động vật thuỷ sản là những nguồn cung cấp lương thực, thực phẩm và các sản phẩm tiêu dùng phong phú cho người Trong đó, bao gồm các loại tơm, cua, cá,… Tuy nhiên, năm ngành thuỷ sản nước ta lại bị thiệt hại nặng nề dịch bệnh, chủ yếu tôm nước lợ, cá nước ngọt, cá biển, nhuyễn thể… Các yếu tố ngoại cảnh tác động lên động vật thuỷ sản bao gồm môi trường sống và tác nhân gây bệnh Trong đó, dịch bệnh động vật thuỷ sản gây thiệt hại lớn chủ yếu là các tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm, tác nhân gây bệnh kí sinh…) Một những vi khuẩn gây bệnh động vật thuỷ sản điển hình là các vi khuẩn thuộc chi Vibrio [2 ; 22] Thiệt hại bệnh thủy sản, đặc biệt là tôm lên đến 60000 (năm 2014) ảnh hưởng lớn đến người nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế Các vi khuẩn Vibrio sống môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển Đối với cá, Vibrio spp chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng máu, tôm Vibrio spp gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin Những vi khuẩn này thường là tác nhân gây bệnh hội, động vật thuỷ sản chịu sự bất lợi từ yếu tố môi trường bị nhiễm các bệnh khác virus, nấm, kí sinh trùng Động vật thuỷ sản ́u khơng có sức đề kháng, các loài vi khuẩn Vibriocơ hội gây bệnh nặng làm động vật này chết rải rác tới hàng loạt [2] Nhiều giải pháp để phòng, trừ bệnh nhóm vi khuẩn này gây động vật thuỷ sản sử dụng kháng sinh, chế phẩm sinh học Tuy nhiên, hiệu của các biện pháp này thấp Hơn nữa, sử dụng nhiều kháng sinh mà các vi khuẩn Vibrio đa phần đều kháng kháng sinh gây ảnh hưởng đến môi trường và càng làm giảm hiệu của thuốc kháng sinh Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tập trung vào việc làm rối loạn hệ thống “quorum sensing” – dạng “giao tiếp của vi khuẩn” Quorum sensing (QS) là chế thông tin liên lạc giữa các tế bào và đáp Footer Page 11 of 27 Header Page 12 of 27 ứng lại mật độ tế bào cách sản xuất, giải phóng, dò tìm các phân tử tín hiệu Vai trò của quorum sensing là điều khiển số quá trình vi khuẩn gây bệnh như: sự phát sáng, sự tiếp hợp, sự hình thành biofilm, swarming… [1; 9] Việc ngăn chặn hệ thống giao tiếp QS của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Vibrio nói riêng là hướng nhằm ngăn ngừa khả gây bệnh của chúng mà không cần đặt chúng áp lực chọn lọc (chẳng hạn dùng kháng sinh chất hoá học để tiêu diệt chúng) Xuất phát từ thực tế chúng chọn đề tài “Nghiên cứu khả sử dụng vi sinh vật để ức chế trình quorum sensing vi khuẩn Vibrio gây bệnh động vật thuỷ sản” Footer Page 12 of 27 Header Page 13 of 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Hồng Vân và Bùi Thị Việt Hà (2011), Giáo trình Di truyền học sinh vật nhân sơ, NXB Giáo dục Việt Nam Đặng Xuân Bình, Bùi Quang Tề, Đoàn Quốc Khánh (2012) , Giáo trình Bệnh đợng vật thuỷ sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành Vi sinh vật học, NXB Đại học sư phạm, Hà Nội Nguyễn Văn Phúc, Phan Thị Phượng Trang (2014), “Phân lập, định danh và xác định các đặc tính có lợi của chủng Bacillus spp từ ao ni tơm tỉnh Bến Tre”, Tạp chí khoa học – Đại học Sư phạm TPHCM,64, tr 94-102 Tiếng Anh R Chythanya, Indrani Karunasagar, (2002), “Iddya Karunasagar Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain”, Aquaculture,208, pp 1-10 Alsina M & Blanch AR (1994), “A set of keys for biochemical identification of environmental Vibrio species”, Journal of Applied Bacteriology, 76, pp 7985 Alsina M & Blanch AR (1994), “Improvement and update of a set of keys for biochemical identification of Vibrio species”, Journal of Applied Bacteriology, 76, pp.719-721 Simidu, U., and K Tsukamoto (1980), “A method of the selective isolation and enumeration of marine Vibrionaceae”, Microb Ecol, 6, pp.181–184 Debra L Milton (2006), “Quorum sensing in vibrios: Complexity for diversification”, Internal Journal of Medical Microbiology, 296, pp 61-71 10 Claudia Lupp & Edward G Ruby (2005),“Vibrio fischeri Uses Two QuorumSensing Systems for the Regulation of Early and Late Colonization Factors”, J Bacteriol, 187, pp 3620-3629 10 Footer Page 13 of 27 Header Page 14 of 27 11 Josephine R Chandler & et al, (2012), “Acyl-homoserine lactone-dependent eavesdropping promotes competition in a laboratory co-culture model”, The ISME Journal, 6, pp 2219-2228 12 Yi-Hu Dong & et al, (2011),“Quenching quorum-sensing dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase”, Nature 411, pp 813-817 13 Brian K Hammer,Bonnie L Bassler (2003), “Quorum sensing controls biofilm formation in Vibrio cholerae”, Mol Microbiol,50, pp 1521 14 Dalsgaard A et al (1995), “Characterization of Vibrio cholerae non-O1 serogroup obtained from an outbreak of diarrhoea in Lima, Peru”, Journal of Clinical Microbiology 33, pp.2715–2722 15 Kimberly C Tu, Tao Long, Sine L Svenningsen, Ned S Wingreen, and Bonnie L Bassler, (2010), “Negative Feedback Loops Involving Small Regulatory RNAs Precisely Control the Vibrio harveyi Quorum-Sensing Response”, PMC, pp.567–579 16 Audra J Pompeani, Joseph J Irgon, Michael F Berger, Martha L Bulyk, Ned S Wingreen1 and Bonnie L Bassler, (2008), “The Vibrio harveyi master quorum-sensing regulator, LuxR, a TetR-type protein is both an activator and a repressor: DNA recognition and binding specificity at target promoters”, Molecular Microbiology, 70,pp 76–88 17 Yi Shao and Bonnie L Bassler (2012), “Quorum-sensing non-coding small RNAs use unique pairing regions to differentially control mRNA targets”, Molecular Microbiology, 83,pp 599-611 18 Kimberly C Tu1 and Bonnie L Bassler, (2007), “Multiple small RNAs act additively to integrate sensory information and control quorum sensing in Vibrio harveyi”, Genes & development, 21, pp 221-233 19 Derrick H Lenz, Kenny C Mok, Ned S Wingreen, Bonnie L Bassler, (2008), “Small RNAs and bacterial strains involved in quorum sensing” , United States Patent 20 Andrei Y Chistoserdov & et al, (2005), Culture-Dependent characterization of the microbial community associated with epizootic shell disease lesions in 11 Footer Page 14 of 27 Header Page 15 of 27 American lobster, Homarus Americanus, Journal of Shellfish Research 24, pp 741-747 21 Alcaiden E et al (2001), Vibrio harveyi causes disease in seahorse, Hippocampus sp Journal of Fish Diseases, 24, pp 311-313 22 Austin B et al (1993), Bacterial fish pathogens: Disease of farmed and wild fish, 3rd edition,Ellis Horwood 23 Lightner, D.V & et al, (1996), A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Disease of Cultured Penaeid Shrimp, World Aquaculture Society, Baton Rouge 24 Julian R Marchesi et al (1998), “Design and Evaluation of Useful BacteriumSpecific PCR primers that amplify genes coding for Bacterial 16S rRNA”, Appl Environ Microbiol, 64, pp (795-799) 25 C.V.L Jayasinghe et al (2008), “The Isolation and Identification of Vibrio Species in Marine Shrimps of fischeri Lanka”, Journal of Food and Agriculture, 1, pp.36-44 26 Defoirdt T et al (2006), “Quorum sensing-disrupting brominated furanones protect the gnotobiotic brine shrimp Artemia franciscana from pathogenic Vibrio harveyi, Vibrio campbellii, and Vibrio parahaemolyticus isolates”, Appl Environ Microbiol, 72, pp.6419-23 27 Austin B & Zhang XH (2006), “Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates”, Lett Appl Microbiol43, pp 119-124 28 Belas R et al (1982), “Bacterial bioluminescence: isolation and expression of the luciferase genes from Vibrio harveyi”, Science,218, pp 791-793 29 B L Bassler, E P Greenberg and A M Stevens (1997), “Cross-species induction of luminescence in the quorum-sensing bacterium Vibrio harveyi”, J Bacteriol, 179, pp 4043-4045 30 F.M.I Natrah et al (2011), “Regulation of virulence factors by quorum sensing in Vibrio harveyi”, Veterinary Microbiology, 154,pp 124–129 12 Footer Page 15 of 27 Header Page 16 of 27 31 Yi-Hu Dong et al (2002), “Identification of Quorum-Quenching N-Acyl Homoserine Lactonases from Bacillus Species”, Appl Environ Microbio, 68, pp 1754–1759 32 Jun Zhu et al (2002), “Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholera”, PNAS, 99, pp 3129-3134 33 Martin, M., Showalter, R & Silverman, M (1989), “Identification of a locus controlling expression of luminescence genes in Vibrio harveyi”, J Bacteriol, 171, pp 2406–2414 34 Manefield M et al (2000), “Inhibition of luminescence and virulence in the black tiger prawn (Penaeus monodon) pathogen Vibrio harveyi by intercellular signal antagonists”, Appl Environ Microbiol,66,pp 2079-2084 35 Swift, S., Throup, J., Bycroft, B., Williams, P & Stewart, G (1998), “Quorum sensing: bacterial cell-cell signaling from bioluminescence to pathogenicity, In Molecular Microbiology, 103, pp.185–207 36 “Autoinduction in Erwinia amylovora: Evidence of an Acyl-Homoserine Lactone Signal in the Fire Blight Pathogen”, J Bacteriol, 187, pp 32063213 37 U Schmidt, H Chmel, and C Cobbs (1979), “Vibrio alginolyticus infections in humans, J Clin Microbiol, 10, pp 666-668 38 Jennifer M Henke and Bonnie L Bassler (2004), “Three Parallel QuorumSensing Systems Regulate Gene Expression in Vibrio harveyi”, Journal of Bacteriology, 186, pp 6902-6914 39 Martins, ML et al (2008), “Isolation and experimental infection with Vibrio alginolyticus in the sea horse, Hippocampus reidi Ginsburg, 1933 (Osteichthyes: Syngnathidae) in Brazil”, 70, pp 205-209 40 Nguyen Thi Ngoc Tinh et al, “Inhibition of Quorum Sensing-mediated Bioluminescence in Vibrio harveyi by a Recombinant AHL-lactonase from Bacillus cereus”, Journal of Pure and Applied Microbiology, Trang web 41 https://www.nottingham.ac.uk/quorum/vibrio.htm 13 Footer Page 16 of 27 Header Page 17 of 27 42 http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-vibrio-sp-gay-benh-tren-thuy-san11372/ 43 www.fistenet.gov.vn 44 http://thuysanvietnam.com.vn/phong-tri-benh-tom-phat-sang-article-7320.tsvn 45 https://www.nottingham.ac.uk/quorum/history.htm 14 Footer Page 17 of 27  ... Nguyễn Thị Kim Thu NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c Mã số...n đề tài Nghiên cứu khả sử dụng vi sinh vật để ức chế trình quorum sensing vi khuẩn Vibrio gây bệnh động vật thuỷ sản Footer Page 12 of 27 Header Page 13 of 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Vi t Nguyễ...ừ bệnh nhóm vi khuẩn này gây động vật thuỷ sản sử dụng kháng sinh, chế phẩm sinh học Tuy nhiên, hiệu của các biện pháp này thấp Hơn nữa, sử dụng nhiều kháng sinh mà các vi khuẩn Vibri