CD BV 2.4 Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuô i cấy mô từ chồi ngủ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ 2.4.1 (HĐ số ngày tháng năm 2014) Tên chuyên đề: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU NUÔI CẤY MÔ TỪ CHỒI NGỦ Thuộc đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin bình vơi trồng qui mơ sản xuất thử, áp dụng tỉnh Thái Bình” Mã số: VAST.NĐP.07/14-15 Người thực hiện: TS Nguyễn Văn Dư Hà Nội, 2014 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ (HĐ số ngày tháng năm 2014) Tên chuyên đề: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU NUÔI CẤY MÔ TỪ CHỒI NGỦ Thuộc đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin bình vơi trồng qui mơ sản xuất thử, áp dụng tỉnh Thái Bình” Mã số: VAST.NĐP.07/14-15 Người thực Chủ nhiệm đề tài Xác nhận quan (Ký, họ tên) (Ký, họ tên) (Ký, họ tên đóng dấu) TS Nguyễn Văn Dư MỤC LỤC MỤC LỤC .3 ĐẶT VẤN ĐỀ .3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .5 1.1 Giới thiệu chung lồi Bình Vơi 1.1.1 Đặc điểm sinh học .5 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng công dụng 1.1.4 Giá trị kinh tế, khoa học, bảo tồn 1.2 Thực trạng gieo trồng bình vơi 1.3 Các hình thức nhân giống 1.4 Cơ sở việc nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 1.5 Mục tiêu nghiên cứu .12 1.6 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 12 1.7 Nội dung nghiên cứu .12 1.8 Phương pháp nghiên cứu 12 2.4.1 Phương pháp luận 12 2.4.2 Phương pháp thực nghiệm 12 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .17 1.9 Cơng thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu in vitro 17 3.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro 19 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 22 1.10 Kết luận .22 1.11 Khuyến nghị 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Bình vơi (Stephania) gồm nhiều lồi thuốc q có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, lỵ, dày, chữa ngủ, chúng sử dụng để chữa bệnh ung thư bệnh kỷ Hiện tài liệu mô tả đặc điểm sinh vật học, sinh thái học loài Bình vơi hạn chế Trong lồi Bình vơi (Stephania rotunda Lour.) bị suy giảm nghiêm trọng tự nhiên Do việc hiểu biết số đặc điểm sinh vật học lồi có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen phát triển loài thuốc quý Bên cạnh đó, hiểu biết tầm quan trọng, lợi ích công tác nhân giống, đặc biệt nhân giống sinh dưỡng lồi khơng giúp cho cơng tác bảo tồn mà cịn tạo nguồn nguyên liệu đảm bảo số lượng chất lượng cho việc sản xuất hóa dược với quy mơ lớn Chính lý đây, đề tài tiến hành thực nội dung nghiên cứu “Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ” nhằm cung cấp thêm thông tin phương pháp khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Bình Vơi, góp phần tạo sở cho bước quy trình ni cấy mơ tế bào thực vật lồi Bình Vôi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung lồi Bình Vơi 1.1.1 Đặc điểm sinh học Bình vơi loại ưa sáng chịu bóng chịu bóng Cây thường mọc kẽ đá, leo trùm lên loại khác phủ lên đá, loại hình rừng ẩm núi đá vôi Độ cao phân bố loài S sinia Diels thường từ vài chục đến vài trăm mét chưa phát thấy khoảng 100m so với mặt biển Bình vơi có tượng rụng vào mùa đông, mọc lại vào mùa xuân hoa xuất sau non Mùa hoa vào tháng 4-8, cá biệt thấy chín vào tháng 10 Cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt từ phần khác lại sau cắt Ngồi ra, từ củ Bình vơi đem vùi 1/3 xuống đất cần đặt phần gốc tiếp xúc với đất ẩm mọc thành Nhìn chung, lồi Binh vơi ưa ẩm Lúc nhỏ, mọc tán rừng Sau 2, năm, leo lên giá thể, ưa sáng Những lồi sống núi đá vơi trảng cát ven biển có mọc thường có hệ rễ phát triển, len lõi khe đá đâu sâu xuống cát để hút nước chất dinh dưỡng Có thể rễ củ to, chứa nhiều nước nên lối sống núi đá vơi có khả chống chịu cao với điện kiện thời tiết khắc nghiệt khơ hạn nắng nóng mùa hè Đặc điệm tượng học Binh vôi thể rõ nét qua tập tính sinh trưởng phát triển chồi Nhìn chung, lồi Binh vơi có Việt Nam có hai vụ chồi năm Vụ chồi Đông Xuân, bao gồm chồi sớm xuất thân đầu củ từ tháng 11 – 12 Những chồi trạng thái chồi ngủ mùa Xuân tháng 1-2 bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh Chỉ vòng 1-2 tháng, chồi dài tới 1m Chồi Đông Xuân lứa chồi quan trọng Binh vơi, Xuân Hè (chồ cấp II) Số chồi cấp II nhiều gấp bội so với chồi Đông Xuân tính đơn vị chiều dài chồi Lá trưởng thành gnay mùa Hè rụng hết vào mùa khô hanh (tháng 10) Sự rụng hàng năm tập tính quan trọng Binh vôi Sự tái sinh chồi mạnh mẽ Bình vơi cịn thể khả mọc mầm mảnh bổ từ củ đem vùi xuống đất Những mảnh đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt mảnh khác Có thể áp dụng khả để nhân giống Binh vôi 1.1.2 Đặc điểm phân bố Thế giới: Trung Quốc, Lào Việt Nam: Trong lồi Bình vơi kể trên, có số lồi S sinica Diels, S kwangsiensis H S Lo, S rotunda Lour thường mọc lẫn với rừng núi đá vôi tỉnh Ninh Bình, Hà Nam, Thanh Hóa, Quảng Bình, Hải Phòng(Cát Bà), Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Tây (cũ) 1.1.3 Bộ phận dùng công dụng Bộ phận dùng: Củ thái lát phơi hay sấy khô, dùng làm thuốc theo y học cổ truyền Để chiết xuất hoạt tính làm thuốc dùng củ tươi Thành phần hóa học: Trong củ lồi Bình vơi nói chung thường có số nhóm hoạt chất, thành phần chủ yếu alkaloid như: Ltetrahydropamatin, stepharin, cycleanin, tuduranin, palmatin, dihydropalmatin, dicentrin… Công dụng: Trong y học cổ truyền dùng củ Bình vơi thái lát phơi khơ sắc uống có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, lỵ, dày… Liều dùng 3-6 g/ngày Tuy nhiên, cách dùng áp dụng, dễ bị ngộ độc (gây nơn) có alkaloid Bình vơi ngun liệu chiết alcalid làm thuốc an thần, chữa ngủ Thuốc làm dạng viên có tên Rotunda, viên chứa 0,05g L-tetrahydropalmatin clohydrat Liều dùng viên 1-2 viên trước ngủ 1.1.4 Giá trị kinh tế, khoa học, bảo tồn Bình vơi thuốc quý Do nguồn nguyên liệu tương đối dồi nên giá thu mua rẻ Tại nơi khai thác, giá mua khoảng 4.000 – 4.500 đ/kg tươi Bởi giá thành thuốc rẻ (3.000- 3.500 đồng vỉ 10 viên) Tuy nhiên, phát động khai thác ạt (từ năm 1992 đến nay) nhằm cung cấp cho thị trường nước xuất nên nguồn Bình vơi tỉnh miền núi phía Bắc mau cạn kiệt Bên cạnh đó, Việt Nam cịn có số lồi Bình vơi coi q hiếm, như: Stephania brachyandra Diels có hàm lượng L-tetrahydropalmatin cao số loài biết (khoảng 2,3-3,5%), phân bố số vùng núi cao 1.000m Hoặc loài Stephania cepharantha Hayta chứa hợp chất Cepharantin, có tác dụng làm thuốc chữa ung thư, phát điểm Quảng Ninh Hịa Bình … Những loài đưa vào danh mục Sách đỏ Danh lục đỏ thuốc Việt Nam để bảo vệ, mức đe dọa tuyệt chủng cao Để khai thác lâu dài nguồn Bình vơi Việt Nam, trước mắt nên khai thác hạn chế, với khối lượng vừa đủ cho nhu cầu sử dụng nước (ước tính 50100 tấn/năm) Bên cạnh đó, cần hồn tất việc nghiên cứu, phát triển số lồi có hàm lượng cao Stephania brachyandra Diels Stephania kwangsienssis H S Lo tỉnh phía Bắc 1.2 Thực trạng gieo trồng bình vơi Hiện Việt Nam thu hái củ Bình Vơi chủ yếu từ nguồn mọc hoang dại Khi thu cạo vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi sấy khô đem chiết rotudin Có thể trồng bình vơi hạt phần đâu củ Thu hái chín vào khoảng tháng 8-10, lấy hạt bảo quản cát ẩm gieo hạt vào mùa xuân (tháng 2-3) Ngoài ươm giống từ hạ, cắt phần đầu củ đề làm giống Mỗi đầu xẻ làm mảnh trồng vào màu xuân Thu hoạch trồng sau 2-3 năm, thời gian lâu xuất cao Trồng hạt có suất cao trồng từ mầm củ Năng suất trung bình củ khơ/ha (Đỗ Tất Lợi, 1991.) 1.3 Các hình thức nhân giống Thực vật có hai hình thức sinh sản chủ yếu, sinh sản hữu tính sinh sản vơ tính Sinh sản hữu tính hình thức sinh sản có sở dựa phân bào giảm nhiễm Hợp tử hình thành kết hợp hai giao tử đực giao tử hai thể bố mẹ Do sinh sản hữu tính có phân ly tái tổ hợp gen, nên thể thường khơng giữ đặc tính di truyền thể bố mẹ cách nguyên vẹn Sinh sản sinh dưỡng hình thức sinh sản có sở dựa vào phân bào nguyên nhiễm Tế bào mẹ sinh tế bào có nhiễm sắc thể giống hệt Do mà thực vật sinh sản sinh dưỡng trì đặc điểm di truyền thể mẹ ổn định qua nhiều hệ Nhân giống sinh dưỡng (vegatative propagation) kĩ thuật tạo từ phận sinh dưỡng lá, cành, củ, thân, mô phân sinh tiếp hợp phận dinh dưỡng (ghép) để tạo thành Theo nghĩa rộng nhân giống sinh dưỡng bao gồm nhân giống củ (mảnh cắt củ), chiết cành, ghép nuôi cấy mô – tế bào + Phương pháp chiết việc tạo rễ cho đoạn cành (thân) mẹ tách cành (thân) khỏi thân mẹ để nhân giống Phương pháp có ưu điểm chiết sớm Tuy nhiên, hệ số nhân giống thấp, chiết nhanh bị cỗi + Phương pháp ghép dùng phân sinh dưỡng mẹ định thân giống ghép lên khác (gốc ghép) để tạo nên hoàn chỉnh Phương pháp cho hệ số nhân giống cao, ghép sinh trưởng tốt, tuổi thọ cao Nhưng phương pháp yêu cầu ghép phức tạp, phương pháp địi hỏi người có kinh nghiệm để lựa chon cành mắt chiết đạt yêu cầu để đảm bảo chất lượng tốt + Phương pháp nhân giống nuôi cấy mô – tế bào phương pháp tạo từ phân nhỏ (các quan, mô, tế bào) cách ni chúng bình ni điều kiện vơ trùng có mơi trường thích hợp kiểm sóat nghiêm ngặt Đây phương pháp nhân giống vơ tính mang lại hiệu cao nhất, chất lượng tốt, đồng Tuy nhiên, việc nuôi cấy mơ thực với quy trình thật nghiêm túc tỉ mỉ, điều kiện trang thiết bị đầy đủ mơ phát triển mơi trường hồn tồn vơ trùng, việc nhân giống thực với quy mô nhỏ phục vụ cho nghiên cứu + Phương pháp nhân giống hom củ (mảnh cắt củ) phương pháp dùng phần lá, đoạn thân, đoạn cành đoạn rễ để tạo gọi Củ phương pháp nhân giống giữ nguyên tính trạng mẹ (do có kiểu gen hồn tồn giống mẹ ban đầu), đơn giản có hệ số nhân lớn, tương đối rẻ tiền nên ngày sử dụng rộng rãi nhân giống rừng, ăn quả, cảnh… 1.4 Cơ sở việc nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Chồi ngủ: Cây thường tạo chồi "ngủ" để chắn sống cịn, chồi chết bị sâu bọ ăn Trong thời dài, lớn lên sản xuất chất điều hồ sinh trưởng (hormone – kích thích tố) để ngăn cản phát triển chồi khác thân Nếu chết đi, chất điều hoà sinh trưởng bị thiếu hụt chồi "ngủ" bắt đầu phát triển Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào: Cơ sở phân hóa phản phân hóa tế bào tính tồn tế bào Mỗi tế bào chun hóa chứa lượng thơng tin di truyền (bộ nhiễm sắc thể) giống với toàn tế bào khác thể trưởng thành giống tế bào hợp tử Nếu tế bào chuyên hóa để điều kiện định tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Đặc tính tế bào gọi tính tồn tế bào Như tế bào phát triển thành hồn chỉnh sở phương pháp nuôi cấy in vitro Về mặt di truyền phân tử nói tồn trình phát triển cá thể từ hợp tử chết tuổi tối đa mã hóa cấu trúc phân tử ADN đặc trưng cho loài Đời sống trình thực chương trình di truyền Sơ đồ thể biệt hóa phản biệt hóa tế bào Q trình biệt hóa TB TB phơi sinh TB giãn TB phân hóa chức Q trình phản biệt hóa TB Cơ sở thứ hai phương pháp nuôi cấy mô - tế bào biệt hóa phản biệt hóa tế bào Sự biệt hóa tế bào q trình tế bào chuyển từ giai đoạn sinh trưởng tế bào sang giai đoạn chuyên hóa chức Các tế bào giai đoạn có đặc trưng khác cấu trúc chức Sự phản 10 phân hóa tế bào trình diễn ngược lại, tế bào biệt hóa mơ chức không khả phân chia mà điều kiện định chúng quay trở lại đóng vai trị mơ phân sinh có khả phân chia tế bào [3], [1] Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ: Trong giai đoạn người ta thường sử dụng loại hóa chất như: HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ nguồn nấm, vi khuẩn tạo chủ động nguồn mẫu cấy Nguồn mẫu ban đầu chồi, hạt phận khác Mục đích giai đoạn tạo nguồn vật liệu để đưa vào nuôi cấy giai đoạn 11 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.5 Mục tiêu nghiên cứu - Bước đầu xây dựng kỹ thuật khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Bình vơi phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật 1.6 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu đề tài Bình vơi (Stephania rotunda Lour.) - Vật liệu nghiên cứu: Chồi ngủ Bình Vơi - Phạm vi nghiên cứu: Phịng ni cấy mơ hợp tác xã Linh Dược Sơn, thành phố Hịa Bình nơi có lồi Bình vơi phân bố tự nhiên 1.7 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro 1.8 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp luận - Các nhân tố tiêu nghiên cứu: phải chia thành cơng thức thí nghiệm khác nhau, phải có công thức đối chứng - Các nhân tố tiêu nghiên cứu: phải bảo đảm tính đồng cơng thức thí nghiệm - Số mẫu cơng thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30) - Thí nghiệm lặp lại ≥ lần 2.4.2 Phương pháp thực nghiệm 12 Sử dụng chồi ngủ làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng cấy vào môi trường MS Khi mẫu tái sinh bật chồi, sau 2-3 tuần cắt chồi cấy chuyển sang mơi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu khả nhân nhanh chồi Khi chồi dài khoảng 3-5 cm tiến hành cắt cấy chuyển sang mơi trường kích thích tạo rễ, chồi khơng đủ kích thước tiếp tục cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh Các mơi trường thí nghiệm chỉnh pH đến 5,8 sau khử trùng 120oC thời gian 20 phút Các mẫu cấy nuôi điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27 oC Đề tài tiến hành thí nghiệm với phương pháp bố trí thí nghiệm sau: 2.4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Có nhiều hóa chất sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ nguồn bệnh tạo lượng lớn mẫu in vitro, hai loại hóa chất sử dụng nhiều có hiệu cao HgCl NaClO - Phương pháp khử trùng: Khử trùng box cấy: Phần thân mang chồi đựng ống phancol, lắc rửa mạnh nước dung dịch nước xà phòng để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt Sau rửa mẫu vịi nước chảy cho hết xà phòng, tráng lại mẫu nước cất Khử trùng box cấy: Phần thân rửa nước cất vô trùng, lắc mạnh 1-2 phút để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt, lặp lại lần Sau tiến hành rửa cồn 70 % phút rửa nước cất vơ 13 trùng (rửa lần) Sử dụng hóa chất HgCl 0,1% NaClO 60% với thời gian khử trùng khác nhau, sau rửa lại 4-5 lần nước cất vơ trùng để loại bỏ hóa chất bám bề mặt tránh gây độc cho chồi Cấy mẫu vào môi trường: Phần thân sau xử lý đưa đĩa vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước bề mặt phần thân, sau cấy lên mơi trường: MS + 8g/l Agar + 30g/l sucrose Thí nghiệm bố trí bảng 2.1 Bảng 2.1: Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Hóa chất Thời Tổng Mẫu gian số mẫu Số Tỷ lệ Công (phút) cấy mẫu mẫu thức (mẫu) sạch (mẫu) (%) KT1 KT2 HgCl 0,1% 30 30 KT3 30 Javen KT4 60% KT5 (NaClO) KT6 12 18 30 30 30 Mẫu tái sinh Thời Số mẫu Tỷ lệ mẫu gian mẫu nẩy nẩy nẩy chồi chồi chồi (%) (ngày) 2.4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro Trong nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng xem nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng nhiều đến hiệu nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng trưởng, phát triển phân hóa mơ suốt q trình ni cấy Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp với đối tượng trồng giai đoạn cụ thể quy trình ni cấy 14 việc cần thiết, để đạt hiệu nuôi cấy cao Trong thí nghiệm này, sử dụng chồi ngủ in vitro để cấy vào loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg Chu (N6), loại môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP + g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Bình Vơi in vitro Thí nghiệm bố trí bảng 2.2 Bảng 2.2: Ảnh hưởng mơi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro Cơng thức thí nghiệm Mơi trường dinh dưỡng Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) MT1 MT2 MT3 MT4 ½ MS MS WPM B5 (Gamborg) N6 (Chu) 45 45 45 45 MT5 Số mẫu tái sinh chồi Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Số chồi TB/mẫu Chất lượng chồi 45 Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant Medium); B5 ( Gamborg Medium); N6 (Chu medium) 2.5 Các tiêu theo dõi thu thập 2.5.1 Chỉ tiêu thu thập + Thí nghiệm nghiên cứu tạo mẫu in vitro: Tỉ lệ mẫu = Tỉ lệ mẫu nảy chồi = Tổng số mẫu Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu nảy chồi Tổng số mẫu cấy x100 (%) x100 (%) Số mẫu cho thí nghiệm ≥ 30 mẫu, Thời điểm thu thập số liệu sau tuần nuôi cấy 15 2.5.2 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu xử lý chương trình Excel Dùng phương pháp phân tích số liệu phần mềm Microsoft Excel 2007, bước tiến hành sau: mở bảng tính Excel → Data → Data analysis → Anova single factoc Anova two factoc with replication → chọn vùng dự liệu phân tích, vùng xuất liệu độ tin cậy 0.05→ nhấn Ok 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1.9 Cơng thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu in vitro Trong quy trình kỹ thuật nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ mẫu có khả tái sinh chồi có ý nghĩa quan trọng bước Vì vậy, cần phải tìm cơng thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu tạo mẫu in vitro khả nảy chồi mẫu Tuỳ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ thời gian khử trùng khác mà hiệu tạo mẫu in vitro thu khác Trong nghiên cứu này, sử dụng phần thân mang chồi Bình Vơi để tạo in vitro sau lấy vật liệu sinh dưỡng cho nhân giống Kết thí nghiệm thu bảng 3.1 Bảng 3.1: Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Thời Tổng số Mẫu Mẫu tái sinh Thời gian mẫu Số mẫu Tỷ lệ Hóa chất gian Tỷ lệ mẫu mẫu nẩy thức mẫu Số mẫu chồi (phút) cấy sạch nẩy nẩy chồi (chồi) (chồi) (ngày) chồi (%) (%) KT1 HgCl2 30 25 83,3 22 73,3 Công KT2 0,1% KT3 KT4 KT5 KT6 Javen 60% (NaClO) 30 27 90,0 14 46,6 10 30 30 100 13,3 12 12 18 30 30 30 22 30 30 73,3 100 100 22 30 26 73,3 100 86,6 6 Kết phân tích phương sai nhân tố cho thấy F tính (65,3) > F crit (3,1) Như có ảnh hưởng rõ rệt công thức khử trùng, điều cho thấy loại hóa chất sử dụng để khử trùng thời gian khử trùng có ảnh hưởng đến khả tạo mẫu in vitro mẫu Bình Vơi 17 Kết bảng 3.1 cho thấy, khử trùng HgCl 0,1% tỷ lệ mẫu cao (83,3 – 100%) tỉ lệ mẫu tái sinh lại thấp Khi tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nẩy chồi giảm xuống thấp đạt 13,3 % công thức KT2 khử trùng HgCl 0,1% phút thời gian nảy chồi chậm Ở công thức KT1 khử trùng HgCl 0,1% phút tỷ lệ mẫu đạt cao đạt 83,3 % tỷ lệ mẫu nẩy chồi cao đạt 73,3%, thời gian lên chồi 10 ngày nuôi môi trường Khi khử trùng mẫu cấy với hoá chất Javen 60% đem lại kết tốt cho tỉ lệ mẫu tỉ lệ mẫu tái sinh cao Thời gian khử trùng 12 phút, tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu tái sinh cao đạt 100%, sau ngày nuôi phận sinh dưỡng nảy chồi Với thời gian khử trùng 18 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp đạt 73,3% 86,6% Từ kết cho thấy, khử trùng Javen 60% cho kết tốt so với HgCl 0,1%, nguyên nhân HgCl chất khử trùng mạnh có độc tính cao tế bào nên tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu tăng tỷ lệ mẫu tái sinh lại giảm thời gian nảy chồi chậm Vậy công thức khử trùng tốt cho phần thân mang chồi ngủ sử dụng Javen 60% thời gian 12 phút cho tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 100%, sau ngày ni nảy chồi 18 B A Hình 3.1 Bộ phận sinh dưỡng Bình Vơi nảy chồi mơi trường MS A Mẫu khử trùng Javen 60% 12 phút; B.Mẫu khử trùng HgCl2 0,1% phút 3.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro Trong nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng xem nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng nhiều đến hiệu nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng trưởng, phát triển phân hóa mơ suốt q trình ni cấy Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp với đối tượng trồng giai đoạn cụ thể quy trình ni cấy việc cần thiết, để đạt hiệu ni cấy cao Trong thí nghiệm 19 này, sử dụng chồi in vitro để cấy vào loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, gồm: Mơi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg Chu (N6) (Bảng 3.2), loại môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP + g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Bình Vơi in vitro Kết thí nghiệm thu thập sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.2 Bảng 3.2: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro Mơi trường dinh dưỡng ½ MS MS WPM Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) 45 45 45 Số mẫu tái sinh chồi 25 28 26 Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) 84,44 93,33 88,89 MT4 B5 (Gamborg) 45 20 66,67 1,68 - MT5 N6 (Chu) 45 16 57,78 1,44 - CTTN MT1 MT2 MT3 Số chồi TB/mẫu 1,71 2,35 1,86 Chất lượng chồi + +++ ++ Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant Medium); B5 ( Gamborg Medium); N6 (Chu medium) Kết phân tích phương sai nhân tố ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro, cho kết sau: Ftính = (24,4) > Fcrit = (3,4), chứng tỏ mơi trường dinh dưỡng khác có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tái sinh chồi Bình Vơi in vitro Kết bảng 3.2 cho thấy, Chồi Bình Vơi cấy vào mơi trường 1/2MS cho số chồi trung bình đạt 1,71 chồi/mẫu chất lượng chồi mức trung bình (chồi yếu, xanh vàng, phiến hẹp, mỏng) Ở công thức môi trường MS mẫu cấy có khả tái sinh tốt nhất, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 20 93,33%, số chồi trung bình đạt 2,35 chồi/mẫu chất lượng chồi tốt (chồi mập, khỏe mạnh, xanh đậm, chồi phát triển nhanh) Trong mơi trường cịn lại mơi trường WPM cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao đạt 88,90 %, số chồi trung bình 1,83 chồi/mẫu; mơi trường B5 N6 cho hiệu mẫu tái sinh thấp, chất lượng chồi Tóm lại, mơi trường MS phù hợp cho tái sinh chồi Bình Vơi điều kiện nuôi cấy in vitro 21 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 1.10 Kết luận Công thức khử trùng vật liệu nuôi cấy tốt sử dụng dung dịch Javen 60% (NaClO) 12 phút, tỷ lệ mẫu in vitro đạt 100%, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 100%, thời gian mẫu chồi sau ngày nuôi Công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh chồi Bình Vôi in vitro môi trường: MS + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + g/l Agar + 30g/l sucrose, cho số chồi trung bình đạt 5,25 chồi/mẫu chiều cao trung bình chồi 3,85 cm, chất lượng chồi tốt 1.11 Khuyến nghị Từ kết luận tồn xin đưa số khuyến nghị sau: - Thử nghiệm kết nghiên cứu vào thực tiễn - Tiến hành điều tra đặc điểm sinh vật học Bình vơi nhiều tỉnh khác để tổng hợp nhận xét đưa kết tốt 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Thị Đào (2008 ), “Ảnh hưởng số nhân tố tới kết giâm củ cắt Tai chua ” Khoá luận tốt nghiệp 2008, GVHD Kiều Văn Thịnh Phan Nguyên Hồng, Vũ Văn Dũng (1978); Sinh thái thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội Dương Mộng Hùng “ Nhân giống Phi lao Củ cành” ĐH Lâm Nghiệp số 11/1992 Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003) Giáo trình giống rừng Nhà xuất Nơng Nghiệp Đồn Thị Mai cộng (2000) Kết bước đầu vê nhân giống Bạch đàn lai phương pháp nuôi cấy mô phân sinh Tạp chí Lâm nghiệp, 10 : 46 – 47 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ Sinh học thực vật cải tiến giống trồng Nhà xuất Nông Nghiệp Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên Thực vật rừng Lê Văn Chi (1992) Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng vi lượng hiệu cao Nhà xuất Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội Lê Đình Khả, 1993, “ Nhân giống Keo tràm Keo tai tượng” Tạp chí lâm nghiệp số 5/1993 10 Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng, giáo trình giống rừng, 2003 11 Lê Đình Khả, Đồn Thị Bích, Trần Cự, “ Nghiên cứu tạo chồi, môi trường giá thể giâm củ cắt Bạch đàn trắng”, tạp chí Lâm nghiệp dố 10/1996 12 Lê Đình Khả, Trần Cự, Lê Thị Xuân (1996 ), “ Nhân giống Thông đỏ bắng Củ”, tạp chí Lâm nghiệp số 9/1996 13 Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Cấn Thị Lan (1998) “ Nhân giống Sao đen thuốc bột TTG”, tạp chí khoa học lâm nghiệp số 8/1998 23 14 Ngô Kim Khơi (1998), Thống kê tốn học Lâm nghiệp, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội 15 Hồng Kin Ngũ – Phùng Ngọc Lan: Giáo trình sinh thái rừng, ĐH Lâm nghiệp, NXB nông nghiệp, Hà Nội 16 Lê Đức Thọ (2007 ) “ Nhân giống vơ tính chàm (Melaleula caujuputy Powell ) phương pháp giâm củ cắt” Luận văn tốt nghiệp trường ĐH Lâm Nghiệp 17 Nguyễn Hữu Thước cộng sự: “Ảnh hưởng chế đọ che sáng đến Xà Cừ” Tập san SVĐH III 1964 Tr.35-38 18 Nguyễn Hữu Thước, Lê Văn Khôi: “Nghiên cứu yêu cầu ánh sáng Mỡ giai đoạn tuổi non” Tập san SVĐH III 19 Thái Văn Trừng (2000): “Những hệ sinh thái rừng mưa nhiệt đới Việt Nam”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 20 Phạm Văn Tuấn (1997) “ Nhân giống rừng Củ, thành tựu khả áp dụng Việt Nam” Tổng luận chuyên khảo kỹ thuật Lâm nghiệp Việt Nam NXB Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 21 Đỗ Tất Lợi, 1991 Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB BNN 24 ... sở việc nghiên cứu ? ?i? ??u kiện khử trùng tạo mẫu nu? ?i cấy mô từ ch? ?i ngủ Ch? ?i ngủ: Cây thường tạo ch? ?i "ngủ" để chắn sống cịn, ch? ?i chết bị sâu bọ ăn Trong th? ?i d? ?i, lớn lên sản xuất chất ? ?i? ??u. .. cho việc sản xuất hóa dược v? ?i quy mơ lớn Chính lý đây, đề t? ?i tiến hành thực n? ?i dung nghiên cứu ? ?Nghiên cứu ? ?i? ??u kiện khử trùng tạo mẫu nu? ?i cấy mô từ ch? ?i ngủ? ?? nhằm cung cấp thêm thông tin phương... Vật liệu nghiên cứu: Ch? ?i ngủ Bình V? ?i - Phạm vi nghiên cứu: Phịng nu? ?i cấy mô hợp tác xã Linh Dược Sơn, thành phố Hịa Bình n? ?i có l? ?i Bình v? ?i phân bố tự nhiên 1.7 N? ?i dung nghiên cứu Nghiên cứu