QUY TRÌNH ĐỊNH TÝP GEN CagA VÀ VacA CỦA Helicobacter pylori BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION Hồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Tuấn Anh, Trần Thiện Trung Địa liên lạc: PGS TS BS Trần Thiện Trung, Bộ môn Ngoại, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, điện thoại: 0903645659, Email: tranthientrung @ yahoo.com TĨM TẮT Chúng tơi xây dựng quy trình phát định týp gen cagA vacA vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori) bệnh phẩm dựa kỹ thuật multiplex PCR Quy trình xây dựng bao gồm bước kiểm tra mẫu, phát triển phương pháp tách chiết DNA, tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR xác định độ nhạy phản ứng Tiếp theo, quy trình kiểm tra số mẫu sinh thiết dày bệnh nhân ung thư viêm dày Kết cho thấy quy trình có khả phát định týp xác gen cagA vacA vi khuẩn H pylori cách nhanh chóng đơn giản Quy trình xây dựng thành cơng, có khả phát triển thành phương pháp chẩn đốn nhanh, xác sử dụng cơng cụ nghiên cứu dịch tễ học nhiễm H pylori, tìm hiểu mối liên quan týp gene cagA vacA với biểu lâm sàng bệnh nhân ung thư viêm dày ABSTRACT PROTOCOL FOR THE DETECTION OF VACA GENOTYPES AND CAGA GENE OF HELICOBACTER PYLORI FROM GASTRIC BIOPSIES BY A NOVEL MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY We set up a multiplex PCR-based protocol for the detection and genotyping of cagA and vacA genes The protocol includes clinical samples selection, DNA extraction, multiplex PCR optimization and sensitivity determination The set up protocol was then applied to some gastric cancer and gastritis biopsies We showed that this can be a rapid and simple method to detect and genotype H pylori in clinical samples The multiplex PCR protocol can be developed into a rapid and accurate diagnostic kit as well as a tool to study H pylori infection epidemiology and the relationship between cagA and vacA genotypes with clinical manifestations in patients ĐẶT VẤN ĐỀ Helicobacter pylori (H pylori), xoắn khuẩn Gram âm có dày người, chứng minh có liên quan đến bệnh dày-tá tràng ung thư dày (7) Các chủng H pylori khác có độc tính khác q trình gây bệnh người (2) Nhiều gen H pylori ñược chọn ñể phát diện vi khuẩn bệnh phẩm (urease, rRNA 16S, gen bám-adhesion gene…) Trong nghiên cứu này, chúng tơi quan tâm đến hai gen cagA (cytotoxinassociated gene) vacA (vacuolating toxin gene) sản phẩm chúng ñược coi hai yếu tố ñộc lực chủ yếu có khả gây bệnh đặc trưng vi khuẩn H pylori (1, 4) Sự kết hợp týp gen khác hai gen liên quan đến biểu lâm sàng khác người bệnh Gen cagA khơng có tất chủng H pyori Sự diện gen cagA chủng thường có liên quan ñến hậu lâm sàng nghiêm trọng cho người bị nhiễm (3) Protein cagA, có kích thước từ 128 đến 140 kDa, có khả kích thích phản ứng phosphoryl hóa tyrosine tế bào ký chủ, dẫn ñến tăng sinh bất thường tế bào biểu mơ dày (9) Trong đó, gen vacA có mặt tất chủng H pylori, cảm ứng hình thành khơng bào Cấu trúc gen chứa hai vùng biến đổi gồm vùng “tín hiệu” vùng “giữa” Vùng “tín hiệu” có týp gen s1 s2 Vùng có týp gen m1 m2 Độc lực cao hay thấp gen vacA phụ thuộc vào týp gen 185 hai vùng Chủng H pylori với týp gen s1/m1 tạo ñộc tố mạnh có khả gây bệnh cao chủng khác, chủng H pylori với týp gen s2/m2 tạo khơng tạo độc tố (1) Việc phát phân týp H pylori thực nhiều phương pháp giải trình tự, PCR lai phân tử với mẫu dị đặc hiệu Trong đó, phương pháp PCR có nhiều ưu ñiểm ñộ nhạy cao, thao tác nhanh, chi phí thấp Phương pháp PCR sử dụng thành cơng để phát phân týp cagA vacA trực tiếp từ mẫu sinh thiết dày ñược dùng ñể phát H pylori từ nhiều nguồn mẫu khác dịch dày, nước bọt, mảng cao phân người (10) Ngoài ra, việc áp dụng kỹ thuật multiplex PCR cho phép phát ñịnh týp ñồng thời gen vacA cagA phản ứng Nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình multiplex PCR để định týp gen cagA vacA H pylori từ mẫu sinh thiết dày bệnh nhân viêm ung thư dày có H pylori-dương tính Từ phát triển phương pháp chẩn đốn nhanh xác nhiễm H pylori, ñồng thời cung cấp công cụ nghiên cứu dịch tễ học nhiễm H pylori, phương pháp ñể tìm hiểu mối liên quan týp gene cagA vacA với biểu lâm sàng bệnh nhân ung thư viêm dày ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh phẩm bệnh nhân ung thư dày ñược lấy sau phẫu thuật cắt 2/3 dày, mẫu mô sinh thiết niêm mạc bệnh nhân viêm dày ñược lấy qua nội soi có kết H pylori-dương tính hai thử nghiệm CLO test giải phẫu bệnh ñược dùng cho nghiên cứu Các bệnh nhân ñược khám ñiều trị Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh khoảng thời gian từ tháng 12/2008 ñến tháng 4/2010 Mẫu sinh thiết, kích thước khoảng 3-5 mm, giữ eppendorf 1.5mL chứa sẵn dung dịch xử lý mơ TS (TE SDS), cắt thật nhỏ, sau vortex mạnh 10-15 giây ủ nhiệt độ 700C 20 phút Thêm vào 10 µL dung dịch proteinase K ủ tiếp nhiệt ñộ 700C 20 phút 700C qua ñêm Kết thúc giai đoạn này, tiến hành tách chiết DNA từ mẫu ñã xử lý giữ -200C cho ñến tách chiết Việc tách chiết DNA gen H pylori từ mẫu sinh thiết ñã xử lý ñược thực theo nguyên tắc hấp phụ ñặc hiệu DNA lên pha rắn (màng silica) Nguyên tắc ñã ñược ứng dụng thành công vào kit tách chiết Cột “DNA column-based extraction kit” chúng tơi tối ưu hóa cho việc tách chiết DNA từ mẫu mô sinh thiết dày Tất thao tác ñều ñược thực theo ñúng hướng dẫn kit nhà sản xuất DNA gen H pylori sau tách chiết ñược dùng ñể tiến hành phản ứng multiplex PCR hệ thống PCR CFX96TM Real-Time (BioRad) Hỗn hợp phản ứng multiplex PCR bao gồm 1U Taq DNA polymerase (Bio-Rad), 200 µM dNTPs, mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 200 nM loại mồi xuôi ngược (IDT) gồm mồi cagA (8), vacA s1/s2 (6, 8), vacA m1/m2 (6, 8), 50 nM mồi chứng nội hGSTP (glutathione-S-transferase) (5) µl DNA tách chiết tổng thể tích phản ứng 25µl Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR bao gồm phút 30 giây 950C, 40 chu kỳ lặp lại gồm 20 giây 940C, 40 giây 600C 40 giây 720C, cuối phút 720C Sản phẩm nhân ñược quan sát qua ñiện di gel agarose 3% nhuộm ethidium bromide (0.2mg/mL) với thang phân tử 100 bp (Bio-Rad) Mẫu DNA H pylori chứng phản ứng PCR sản phẩm nhân có týp gen cagA (+) vacA s1m1 cagA (+) vacA s1m2 ñược xác ñịnh phương pháp giải trình tự KẾT QUẢ Xây dựng quy trình multiplex PCR Bước kiểm tra hoạt ñộng mồi (primer) sử dụng ñể phát H pylori ñể ñịnh týp gene vacA cagA Kết ñiện di sản phẩm phản ứng multiplex PCR (hình 1) tương ứng với kiểu gen cagA (+)/(-) , vacA s1/s2, vacA m1/m2 gen hGSTP từ mẫu sinh thiết chứa H pylori bệnh nhân 186 Kết cho thấy sản phẩm PCR tạo có kích thước phù hợp với kích thước dự kiến: vacA m1/m2 (567/642 bp), cagA (349 bp), vacA s1/s2 (259/286 bp) hGSTP (192 bp) Tín hiệu thu mạnh đặc hiệu, khơng có sản phẩm ký sinh Điều cho thấy mồi gồm cặp mồi sử dụng phản ứng multiplex PCR hoạt ñộng tốt với nồng ñộ chương trình xác định Các sản phẩm nhân kiểm tra giải trình tự cho thấy phù hợp với trình tự gen H pylori cơng bố (kết khơng trình bày đây) Hình 1: Kết multiplex PCR phát phân týp gen cagA vacA H pylori Giếng (+), chứng dương DNA H pylori có kiểu gen cagA (+), vacA s1m2; giếng (-), chứng âm; giếng 1, cagA (-), vacA s1m2; giếng 2, cagA (+), vacA s1m2; giếng 3, cagA (+), vacA s1m1 Giếng 4, cagA (-), vacA s2m2; giếng M, thang phân tử 100-bp (Bio-Rad) Bước tiếp theo, chúng tơi kiểm tra tính phù hợp hai loại mẫu dùng phát H pylori, mẫu sinh thiết tươi mẫu sinh thiết ñã xử lý CLO test Kết (hình 2) cho thấy hai loại mẫu cho tín hiệu mạnh đặc hiệu Hình 2: Kết multiplex PCR mẫu mô tươi mô sau thực CLO test 187 Giếng M, thang phân tử 100 bp; giếng (-), chứng âm; giếng (+), chứng dương DNA H pylori; giếng A, mẫu sinh thiết người thứ nhất; giếng B, mẫu sinh thiết người thứ hai Xác ñịnh ñộ nhạy phương pháp multiplex PCR, trước tiên chúng tơi định lượng hàm lượng DNA gen H pylori số mẫu kit ñịnh lượng H pylori (Primer design) Sau chúng tơi pha lỗng mẫu theo bậc mười tới mức pha lỗng 1.104 lần xác định giới hạn phát phương pháp cho mẫu dựa kết ñịnh lượng nêu Kết mẫu (hình 3) cho thấy phương pháp cho phép phát H pylori mẫu 48 sao/phản ứng (tương ứng với 10 sao/µL dịch DNA tách chiết), 132 sao/phản ứng (26 sao/µL DNA tách chiết) 64 sao/phản ứng (12 sao/ µL DNA tách chiết) Hình Kết khảo sát ñộ nhạy phương pháp mPCR Giếng M, thang phân tử 100 bp; giếng 1, 2, 3, 4, 5: bậc pha loãng 100, 101, 102, 103, 104 dịch DNA từ mẫu A; giếng 6, 7, 8, 9, 10, tương tự ñối với mẫu B; giếng 11, 12, 13, 14, 15, tương tự ñối với mẫu C Áp dụng quy trình multiplex PCR để phát týp gen phân týp H pylori 30 mẫu bệnh phẩm viêm ung thư dày Kết ñược trình bày bảng Bảng Kết multiplex PCR ñịnh týp gen vacA cagA 30 bệnh phẩm Định týp gen Số mẫu (n=30) Phát H pylori cagA, vacA Dương tính cagA (+) vacA 12 s1m1 cagA (+) vacA s2m2 cagA (+) vacA 10 s1m2 cagA (+) vacA s2m1 cagA (-) vacA s1m1 cagA (-) vacA s2m2 cagA (-) vacA s1m2 cagA (-) vacA s2m1 Âm tính 188 Kết cho thấy 30 mẫu, quy trình phát 25 mẫu dương tính với H pylori Trong số mẫu dương tính, có 12 mẫu có týp gen cagA (+), vacA s1m1; 10 mẫu có týp gen cagA (+), vacA s1m2; mẫu có týp gen cagA (-), vacA s2m2; mẫu có týp gen cagA (-), vacA s1m2 BÀN LUẬN Để phát ñịnh týp H pylori PCR, nhiều phương pháp xử lý mẫu tách chiết ñã ñược dùng với nhiều loại mẫu khác Với loại mẫu sinh thiết mẫu mô ung thư mẫu mô từ niêm mạc dày, chọn phương pháp tách chiết DNA dựa nguyên tắc hấp phụ pha rắn sau so sánh với số phương pháp khác phenol : chloroform : isoamyl alcohol, xử lý mô với nhiệt, xử lý học (kết không trình bày đây) Phương pháp hấp phụ DNA lên pha rắn an tồn với người sử dụng, có thao tác nhanh, ñơn giản cho phép thu hồi lượng lớn DNA tinh Ngoài ra, việc phát thành công vi khuẩn H pylori mẫu mô sinh thiết ñã xử lý ñược vùi thử nghiệm CLO test, cho thấy kết không khác với mẫu mơ sinh thiết tươi Nghiên cứu chúng tơi cho phép giảm số lượng số lần lấy mẫu mơ sinh thiết người bệnh, từ mẫu mơ sinh thiết sử dụng cho hai loại xét nghiệm CLO test PCR Phản ứng multiplex PCR dùng phát ñịnh týp gen vi khuẩn H pylori đạt hiệu độ xác cao, với cường độ tín hiệu đặc trưng cho gen không chênh lệch Điều cho thấy ñiều kiện phản ứng ñã ñược tối ưu hóa phù hợp cho nhân gen Kết áp dụng quy trình số bệnh phẩm bệnh nhân viêm ung thư dày nghiên cứu cho thấy ưu týp gen cagA (+), vacA s1m1; cagA (+), vacA s1m2 KẾT LUẬN Phương pháp multiplex PCR kỹ thuật xác nhanh, cho phép phát hiện, ñịnh danh týp gen, phân týp vi khuẩn H pylori từ mẫu mô sinh thiết niêm mạc dày qua nội soi; từ bệnh phẩm phẫu thuật bệnh nhân ñể phục vụ cho nghiên cứu dịch tễ học, bệnh học ñiều trị Kết cơng trình góp phần vào việc phát triển phương pháp chẩn đốn xác, ñơn giản hiệu ñể phát nhiễm vi khuẩn từ chủng H pylori khác có yếu tố ñộc lực với khả gây bệnh khác bệnh nhân mắc bệnh viêm dày, loét dày-tá tràng ung thư dày TÀI LIỆU THAM KHẢO Atherton, J C., P Cao, R M Peek, Jr., M K Tummuru, M J Blaser, and T L Cover Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration J Biol Chem 1995, 270:17771-7 Atherton, J C., R M Peek, Jr., K T Tham, T L Cover, and M J Blaser Clinical and pathological importance of heterogeneity in vacA, the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori Gastroenterology 1997, 112:92-9 Blaser, M J., G I Perez-Perez, H Kleanthous, T L Cover, R M Peek, P H Chyou, G N Stemmermann, and A Nomura Infection with Helicobacter pylori strains possessing cagA is associated with an increased risk of developing adenocarcinoma of the stomach Cancer Res 1995, 55:2111-5 De Martel, C., M Plummer, L J van Doorn, J Vivas, G Lopez, E Carillo, S Peraza, N Munoz, and S Franceschi Comparison of polymerase chain reaction and histopathology for the detection of Helicobacter pylori in gastric biopsies Int J Cancer 2009 Kangsadalampai, S., P Rojpibulstit, T Ratanavalachai, and P Tomtitchong CagA-positive Helicobacter pylori and the gastroduodenal pathology Thammasat Int J Sc Tech 2005, Vol 10 189 10 Kumar, S., A Kumar, and V K Dixit Direct detection and analysis of vacA genotypes and cagA gene of Helicobacter pylori from gastric biopsies by a novel multiplex polymerase chain reaction assay Diag Microbiol Infect Dis 2008, 62:366-73 Marshall, B J Helicobacter pylori Am J Gastroenterol 1994, 89:S116-28 Park, C Y., M Kwak, O Gutierrez, D Y Graham, and Y Yamaoka Comparison of genotyping Helicobacter pylori directly from biopsy specimens and genotyping from bacterial cultures J Clin Microbiol 2003, 41:3336-8 Peek, R M., Jr., M F Vaezi, G W Falk, J R Goldblum, G I Perez-Perez, J E Richter, and M J Blaser Role of Helicobacter pylori cagA(+) strains and specific host immune responses on the development of premalignant and malignant lesions in the gastric cardia Int J Cancer 1999, 82:520-4 Rudi, J., A Rudy, M Maiwald, D Kuck, A Sieg, and W Stremmel Direct determination of Helicobacter pylori vacA genotypes and cagA gene in gastric biopsies and relationship to gastrointestinal diseases Am J Gastroenterol 1999, 94:1525-31 190 ... Phát H pylori cagA, vacA Dương tính cagA (+) vacA 12 s1m1 cagA (+) vacA s2m2 cagA (+) vacA 10 s1m2 cagA (+) vacA s2m1 cagA (-) vacA s1m1 cagA (-) vacA s2m2 cagA (-) vacA s1m2 cagA (-) vacA s2m1... Áp dụng quy trình multiplex PCR ñể phát týp gen phân týp H pylori 30 mẫu bệnh phẩm viêm ung thư dày Kết trình bày bảng Bảng Kết multiplex PCR ñịnh týp gen vacA cagA 30 bệnh phẩm Định týp gen Số... 30 mẫu, quy trình phát 25 mẫu dương tính với H pylori Trong số mẫu dương tính, có 12 mẫu có týp gen cagA (+), vacA s1m1; 10 mẫu có týp gen cagA (+), vacA s1m2; mẫu có týp gen cagA (-), vacA s2m2;