adn tái tổ hợp

Chuyên đề: KĨ THUẬT DNA TÁI TỔ HỢP Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Xuân Viết Học viên : Nguyễn Thị Hải Yến Mã HV : k24 0393 NỘI DUNG I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT DNA TÁI TỔ HỢP Khái niệm - Kỹ thuật DNA tái tổ hợp liên quan đến việc cắt, nối đoạn DNA có nguồn gốc khác tạo thành phân tử DNA có chức năng, tức phân tử phiên mã, dịch mã, tái tạo số lượng lớn tế bào invitro - Phân tử DNA bao gồm đoạn DNA mà trật tự xếp chúng không tồn tự nhiên gọi DNA tái tổ hợp Cơ sở sinh học phân tử DNA tái tổ hợp - Với cấu trúc đặc biệt phân tử DNA bắt cặp nghiêm ngặt bazơ nitơ, nhiều nhà nghiên cứu nảy ý tưởng: tạo đuôi hai sợi phân tử DNA khác chúng nối lại với nhờ bắt cặp bổ sung - Vào năm 70, phương pháp khác nhau, người ta tạo phân tử DNA tái tổ hợp - Năm 1972, nhóm nghiên cứu trường đại học Stranford (PaulBerg) đưa phương pháp đuôi để nối phân tử DNA khác Để tạo đầu dính, người ta sử dụng enzyme terminal transferase Dưới tác dụng enzyme này, người ta tạo đuôi poly nucleotide khoảng 50 đến 100 gốc adenine (polyA) đầu OH (3’) mạch đơn DNA SV 40 (Simian virus 40) đuôi polyT DNA plasmid mở enzyme Sau trộn lẫn hai loại DNA này, đuôi bổ sung adinine thymine bắt cặp lại với với có mặt enzyme ligase, hai DNA nối lại tạo plasmid tái tổ hợp vịng Vì an toàn cho cộng đồng nên sản phẩm tái tổ hợp không biến nạp tế bào chủ Tuy chưa hoàn tất, thực nghiệm Berg cho ta hai vấn đề mấu chốt DNA tái tổ hợp Ơng cho rằng, dùng enzyme để cắt DNA cách định trước đoạn DNA lồi khác nối lại với - Năm 1973, Staley Cohen Annie Chang tạo phân tử DNA tái tổ hợp từ lồi khác nhau, có nhiều ưu điểm biến nạp tế bào chủ Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp đời Sau đó, nhiều nhà khoa học lao vào thí nghiệm lắp ghép gen nhanh chóng thu kết có ứng dụng thực tiễn Kỹ thuật tái tổ hợp DNA Rerg, Chang, Boyer Cohen đề giúp nhà sinh học làm thay đổi tính di truyền thể sống theo chiều hướng định trước vượt qua hàng rào ngăn cản loài Mỗi tổ hợp DNA tạo nên đặc điểm sinh học kể mặt di truyền lẫn sinh hóa - Vậy người ta gọi DNA tái tổ hợp DNA lai, tìm invitro (trong ống nghiệm) cách tổ hợp DNA thuộc lồi khác Ví dụ: Hai vector plasmid, phage λ cài mảnh DNA lạ để tạo DNA tái tổ hợp (Hình dưới) Các DNA lạ gọi đoạn cài hay DNA ngoại lai Nó mảnh (đoạn) DNA gen mà người nghiên cứu quan tâm ghép vào DNA plasmid hay DNA virus - Tóm lại, thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp bắt đầu với enzyme, ví dụ enzyme giới hạn endonuclease có khả cắt đoạn DNA lớn thành đoạn nhỏ Tiếp đến, đoạn DNA nối với nhờ DNA ligase Hơn nữa, phân tử DNA có mang tâm tái số lượng chúng tăng cao sau đưa vào tế bào vi khuẩn Ví dụ, đoạn DNA có chứa gen cắt từ genome người ghép vào plasmid (có tâm chép) tạo thành phân tử DNA tái tổ hợp Phân tử đưa trở lại tế bào vi khuẩn Sau 24 nuôi cấy, khoảng 1012 phân tử giống hệt phân tử ban đầu tạo Do đó, số lượng đoạn DNA mang gen người nhân lên theo Lúc này, đoạn DNA xem tách dòng plasmid mang DNA lạ gọi vector tách dịng (cloning vector) Nếu vector có mang promoter tín hiệu kết thúc phiên mã phù hợp đoạn DNA phiên mã dịch mã tổng hợp protein theo mã di truyền đoạn DNA Nếu vector tách dòng đưa vào tế bào động vật, DNA lạ ghép vào genome tế bào biểu tính trạng Vấn đề đặt làm tách gen riêng biệt khỏi genome? Làm xác định phân tử mARN tương ứng với gen? Khi có gen, tổng hợp protein invitro invivo hay không? Mặt khác điều khiển hoạt động gen sau thay đổi (gây đột biến) trình tự nucleotide hay không? Trong thể, đa số gen hoạt động cách chuyên biệt, tức chúng thường biểu số, chí loại tế bào biệt hóa thời điểm định, với mức độ biểu khác Làm để tìm gen biết chức chúng? Ngồi có bệnh đột biến gen gây (bệnh di truyền)nhưng sản phẩm gen chưa xác định làm để phân lập gen tìm biến đổi mức độ DNA liên quan đến bệnh? tất vấn đề nêu sinh học phân tử giải quyết, đặc biệt nhờ áp dụng kỹ thuật tách dòng DNA tái tổ hợp Cắt DNA enzyme giới hạn (restriction endonuclease) - Enzyme cắt giới hạn (RE) công cụ kỹ thuật DNA tái tổ hợp - Enzyme cắt giới hạn có khả nhận biết phân cắt DNA vị trí có nucleotide xếp theo trật tự - Tùy thuộc vào khoảng cách vị trí nhận biết vị trí cắt để phân biệt enzyme giới hạn thành loại khác Các enzyme nhận biết cắt vị trí xếp vào loại II Đây enzyme sử dụng nhiều kỹ thuật DNA tái tổ hợp, chúng chủ yếu tách chiết từ vi sinh vật - Enzyme giới hạn nhận biết cắt trình tự đặc hiệu gồm đến nucleotide Đặc điểm trình tự đối xứng tức trình tự nucleotide vị trí cắt sợi đơn giống theo chiều (5’-> 3’ 3’ ->5’) - Enzyme cắt sợi đơn DNA điểm tạo đầu cắt phẳng enzyme gọi enzyme cắt đầu - Tại vị trí nhận biết enzyme giới hạn cắt sợi đơn DNA lệch vài nucleotide tạo đầu có sợi đơn so le Những enzyme gọi enzyme cắt đầu so le Enzyme tạo đầu so le thông dụng DNA tái tổ hợp DNA ligase nối đoạn DNA đầu so le với hiệu suất cao nhiều so với đoạn đầu - Xác suất phân bố vị trí nhận biết enzyme giới hạn giảm tỷ lệ nghịch với số nucleotide vị trí nhận biết DNA chứa loại nucleotide A, T, G, C khác Xác suất để nucleotide xếp theo trật tự (1/4)4= 1/ 256 Như vậy, trung bình đoạn DNA dài 256 nucleotide có vị trí enzyme giới hạn nhận biết nucleotide xếp theo trật tự xác định Xác suất giảm xuống 1/4000 vị trí gồm nucleotide Như vậy, phân cắt genome có kích thước xác định, số lượng chiều dài đoạn tạo thành phụ thuộc vào việc lựa chọn số nucleotide vị trí nhận biết củ enzyme giới hạn Ngồi cần ý đến tượng methyl hóa DNA ức chế số enzyme nhận biết vị trí có C A bị methyl hóa Ví dụ, HpaII MspI nhận biết CCGG hoạt tính chúng thay đổi tùy thuộc vào nhóm methyl gắn vào C hay C Mục đích tạo DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp chế tác với mục đích để thực q trình gọi tách dịng Tách dịng tách lập thu nhận nhiều đồng gen hay mảnh đoạn DNA Tách dịng kèm khơng kèm với biểu protein Những áp dụng DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập ngân hàng gen, cDNA tổng hợp protein, enzyme, hormone, Những yêu cầu DNA tái tổ hợp - DNA tái tổ hợp phải đạt yêu cầu cần thiết vector chuyển gen - DNA tái tổ hợp phải có hoạt tính đưa vào tế bào chủ - DNA tái tổ hợp phải có dấu hiệu dễ phát quần thể vi khuẩn Và dễ quan sát hoạt động biểu gen tái tổ hợp Các cơng đoạn tạo DNA tái tổ hợp - Chọn nguyên liệu DNA chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường DNA plasmid DNA phage Chúng thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, tách làm theo phương pháp chiết tách DNA plasmid, DNA virus DNA chứa gen cần nghiên cứu (DNA lạ) thu nhận từ tế bào sinh vật chiết tách làm kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA Ngoài ra, người ta sử dụng DNA tổng hợp phương pháp h óa học tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme chép ngược theo chế nuclease S1 kỹ thuật Gubler-Hoffman Các enzyme để cắt, nối đoạn DNA lại với enzyme ristriction, enzyme ligase với hợp tác số enzyme khác kinase alkanline phosphotase, - Công đoạn cắt với tham gia enzyme RE kiểu II RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: enzyme cắt hạn chế vị trí xác định dùng cơng nghệ DNA tái tổ hợp chúng có số ưu điểm: Hầu có kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên Mỗi enzyme cắt vị trí phù hợp định trước bên hay cạnh trình tự nhận biết Chúng cần ion Mg+2 không cần lượng ATP Các enzyme gặp chuỗi đích phân tử DNA cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu hay đầu dính Hiệu cắt enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác hàm lượng enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH độ tinh khiết DNA - Cơng đoạn nối với có mặt DNA ligase Bước kĩ thuật di truyền nối đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang DNA lạ Phản ứng nối thực nhờ enzyme DNA ligase DNA ligase enzyme xúc tác phản ứng nối hai mảnh DNA cách tạo cầu nối phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hai nucleotide đứng cạnh (Hình 6-2) Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase chất keo phân tử để kết dính mẫu DNA lại với +Nối đầu Nối đầu xảy hai đoạn DNA đầu đứng cạnh Dưới tác dụng enzyme ligase, liên kết phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hình thành hai nucleotide nối lại với Khả nối hai đoạn DNA đầu thấp Để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ đoạn DNA +Nối đầu lệch Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch có bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại để tạo liên kết hydro bazơ nitơ bổ sung Sau đó, hai nucleotide hai đầu nối tạo liên kết este OH(3’) P(5’) tác dụng enzyme DNA ligase Phản ứng nối thực theo sơ đồ biểu diễn Hình Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp a Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch - Chọn xử lí DNA plasmid Plasmid tách từ tế bào E Coli tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo plasmid hở có hai đầu lệch - Chọn xử lí đoạn cài DNA đoạn cài thu nhận lựa chọn, tinh chế theo mục đích nghiên cứu Cắt DNA enzyme RE loại II loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI) để tạo vết cắt giống - Tạo plasmid tái tổ hợp Ghép đoạn cài vào plasmid cách ủ DNA đoạn cài với plasmid với có mặt enzyme DNA ligase, ta thu DNA tái tổ hợp Phản ứng nối xảy theo sơ đồ biểu diễn Hình b Phương pháp sử dụng đoạn nối (linker) - Chọn xử lí vector plasmid:(tương tự trên) - Chọn xử lí đoạn cài Linker đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, tổng hợp phương pháp hóa học, cho linker phải có trình tự nhận biết enzyme cắt hạn chế loại II Ví dụ EcoRI có chuỗi đích G/AATTC cDNA đầu tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme chép ngược theo chế nuclease S1 Metyl hóa vùng hạn chế có đoạn cDNA sợi đơi nhận biết enzyme EcoRI Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA enzyme DNA ligase để tạo phân tử lai Cắt phân tử DNA lai enzyme EcoRI, ta phân tử lai có hai đầu lệch c Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT) - Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính enzyme terminal transferase có khả gắn loại nucleotide vào đầu 3’(OH) phân tử DNA - Cách tạo DNA tái tổ hợp phương pháp tiến hành theo bước sau Bước Chọn phân lập DNA lạ đầu plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có chứa chuỗi đích nhận biết enzyme BamHI (G/GATCC) Cắt plasmid enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính Cắt DNA lạ enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai đầu lệch Bước Ủ DNA lạ với loại nucleotide dCTP với có mặt enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyC đầu 3’(OH) DNA lạ Ủ plasmid với loại nucleotide dGTP với có mặt enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG đầu 3’(OH) plasmid hở Bước Đưa DNA lạ vào plasmid với có mặt enzyme DNA ligase, đầu mút homopolymer có trình tự bổ sung ( -GGGG 3’/3’CCCC -) bắt cặp với Bước Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester cuối tạo plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích nhận biết enzyme BamHI - Ưu điểm phương pháp ghép DNA lạ đầu vào plasmid để tạo DNA tái tổ hợp chế tác DNA đầu lệch từ DNA đầu + Xử lí tế bào chủ dung dịch CaCl2 nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào + ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ xử lí - Hiệu suất phương pháp hóa biến nạp vào khoảng 10 đến 106 tế bào biến nạp 1mg DNA tái tổ hợp Qua kết thực nghiệm, người ta thấy rằng, tế bào phát triển pha sớm đến pha dễ biến nạp - Những nghiên cứu sau cho thấy việc xử lí tế bào ion kim loại hóa trị hai Mg+2, Mn +2 Ba +2 cho khả biến nạp lớn.Ngồi ra, hiệu suất biến nạp cịn phụ thuộc vào kích thước plasmid, plasmid nhỏ hiệu suất biến nạp cao b Điện biến nạp - Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao cục theo xung để tạo lỗ nhỏ màng sinh học tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp dễ dàng - Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có lên tới 70% Hiệu suất phương pháp phụ thuộc vào yếu tố sau: + Độ mạnh điện trường tác động khác loại tế bào khác nhau, + Độ dài số thời gian (thời gian ngắt xung - ms) Theo nhiều nghiên cứu, hầu hết loại tế bào sinh vật, hiệu biến nạp cao số thời gian đạt khoảng 6ms, + Nồng độ tế bào chủ, + Nồng độ DNA tái tổ hợp, + Giai đoạn phát triển tế bào (tế bào già non khơng thích hợp), + Mơi trường dung dịch đệm, + Cấu trúc màng tế bào c Biến nạp tế bào trần (protoplast) - Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ xử lí polyetylen glycol (PEG) Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30% đến 40% Đây phương pháp chuyển gen có hiệu cao tế bào thực vật Bằng phương pháp này, người ta nhận mang gen biến nạp ổn định di truyền qua nhiều hệ (Potrykus cộng - 1995) Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen thị gen cần biến nạp cao Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast loại Đặc biệt loại có giá trị kinh tế cao lúa, ngô, đại mạch - Nhược điểm: Việc tái sinh protoplast cịn khó khăn số loài d Phương pháp bắn gen - Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng bao bọc DNA bắn trực tiếp vào tế bào - Ưu điểm: Phương pháp biến nạp cho tất loại tế bào thực vật Thao tác dễ dàng, bắn lần nhiều tế bào - Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận biến nạp khảm (cây có tế bào biến nạp tế bào không biến nạp) - Một số thành tựu đạt phương pháp bắn gen: Năm 1988, Mc Cabe cộng nhận đậu tương biến nạp phương pháp bắn gen Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm cộng nhận ngơ biến nạp nhiều phịng thí nghiệm Những năm gần có hàng loạt cơng bố biến nạp thành công lúa Năm 1996, Zthang cộng biến nạp đu đủ, mía bơng Điều khẳng định tính ưu việt phương pháp e Phương pháp vi tiêm - Phương pháp vi tiêm phương pháp sử dụng vi kim kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào định - Đây trình lai ghép cho tế bào bậc cao tế bào hợp tử Tùy thuộc trường hợp cụ thể, người ta chọn phương pháp cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu cao - Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào định đưa DNA vào loại tế bào Đưa xác chí vào tận nhân tế bào quan sát Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn, tế bào tiền phơi tiến hành cách xác Có thể biến nạp cho giống - Nhược điểm: Một phát tiêm tế bào thao tác cần phải khéo léo tỉ mỉ f Tải nạp - Tải nạp tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, có trình chuyển gen tái tổ hợp gen vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage) - Thực nghiệm chứng minh tải nạp E Coli qua phage λ, phage P1 Bacillus subtilis qua phage SP10 So với phương pháp trên, tải nạp cho hiệu suất cao - Như vậy, đến có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, học sinh học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ Tùy đối tượng yêu cầu cụ thể, phương pháp hay phương pháp khác có hiệu sử dụng nhiều Kỹ thuật tách dòng (tạo dòng) a Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài mảnh (chuỗi) DNA lạ vào vector (plasmide phage λ) phương pháp hóa sinh Sau đó, đưa phân tử lai vào tế bào chủ chọn lựa phương pháp biến nạp tải nạp Trường hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen cấu trúc enzyme b Mục đích tách dịng - Thiết lập ngân hàng gen, - Thiết lập ngân hàng cDNA, - Sản xuất protein, enzyme, - Sản xuất vaccine, - Sản xuất kháng sinh c Các bước phương pháp tách dịng Q trình thực thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia mục đích q trình tách dịng Tuy nhiên để tạo dòng, cần phải thực bước sau - Tách lập DNA lạ cần tạo dòng - Chọn cắt DNA lạ tế bào cho enzyme cắt hạn chế (RE) Phân lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector mục đích cần tạo dịng Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng gen chưa biết, người nghiên cứu tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dịng dự đốn cấu trúc protein gen huy tổng hợp tổng hợp cDNA từ mRNA - Tạo đầu dính cần thiết - Chọn xử lí vector + Chọn vector cần phải ý yêu cầu sau: độ lớn gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector phương pháp ứng dụng + Xử lí vector: cắt vector enzyme cắt hạn chế loại với enzyme cắt DNA nói (để tạo vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khử nhóm phosphat enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại - Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp) + Việc tạo DNA tái tổ hợp cách ghép DNA lạ vào vector cắt enzyme cắt hạn chế loại II, đó, chúng ghép đơi đầu dính lại với nhờ bắt cặp bổ sung Một phản ứng ghép nối xảy với có mặt enzyme DNA ligase E Coli phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai - Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ phương pháp biến nạp tải nạp + Công đoạn nhằm mục đích sử dụng máy tế bào chủ để chép vector tái tổ hợp thành số lượng lớn Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa có khả thấm vector tái tổ hợp Sự thấm xảy cách tự nhiên cảm ứng Tuy nhiên, phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector phụ thuộc vào định vị vùng cài lắp chứa bên vector mà người nghiên cứu chọn phương pháp biến nạp tải nạp + Biến nạp tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần tiếp xúc hai tế bào nhân tố trung gian phage virus Biến nạp thực với vector chuyển gen plasmid Có nhiều phương pháp biến nạp hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen phương pháp vi tiêm + Tải nạp tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian virus Tải nạp thực với vector chuyển gen có nguồn gốc virus phage, cosmid, - Phát dịng cần tìm Cơng việc kiểm tra diện gen mong muốn Việc chọn lựa chủng ý muốn khơng đơn giản, cách tiến hành thí nghiệm hỗn hợp khơng đồng nên dịng vi khuẩn mọc lên theo ba khả + Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp, + Tế bào nhận plasmid khơng có gen lạ, + Tế bào vi khuẩn nhận plasmid tái tổ hợp Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có phương pháp khác để xác định dịng cần tìm Nếu mục đích nghiên cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng đầu dò Nếu đoạn DNA biết (cDNA), cơng việc đơn giản nhanh chóng - Kiểm tra thu nhận sản phẩm gen tái tổ hợp Tùy trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa phương pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm gen tái tổ hợp Nếu mục đích thiết lập ngân hàng cDNA, ta phải tiến hành bước sau: Đầu tiên người ta phải tách plasmid tái tổ hợp khỏi dịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp enzyme RE loại II thu hai băng DNA, có độ dài khung vector, cịn băng khác có độ dài tương ứng cDNA Cách kiểm tra lại cDNA cắt cách điện di gel agaroza 0,8% kiểm tra lại độ dài băng cDNA thu Những đoạn có kích thước khác di chuyển khoảng cách khác gel Nếu sản phẩm gen tái tổ hợp protein, enzyme, hormone, vaccine, kháng sinh, người ta thu nhận sản phẩm phương pháp chiết tách lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn trao đổi ion d Một số phương pháp xác định dòng cần tìm - Phương pháp lai axit nucleic + Khái niệm đầu dò Các đầu dò mảnh DNA đánh dấu, có khả nhận biết chuỗi DNA RNA đồng đẳng qua lai hóa + Đặc điểm đầu dò Là đoạn axit nucleic (DNA RNA) sợi đơn Đầu dò phải bổ sung bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết Đầu dị phải so mốc được, đầu đánh dấu phóng xạ + Các loại đầu dị cDNA làm đầu dị cực tốt, ngồi ra, mRNA oligonucleotide làm đầu dị Nếu chuỗi DNA chưa biết trình tự, người ta phải tinh lượng nhỏ protein tương ứng với DNA nghiên cứu từ tổng hợp đầu dị Cịn phần DNA phải so mốc biết cơng việc dễ dàng để tổng hợp đầu dò + Nguyên tắc phương pháp lai axit nucleic Dựa vào khả biến tính nhiệt độ tăng hồi tính hạ nhiệt độ từ từ DNA Khi tăng nhiệt độ DNA lên nhiệt độ sinh lý (thường khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn DNA tách rời liên kết hydro bị đứt Khi hạ nhiệt độ từ từ khối DNA biến tính với điều kiện thích hợp khác, mạch đơn bắt cặp trở lại Sự bắt cặp xảy hai trình tự DNA hồn tồn bổ sung cho Tính đặc hiệu cực lớn phản ứng lai cho phép trình tự mạch đơn tìm gặp mạch bổ sung với nó, chúng nằm hàng triệu trình tự DNA RNA khác Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát đoạn lai + Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu (đầu) dị đánh dấu đồng vị phóng xạ hóa chất Biến tính dịng cần tìm dạng sợi, sau hạ nhiệt độ từ từ, sợi đơn tương đồng bắt cặp với Sự bắt cặp xảy DNA DNA, RNA DNA, RNA RNA - Phương pháp sử dụng kháng thể + Nguyên tắc Dựa vào phản ứng đặc trưng số protein kháng thể mà nhận biết qua phản ứng đặc trưng phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa + Cách tiến hành Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein) Tách protein biểu q trình tạo dịng Ủ protein với kháng thể đặc trưng Sau tiến hành nhận biết thơng qua dấu hiệu phản ứng đặc trưng protein kháng thể + Ứng dụng Chủ yếu sử dụng y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên cứu gắn vào vector phải biểu protein tạo dòng đồng thời, vector tạo dòng phải vector biểu (ví dụ vector λgt11) Protein biểu cần phải có kháng thể đặc trưng Phương pháp phát hoạt tính xen đoạn + Nguyên tắc: Dựa vào khả kháng thuốc vi khuẩn mang vector tái tổ hợp chúng nuôi cấy môi trường kháng sinh Phạm vi sử dụng: Phương pháp dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ vector pBR322 Trong plasmid pBR322 có hai gen kháng thuốc AmPR TetR Trên gen có điểm nhận biết RE nơi cài đặt DNA lạ Khi gắn DNA lạ vào hai gen nói gen nhận đoạn cài khả kháng thuốc Quan sát khuẩn lạc bị gen kháng thuốc, chứng tỏ khuẩn lạc có chứa gen cần tạo dòng + Ưu điểm phương pháp tốn so với phương pháp lai - Phương pháp phát thay đổi kiểu hình + Nguyên tắc Dựa vào thay đổi màu sắc khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc có chứa gen lạ + Cách tiến hành Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dịng có chứa gen lacZ (ví dụ dãy pUC), mẫu để so sánh mẫu để cài DNA lạ vào gen lacZ Sau đó, ni cấy hai mẫu mơi trường có chất cảm ứng X-Gal (5 brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside) Chất cảm ứng bị phân hủy enzyme β-galactosidase tạo galactose X (dẫn xuất indol), ngồi mơi trường, dẫn xuất bị oxy hóa cho màu xanh đậm - Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase Còn plasmid thứ cho khuẩn lạc màu trắng, điều chứng tỏ chứa DNA lạ cài gen lacZ chọn khuẩn lạc màu trắng e Ngân hàng gen - Ngân hàng gen sinh vật tập hợp trình tự DNA cấu thành gen gắn vào vector, biểu diễn tổng số gen - Ngân hàng tạo từ sưu tập DNA tái tổ hợp chuỗi mã hóa lẫn chuỗi khơng mã hóa Khác với ngân hàng cDNA, ngân hàng gen thiết lập loại tế bào sinh vật nghiên cứu - Các bước thiết lập ngân hàng gen: + Tách làm DNA sinh vật, + Cắt DNA thành đoạn có kích thước xác định enzyme RE loại II - thông thường, người ta sử dụng EcoRI, + Vector chọn để tạo dòng gen thường cosmid phage λ xử lý EcoRI, + Tạo vector tái tổ hợp đóng gói vỏ phage, + Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ tạo dịng, + Xác định đặc tính biểu dòng vi khuẩn vừa lập, + Tiến hành sàng lọc, nghĩa phải tách vector có đoạn DNA ưa chuộng, từ xây dựng ngân hàng gen - Đặc điểm ứng dụng: + Ngân hàng gen chứa đoạn DNA lớn 100 lần so với cDNA + Giải mã thông tin di truyền chứa gen, đặc biệt cấu trúc intron exon gen xác định + Tạo dịng trình tự DNA khơng mã hóa nằm cạnh gen mã hóa đóng vai trị định điều hòa biểu gen f Ngân hàng cDNA - Thiết kế ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA tập hợp cDNA từ tất mDNA tế bào Như vậy, ngân hàng thiết lập từ loại tế bào xác định (tế bào biệt hóa), thế, cDNA mang tính tế bào cao - Q trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm bước sau đây: + Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn tế bào có chứa nhiều mRNA cần thiết sau đó, làm mRNA, + Chọn lựa mRNA chứa nhiều A (polyA) cách tách cột xenlulose oligo dT, + Tổng hợp cDNA sợi kép đầu từ mRNA tác dụng enzyme chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 kỹ thuật Gubler-Hoffman, + Metyl hóa vùng hạn chế (có đoạn cDNA sợi đơi) nhận biết enzyme EcoRI để bảo vệ vùng không bị cắt thao tác với EcoRI, + Tạo đầu dính cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết EcoRI, sau đó, cắt enzyme EcoRI Trong trường hợp này, có đoạn nối bị cắt cDNA nguyên vẹn (do metyl hóa) Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp, + Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp mở EcoRI khử nhóm phosphat, + Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp, + Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ nuôi cấy điều kiện thích hợp để tạo dịng, + Xác định dịng cần tìm thành lập ngân hàng cDNA - Mục đích việc thiết lập ngân hàng cDNA nhằm nghiên cứu biểu gen xác định với vấn đề liên quan đến điều hòa biểu gen mối tương tác gen trình sống - Khi phân tích kết thu ngân hàng cDNA, cần ý tác dụng sinh lí thời điểm thí nghiệm - Sàng lọc ngân hàng cDNA Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng cDNA DNA plasmid từ mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitroxenlulose (màng lai) bị biến tính lai với mRNA tổng số Mỗi mRNA khác lai nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung Các mRNA bám vào màng lọc tách dùng để tổng hợp protein mà mã hóa hệ thống dịch mã invitro Protein hình thành đem phân tích xem có phải sản phẩm mRNA cần tìm hay khơng, từ đó, xác định vi sinh vật nuôi cấy chứa gen mong muốn Sàng lọc tất mẻ nuôi cấy theo cách để xác định dịng đơn thể gen tìm kiếm II ỨNG DỤNG CỦA DNA TÁI TỔ HỢP TRONG CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT DNA tái tổ hợp ứng dụng nhiều lĩnh vực khác chọn giống thực vật, động vật, vi sinh vật, y sinh học, thủy sinh học… nhiên, ứng dụng nhiều chuyển gen thực vật đạt nhiều thành tựu to lớn Trước hết ta tìm hiểu khái quát chuyển gen thực vật Khái niệm chung - Trước đây, để tạo giống nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại gen hai cá thể thực vật tạo lai mang tính trạng mong muốn Tuy nhiên, phương pháp có nhiều hạn chế Ngày nay, cơng nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống lúc đưa vào loài trồng gen mong muốn có nguồn gốc từ thể sống khác nhau, khơng lồi có họ gần mà cịn lồi xa Phương pháp hữu hiệu cho phép nhà tạo giống thực vật thu giống nhanh vượt qua giới hạn kỹ thuật tạo giống truyền thống - Cây chuyển gen (transgenic plant) mang nhiều gen đưa vào phương thức nhân tạo thay thơng qua lai tạo trước Những gen tạo đưa vào (gen chuyển) phân lập từ lồi thực vật có quan hệ họ hàng từ loài khác biệt hoàn toàn Thực vật tạo gọi thực vật “chuyển gen” thực tế tất thực vật “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại chúng q trình hóa, chọn lọc lai giống có kiểm sốt thời gian dài Nhìn chung, việc ứng dụng chuyển gen có lợi ích rõ rệt sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những chuyển gen “thế hệ thứ nhất” giúp giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa học hướng đến việc tạo chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng giá trị dinh dưỡng có đặc điểm thích hợp cho cơng nghiệp chế biến Lợi ích trồng hướng trực tiếp vào người tiêu dùng Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ngô khoai tây - Những giống ngô trồng điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm có nguy tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật Bao gồm: - Mối nguy hiểm việc vơ tình đưa chất gây dị ứng làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả phát tán gen biến nạp trồng sang họ hàng hoang dại - Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với chất độc tiết từ chuyển gen - Nguy chất độc tác động tới sinh vật loại sinh vật cần diệt, làm cân sinh thái Nhìn chung, cịn điểm cịn chưa rõ ràng chuyển gen với khả tạo giống trồng có giá trị kinh tế, cơng nghệ có vai trị khơng thể phủ nhận Tuy vậy, số vấn đề đáng lo ngại Để giải vấn đề kết luận thu phải dựa thơng tin tin cậy có sở khoa học - Khái niệm thực vật chuyển gen + Muốn tạo sinh vật biến đổi gen (genetically modified organism-GMO) cần phải có phương pháp thích hợp để đưa DNA ngoại lai (foreign DNA) vào tế bào chúng + Quá trình đưa DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) sinh vật gọi trình biến nạp (transformation) Những biến nạp gọi biến đổi gen (genetically modified plant-GMP) Ứng dụng công nghệ gen công tác giống trồng đại có nhiều ưu điểm, chẳng hạn như: Bằng việc biến nạp gen thu mang đặc tính xác định Rào cản lồi khơng cịn có tác dụng, khơng gen từ thực vật mà từ vi khuẩn, nấm, động vật người chuyển thành công vào thực vật Về nguyên tắc thay đổi vùng điều khiển gen, promoter terminator Tuy nhiên, số trường hợp đòi hỏi thay đổi phù hợp codon Những đặc điểm không mong muốn thực vật Chẳng hạn, tổng hợp chất độc chất gây dị ứng loại trừ cơng nghệ gen Thực vật biến đổi gen lò phản ứng sinh học (bioreactor) sản xuất hiệu protein chất cần thiết dùng dược phẩm thực phẩm Mở khả nghiên cứu chức gen trình phát triển thực vật trình sinh học khác Vì vậy, thực vật biến đổi gen có ý nghĩa nghiên cứu Trong lai tạo giống đại, công nghệ gen giúp làm giảm mâu thuẫn kinh tế môi trường sinh thái Bằng việc sử dụng trồng kháng thuốc diệt cỏ giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật Một số nguyên tắc việc chuyển gen a Một số nguyên tắc sinh học Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: - Khơng phải tồn tế bào thể tính tồn (totipotency) - Các khác có phản ứng không giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hồn tồn khơng có khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập DNA ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thơng qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các DNA (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - Trong đó, DNA virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) b Phản ứng tế bào với trình chuyển gen Mục đích chuyển gen đưa đoạn DNA ngoại lai vào genome tế bào vật chủ có khả tái sinh biểu ổn định tính trạng Nếu q trình biến nạp xảy mà tế bào không tái sinh thành cây, tái sinh diễn mà không kèm theo biến nạp thí nghiệm biến nạp chưa thành cơng Ở nhiều lồi thực vật, điều khó khăn phải xác định cho kiểu tế bào có khả tiếp nhận biến nạp Hạt phấn hay tế bào noãn sau biến nạp dùng để tạo biến nạp hồn tồn, thơng qua q trình thụ tinh bình thường Hạt phấn thường coi nguyên liệu lý tưởng để gây biến nạp Trong đó, việc biến nạp gen vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn Trong trường hợp này, người ta thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi Việc biến nạp gen tế bào đơn mô phức tạp phôi hay mô phân sinh thường cho khảm Từ nhiều thập kỷ qua người ta biết rằng, tính tồn thể tế bào thực vật tạo điều kiện cho tái sinh hoàn chỉnh in vitro qua trình phát sinh quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi Các chồi bất định hay phôi hình thành từ tế bào đơn hoạt hóa phận dễ dàng tiếp nhận biến nạp có khả cho biến nạp hồn chỉnh (khơng có tính khảm) Các bước chuyển gen Từ người ta khám phá thí nghiệm chuyển gen thực nhờ loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, nhà khoa học tin Agrobacterium chuyển gen vào tất trồng Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc (một mầm) hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bắn gen vi đạn (bombardement/gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) Đến nay, nhờ cải tiến vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Quá trình chuyển gen thực qua bước sau : - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cDNA từ thư viện genomic DNA) - Gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E coli - Tách chiết DNA plasmid - Biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác kể - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) Nguyên liệu để thực biến nạp tế bào thực vật riêng lẽ, mô hoàn chỉnh Cản trở lớn tiếp nhận DNA phần lớn sinh vật thành tế bào Muốn làm thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzyme điều kiện thích hợp người ta tạo tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, tế bào đặt xung điện ngắn, xung điện làm xuất lỗ tạm thời màng tế bào, phân tử DNA vào bên tế bào Sau biến nạp người ta tách enzyme phân giải tế bào phát triển, thành tế bào tạo nên Các tế bào biến nạp nuôi cấy môi trường nhân tạo thích hợp với chất kích thích sinh trưởng để tạo nên hồn chỉnh Sau phương pháp phân tích genome PCR, Southern blot, Northern blot thực để tìm xác biến đổi gen Bên cạnh phương pháp biến nạp Agrobacterium xung điện, có hai phương pháp khác thường sử dụng để đưa DNA vào tế bào vi tiêm bắn vào tế bào vi đạn (microprojectile), thường vàng wolfram, bao bọc DNA Ở động-thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối thường tế bào biến nạp, mà thể biến nạp hoàn toàn Phần lớn thực vật tái sinh dễ dàng nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, tái sinh mầm ngũ cốc loại cỏ khác gặp vài khó khăn Từ tế bào biến nạp người ta tạo chuyển gen, tế bào mang DNA ngoại lai tiếp tục chuyển cho hệ sau sau nở hoa tạo hạt Ví dụ Chọn tạo dịng ngơ chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Trương Thu Hằng Trường Cao đắng Sư phạm Thái Nguyên Dường Quang Trung, Phường Thịnh Dán, TP Thái Nguyên Nhận ngày 09 tháng 10 năm 2012 Chỉnh sửa ngày 24 tháng 10 năm 2013; chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2013 - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm gen kháng sâu (CryIAc) Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cDNA từ thư viện genomic DNA) Gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp ADN plasmid vector Padtl chứa gen kháng sâu CryIAc điều khiển đoạn khởi động Ubiquitin gen chọn lọc thực vật hyg (H) Padt2 chứa gen kháng sâu CryIAc điều khiển đoạn khởi động Ubiquitin gen chọn lọc thực vật pmi (M) Biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens chủng LB4404 sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 mang ADN plasmid vector Padtl chứa gen kháng sâu CryIAc điều khiển đoạn khởi động Ubiquitin gen chọn lọc thực vật hyg (H) Padt2 chứa gen kháng sâu CryIAc điều khiển đoạn khởi động Ubiquitin gen chọn lọc thực vật pmi (M) Tách chiết DNA plasmid Biến nạp vào mô tế bào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens chủng LB4404 + Tạo dịch huyền phù Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens chủng LB4404 chứa plasmid quan tâm cất giữ glycerol -200C nuôi cấy mơi trường LB có bổ sung kháng sinh với nồng độ thích hợp Thu dịch huyền phù vi khuẩn sử dụng để lây nhiễm với phôi ngô non + Lây nhiễm vi khuẩn với phôi Bắp non thu từ ngô mẹ trồng nhà lưới Ngay sau thu, phôi non tách điều kiện vô trùng Phôi non sau đưa vào mơi trường IM có bổ sung AS dịch huyền phù vi khuẩn 30-60 phút, lắc nhẹ nhiệt độ 210C, điều kiện tối + tiến hành đồng nuôi cấy môi trường cộng sinh CCM nuôi phục hồi môi trường ReM điều kiện thích hợp Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc + Chọn lọc mô sẹo chuyển gen Mô sẹo tạo thành từ phôi non biến nạp môi trường ReM cấy chuyển sang mơi trường ReM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật tương ứng, nuôi điều kiện thời gian thích hợp + Tạo chồi Mơ sẹo phơi hố tạo thành mơi trường chọn lọc ReM cấy chuyển sang mơi trường ReM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật thích hợp để tái sinh chồi, nuôi điều kiện môi trường phù hợp Tái sinh biến nạp + Chồi tái sinh môi trường chọn lọc SeM đặc trưng cấy chuyển sang mơi trường RM tạo hồn chỉnh có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật, ni điều kiện mơi trường thích hợp ... DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập ngân hàng gen, cDNA tổng hợp protein, enzyme, hormone, Những yêu cầu DNA tái tổ hợp - DNA tái tổ hợp phải đạt yêu cầu cần thiết vector chuyển gen - DNA tái tổ hợp. .. lại tạo plasmid tái tổ hợp vòng Vì an tồn cho cộng đồng nên sản phẩm tái tổ hợp không biến nạp tế bào chủ Tuy chưa hoàn tất, thực nghiệm Berg cho ta hai vấn đề mấu chốt DNA tái tổ hợp Ơng cho rằng,... hoạt tính đưa vào tế bào chủ - DNA tái tổ hợp phải có dấu hiệu dễ phát quần thể vi khuẩn Và dễ quan sát hoạt động biểu gen tái tổ hợp Các cơng đoạn tạo DNA tái tổ hợp - Chọn nguyên liệu DNA chọn