TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7538-6:2010 ISO 10381-6:2009 CHẤT LƯỢNG ĐẤT – LẤY MẪU – PHẦN : HƯỚNG DẪN VỀ THU THẬP, XỬ LÝ VÀ BẢO QUẢN MẪU ĐẤT Ở ĐIỀU KIỆN HIẾU KHÍ ĐỀ ĐÁNH GIÁ CÁC QUÁ TRÌNH HOẠT ĐỘNG, SINH KHỐI VÀ TÍNH ĐA DẠNG CỦA VI SINH VẬT TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM Soil quality – Sampling – Part : Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory Lời nói đầu TCVN 7538-6:2010 thay TCVN 5960:1995 (ISO 10381-6:1993) TCVN 7538-6:2010 hoàn toàn tương đương với ISO 10381-6:2009 TCVN 7538-6:2010 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 190 Chất lượng đất biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN 7538 (ISO 10381) Chất lượng đất – Lấy mẫu bao gồm phần sau: - TCVN 7538-1 (ISO 10381-1) Phần 1: Hướng dẫn thiết kế chương trình lấy mẫu; - TCVN 7538-2 (ISO 10381-2) Phần 2: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu; - TCVN 7538-3 (ISO 10381-3) Phần 3: Hướng dẫn an toàn; - TCVN 7538-4 (ISO 10381-4) Phần 4: Hướng dẫn trình điều tra vùng tự nhiên, bán tự nhiên vùng canh tác - TCVN 7538-5 (ISO 10381-5) Phần 5: Hướng dẫn qui trình điều tra vùng đô thị vùng công nghiệp liên quan đến nhiễm bẩn đất; - TCVN 7538-6 (ISO 10381-6) Phần 6: Hướng dẫn thu thập, xử lý bảo quản mẫu đất điều kiện hiếu khí để đánh giá trình hoạt động, sinh khối tính đa dạng vi sinh vật phòng thí nghiệm Bộ ISO 10381 gồm phần sau: - ISO 10381-7 Part 7: Guidance on sampling of soil gas; - ISO 10381-8 Part 8: Guidance on sampling of stockpiles Lời giới thiệu Đất thực thể phức tạp không đồng chúng bao gồm hợp phần hữu sinh vô sinh xảy mối kết hợp khác Do vậy, điều kiện đất, từ giai đoạn thu thập đến giai đoạn hoàn thành thí nghiệm cần phải xem xét đến mối liên quan đến vi sinh vật đất Nhiệt độ, hàm lượng nước, nồng độ oxy có sẵn thời gian bảo quản tất biết có ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đất, ảnh hưởng đến trình chúng sinh sống Tuy nhiên, đất sử dụng hữu hiệu hệ thống phòng thí nghiệm để khảo sát trình vi sinh vật, miễn động thái hệ vi sinh vật đất dự kiến Tiêu chuẩn cung cấp hướng dẫn thu thập, xử lý bảo quản đất phòng thí nghiệm hoạt tính vi sinh vật hiếu khí hợp phần nghiên cứu Tiêu chuẩn mô tả cách giảm thiểu ảnh hưởng nhiệt độ, hàm lượng nước oxy trình hiếu khí để tạo thuận lợi cho tính tái lập phép xác định phòng thí nghiệm CHẤT LƯỢNG ĐẤT – LẤY MẪU – PHẦN : HƯỚNG DẪN VỀ THU THẬP, XỬ LÝ VÀ BẢO QUẢN MẪU ĐẤT Ở ĐIỀU KIỆN HIẾU KHÍ ĐỀ ĐÁNH GIÁ CÁC QUÁ TRÌNH HOẠT ĐỘNG, SINH KHỐI VÀ TÍNH ĐA DẠNG CỦA VI SINH VẬT TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM Soil quality – Sampling – Part : Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn thu thập, vận chuyển bảo quản mẫu đất để sau tiến hành thử nghiệm điều kiện hiếu khí phòng thí nghiệm Những khuyến nghị tiêu chuẩn không áp dụng cho việc xử lý đất nơi có điều kiện ký khí trì liên tục Tiêu chuẩn chủ yếu áp dụng cho vùng đất có khí hậu ôn hòa Đất lấy điều kiện khí hậu khắc nghiệt (ví dụ, đất đóng băng thường xuyên, đất nhiệt đới) cần xử lý đặc biệt Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 2.1 Hiếu khí (aerobic) Mô tả điều kiện mà có ôxy phân tử tự 2.2 Kị khí (anaerobic) Mô tả điều kiện mà ôxy phân tử 2.3 Hàm lượng nước theo khối lượng khô (water content on a dry mas basis) Khối lượng nước bay từ đất sấy đất nhiệt độ 105 0C đến khối lượng không đổi, chia cho khối lượng khô đất nhân với 100 Quy trình 3.1 Lựa chọn địa điểm lấy mẫu Các địa điểm lấy mẫu vị trí lấy mẫu cần phải lựa chọn theo mục đích nghiên cứu Những địa điểm cần phải nhận biết rõ ghi chép lại, ví dụ đồ cách đối chiếu với vật cố định dễ nhận dùng đồ đối chiếu chi tiết GIS Nếu địa điểm lấy mẫu cần đánh dấu cho chúng dùng cho thử nghiệm so sánh để lấy mẫu lại 3.2 Mô tả vị trí lấy mẫu Việc lựa chọn vị trí lấy mẫu đất tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu cụ thể, hiểu biết lịch sử khu vực đất đai lấy mẫu Vị trí lấy mẫu cần phải mô tả cách xác cung cấp lịch sử vị trí Các chi tiết thảm thực vật bao phủ đất, địa hình vùng lấy mẫu (ví dụ khu vực phẳng, độ nghiêng, độ dốc), điều kiện hóa học sinh học cố ô nhiễm cần phải ghi chép lại viết vào báo cáo 3.3 Điều kiện lấy mẫu Mẫu đất để tiến hành nghiên cứu điều kiện phòng thí nghiệm, phải lấy trường nơi đất có hàm lượng nước không gây khó khăn cho việc rây đất Tránh lấy mẫu sau đất bị khô hạn ( ví dụ tháng), bị đóng băng bị ngập lụt, trừ yêu cầu khác nghiên cứu Nếu thử nghiệm để phục vụ cho việc quan trắc trường, chấp nhận lấy mẫu với điều kiện có trường Mẫu đất làm lạnh trước nghiên cứu, ví dụ, trình oxi hóa amoni 3.4 Phương pháp lấy mẫu Kỹ thuật lấy mẫu tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu Nếu yêu cầu lấy mẫu đất canh tác hiếu khí, thông thường mẫu lấy suốt chiều sâu tầng canh tác thực Bất lớp phủ thực vật bề mặt đất bao phủ, lớp rác phủ rêu, rễ cây, cành rác từ gỗ động vật sống đất nhìn thấy phải nhặt bỏ để giảm đến mức thấp việc bổ sung cacbon hữu vào đất Thành phần hữu sinh từ rễ nguồn khác gây thay đổi đoán trước thành phần hoạt tính hệ vi sinh vật đất Nếu đất tự nhiên có tầng khác biệt mẫu đất cần lấy tầng 3.5 Đánh dấu mẫu Dụng cụ chứa mẫu cần phải đánh dấu rõ ràng rành mạch phân định cho mẫu thể địa điểm khu vực mẫu lấy Cần tránh sử dụng dụng cụ chứa mẫu hấp thụ nước từ đất tiết chất, ví dụ dung môi chất dẻo, hòa vào mẫu đất 3.6 Điều kiện vận chuyển mẫu Mẫu cần vận chuyển theo cách thức cho giảm tới mức thấp thay đổi hàm lượng nước đất, mẫu cần giữ tối, tiếp xúc với không khí dễ dàng; nói chung túi polyetylen thắt lỏng đáp ứng nhu cầu Cần phải tránh điều kiện môi trường khắc nghiệt: đất nên giữ mát tốt quan trọng không làm cho đất bị khô cứng trở nên sũng nước Tránh tiếp xúc với ánh sáng thời gian dài điều kích thích phát triển tảo bề mặt đất Tránh để đất bị nén vật lý tốt Mẫu dùng cho phân tích AND ARN cần phải làm lạnh thật nhanh trường sử dụng đá khô Trong trình vận chuyển tới phòng thí nghiệm, đá khô sử dụng để giữ nhiệt độ mẫu để phân tích ARN Mẫu dùng cho phân tích AND vận chuyển hộp mát ngoại trừ trường hợp yêu cầu phải sử dụng đá khô 3.7 Xử lí đất Đất cần xử lý nhanh tốt sau lấy mẫu Thực vật, động vật sống đất sỏi sạn cần phải loại bỏ trước rây qua rây cỡ lỗ mm Rây đất qua rây cỡ lỗ mm để tạo thuận lợi cho trao đổi khí hạt đất nên giữ đất điều kiện hiếu khí tự nhiên đất Đồng thời cần loại bỏ đá sỏi nhỏ, động vật mẫu vụn thực vật khỏi đất Một số chất hữu lớp đất bùn lầy than bùn khó lọt qua rây có lỗ mm cần phải rây với rây có lỗ mm điều kiện ẩm Công việc cần đến thao tác thủ công chất lượng vật liệu lọt qua rây phụ thuộc vào người thực Nếu đất bị ẩm rải đất ra, thổi nhẹ không khí vào đất để tạo điều kiện cho đất khô Đất cần bóp vụn tay đảo để tránh lớp đất bề mặt bị khô Thông thường công việc thực điều kiện nhiệt độ xung quanh không đổi Nếu cần làm khô đất không nên làm khô mức cần thiết để tạo thuận lợi cho công việc rây đất Nói chung, không nên làm khô đất làm khô không khí làm ẩm lại ảnh hưởng đến sinh lý nói chung quần thể vi khuẩn đất bề mặt Trường hợp làm khô làm ẩm lại gây thay đổi đáng kể tính động thái C N vi sinh vật mà kéo dài tháng [12] Làm ẩm lại sau làm khô dẫn đến bùng phát hô hấp phát triển quần thể vi khuẩn rõ rệt [15] Nếu bảo quản mẫu đất lâu phương pháp xử lý cần xem xét theo thông số nêu 3.8 3.8 Điều kiện bảo quản thời gian bảo quản Mẫu đất cần bảo quản chỗ tối với nhiệt độ (4 ± 2) 0C, tiếp xúc dễ dàng với không khí Đựng mẫu vào túi chất dẻo thắt lỏng đựng túi tương tự nói chung phù hợp với yêu cầu nêu Cần phải cẩn thận để đảm bảo khối lượng đất lưu giữ không nhiều để không cho điều kiện yếm khí xảy đáy dụng cụ chứa mẫu Mẫu đất cần phải xử lý (xem 3.7) trước bảo quản để đảm bảo điều kiện hiếu khí ổn định Điều quan trọng đất không để bị khô trở nên sũng nước thời gian bảo quản Mẫu đất không để chồng lên Sử dụng mẫu đất sau lấy sớm tốt Cần phải giảm đến mức thấp nguyên nhân làm trì hoãn việc vận chuyển mẫu Nếu cần phải bảo quản mẫu điều tránh khỏi đất không bảo quản ba tháng trừ mẫu đất cho thấy dấu hiệu hoạt động vi sinh vật đất Các mẫu đất dùng cho phân tích AND phải làm lạnh nhiệt độ -200C không xử lý Đối với phân tích ARN, mẫu phải làm lạnh nhiệt độ -800C Nếu mẫu đất cần bảo quản thời gian dài (hơn ba tháng), làm lạnh mẫu nhiệt độ thích hợp -200C, -800C -1800C không thường xuyên khuyến nghị Ví dụ điều kiện bảo quản thích hợp cho số mục đích thử nêu Bảng Các điều kiện cho thấy số mẫu lấy vùng có khí hậu ôn hòa mà bảo quản nhiệt độ -200C tới 12 tháng không ức chế hoạt động vi khuẩn (ví dụ trình oxi hóa amoni) Hơn nữa, mẫu đất để phân tích axit béo phospholipid (PLFA) phân tích AND bảo quản nhiệt độ -200C tới hai năm Mẫu để phân tích ARN bảo quản nhiệt độ -800C thời gian tương tự Nên làm lạnh nhanh với nitơ lỏng để mẫu đông lạnh dùng cho phân tích AND, ARN PLFA/PLEL Khoảng thời gian bảo quản chủ yếu cần cho phép thử nghiên cứu ảnh hưởng việc đưa thêm chất ô nhiễm lên vi sinh vật đất hoạt động vi sinh vật đất với vật liệu đất đánh giá cấu trúc quần thể (PLFA, AND, ARN) đất thời điểm khác biệt năm Trong trường hợp này, thời gian cần cho phân tích dễ vượt ba tháng (hóa chất, phép thử chất ô nhiễm) Đối với phân tích cấu trúc hệ vi thực vật, bảo quản nhiệt độ 40C không phù hợp Bảng – Điều kiện bảo quản để đánh giá trình hoạt động vi sinh vật hiếu khí tiến hành phân tích Độ ẩm Độ ẩm Độ ẩm 40C -200C (tháng) (năm) PLFA, PLEL - 10 AND - 10 ARN - - 10 10 10 10 Mục đích thử Tiêu chuẩn -800C nitơ lỏng (-1800C)a (năm) Sinh khối - Phương pháp hô hấp cảm ứng chất - Phương pháp chiết – xông TCVN 6856-1 (ISO 14240-1) TCVN 6856-2 (ISO 14240-2) Khả oxi hóa amoni ISO 15685 Sự khoáng hóa nitơ TCVN 6653 (ISO 14238) Sự hô hấp đất vi sinh vật ISO 16072 10 Phạm vi hô hấp đất ISO 17155 10 - Hoạt tính dehydrogenaza ISO 23753-1 ISO 23753-2 Ký hiệu: - = khả bảo quản a Đất chia thành mẫu phụ cho nghiên cứu thêm trước bảo quản Cách khác, PLFA cần phải chiết từ đất đồng ẩm (