Nghiên cứu thành phần lipid và các dạng phân tử của phospholipid từ một số loài san hô mềm ở việt nam

Thành phần và hàm lượng % axit béo trong lipid tổng, lipid trung tính và lipid phân cực các mẫu san hô mềm nghiên cứu ..... Trong các nghiên cứu hiện đại, thành phần hàm lượng các lớp c

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ LIPID 3

1.2 VÀI NÉT VỀ PHOSPHOLIPID 6

1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌCCỦA LIPID SINH VẬTBIỂN 11

1.4 THÀNH PHẦN LIPID, AXIT BÉO – VAI TRÒ ĐÁNHDẤU SINH HỌC (BIOMARKER) ĐỐI VỚI SAN HÔ 21

1.4.1 Thành phần lipid, axit béo và đặc điểm dinh dưỡng của san hô 22

1.4.2 Thành phần lipid, axit béo và phân loại sinh thái san hô 23

1.4.3 Thành phần lipid, axit béo và sức khỏe của rạn san hô 28

1.4.4 Thành phần lipid, axit béo và phân loại hóa học (chemotaxonomy) đối với san hô 28

1.5 ỨNGDỤNGPHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH CẤU TRÚC LIPID 31

1.6 VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 NGUYÊN LIỆU 39

2.1.1 Mẫu san hô mềm Sinularia macropodia 39

2.1.2 Mẫu san hô mềm Xenia sp 39

2.1.3 Mẫu san hô mềm Capnella sp 40

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.2.1 Phương pháp chiết lipid tổng 40

2.2.2 Phương pháp phân lập các lớp chất lipid 40

2.2.3 Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid, phospholipid 41

2.2.4 Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các axit béo 42

2.2.5 Phương pháp xác định dạng phân tử và cấu trúc của các hợp chất 42

2.2.6 Phương pháp phân tích thành phần chính (PCA) 42

2.2.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 44

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 45

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG 45

3.1 CHIẾT LIPID TỔNG 46

3.2 PHÂN LẬP LIPID TRUNG TÍNH VÀ LIPID PHÂN CỰC [67] 46

3.3 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚPCHẤT LIPID, PHOSPHOLIPID 47

3.3.1 Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid 47

3.3.2 Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất phospholipid 47

3.4 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC AXIT BÉO TRONG LIPID TỔNG, LIPID TRUNG TÍNH VÀ LIPID PHÂN CỰC 48

3.5 PHÂN LẬP CÁC LỚPCHẤT PHOSPHOLIPID ĐỂ PHÂN TÍCH DẠNG PHÂN TỬ 48

3.6 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT, DẠNG PHÂN TỬ CỦA CÁC CHẤT CHUẨN PHOSPHOLIPID VÀ CÁC MẪU NGHIÊN CỨU 51

3.6.1 Sử dụng phổ khối phân giải cao phân tích một số chất chuẩn phospholipid 51

3.6.2 Sử dụng phổ khối phân giải cao phân tích các mẫu nghiên cứu 52

3.6.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được 53

3.7 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC 53

3.7.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 53

3.7.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 56

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

4.1 HÀM LƯỢNG LIPID TỔNG TRONG CÁC MẪU SAN HÔ MỀM NGHIÊN CỨU 59

4.2 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚPCHẤT LIPID TRONG CÁC MẪU SAN HÔ MỀM NGHIÊN CỨU 59

4.2.1 Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng của các mẫu san hô mềm nghiên cứu 59

4.2.2 Phân tích cấu tử chính (PCA) dựa trên các số liệu về thành phần các lớp chất lipid trong lipid tổng các mẫu san hô mềm nghiên cứu 62

4.3 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG AXIT BÉO TRONG CÁC MẪU SAN

HÔ MỀM NGHIÊN CỨU 63

4.3.1 Thành phần và hàm lượng axit béo trong các mẫu san hô mềm 63

4.3.2 Phân tích cấu tử chính (PCA) dựa trên các số liệu về thành phần và hàm lượng các axit béo 69

4.4 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNHLƯỢNG THÀNH PHẦN PHOSPHOLIPID TRONG CÁC MẪU SAN HÔ MỀM NGHIÊN CỨU 71

4.5 XÁC ĐỊNH CÁC DẠNG PHÂN TỬ PHOSPHOLIPID CỦA CÁC MẪU SAN HÔ MỀM NGHIÊN CỨU 73

4.5.1 Phosphatidylcholine (PC) 74

4.5.2 Phosphotidylethanolamine (PE) 82

4.5.3 Phosphatidylserine (PS) 86

4.5.4 Phosphatidylinositol (PI) 92

4.5.5 Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) 97

4.6 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CAEP 100

4.7 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC 105

4.7.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 105

4.7.2 Hoạt tính gây độc tế bào 105

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 107

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111

DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

Bảng 1.1 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ Lobophytum crassum [12] 14

Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học của một số hợp chất sphingolipid từ sinh vật biển 14

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn của các hợp chất sphingolipid và glycolipid phân lập từ loài san hô Sinularia grandilobata và Sinularia sp [20] 18

Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế virus HSV-1 của phospholipid tách chiết từ vi tảo biển 19

Bảng 1.5 Hoạt tính ức chế virut HSV-1 ở các nồng độ khác nhau của phospholipid trong U fasciata và L papillose 19

Bảng 1.6 Hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào MC-F7, Hep-G2 20

Bảng 1.7 Thành phần, hàm lượng axit béo và rượu mạch dài trong lipid tổng của loài Lophelia pertusa, Calanus finmarchicus, Oithona similes [21] 22

Bảng 1.8 Hàm lượng các lớp chất lipid (% lipid tổng) trong san hô nguyên vẹn, san hô vật chủ, zooxanthellae của loài Sinularia sp (giá trị TB ± SD, n = 3) [36] 25

Bảng 1.9 Thành phần axit béo (% tổng axit béo), giá trị TB ± SD, n = 3) của lipid tổng của san hô nguyên vẹn, zooxanthellae, và san hô vật chủ loài Sinularia sp 26

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 45

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG 45

Bảng 3.1 Khối lượng các phân đoạn thu được tương ứng với từng mẫu san hô mềm được nghiên cứu 51

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

Bảng 4.1 Hàm lượng lipid tổng của các mẫu san hô mềm nghiên cứu (n=3) 59

Bảng 4.2 Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid chính của các mẫu san hô mềm nghiên cứu (n=3) 60

Bảng 4.3 Thành phần và hàm lượng (%) axit béo trong lipid tổng, lipid trung tính và lipid phân cực các mẫu san hô mềm nghiên cứu 64

Bảng 4.4 Thành phần và hàm lượng các phân lớp phospholipid trong của 3 mẫu

san hô mềm Sinularia macropodia, Xenia sp., Capnella sp 72

Bảng 4.5 Kết quả phân tích dạng phân tử phân lớp phosphatidylcholine (PC) mẫu san hô mềm Sinualaria macropodia 76

Bảng 4.6 Kết quả phân tích dạng phân tử phân lớp phosphatidylcholine mẫu san hô mềm Xenia sp và Capnella sp 78

Bảng 4.7 Tổng hợp thành phần và hàm lượng các dạng phân tử phosphatidylcholine từ 3 loài san hô mềm nghiên cứu 81

Bảng 4.8 Dạng phân tử phân lớp phosphatidylethanolamine trong ba mẫu san hô 83 Bảng 4.9 Kết quả phân tích ESI-HRMS1, MS2 của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm tại m/z 750,5305 (PE 18:1e/20:4) 85

Bảng 4.10 Kết quả phân tích dạng phân tử phân lớp PS mẫu san hô mềm Sinularia macropodia 89

Bảng 4.11 Kết quả phân tích dạng phân tử phân lớp PS phân lập từ mẫu san hô mềm Xenia sp và Capnella sp 90

Bảng 4.12 Tổng hợp kết quả phân tích dạng phân tử lớp chất PS trong 3 mẫu 91

Bảng 4.13 Các dữ liệu phổ ESI-MS1, MS2 của dạng phân tử PI 18:0/22:4 94

Bảng 4.14 Kết quả dạng phân tử của phân lớp PI trong 3 mẫu san hô mềm 96

Bảng 4.15 Số liệu phổ ESI-MS1, MS2, MS3 CAEP của loài Xenia sp 97

Bảng 4.16 Dạng phân tử của phân lớp CAEP ở loài san hô mềm Sinularia macropodia và Capnella sp 99

Bảng 4.17 Kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của lipid tổng, phân đoạn lipid phân cực và các phân lớp phospholipid 105

Bảng 4.18 Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của các TL, PoL và các phân lớp phospholipid 106

DANH MỤC HÌNH

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của phospholipid [58] 7

Hình 1.2 Một số glycerophospholipid khác 8

Hình 1.3 Cấu trúc của shingosine, ceramide và sphingomyelin 9

Hình 1.4 Sơ đồ sắc ký phổ bản mỏng hai chiều của phospholipid trong lipid tổng san hô mềm Sarcophyton digitatum [54] 11

Hình 1.5 Hàm lượng trung bình của các axit béo chính (% tổng axit béo) trong các họ Acroporidae, Pocilloporidae, Poritidae, Faviidae, Dendrophylliidae, và Milleporidae 24

Hình 1.6 Sinh tổng hợp axit béo chuỗi n-3 và n-6 26

Hình 1.7 So sánh thành phần một số axit béo trong san hô nguyên vẹn, san hô vật chủ và zooxanthelae loài Sinularia sp và Acropora sp [39] 26

Hình 1.8 Phân tích thành phần chính (PCA) sử dụng biến là 5 thành phần lipid của 110 mẫu san hô (cứng/mềm, có VSV cộng sinh/không có VSV cộng sinh) 29

Hình 1.9 Hàm lượng trung bình (± SD) của các lớp chất lipid ở các nhóm san hô 30 Hình 1.10 Lựa chọn kiểu tạo ion [90] 32

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

Hình 2.1 Mẫu san hô mềm Sinularia macropodia 39

Hình 2.2 Mẫu san hô mềm Xenia sp 39

Hình 2.3 Mẫu san hô mềm Capnella sp 40

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 45

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

Hình 4.1 Hình ảnh TLC của TL các mẫu san hô nghiên cứu 60

Hình 4.2 Kết quả phép phân tích thành phần chính (PCA) dựa trên thành phần các lớp chất lipid của các mẫu san hô 62

Hình 4.3: Phổ GC-MS methyl ester của axit béo mẫu san hô mềm Xenia sp 66

Hình 4.4 So sánh hàm lượng của một số axit béo trong lipid tổng, lipid trung tính,

lipid phân cực của 3 mẫu san hô Sinularia macropodia, Xenia sp., Capnella sp 69

Hình 4.5 Phân tích thành phần chính (PCA) sử dụng thành phần và hàm lượng các axit béo trong các mẫu san hô mềm làm các biến 70

Hình 4.6 Sự phân bố các phospholipid trên bản mỏng 2 chiều 71

Hình 4.7 Phosphatidylcholine (PC) 74

Hình 4.8 Phổ khối phân giải cao của hợp chất 1-O-hexadecyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC 16:0e/18:1) 75

Hình 4.9 Phổ ESI-MS1, MS2 và MS3 của dạng phân tử PC có tín hiệu ion âm tại m/z 854,6134 (PC 18:0e/20:4) (e: ether) 77

Hình 4.10 Phosphatidylethanolamine (PE) 82

Hình 4.11 Phổ khối phân giải cao của hợp chất 1-O-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PE 18:1e/18:0) 82

Hình 4.12 Phổ ESI-MS của phân lớp phosphatidyl ethanolamine mẫu san hô mềm Xenia sp 84

Hình 4.13 Phổ ESI-MS1, MS2 của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm tại m/z 750,5305 (PE 18:1e/20:4) 84

Hình 4.14 Phosphatidylserine (PS) 86

Hình 4.15 Phổ khối phân giải cao của hợp chất 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine 87

Hình 4.16 Sự phân mảnh đặc trưng của PS trong ESI-MS 88

Hình 4.17 Phổ MS2 của dạng phân tử PS 18:0e/24:5 889

Hình 4.18 Phosphatidylinositol (PI) 92

Hình 4.19 Phổ khối phân giải cao của 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (PI 16:0/18:2) 92

Hình 4.20 Phổ MS2 PI 18:0/24:5 94

Hình 4.21 Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) 97

Hình 4.22 Phổ MS2 của CAEP 16:0/18:2base 98

Hình 4.23 Sắc ký đồ phổ ESI-MS1 phân đoạn CAEP phân lập từ mẫu san hô mềm

Sinularia macropodia 99

Hình 4.24 Sự tổng hợp sphingophospholiopid (C) dựa trên cơ sở kết hợp giữa

ceramide (A) với (2-aminoethyl)phosphonic acid (B) [9, 94] 100

Hình 4.25 Cấu trúc hóa học với số thứ tự carbon của hợp chất CAEP 102 Hình 4.26 Các tương tác (1H‒1H) COSY và (1H→13C) HMBC của hợp chất CAEP 102

Hình 4.27 Phổ 1H-NMR của hợp chất CAEP (đo trong CDCl3+MeOH, tại 700 MHz) 1033

Hình 4.28 Phổ 13C-NMR của hợp chất CAEP (đo trong CDCl3+MeOH, tại 175 MHz) 104

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

APCI Atmospheric pressure chemical

CAEP Ceramide aminoethylphosphonate Ceramide

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

HPLC High performance liquid

HRMS High resolution mass spectrometry Phổ khối phân giải cao HSQC Heteronuclear Single-Quantum

Coherence

Phổ tương tác 2 chiều trực tiếp dị hạt nhân

LPC Lyso phosphatidylcholine Lyso phosphatidylcholine

phosphatidylethanolamine

MALDI Matrix assisted laser desorption

ionization

ion hóa phản hấp thụ laser được hỗ trợ bởi chất nền

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MUFA Monounsaturated fatty acid Axit béo một nối đôi

NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt

MỞ ĐẦU

Rạn san hô là tài sản quốc gia của mỗi nước nói chung và Việt Nam nói riêng, chúng góp phần duy trì cân bằng sinh thái biển và tạo cơ hội để phát triển nhanh chóng một số lĩnh vực trong nền kinh tế của đất nước Các loài san hô là cơ

sở của quần thể rạn san hô biển Sự nỗ lực của nhiều phòng thí nghiệm khoa học đã tập trung vào việc nghiên cứu các hệ sinh thái, đa dạng sinh học và hóa sinh của loài động vật không xương sống này Trong đó, lipid là một thành phần hóa học quan trọng, chiếm tới 40% sinh khối khô của san hô, và là cơ sở cấu trúc của màng tế bào các polip, dự trữ năng lượng cho san hô trong thời gian dài

Trong các nghiên cứu hiện đại, thành phần hàm lượng các lớp chất lipid, thành phần hàm lượng các axit béo phản ánh sự đa dạng sinh hóa, các nguồn dinh dưỡng, các mối quan hệ cộng sinh, phục vụ cho việc nghiên cứu các con đường sinh tổng hợp và sự vận chuyển theo chuỗi thức ăn các dạng ban đầu của lipid trong cơ thể các loài sinh vật nói chung và san hô nói riêng Cần phải lưu ý rằng, mỗi lớp chất lipid là một hỗn hợp của 50 đến 200 hợp chất hóa học riêng biệt (còn được gọi

là các “dạng phân tử”), có phần phân cực của phân tử giống nhau, nhưng khác nhau

về thành phần axit béo trong các phân tử dưới dạng gốc acyl Nghiên cứu hóa học, hoạt tính sinh học của các lipid rất phức tạp, việc phân lập từng hợp chất lipid riêng biệt rất khó khăn,và sự sử dụng chúng làm các sản phẩm dược phẩm gặp nhiều hạn chế chính bởi đặc thù cấu trúc này Hiện nay, với sự góp sức của các thiết bị nghiên cứu hiện đại, khoa học thế giới đã đạt được những tiến bộ lớn trong việc phân tích các thành phần hóa học của dạng phân tử của một số lớp lipid không phân cực, như triglyceride từ dầu thực vật [70] Thông tin về thành phần dạng phân tử của các lipid từ động vật, đặc biệt là lipid phân cực ít hơn rất nhiều Đối với các động vật không xương sống phát hiện cấu trúc của các dạng phân tử riêng biệt trong phospholipid một số loài ruột khoang [82]

Ngày nay, sự biến đổi khí hậu toàn cầu, cùng với nhiều hoạt động của con người về khai thác, du lịch, công nghiệp… đã gây ảnh hưởng lớn đến rạn san hô, dẫn đến suy thoái, trắng hóa, có những vùng biển sự trắng hóa xảy ra đến 30% rạn

san hô Do vậy, việc tìm hiểu rõ mối liên quan giữa sinh học – hóa học (trong đó lipid là một thành phần hóa học quan trọng) sẽ góp phần có thêm những thông tin hữu ích nhằm cải thiện và bảo tồn rạn san hô

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây về lipid từ san hô mới chỉ dừng ở mức độ nghiên cứu đa dạng sinh thái, đánh giá hiện trạng rạn san hô, các nghiên cứu hóa sinh bước đầu thu được những số liệu về hàm lượng lipid tổng, thành phần axit béo, thành phần các lớp chất, một số nghiên cứu có đi sâu vào nghiên cứu thành phần các lớp chất lipid không phân cực [4] Cho tới nay chưa có thông tin về thành phần dạng phân tử của lớp chất phospholipid – lớp chất chứa đựng nhiều thông tin

về quá trình sinh tổng hợp lipid của san hô ở Việt Nam cũng như trên thế giới

Nhận thấy tầm quan trọng của các nghiên cứu chuyên sâu về lipid để sử dụng trong lĩnh vực sinh thái học và sinh hóa học nhằm thiết lập các mối liên hệ dinh dưỡng, cộng sinh và phân loại trong nghiên cứu đối với loài sinh vật biển này, tác

giả đã lựa chọn đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần lipid và các dạng phân tử của phospholipid từ một số loài san hô mềm ở Việt Nam” Mục tiêu của luận án là

nghiên cứu thành phần lipid, axit béo và dạng phân tử của lớp chất lipid

phospholipid của 3 loài san hô mềm ở Việt Nam (Xenia sp., Capnella sp., và Sinularia macropodia) theo các nội dung sau:

Phân tích hàm lượng lipid tổng; thành phần và hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng

Phân tích thành phần và hàm lượng các axit béo trong lipid tổng, lớp chất lipid trung tính và lipid phân cực

Phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất phospholipid

Nghiên cứu dạng phân tử của các lớp chất phospholipid

Khảo sát hoạt tính sinh học của các lớp chất lipid phân cực phân lập từ các mẫu san hô nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ LIPID

Lipid là lớp chất tự nhiên có nhiều chức năng sinh học khác nhau: chúng kết hợp với carbohydrate và protein để tạo thành thành phần chủ yếu của tất cả các tế bào thực vật và động vật Lipid đặc biệt quan trọng trong màng tế bào, nơi chúng có thể có vai trò cả về cấu trúc và chức năng; và hơn hết chúng được coi là nguồn năng lượng dự trữ quan trọng của các cơ thể sống, quy định các quá trình trao đổi chất Ngoài ra trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã tìm ra các bằng chứng chỉ

ra rằng lipid là một phần quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu tế bào Theo nghiên cứu của Kathleen M E [47], một vài hợp chất thuộc các nhóm lipid khác nhau có vai trò là các phân tử truyền tín hiệu và các chất truyền tín hiệu tế bào (cellular messengers) Các hợp chất này bao gồm sphingosin 1-phosphat; diacylglycerol và phosphatidylinositol phosphate; các prostaglandin; các hormone steroid ví dụ estrogen, testosterone và cortisol; và các oxysterol

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về lipid, nhưng cho tới nay vẫn chưa có định nghĩa nào được chấp nhận một cách rộng rãi Lipid có thể bao gồm một phạm

vi đa dạng các hợp chất khác nhau: các hydrocarbon bậc cao, steroid, terpen, alcol, aldehyde hydrate, axit béo và các lớp chất như glyceride, sáp, phospholipid, glycolipid, sulfolipid…, và khó có thể đưa ra một định nghĩa chung về cấu trúc hóa học của chúng Trong các sách, tài liệu tham khảo thường miêu tả lipid là một nhóm các hợp chất tự nhiên, có khả năng hòa tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, benzene, ether và rượu; tuy nhiên khái niệm này cũng không bao phủ được hết các hợp chất được coi là lipid, như ganglioside cũng được coi là lipid và

có khả năng tan trong nước gần như trong dung môi hữu cơ [60, 19]

Một trong những khái niệm thuyết phục được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

về lipid là của tác giả William W Christie – một trong những chuyên gia hàng đầu

về lipid trên thế giới đó là: Lipid là các axit béo và các dẫn xuất của chúng, các chất

có liên quan chặt chẽ với các hợp chất này thông qua quá trình sinh tổng hợp (ví dụ

ether béo hoặc rượu béo), đặc điểm sinh hóa, hoặc chức năng của chúng (ví dụ cholesterol, hay các sterol như axit mật, các tocopherol) [100]

Về cấu trúc hóa học, theo nhà khoa học Vaskovsky V.E., lipid bao gồm lipid đơn giản, lipid phức tạp, và oxylipin [89] Lipid đơn giản gồm các axit béo và một

số dẫn xuất của chúng Lipid phức tạp có thể được phân chia thành lipid trung tính

và lipid phân cực Lipid trung tính bao gồm triglyxeride, sáp, este của sterol, ceramide, ethanolamide của axit béo Các lớp chất lipid phân cực điển hình bao gồm glycolipid (gồm các glyceroglycolipid như galactolipid, sulfolipid và các glycosphingolipid); các phospholipid (glycerophospholipid, sphingophospholipid) Hai nhóm lipid phân cực phổ biến nhất là galactolipid (mono và digalactosyldiglyceride) và phospholipid (phosphatidylcholine, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, cardiolipin, sphingomyelin…) Khái niệm “oxylipin” được đưa ra năm 1991 bởi các nhà khoa học Thủy Điển và Hoa Kỳ, được định nghĩa là các dẫn xuất có chứa oxy của lipid, trong đó điển hình là các axit béo có chứa 20 cacbon trong phân tử Trong các tài liệu tham khảo, oxylipin thường được gọi là các eicosanoid, được biết đến nhiều nhất là prostaglandin Nhưng cũng có nhiều các hợp chất giống như các eicosanoid

mà phân tử của nó có chứa nhiều hơn hoặc ít hơn 20 nguyên tử cacbon

Trong hệ sinh thái biển, lipid là nguồn hoạt chất giàu năng lượng nhất, và được vận chuyển từ tảo sang các loài động vật có xương sống thông qua các động vật phù du Lipid có nguồn gốc sinh vật biển được chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ, và trong dịch chiết có thể chứa nhiều lớp chất với độ phân cực khác nhau, bao gồm các hợp chất có nguồn gốc từ cơ thể sinh vật, và cả những hợp chất hình thành do những tác động của các yếu tố bên ngoài Phân tích trên sắc ký lớp mỏng TLC trên Chromarods, nhà khoa học Christopher C Parrish [17] đã chia các lớp

chất lipid trong sinh vật biển thành 3 nhóm: nhóm A là những lớp chất ít phân cực nhất như các hydrocacbon, các ester đơn giản (sáp, ester của sterol….); nhóm B

gồm các lớp chất có độ phân cực trung bình như các ester phức tạp (triacylglycerol,

diacylaglycerol…), các axit béo tự do, các hợp chất rượu, sterol; nhóm C gồm các

lớp chất phân cực nhất và phức tạp nhất như các pigment, monoacylglycerol, glycolipid, phospholipid

Lớp chất lipid Công thức cấu tạo Tên hợp chất đại diện

O C O

CH 2

O P O

O

-O C C

N +

H 2 C

H 2 C

H 2 C H

là galactose hoặc các dẫn xuất của galactose, đôi khi là glucose Hầu hết các glycolipid ở vi khuẩn và thực vật là các glycoglycerolipid, trong khi ở động vật và con người thì các glycosphingolipid chiếm ưu thế [30, 46, 51]

Phospholipid có mặt trong tất cả các cơ thể sinh vật, từ vi sinh vật tới thực vật, động vật và con người Phospholipid có 2 nhóm chính: glycerophospholipid và sphingophospholipid, trong đó glycerophospholipid là phân nhóm phổ biến nhất

Glycerophospholipid Sphingophospholipid

Khi glycerol được ester hóa bởi axit phosphoric thì trong phân tử

glycerophospholipid có mặt một cacbon bất đối, do đó cần dùng ký hiệu sn (từ tiếng Anh stereospecifical numbering) [5] Cấu trúc chung của glycerophospholipid là: dẫn xuất của phân tử glycerol với một nhóm acyl hoặc nhóm alkyl tại vị trí sn-1, nhóm acyl tại vị trí sn-2, và một nhóm phosphate ester đặc trưng tại vị trí sn-3

Trong các sinh vật nhân chuẩn, nhóm R2 ở vị trí sn-2 luôn là một liên kết ester, còn nhóm R1 ở vị trí sn-1 có liên kết ester với nhóm acyl hoặc liên kết ether với nhóm

alkyl hoặc alkenyl (phân lớp plasmalogen) (hình 1.1) [61]

Từ cấu tạo của phospholipid chúng ta thấy trong cấu tạo của chúng có những vùng kỵ nước (gốc hydrocacbon) và có những vùng ưa nước (axit phosphoric và bazơ chứa nitơ vì chúng có khả năng ion hóa) giúp ích rất lớn cho hoạt động và đảm bảo tính thấm một chiều của màng tế bào

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của phospholipid [61]

Những nghiên cứu trước đây của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra rằng, các diacyl phospholipid được phân lập từ màng sinh học của các tế bào động vật đều mang tính chất chung [16, 54] đó là:

- Các axit béo ở vị trí sn-1 và sn-2 thường khác nhau

- Các axit béo trong phân tử phospholipid không phân bố một cách ngẫu

nhiên, ở vị trí sn-1 trong phân tử glycerol thường là dẫn xuất của axit béo no, còn ở

vị trí sn-2 là axit béo không no

- Các axit béo ở vị trí sn-2 phân tử phospholipid sau khi thủy phân có công

thức chung là CH3-(CH2)α-[CH=CH-CH2)β-(CH2)γ-COOH trong đó α = 1, 4, 5 và 7;

β = 1-6; γ = 2-7; và liên kết đôi dạng cis (β = 1-6) luôn được cách nhau bởi một nhóm metylen

Các glycerophospholipid khác nhau ở đầu phân cực Nhóm đầu có thể là choline, etanolamin, glycerol, inositol, serine… tạo thành cás phospholipid như phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethalnol amine (PE), phosphatidylinositol (PI), phosphatidyl serine (PS) tương ứng Dạng đơn giản nhất của diacyl glycerophospholipid là phosphatidic axit Khi trong phân tử phospholipid chỉ có

một axit béo (thường ở vị trí sn-1), ở vị trí sn-2 là nhóm –OH, thì được gọi là các

lyso phospholipid như lyso phosphatidylcholine (LPC), lyso phosphatidylethanol amine (LPE), lyso phosphatidylinositol (LPI), lyso phosphatidylserine (LPS) Ngoài

ra còn có diphosphatidyl glycerol (hay cardiolipin) (hình 1.2)

lượng nhỏ EPA, DHA còn trong hải sản, hàm lượng các axit béo này rất dồi dào [26]

Sphingophospholipid hay còn gọi là sphingoceramide, thường gặp nhất là các sphingomyelin (SPM) gồm ceramide và nhóm phosphocholine hoặc phosphoethanolamine trong phân tử (hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc của shingosine, ceramide và sphingomyelin

Các nhà khoa học còn tìm ra sự tồn tại của các hợp chất được gọi là phosphonolipid, trong phân tử có chứa gốc của axit 2-aminoethylphosphonic (AEP)

Phosphonolipid đầu tiên được tìm thấy trong vi khuẩn đơn bào Tetrahynema pyriformis, phân lập từ dạ dày cừu, và sau đó các phosphonolipid được tìm thấy

trong nhiều sinh vật biển [62]

Sự phân bố của các phospholipid khác nhau trong nguồn sinh vật biển đã được nhà khoa học Henna Lu và cộng sự nghiên cứu [33] Theo đánh giá này, phospholipid chiếm ưu thế trong các nguồn hải sản như cá hồi, cá ngừ, cá thu là PC, trong khi đó PE chiếm hàm lượng cao thứ 2, các phospholipid khác như PI, PS, LPC, SPM được tìm thấy với hàm lượng nhỏ hơn, ngoại trừ ở các loài cá ngừ và các

loài nhuyễn thể như Euphausia superba và Euphausia pacifica rất giàu

sphingomyelin Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) là một cấu trúc shingolipid điển hình – hợp chất lipid phân cực này là đặc trưng của các đối tượng

thuộc ngành động vật ruột khoang Trong thành phần lipid của loài san hô Gersemia rubiformis còn tìm thấy một cấu trúc sphingolipid khác là ceramide

methylaminoethylphosphonate (CAMEP), chiếm tới 9,5% tổng phospholipid [37] Theo như các phân tích trước đó, phospholipid được tìm thấy với hàm lượng cao trong trứng, đầu và nội tạng cá biển [26]

Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) Trong san hô, phospholipid chiếm từ 14 đến 33% lipid tổng [4] Đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hàm lượng các phospholipid trong các loài san hô ở các vùng biển khác nhau.Latyshev và cộng sự đã xác định thành phần

và sự biến đổi theo mùa của các dạng phospholipid ở 22 loài san hô Alcyonaria vùng biển ven bờ iệt Nam Trong thành phần phospholipid xác định được sự có mặt của PC, PE, PS, CAEP, DPG, PI và các lysophospholipid [57] Trong lipid tổng của

loài san hô mềm Sinularia sp ở vùng biển Việt nam có chứa 13,6% lipid phân cực

trong đó các phospholipid chủ yếu là PG (30,7%), CAEP (30,6%), PC (14,6%), PS (14,5%), LPC (9,5%) [44] Phospholipid chính của loài san hô Gorgonia ở vùng

Caribe là PE, PC và PS [11] Ở loài san hô Gersemia rubiformis (biển Bering), hàm

lượng các phosphonolipid khá cao, cụ thể CAEP (15,6%) và CAMEP (13,3%), các phospholipid còn lại là PC (31,4%); PE (25,6%), PS (14,1%) [37]; Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng, một số phospholipid trong san hô tồn tại dưới dạng plasmalogen (có chứa mạch alkyl trong phân tử) [4] Bức tranh tổng thể về sự phân

bố định tính, định lượng của các phospholipid trong các mẫu san hô có sự tương đồng

Hình 1.4 Sơ đồ sắc ký phổ bản mỏng hai chiều của phospholipid trong lipid tổng

san hô mềm Sarcophyton digitatum [57]

Thành phần phospholipid trong san hô khá đa dạng, nhưng hầu hết các loài san hô đều có mặt đầy đủ các phân lớp chính đó là PE, PC, CAEP và PS (hình 1.4) Một số loài san hô có thêm thành phần PI với hàm lượng không lớn, và đôi khi có mặt các dẫn xuất lyso phospholipid

1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LIPID SINH VẬT BIỂN

Hoạt tính sinh học của lipid cũng là một mối quan tâm lớn của các nhà khoa học Trong nghiên cứu của Pravat M và cộng sự [70], hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lipid tổng chứa hàm lượng cao các axit béo không no đa nối đôi (PUFA)

từ loài hải miên Fasciospongia cavernosa thu thập tại vịnh Bengal (Orissa Coast)

đã được nghiên cứu trên một số tác nhân gây bệnh ở cá (Edwardsiella tarda, Micrococcus sp., Pseudomonas aeruginosa), một số chủng đa kháng thuốc (Staphylococcus pyrogenes, Acinetobacter sp., Salmonella typhi) và một tác nhân gây bệnh ở người (Salmonella typhi) Kết quả cho thấy, dịch chiết lipid tổng của Fasciospongia cavernosa thể hiện hoạt tính mạnh chống lại tất cả các tác nhân gây

bệnh được nghiên cứu, với giá trị MIC 25μg Trong khi ở các nghiên cứu trước đó, các nhà khoa học đã nhận thấy hoạt tính kháng khuẩn của các axit béo mạch dài đối

với chủng Staphylococcus pyrogenes tỉ lệ thuận với độ bất bão hòa của chúng Như

vậy, sự có mặt với hàm lượng cao của các PUFA trong dịch chiết lipid tổng của loài hải miên này có thể là nguyên nhân dẫn tới hoạt tính sinh học mạnh mẽ của nó

Hệ dung môi:

I CHCl 3 :MeOH:25% NH 3 , 65:35:5,

II CHCl 3 :MeOH:C 6 H 6 :CH 3 COOH:(CH 3 ) 2 CO:H 2 O 70:30:10:5:4:1

Х1, Х2, Х3 – các phospholipid chưa xác định

Lipid tổng của năm loài tảo biển, hai loài Laurencia popillose, Galaxoura cylindriea có nguồn gốc từ biển Đỏ, và ba loài Ulva fasciata, Dilophys fasciola, Taonia atomaria từ biển Địa Trung Hải đã được nghiên cứu hoạt tính chống ung

thư , kháng virus, kháng khuẩn và các hoạt tính chống oxy hóa [21] Những mẫu dịch chiết lipid thô ở nồng độ 10 mg/ml thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của virut HSV-1, tỉ lệ ức chế dao động 12,5-74,4% Ở nồng độ 20 mg/ml lipid tổng các

loài Dilophys fasciola, Taonia atomaria, Galaxoura cylindriea ức chế hoàn toàn vi

rut HSV-1 Lipid của tất cả năm loài tảo đều có hoạt tính kháng vi sinh vật đáng chú

ý với vi khuẩn Escherichia coli, nấm Aspergillus niger và men Candida albicans, không dịch chiết nào thể hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis Hoạt tính

chống oxy hóa được đánh giá dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH Phần lớn lipid tổng của năm loài tảo biển đều có hoạt tính chống oxy hóa với các mức độ khác nhau Tỉ lệ khử gốc tự do DPPH dao động trong khoảng 12,17-90,88% ở nồng

độ 100 μg lipid tổng, trong đó hoạt tính cao nhất thể hiện ở loài D fasciola

(90,88%) Hoạt tính kháng u của các mẫu được thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và tế bào ung thư gan (Hep-G2) ở người Kết quả cho thấy, ở các nồng độ khác nhau, dịch chiết thô của các mẫu tảo biển nghiên cứu đều thể hiện tác dụng ức chế mạnh trên cả hai dòng tế bào ung thư vú và ung thư gan với giá trị IC50

dao động từ 0,34 đến 7,11 μg/ml Trong đó, thể hiện hoạt tính cao nhất cả ở 2 dòng

tế bào ung thư là dịch chiết lipid của loài tảo T atomaria ở tất cả các nồng độ

nghiên cứu, tỉ lệ ức chế tế bào khối u dao động từ 77,21 đến 82,34% và 42,0 đến 61,0% lần lượt với MCF-7 và HepG2 Giá trị IC50 đối với MCF-7 là 0,34 μg/ml, thấp hơn nhiều so giá trị tương ứng của thuốc kháng u Novatrone Một nghiên cứu

khác về loài tảo nâu Sargassum marginatum cho thấy dịch chiết lipid tổng của loài

tảo này có tác dụng ức chế chống loại bệnh bạch cầu cấp tính [10]

Trong một nghiên cứu của Emilie Genin và cộng sự năm 2004 [25] về các hợp chất glycolipid ở một số loài hải miên, các nhà nghiên cứu đã phân lập được một số cấu trúc glycolipid và tiến hành thử hoạt tính sinh học Từ loài hải miên

Axinyssa djiferi thu thập tại vùng biển Nam Senegal đã phân lập được 9 hợp chất

monoglycosylceramide là các axidjiferoside (1- 9); từ loài Trikentrion leave thu

thập tại vùng biển Dakar đã phân lập được một hợp chất alkyldiglycosylglyserol

(10) là trikentroside, từ loài hải miên Myrmekioderma dendyi thu thập tại vùng biển

Nam Thái Bình Dương, gần Vanuatu; phân lập được hai hợp chất alkyldiglycosylglycerol là các myrmekiosise Một số thử nghiệm sinh học đã được thực hiện với các hợp chất phân lập được như hoạt tính gây độc tế bào, kháng nấm,

kháng khuẩn, kháng virus và tăng cường miễn dịch, hoạt tính chống Plasmodium, Leishmania và Trypanosoma

(10)Trikentroside

(1-9) Axidjiferoside: m = 19-23, n = 6 -14

(11, 12) Myrmekiosise

Các glycolipid từ loài hải miên Trikentrion leave và Axinyssa djiferi (1-9, 10)

đã được chứng minh là có hoạt tính gây độc tế bào trên các tế bào KB, ức chế 47 và 75% ở 10μg/ml; và có hoạt tính chống sốt rét với giá trị IC50 9,5 μg/ml và 3,1 μg/ml

tương ứng Các hợp chất axidjiferosides (1-9) có hoạt tính ức chế tăng dần theo

nồng độ đối với Plasmodium falciparum với giá trị IC50 0,45 μg/ml Các glycolipid

(11, 12) từ Myrmekioderma dendyi thể hiện hoạt tính ức chế khối u trên dòng tế bào THP1, và glycolipid (10) từ Trikentrion leave kháng u trên dòng tế bào NSCLC L16

[25]

(13) R = OH, n = 10; (14) R = OH, n = 12; (15) R = OAc, n = 10

Ba hợp chất glycolipid (13-15) đã được phân lập từ loài san hô mềm

Lobophytum crassum thu thập tại vùng biển Thái Lan [13] Hoạt tính gây độc tế bào

của các hợp chất này đối với các dòng tế bào ung thư Hep-G2, Hep-3B,

MDA-MB-231, Ca9-22 được thể hiện trong bảng 1.1 Kết quả thể hiện rằng cả ba hợp chất đều

có hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư trên với giá trị IC50 dao động từ 9,2 đến 15,0 μg/ml

Bảng 1.1 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ Lobophytum

Hoạt tính sinh học của các hợp chất shingolipid (16)  (74), được phân lập

từ một số sinh vật biển được thể hiện ở bảng 1.2 [63]

Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học của một số hợp chất sphingolipid từ sinh vật biển [63]

(16) ; (17) Ulva fasciata (Tảo biển) Kháng virut

(18); (19) Flavobacterium sp

(Vi khuẩn Gram (-)) Ức chế DNA polymerase α

(Tảo vàng đơn bào)

Kích hoạt Ca2+ ATPase của màng lưới cơ tương

(Hải miên) bào ung thư

C 9 H 19 2

NH

O C 15 H 31

- O 3 S

OH NH

O

OH 11

9

O

C14H29NH

NH

O HO HO

OH

HO

(23) R1=C14H35 – C21H43

R2= chuỗi ankyl C11 đến C16 khác nhau

R 2

OH OH HO HO

OH

OH OH HO

OH

NHAc OH HO

OH HO

OH HO

OH OH

NH O OH

OH O

O O

OH OH OH

O O

NH O OH

OH

O

n m

(50) m = 14, n = 12 (51) m = 16, n = 12 (52) m = 18, n = 12

(54)

RO NH

OH

O OH

OH m

n

(55) R = H, m = 17 19, n = 79

O O

O HO

O O

OH OH

OR HO

NHAc HO

(57)

(58)

C7H15NH

O R OH

OH HO

HO OH OH

OH

OH

OH

OH OH

O

(59)

C7H15NH

O R OH

OH HO

HO OH OH

2

(61) R = C20H41; (62) R = C18H37 (63) R = C19H39 ; (64) R = C21H43

NH

O

R1OH

OH HO

HO OH OH

HO OH OH

R 2

R1 = C21H43 ; R2 = (CH2)8CH(CH3)C2H5

(66)

Các hợp chất sphingolipid và glycolipid (75-79 a,b) đã được phân lập từ loài

san hô Sinularia grandilobata và Sinularia sp thu thập gần quần đảo Andaman, Ấn

Độ Dương, trong đó hợp chất 76a đã từng được phân lập từ loài san hô Acabaria

indulata [22] Kết quả thử nghiệm cho thấy, các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính

kháng khuẩn và kháng nấm ở các nồng độ 50, 100 và 200 μg/ml (bảng 1.3)

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn của các hợp chất sphingolipid và

glycolipid phân lập từ loài san hô Sinularia grandilobata và Sinularia sp [22]

OH HO

HO OH OH

R

C 8 H 17

12

(67) R1 = (CH2)2CH=CH(CH2)8CH3 (68) R1 = (CH2)2CH(CH3)C2H5

NH

O R OH

OH HO

HO

OH

OH

R2OH

(69) R1 = C21H43

R2 = (CH2)9CH(CH3)C2H5

(70) R1 = C23H47 R2 = (CH2)9CH(CH3)C2H5

O O O

NH O OH

C 23 H 47

OH OH OH NH O HOOC

OH O

NH

O

OH

OH OH OH HO

COOH HO

HO HO

9

(74)

(72) m = 19, 20,21 ; n = 8

Thành phần phospholipid trong vi tảo chiếm từ 3-8% lipid tổng, các thành phần chính được xác định là PS, PA, LPC, PE và PG Phân đoạn phospholipid của

năm loài vi tảo Laurencia popillose, Galaxoura cylindriea, Ulva fasciata, Taonia atomaria, Dilophys fasciola đã được phân lập và sử dụng để nghiên cứu hoạt tính

sinh học [32]

Hoạt tính kháng virus của phospholipid từ các loài vi tảo này được đánh giá theo phương pháp giảm đám hoại tử (Bảng 1.4) và đều thể hiện hoạt tính ức chế virus HSV-1

Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế virus HSV-1 của phospholipid tách chiết từ vi tảo biển

Sự ức chế cao nhất HSV-1 được thể hiện ở hai loài Ulva fasciata (75,25%)

và Laurencia papilose (75%) ở nồng độ 20μg/ml Hai loài này tiếp tục được chọn

để khảo sát hoạt tính ức chế virut với các nồng độ khác nhau 25, 50, 75, 100μg/ml (bảng 1.5)

Bảng 1.5 Hoạt tính ức chế virut HSV-1 ở các nồng độ khác nhau của phospholipid

trong U fasciata và L papillose [32]

Nồng độ phospholipid Acyclovir % giảm đám hoại tử

Kết quả cho thấy hiệu quả ức chế 100% virut HSV-1 thể hiện ở phospholipid từ loài Laurencia papilose ở tất cả các nồng độ khảo sát, trong khi

đó phospholipid từ loài Ulva fasciota ức chế cao nhất 78% ở nồng độ 100 μg/ml

Tất cả các phospholipid từ năm loài vi tảo được nghiên cứu đều thể hiện hoạt tính chống ung thư cao trong in vitro trên các tế bào ung thư vú và ung thư gan ở người, với giá trị IC50 dao động trong khoảng 0,47-3,15 μg/ml (bảng 1.6) Ngoài

ra, phospholipid của các loài U fasciota, T atomaria, G cylindriea còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng nấm men trên các chủng E coli, B subtilis, A niger và C albicans với các giá trị MIC từ 40-80 μg/ml

Bảng 1.6 Hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào MC-F7, Hep-G2 [32]

Như vậy, với những tiềm năng về hoạt tính sinh học còn chưa được khai phá hết, nguồn lipid sinh vật biển luôn là đối tượng nghiên cứu hấp dẫn nhiều nhà khoa học trên thế giới

1.4 THÀNH PHẦN LIPID, AXIT BÉO – VAI TRÒ ĐÁNH DẤU SINH HỌC (BIOMARKER) ĐỐI VỚI SAN HÔ

Các rạn san hô là một phần không thể thiếu của đại dương, và hệ sinh thái rạn san hô Việt nam là một trong những khu vực có tính đa dạng cao nhất của vùng biển Ấn độ Thái Bình Dương [6] Hầu hết các loài san hô phải đính kèm vào một bề mặt cứng để phát triển, chúng ít di động do đó phải dựa trên dòng chảy đại dương mang theo thức ăn để lấy nguồn dinh dưỡng Chúng là những sinh vật sử dụng

nhiều nguồn thức ăn San hô có thể dùng các tế bào châm (nematocyst) tiết chất độc

tại các xúc tu để bắt các sinh vật phù du, nhưng đồng thời loại động vật này thu nhận phần lớn dưỡng chất từ các vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae của chúng Vi sinh vật cộng sinh của san hô – zoozanthellae, là loại tảo vàng đơn bào cộng sinh

(phần lớn thuộc chi Symbiodinium) sống trong các mô biểu bì san hô, chúng thực

hiện quang hợp và san hô vật chủ sử dụng các sản phẩm của quá trình quang hợp đó như đường, lipid, oxy để hô hấp và phát triển Do đó, hầu hết các loài san hô phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời và phát triển ở các vùng nước trong và nông, thường ở

độ sâu dưới 100 m Các loại san hô khác không cần đến tảo cộng sinh có thể sống ở

vùng nước sâu hơn, chẳng hạn các loài thuộc giống Lophelia nước lạnh sống được

tới độ sâu 3.000 m ở Đại Tây Dương Zooxanthellae có thể có mặt trong các mô san

hô với mật độ lên tới 1 triệu tế bào/cm2 và cho tới nay có 10 loài khác nhau trong san hô được ghi nhận [81]

Cũng giống như ở nhiều đối tượng sinh vật biển khác, các chỉ số về lipid và các thành phần lipid là một trong những chỉ số hóa học quan trọng của loài sinh vật này Sự thay đổi hàm lượng các thành phần lipid của san hô phụ thuộc đáng kể vào các yếu tố khác của môi trường xung quanh như nguồn dinh dưỡng, giai đoạn sinh trưởng, mùa, độ sâu cư trú, độ chiếu sáng…, cũng như sự khác biệt về phân loại giữa các phân lớp/bộ/giống/loài hay sự có mặt hoặc không có mặt của các vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae trong san hô vật chủ [4] Để xây dựng lên một bức tranh chi tiết về mối liên quan giữa thành phần lipid và những sự khác biệt sinh thái

là cả một quá trình nghiên cứu lâu dài và tốn nhiều công sức của các nhà khoa học

1.4.1 Thành phần lipid, axit béo và đặc điểm dinh dưỡng của san hô

Việc nghiên cứu về thành phần lipid, axit béo để xác định các mối liên kết dinh dưỡng rất hữu hiệu đối với các loài sinh vật biển sâu do sự khó khăn trong hoạt động nghiên cứu quan sát Kỹ thuật chất đánh dấu dinh dưỡng axit béo dựa trên cơ

sở những nguồn dinh dưỡng ban đầu có chứa các axit béo tín hiệu đặc trưng, chúng

sẽ được truyền sang các sinh vật tiêu thụ và đi vào chuỗi thức ăn, dù sẽ bị biến đổi tại mỗi bước những chúng vẫn được duy trì với số lượng đáng kể Năm 2009, nhà

khoa học Dodds L A và cộng sự [23] đã sử dụng 38 mẫu mẫu san hô loài Lophelia pertusa (Scleractinia) thu từ 3 địa điểm khác nhau với các độ sâu khác nhau để

nghiên cứu về những lipid đánh dấu sinh học và sự khác biệt trong chuỗi thức ăn đối với san hô mềm vùng nước lạnh Các loài san hô vùng biển sâu thường không

có vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae và sử dụng động thực vật phù du làm nguồn thức ăn chính Trong kết quả phân tích thành phần lipid, các mẫu thu được đều có hàm lượng lipid tổng cao và trong lipid tổng, nhiều nhất là lớp chất sáp, ở những mẫu thu ở vùng nước nông hơn thì có hàm lượng sáp trong lipid tổng cao hơn

Bảng 1.7 Thành phần, hàm lượng axit béo và rượu mạch dài trong lipid tổng của

loài Lophelia pertusa, Calanus finmarchicus, Oithona similes [23]

New England

>1000m

Oithona similes

Calanus finmarchicus

Calanus finmarchicus: calanoid copepod (động vật giáp xác ăn thực vật)

Oithona similes: non calanoid copepod

Trong thành phần axit béo của lipid ở 3 nhóm đối tượng san hô (bảng 1.7),

so với mẫu thu ở 2 độ sâu lớn hơn, san hô Lophelia Pertusa thu thập ở Mingulay

(độ sâu 130m) có hàm lượng cao các axit béo không no 1 nối đôi (MUFA) 20:1n-9,

22:1n-11, các rượu mạch dài 20:1, 22:1 – được biết tới là các chất chỉ thị sinh học cho loài giáp xác chân chèo calanoid ăn thực vật; và axit béo đa nối đôi (PUFA) 20:5n-3 – là thành phần quan trọng của màng tế bào có nguồn gốc từ thực vật phù

du và cũng được tìm thấy ở các loài giáp xác chân chèo ăn thực vật [18]

Điều này cũng đồng nhất với những nghiên cứu trước đó của Latyshev và cộng sự [56], Yamashiro và cộng sự [102], ở san hô không có chứa zooxanthellae sống trong vùng nước nông với nguồn dinh dưỡng phụ thuộc chủ yếu vào thực vật phù du, trong thành phần axit béo các MUFA có hàm lượng thấp, thay vào đó là các PUFA 20:5n-3, 22:5n-3 và 20:4n-6 Như vậy, các kết quả phân tích cho thấy thức

ăn của loài san hô ở vùng nước nông phần lớn phụ thuộc vào các loài động vật giáp xác chân chèo calanoid ăn thực vật Còn ở 2 vùng nước có độ sâu lớn hơn, thành phần lipid của sinh vật chứa hàm lượng cao các axit béo 18:1n-9 và rượu 16:0, 14:0 – các axit béo đánh dấu của các động vật phù du, tương ứng với nguồn dinh dưỡng liên quan tới các nhóm giáp xác chân chèo sử dụng động vật phù du làm thức ăn [48]

Trong những năm gần đây, sự biến đổi khí hậu dẫn tới những thay đổi lớn trong sự phân bố của các sinh vật phù du, và việc nghiên cứu các chất đánh dấu sinh học kết hợp với các thử nghiệm về dinh dưỡng sẽ giúp cho các nhà khoa học xác định xem san hô có những thích nghi như thế nào với môi trường sống trước những thay đổi của thiên nhiên

1.4.2 Thành phần lipid, axit béo và phân loại sinh thái san hô

Ngoài phần lớn lipid và các axit béo của san hô được đưa vào cơ thể sinh vật thông qua con đường dinh dưỡng, ở một mức độ đáng kể, thành phần axit béo cũng được quy định bởi khả năng di truyền của các loài để sinh tổng hợp lên một số các axit béo nhất định Do vậy, axit béo được sử dụng như một công cụ hữu hiệu trong phân loại hóa học giữa các nhóm khác nhau, các hệ cộng sinh khác nhau; và góp phần vào nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp diễn ra trong cơ thể sinh vật

Một trong những nghiên cứu đầu tiên về thành phần lipid, axit béo của san

hô kiến tạo rạn (san hô sáu ngăn – Hexacorallia) là vào năm 1977 của nhà khoa học

Meyer và cộng sự, và cho đến nay, rất nhiều mẫu san hô kiến tạo rạn đã được các nhà khoa học tiến hành phân tích Đặc điểm chung quan sát thấy đó là thành phần axit béo 16:0, 18:0 và 18:1 có mặt với hàm lượng cao vượt trội trong hầu hết tất cả các mẫu Hexacorallia; các axit béo cơ bản khác là 14:0, 16:1n-7, 18:1n-9, 18:3n-6, 18:4n-3, 20:3n-6 [56, 34, 4] Ngoài ra, đối với các họ san hô khác nhau sẽ có một số axit béo đặc trưng có hàm lượng cao hoặc sự có mặt của chúng có mức độ quan trọng nhất định đối với nhóm sinh vật như: 20:3n-6, 20:4n-3, 22:6n-3 ở các loài thuộc họ Pocilloporidae; 18:1n-9 và 22:6n-3 ở các loài thuộc họ Poritidae; 18:3n-6

và 22:5n-3 ở các loài thuộc họ Faviidae…

Hình 1.5 Hàm lượng trung bình của các axit béo chính (% tổng axit béo) trong các

họ Acroporidae, Pocilloporidae, Poritidae, Faviidae, Dendrophylliidae, và

Milleporidae Dựa trên các kết quả nghiên cứu thu được, năm axit béo chuỗi n-6 và năm axit béo chuỗi n-3 đã được sử dụng như các biến để xây dựng biểu đồ hàm lượng giữa các loài san hô kiến tạo rạn thu thập tại vùng biển Việt Nam trong nghiên cứu của Ibms và cộng sự năm 2007 (Hình 1.5) [40]

Tuy nhiên, cũng là các axit tetracosapolyenoic, 2 axit béo 24:6n-3 và 24:5n-6 không hề được tìm thấy trong san hô sáu ngăn, nhưng từ rất sớm các nhà nghiên cứu đã nhận thấy sự hiện diện của chúng trong các tất cả các đại diện được nghiên cứu ở cả 3 phân lớp san hô mềm (san hô tám ngăn – Octocorallia) là Alcyonaria, Gorgonaria, và Pennatularia [4, 85] Và cho tới nay, 2 axit béo này được coi là một

dấu hiệu phân loại hóa học giữa hai phân lớp san hô kiến tạo rạn (san hô sáu ngăn Hexacorallia) và san hô mềm (san hô tám ngăn Octocorallia)

Đã có nhiều các công trình nghiên cứu sự khác biệt về định tính, định lượng của thành phần axit béo giữa các loài, giống san hô mềm khác nhau Loài san hô

mềm Gersemia rubiformis có thành phần axit béo 18:3n-3 và 18:4n-3 cao nhất

(chiếm tới 17% tổng axit béo) khi thu mẫu vào tháng 4 và tháng 11, thành phần axit béo 20:5n-3 đạt hàm lượng cao nhất vào tháng 6 [37] Các loài san hô thuộc giống Sinularia và Sarcophyton khác biệt nhau một cách rõ ràng về hàm lượng các axit béo chuỗi n-6; còn ở các loài thuộc giống Dendronephthya hàm lượng cao bất thường của các axit béo tetracosapolyenoic (lên đến 16% của 24:5n-6 và và 7% của 24:6n-3) là yếu tố chính tách biệt chúng khỏi các nhóm san hô khác [38, 99, 102]

Bảng 1.8 Hàm lượng các lớp chất lipid (% lipid tổng) trong san hô nguyên vẹn, san

hô vật chủ, zooxanthellae của loài Sinularia sp (giá trị TB ± SD, n = 3) [36]

Lớp chất lipid San hô nguyên

**: những lớp chất mà hàm lượng trong zooxanthellae và san hô vật chủ có sự khác biệt lớn

Rất nhiều loài san hô chứa các vi sinh vật (VSV) cộng sinh là các tảo cộng sinh nội bào zooxanthellae [79], đặc biệt là các loài san hô mềm Để so sánh một cách chi tiết hơn thành phần lipid của san hô vật chủ và các vi sinh vật cộng sinh,

trên đối tượng san hô mềm Sinularia sp., Imbs và cộng sự đã phân lập các

zooxanthellae ra khỏi san hô vật chủ và tiến hành phân tích riêng biệt Kết quả cho thấy hàm lượng của các lớp chất monoalkyldiacylaglycerol (MADAG), triacylglycerol (TAG) và lipid phân cực (PoL) có sự khác biệt đáng kể giữa vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae, san hô vật chủ và san hô nguyên vẹn (bảng 1.8) [28]

Các zooxanthellae giàu PoL, trong khi lipid trung tính (NL) phần lớn tập trung ở san hô vật chủ, MADAG chiếm tới 35% lipid của san hô vật chủ và hầu như là không có ở zooxanthellae Chứng tỏ rằng, MADAG chỉ được tổng hợp trong mô động vật và là lớp chất chỉ thị sinh học của san hô vật chủ trong mối quan hệ cộng sinh của san hô

Theo Sprecher [80] con đường sinh tổng hợp các axit béo chuỗi n-3 và n-6 (hình 1.6) được thực hiện song song bởi sự hoạt động liên tục của các enzyme Rất nhiều bằng chứng cho thấy sự hình thành các axit béo từ C22 lên C24 gặp nhiều khó khăn [95]

Hình 1.6 Sinh tổng hợp axit béo chuỗi n-3 và n-6

Hình 1.7 So sánh thành phần một số axit béo trong san hô nguyên vẹn, san hô vật

chủ và zooxanthellae loài Sinularia sp và Acropora sp [41]

Một số axit béo chính – được coi là các chất đánh dấu sinh học và được sinh tổng hợp bởi các vi sinh vật cộng sinh đó là 18:3n-6 và C18-22 PUFA dãy n-3 (18:4n-3, 18:5n-3, 20:5n-3, 22:5n-3, 22:6n-3) San hô vật chủ có khả năng tổng hợp các axit béo C20-C22 dãy n-6 (20: 3n-6, 20: 4n-6, và 22: 4n-6), tetracosapolyenoic

(24:5n-6, 24:6n-3) và 18:2n-7 Hai axit béo tetracosapolyenoic 24:5n-6 và 24:6n-3 được đề xuất như chất đánh dấu sinh học của lipid nguồn gốc từ động vật (san hô vật chủ) và hầu như có mặt rất nhỏ trong thành phần axit béo của zooxanthellae

(hình 1.7, bảng 1.9)

Bảng 1.9 Thành phần axit béo (% tổng axit béo), giá trị TB ± SD, n = 3) của lipid

tổng của san hô nguyên vẹn, zooxanthellae, và san hô vật chủ loài Sinularia sp [36]

Axit béo San hô nguyên vẹn Zooxanthellae San hô vật chủ

có thể được giải thích do sự vận chuyển axit béo từ vi sinh vật cộng sinh sang san

hô vật chủ [36, 41] Các nhà nghiên cứu còn nhận thấy, sinh tổng hợp các axit béo không no C16 (16:2n-7  16:3n-4  16:4n-1) hạn chế trong zooxanthellae của san

hô kiến tạo rạn và là đặc trưng sinh hóa chính của zooxanthellae ở san hô mềm [42]

1.4.3 Thành phần lipid, axit béo và sức khỏe của rạn san hô

Khi điều kiện sống của môi trường bất lợi, như nhiệt độ nước biển tăng lên,

sẽ xảy ra hiện tượng trắng hóa san hô San hô có thể bị trắng hóa một phần (còn khả năng phục hồi) hoặc hoàn toàn (không còn khả năng phục hồi) So sánh lipid giữa rạn san hô khỏe mạnh và rạn san hô bị trắng hóa, các nhà nghiên cứu nhận thấy, các rạn san hô bị tẩy trắng hoàn toàn mất đi tới 75% tổng hàm lượng các axit béo không

no đa nối đôi, đặc biệt là 18:4n-3, 20:4n-6, 20:5n-3, 22:5n-3 và 22:6n-3 Đây là các axit béo đặc trưng của vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae, và điều đó thể hiện sự vắng mặt của chúng trong các đối tượng san hô bị trắng hóa Đồng thời với sự suy giảm đó là sự tăng lên của các axit béo 15:0, 17:0, 16:1n-7 và 18:1n-7 – các axit béo đặc trưng cho sự có mặt của các vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn khử sulfate [103]

1.4.4 Thành phần lipid, axit béo và phân loại hóa học (chemotaxonomy) đối với san hô

Là những sinh vật có nhiều nguồn thức ăn, san hô có thể đồng thời có được chất dinh dưỡng, bao gồm cả axit béo qua nhiều nguồn khác nhau, từ: con mồi là các sinh vật phù du, các chất hữu cơ trong môi trường sống, các loài vi sinh vật cộng sinh (zooxanthellae), vi khuẩn, các con đường sinh tổng hợp xảy ra trong các

mô cơ thể Sinh tổng hợp axit béo này xảy ra song song cả trong zooxanthellae và các sinh vật chủ [36, 41] Sự linh hoạt của loài sinh vật này trong việc lựa chọn thực phẩm, độ sâu của môi trường sống, thay đổi nhiệt độ nước theo mùa, độ chiếu sáng giải thích cho những khác biệt trong thành phần axit béo giữa các nhóm, điều này ảnh hưởng đến phân loại chemotaxonomy của chúng

Các nghiên cứu về lipid và axit béo của san hô cho tới nay rất nhiều, tuy nhiên, không thể phủ nhận một điều rằng, các phương pháp tiếp cận khác nhau của các tác giả khác nhau khi phân tích thành phần lipid, axit béo sẽ gây ra khó khăn lớn cho việc so sánh các số liệu thu được Vì thế, trong các nghiên cứu về sau này, các nhà khoa học có xu thế hệ thống hóa các số liệu, nghiên cứu chi tiết nhưng trải rộng trên các đối tượng có tính đại diện cao nhằm tìm ra các quy luật trong sự phân bố thành phần lipid, axit béo của các loài san hô thuộc các nhóm phân loại khác nhau,

góp phần vào phân loại hóa học san hô dựa trên các kết quả phân tích chi tiết thành phần các lớp chất lipid, thành phần axit béo thu được

Trong một nghiên cứu như vậy, Imbs A.B và cộng sự đã thực hiện phân tích thành phần các lớp chất lipid, axit béo của 93 loài san hô tạo rạn và san hô mềm (bao gồm bộ Alcyonarian và Gorgonarian) thu thập tại vùng biển Việt Nam, đánh giá sự phân bố thành phần các lớp chất lipid và các axit béo trong các nhóm san hô khác nhau, và sự khác biệt giữa thành phần lipid giữa các loài có vi sinh vật cộng sinh và không có vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae [42] Các kết quả được xử lý qua phân tích thống kê đa nhân tố bằng phương pháp phân tích cấu tử chính (PCA), đây là một trong các phương pháp cung cấp thêm thông tin giúp cho phân loại học các loài sinh vật [59] Tất cả các thành phần lớp chất lipid (trừ axit béo tự do) được

sử dụng như các biến trong phép phân tích PCA

Hình 1.8 Phân tích thành phần chính (PCA) sử dụng biến là 5 thành phần lipid của

110 mẫu san hô (cứng/mềm, có VSV cộng sinh/không có VSV cộng sinh) Hình 1.8 cho thấy, các loài san hô mềm và san hô cứng phân chia rõ ràng thành 2 vùng (đường A-A) trong không gian 2 chiều hình thành bởi trục 1 và trục 2 Các loài san hô có vi sinh vật cộng sinh và không có vi sinh vật cộng sinh bị phân chia nằm về 2 phía đường phân định B-B Các loài không có vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae rơi ra khỏi vùng của các loài có chứa vi sinh vật cộng sinh ở cả 3

nhóm phân loại nêu trên Các đường cong được vẽ bằng tay để xác định ranh giới của các khu vực cho 6 nhóm san hô: có vi sinh vật cộng sinh và không có vi sinh vật cộng sinh Alcyonarian, Gorgonian và san hô tạo rạn Như vậy, thành phần lipid của san hô sáu ngăn và san hô tám ngăn có sự tương quan đáng kể so với vị trí phân loại của chúng trên biểu đồ, nhưng đặc trưng của lipid ở mỗi nhóm lại phụ thuộc chủ yếu vào sự hiện diện của các vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae

Các tác giả đã đưa ra biểu đồ tỉ lệ tương đối giữa thành phần các lớp chất lipid ở các loài san hô Việt Nam được nghiên cứu Các loài san hô 6 tia (san hô tạo rạn) có hàm lượng thấp các lớp chất lipid phân cực, sterol, monoalkyl diacylglycerol, còn hàm lượng các thành phần triacylglycerol, sáp cao hơn ở loài san hô tám ngăn (san hô mềm) Xét giá trị trung bình, các loài san hô có chứa zooxanthellae có hàm lượng PoL và ST thấp hơn và hàm lượng MADAG cao hơn

so với các loài san hô không chứa zooxanthellae (Hình 1.9)

Hình 1.9 Hàm lượng trung bình (± SD) của các lớp chất lipid ở các nhóm san hô

Kết quả phân tích chi tiết thành phần axit béo các mẫu san hô của tác giả có

sự thống nhất với các nghiên cứu trước đó, các axit béo tetracosapolyenoic 24:5n-6

và 24:6n-3 là các axit béo đánh dấu phân loại hóa học của các san hô tám ngăn so với san hô sáu ngăn, trong khi đó axit béo 22:5n-6 là axit béo đánh dấu cho các loài san hô mềm giống Milleporidae Ở cả hai phân lớp san hô sáu ngăn Hexacorallia và san hô tám ngăn Octocorallia, sự hiện diện với hàm lượng cao của hai axit béo 18:3n-6 và 18:4n-3 đều thể hiện đặc trưng của san hô có chứa vi sinh vật cộng sinh