TỔNG QUAN về CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Trong tự nhiên ngoài nhưng vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật có hại như:những chuẩn vi khuẩn gây bệnh cho người, cây trồng, động vật thuỷ sản, nhóm vi sinhvật gây hư hỏng thực

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÁO CÁO TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Môn học: Vi sinh đại cương GVHD: Vương Thị Việt Hoa

Sinh viên: Nguyễn Văn Nhi

MSSV: 13139119

Lớp: DH13HH

I Đặt vấn đề

Từ xa xưa, con người đã biết đến sử dụng vi sinh vật và ứng dụng của vi sinh vậttrong thực phẩm Các quá trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật Khi khoa học phát triển,biết rõ vai trò của vi sinh vật, thì việc ứng dụng vi sinh vật trong sản suất ngày càng rộngrãi có hiệu quả

Trong tự nhiên ngoài nhưng vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật có hại như:những chuẩn vi khuẩn gây bệnh cho người, cây trồng, động vật thuỷ sản, nhóm vi sinhvật gây hư hỏng thực phẩm, gây ô nhiễm môi trường xung quanh Chính vì vậy ta cầnphải tìm hiểu toàn bộ những gì có liên quan đến vi sinh vật để chúng ta sử dụng tối đa đặctính có hại và đề phòng những ảnh hưởng của chúng đem lại

II Tổng quan

*Tổng quan về độc tố vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

Thực phẩm chứa những thành phần dưỡng chất, thích hợp cho sự phát triển củamột số lớn vi sinh vật Chúng tồn tại tồn tại trong thực phẩm có thể gây hư hỏng hay gâybệnh cho người Các loại vi sinh vật thường gặp nhất trong công nghệ thực phẩm là nấmmốc, vi khuẩn, nấm men,

*Giới thiệu về Clostridium botulinum

*Lịch sử phát hiện

Vào năm 1895, Emile Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện ngộ độc botulin

ở dăm bông và ruột già của người bị chết do ngộ độc thịt

Hình: Emile Van Ermengem.

Đến năm 1896, Emile Van Ermengem tìm ra mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn

Clostridium botulinum), một loại sống kị khí, có nha bào, rất khó bị tiêu diệt Sau này,

các tác nhà khoa học khác còn thấy chúng trong đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người.Chúng có chất độc botulin, làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt là đến cáctín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánhsáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất làgây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong cao (70%)

Chúng có nhiều loại A, B, C, D, E nhưng loại A, B, E cho độc tố mạnh nhất.Nhưng sau đó những bằng chứng về kiểu hình và kiểu gen đáng kể tồn tại để chứng minhtính không đồng nhất trong các loài Điều này đã dẫn đến việc phân loại lại của

Clostridium botulinum loại G giống như là một loài Năm 2003 bộ gen của Clostridium botulinum được công bố (công trình của viện Sanger với Tiến sĩ Roger Huston và Tiến sĩ

Ngành: Firmicutes.

Lớp: Clostridia.

Bộ: Clostridiales.

Họ: Clostridiaceae Chi: Clostridium

Clostridium botulinum gồm có 7 chủng tùy thuộc vào loại độc tố A, B, C, D, E,

F, G Khi phát triển trên thực phẩm, Clostridium botulinum tiết các loại độc tố gây ngộ

độc và nguy hiểm, gây chết người do tác động lên hệ thống thần kinh Trong số này cácloại A, B, E và F gây bệnh ở người.Types C and D cause disease in animals Các loại C

và D gây bệnh ở động vật.Type G has not yet been confirmed to cause illness in humans

or animals.8, 4 Type A is the most potent toxin known and an estimated dose of this toxinrequired to cause death in humans vary between 0.1 to 1.0 micrograms Loại G chưađược xác nhận để gây bệnh ở người hay động vật

*Đặc điểm

*Đặc điểm chung

Clostridium botulinum là vi khuẩn kỵ khí có thể di động da dạng, tồn tại ở trong

đất, phân động vật, ruột cá Chúng là vi khuẩn sinh độc tố botulin là nguyên nhân gây tê

liệt cơ, phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 26-280C, sinh khí hydro sulfur (H2S) và sinh hơi

Có đặc điểm chung về kiểu hình là hình thành những nội bào tử nhiệt và kháng cự hóahọc, sự hiện diện của gram dương trong cơ cấu các tế bào sinh dưỡng, có sự trao đổi chất

kỵ khí làm lên men Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum chủ yếu là đặc trưng bởi khả

năng sản xuất độc tố ngoại bào protein nhiều hơn bất kỳ nhóm vi khuẩn nào khác

*Đặc điểm nuôi cấy/sinh hóa

Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum không thể phát triển ở pH acid thấp hơn 4,5 Nồng độ muối trên 1% có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn Clostridium

botulinum không thể sử dụng lactose như một nguồn carbon chính Clostridium botulinum cũng có thể được chia thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc điểm sinh hóa

và sinh lý Những nhóm này bao gồm:

Nhóm I – nhóm này bao gồm:

- Chủng độc tố loại A.

- Những biến dạng thủy phân protein của độc tố loại B và F

- Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF

Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh hơi cong với lông roi cólông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khảnăng chịu nhiệt cao, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là0,94 - 4,6

Nhóm III – nhóm này bao gồm:

- Chủng độc tố loại C và D

- Những sự biến dạng nói chung là không có thủy phân protein

Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lôngrung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năngchịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nướcvẫn chưa biết

Nhóm VI – nhóm này bao gồm: thủy phân protein của chủng độc tố loại G.

Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lôngrung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năngchịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nướcvẫn chưa biết

*Cấu trúc của Clostridium botulinum

*Cấu trúc tế bào

Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương (+),kích thước khoảng 0,3 –

0,7µm × 3,5 – 7,0 µm, không có có roi Sinh bào tử, bào tử thường to hơn chiều ngang

của tế bào

a Thành tế bào

Thành tế bào giúp duy trì hình thái của tế bào, giúp tế bào đề kháng với áp suấtthẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất cóphân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thựckhuẩn thể

Bảng 2.1: Thành phần của vi khuẩn gam (+).

b.

Màng sinh chất

Màng sinh chất vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác Chúng cấu tạobởi 2 lớp phospholipid, chiếm 30-40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong,ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60-70% khối lượng của màng Đầu phosphat của PLtích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵnước Có các chức năng chủ yếu sau đây:

- Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất

- Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào

- Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của baonhày (capsule)

- Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quanghợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng)

- Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp

Peptidoglycan 30-95

Acid teicoic (Teichoic acid) Cao

Lipid Hầu như không có

Protein Không có hoặc có ít

Hình : Cấu trúc của đầu và đuôi của phospholipid.

c Tế bào chất

Là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước.Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiềunhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp Bào quan đáng lưu ý trong tế bào chất làribosom Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của tếbào chất, gồm 2 tiểu phần (50S và 30S) kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S (S là đơn

vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng khi ly tâm cao tốc)

Hình: Ribosom ở vi khuẩn.

Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạtglycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt dịnhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh

d Thể nhân

Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không cóhình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân Khi nhuộm màu tế bào bằngthuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím Đó là 1 nhiễm sắc thể duy nhấtdạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép

e Bao nhầy

Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid vàprotein Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic Ý nghĩa sinh học củabao nhầy là:

- Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn

- Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn

- Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan )

- Giúp vi khuẩn bám vào giá thể

*Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum

Clostridium botulinum sẽ tiết ra một độc tố sinh học mạnh ức chế sự phóng thích

hoạt động của các bó cơ, tác động đến nơi tiếp hợp cholinergic qua trung gian Calciumvào khe synape làm mất khả năng chi phối hóa học tại chổ và mất hoạt động thần kinhcủa sợi nơron vận động trong thoi cơ Hoạt chất này tác động tại nơi tiếp hợp thần kinh

cơ nên ngăn cản sự phóng thích acetylcholine và gây ra liệt

Độc tố của Clostridium botulinum tác dụng qua 3 giai đoạn: Kết nối, thâm nhập,

ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh Độc tố này không ảnh hưởng vào sự

tổng hợp hay dự trữ acetylcholine nhưng ảnh hưởng vào sự phóng thích chất này ở sợitận cùng tiền tiếp hợp

Cơ chế gây bệnh

của Clostridium botulinum.

*Bệnh và các triệu chứng

Nguồn lây bệnh: Các thực phẩm dễ bị nhiễm Clostridium botulinum thường là rau

quả ướp muối, hoặc chế biến mứt tại gia đình, các bán thành phẩm từ thịt, cá hoặc mộtvài đồ hộp không đảm bảo yêu cầu vệ sinh khi chế biến và khử khuẩn

Biểu hiện bệnh: Thời kỳ ủ bệnh thường là 12 - 36 giờ nhưng cũng có thể từ 2 giờđến 8 ngày với các triệu chứng đau bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt, khónuốt, khó thở nếu bệnh kéo dài từ 4 - 8 ngày tỷ lệ tử vong tới 60%-70% Ngộ độc

Clostridium botulinum còn phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như yếu tố môi trường, đặc

tính thực phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt và ăn uống của cá nhân mà nguồnthực phẩm gây ngộ độc cũng khác nhau Ở Nga, ngộ độc chủ yếu do cá, ở Mỹ do đồ hộprau quả, ở Đức do ăn các thức ăn làm bằng thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúcxích

Các triệu chứng: bệnh xuất hiện với các dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là liệt thầnkinh do tổn thương thần kinh trung ương và hành tủy Triệu chứng sớm nhất là liệt mắt,

cơ mắt, có biểu hiện song thị như nhìn một hóa hai; bị liệt vòm họng, lưỡi, yết hầu biểuhiện rối loạn lời nói rồi mất tiếng, mất phản xạ nuốt; bị liệt dạ dày, ruột dẫn đến táo bón,chướng bụng, giảm sự tiết dịch, Bệnh nhân có thể không sốt nhưng mạch nhanh, mạch

có thể tăng nhanh nhưng nhiệt độ cơ thể vẫn bình thường, có hiện tượng mạch-nhiệt phânly

Các loại thực phẩm nhiễm Clostidium botulinum: phát hiện trong đồ hộp (thịt, cá,

patê, xúc xích, rau quả ), lạp xưởng, thịt đùi lợn, cá ướp muối hoặc phơi khô rồi xông

khói thức ăn chế biến sẵn và mật ong Thực phẩm nhiễm Clostridium botulinum rất khó

nhận biết bằng cảm quan, chỉ nhận biết được sau khi sử dụng qua những dấu hiệu lâmsàng

*Sự phân bố của Clostridium botulinum

Clostridium botulinum và bào tử của nó được phổ biến rộng rãi trong môi trường

xảy ra chủ yếu trong đất và trầm tích biển Chúng bao gồm:

- Đất trồng trọt và đất rừng

- Cặn dưới đáy suối, hồ và ven biển nước

Tỷ lệ Clostridium botulinum trên toàn thế giới thay đổi tùy theo khu vực địa lý, mà

nhiều khả năng có liên quan đến thành phần vật lý và hoá học của đất và các vi sinh vậttại nơi đó Ví dụ các loại ưa lạnh và loại không thủy phân protein của nhóm B và E đượctìm thấy phổ biến trong đất có độ lạnh hơn thông thường và cặn dưới đáy trong khi nhữngloại thủy phân protein ưa nhiệt độ trung bình của nhóm A va B đã được tìm thấy phổ biếntrong đất ẩm

Ngoài ra, mầm bệnh và bào tử của nó có một số nơi khác như:

– Trong đường tiêu hóa của loài cá, chim và dạ dày động vật có vú

– Mang và nội tạng của động vật có vỏ như cua và loài sò hến

– Trong mật ong của loài ong

– Bào tử Clostridium botulinum kháng cự đối với những sự căng thẳng môi

trường và (thì) cũng được tìm thấy trong vài thức ăn, bụi, những chất xịt (bìnhxịt), chất thải và những môi trường khác

*Tình hình nhiễm Clostridium botulinum trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam

hiện nay

– Tai Việt Nam: Hiện nay trong sinh hoạt hàng ngày, các loại thực phẩm đónghộp có mặt khá phổ biến trên thị trường và được rất nhiều người tiêu dùng sửdụng Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quantâm đến vấn đề dự trữ các loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó

khăn có thể xảy ra Một trong những thực phẩm thường được dự trữ là các loạithực phẩm đóng hộp Nếu khi mua và sử dụng các loại đồ hộp không cẩn thận,con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển ở trong loại thựcphẩm này Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn

Clostridium botulinum có trong đồ hộp, có thể gây tử vong.

– Tại một số nơi trên thế giới: 161 dân làng ở tỉnh Nan (miền Bắc Thái Lan)

đã phát bệnh sau khi ăn măng tre muối muối chua ở một lễ hội Nhân viên y tếThái Lan cho rằng dịch bệnh ở tỉnh Nan là do bảo quản măng tre không tốt đã

tạo ra vi khuẩn Clostridium botulium có độc tố chết người Độc tố trong vi khuẩn Clostridium botulinum là một trong những độc tố mạnh nhất và có thể

sử dụng làm vũ khí sinh học Độc tố này gây tử vong do nó làm tê liệt các cơ

hô hấp làm người bệnh không thở được

III Các phương pháp phát hiện Clostridium botulinum

*Phương pháp truyền thống

Thử nghiệm độc tố Clostridium botulinum trong chuột

Trong tất cả những phương pháp pháp hiện và xác định độc tố botulinum trongthực phẩm thì trong phương pháp phát hiện trên cơ thể chuột là tiêu chuẩn duy nhất đểxác định độc tố

Sự hiện diện của chất độc được phát hiện bằng cách tiêm vào chuột trích xuất từthực phẩm rồi sau đó quan sát cho đặc tính triệu chứng của bệnh ngộ độc khi chuột chếtsau khoảng thời gian 48 giờ

7 Những ống hút được nút bởi bông vô trùng.

8 Thiết bị pipet cơ khí (không bao giờ được hút pipet bằng miệng)

9 Những ống nghiệm nuôi cấy

10 Bình kỵ khí

11 Dây cấy vòng

12 Vườn ươm 35 - 280C

13 Bình mẫu vô trùng

14 Những cái giá treo đồ ống nghiệm nuôi cấy

15 Những tiêu bản hiển vi

B Môi trường và thuốc thử

1 Dung dịch cồn iốt (4% iốt trong 70% ethanol)

2 Canh gan thịt

3 Dung dịch Trypticase trích xuất từ peptone-men glucose, canh thịt (TPGY) hoặc với trypsin (TPGYT)

4 Lagg volk hoặc lagg volk agar kỵ khí

5 Gạc thấm vô khuẩn, bộ đệm phốt phát chất gien, độ pH 6.2

6 Ethanol tuyệt đối

7 Chất phản ứng nhuộm gam tím crystal violet hoặc dung dịch methylene blue

8 Nước muối sinh lý học vô khuẩn

9 Chế phẩm thuốc kháng độc các loại AF (lấy từ CDC).

10 Dung dịch Trysin

11 Dung dịch Sodium hydroxide 1 N

12 Dung dịch Axít clohiđric 1 N

C Chuẩn bị mẫu

- Kiểm tra sơ bộ: Mẫu được giữ lạnh cho đến khi thử nghiệm, trừ các loại thực

phẩm đóng hộp chưa mở, mà không cần phải được làm lạnh Trước khi thử nghiệm, ghitên sản phẩm, tên nhà sản xuất hoặc chủ sản xuất, nguồn gốc của mẫu, loại container vàkích cỡ, nhãn mác, lô hàng sản xuất, mã sản xuất, và tình trạng của container Làm sạchcontainer đánh dấu với mã số nhận dạng của phòng thí nghiệm

- Thực phẩm rắn và lỏng: Chuyển giao các loại thực phẩm vô trùng lỏng Ngoài

ra, cấy miếng nhỏ các sản phẩm trực tiếp vào canh môi trường với chiếc kẹp vô trùng.Cấy các loại thực phẩm lỏng trực tiếp vào canh môi trường với pipet vô trùng Dự trữmẫu sau khi nuôi cấy cho vào ống nghiệm để dành sau này có thể sử dụng lại

- Mở các loại thực phẩm đóng hộp: Kiểm tra bề ngoài các sản phẩm và mùi Ghi

nhớ bất kỳ bằng chứng nào về sự phân hủy Đừng nếm các sản phẩm dưới bất kỳ trườnghợp nào

D Phát hiện Clostridium botulinum

Tăng sinh

Loại oxy ra khỏi môi trường bằng cách đun sôi môi trường 10 – 15 phút và làmlạnh nhanh và không cần lắc đều cấy 2 ống môi trường thịt được đun với 1 – 2 g thựcphầm rắn hoặc 1 – 2 ml thực phẩm lỏng trong 15ml moi trường tăng sinh, ủ ở 350C

Cấy 2 ống TPGY như trên,Incubate at 28°C ủ ở 280C Use TPGYT as alternativeonly when organism involved is strongly suspected of being a nonproteolytic strain oftypes B, E, or F Sử dụng TPGYT thay thế khi sinh vật phân hủy thuộc nhóm khôngphân giải protein của các loại B, E, hoặc F Tiêm thêm chất dẫn truyền độc tố từ dưới bềmặt canh môi trường Sau 5 ngày ủ bệnh kiểm tra các canh môi trường gồm kiểm tra độđục, sinh hơi và phân hủy các hạt thịt, mùi