Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR Bởi: Cao Xuân Hiếu Thủ thuật thiết kế primer Thành phần phản ứng Enzyme Các đặc tính enzyme DNA polymerase định nghĩa đơn vị (unit) loại (hãng) sản xuất khác Cần kiểm tra thông tin tờ hướng dẫn kèm hóa chất Lượng enzyme cần thiết phụ thuộc vào lượng DNA template kích thước phản ứng PCR Tuy nhiên, thành phần nên hiệu chỉnh 1) sản phẩm PCR lớn 5kb; 2) có khả hoạt tính enzyme bị giảm sút thiếu sót khâu bảo quản; 3) tiến hành hiệu chỉnh nhiều cách sản phẩm PCR thấp Không nên tăng enzyme 2U (5µl) 50 µl tổng thể tích phản ứng Việc thay đổi loại DNA polymerase làm thay đổi hiệu suất phản ứng PCR Khi tính toán chiến lược cloning hệ thống TA vector, cần lưu ý DNA polymerase có đặc tính tạo đầu treo A đầu 3' hay không Nếu không cần phản ứng bổ sung sử dụng Klenow ATP Tính xác enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´→5´ exonuclease Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA polymerase có hay hoạt tính Buffers Hiệu suất, tính xác enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng Thông thường nên sử dụng loại buffer tương ứng với enzyme nhà sản xuất khuyến cáo Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến phản ứng microarray DHPLC 1/5 Kỹ thuật PCR Nhiều loại buffer có sẵn lượng định ion Mg2+ nên cần lưu ý tối ưu hóa nồng độ Mg2+ Nồng độ Mg2+ dNTP Việc tăng nồng độ ion Mg2+ làm xuất thêm sản phẩm không đặc hiệu Tuy nhiên thiếu ion Mg2+ dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template thành phần buffer (một số buffer thương mại có sẵn lượng định ion Mg2+) Dò tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thông thường gradien nồng độ từ 0.5 đến mM với khoảng cách bước 0.2 mM dNTPs loại hóa chất bền cần lưu ý sử dụng bảo quản Nên chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại Lượng dNTP tối ưu 200 µM of loại dNTP Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh yếu tố khác Template Primers Nồng độ tối ưu DNA template từ 1) mẫu DNA tương đối đồng (plasmid, lambda BAC DNA): pg - 10 ng / 50 µl tổng thể tích phản ứng; 2) mẫu DNA genome từ 50 - 500 ng/50 µl tổng thể tích Nồng độ primer thường tối ưu 10 mM loại Chất khác Đối với DNA template lớn, giàu GC sử dụng chất biến tính DMSO, formamide, glycerol, and betaine thành phần PCR Tuy nhiên, phải kiểm tra độ tương thích enzyme DNA polymerase Tăng lượng DMSO PCR cần giảm nhiệt bắt mồi xuống Một số buffer có chứa sẵn loading buffer để điện di sau PCR Tuy nhiên, độ nhạy PCR với buffer không cao Đối với máy luân nhiệt (thermocycler) gia nhiệt nắp nên bổ xung mineral oil để tránh bay mẫu 2/5 Kỹ thuật PCR Chu trình nhiệt Biến tính Việc tăng nhiệt độ kéo dài thời gian biến tính làm tăng tính đặc hiệu PCR làm giảm tuổi thọ enzyme DNA polymerase Đối với enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độ biến tính 95°C-98°C Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu bước biến tính ngắn trước chu kỳ nhiệt Đối với genome lớn thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến Để làm giảm ảnh hướng enzyme bổ sung enzyme DNA polymerase sau biến tính ban đầu Khi tối ưu PCR cần giảm tối thiểu thời gian biến tính chu kỳ để tăng lượng sản phẩm Thông thường từ 10s đến 30s Tốc độ gia nhiệt chế độ điều khiển nhiệt độ hệ thống luân nhiệt (PCR machine, thermocylcer) khác phụ thuộc hãng sản xuất Một số hệ thống cho phép thay đổi thông số tối ưu PCR Bắt mồi Đối với primer dài 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động Tm thấp + 3°C 3/5 Kỹ thuật PCR Đối với primer nhỏ 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp Tm thấp nhất, dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt chu kỳ thường 0.5°C) Đối với cặp Tm cao tự bắt cặp, có loop khắc phục PCR bước (95°C 68°C) Kéo dài Nhiệt độ kéo dài thường tiến hành 72°C nhiên, hoạt tính 5'-3' DNA polymerase xảy nhiệt độ 68°C Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm loại template 1) Đối với DNA đồng (plasmid, lambda BAC DNA) tốc độ đạt tới 15s/kb; 2) DNA genome lớn, phức tạp tốc độ thường 30s-1min/kb Giải pháp tối ưu hóa Không có sản phẩm lượng sản phẩm thấp 10 11 12 Lặp lại thí nghiệm đề phòng lỗi thao tác Sử dụng ống dNTP mới, có chất lượng đảm bảo Tăng lượng DNA template, điện di kiểm tra lại nồng độ DNA template Tinh DNA template chiết phenol, tủa cồn kit tinh gel Nếu cần tiến hành tách chiết DNA template phương pháp tách chiết khác Tăng thời gian kéo dài sản phẩm PCR 0,5 kb Tăng số chu kỳ PCR lên 35, 40 Hạ thấp nhiệt độ bắt mồi xuống đến 2°C Hoặc sử dụng touchdown PCR Dùng PCR đánh bắt với nhiệt độ bắt mồi thấp (~45°C) 10 chu kỳ đầu nâng cao nhiệt độ đến Tm thấp 20 chu kỳ Tăng nhiệt độ biến tính (tối đa 98°C) điều chỉnh thời gian biến tính DNA mẫu DNA genome lớn khuyếch đại đoạn lặp SSR Kiểm tra điều kiện primer, thiết kế cặp primer để chạy nestPCR Tăng nồng độ enzyme DNA polymerase Thay đổi loại enzyme DNA polymerase hệ buffer Vệt smear kích thước lớn sản phẩm mong muốn Giảm nồng độ enzyme DNA polymerase Rút ngắn thời gian kéo dài Giảm số chu kỳ nhiệt PCR xuống tối đa 25 Tăng nhiệt độ bắt mồi lên 2°C thử với PCR giai đoạn nestPCR Thay đổi nhiệt độ biến tính 4/5 Kỹ thuật PCR Thử chạy gradien nồng độ Mg2+ Hạ thấp nồng độ primer • Đối với trường hợp vệt smear thấp băng mong muốn thường tối ưu cách tăng thời gian kéo dài cuối 72°C từ đến 10 Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp sản phẩm mong muốn Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi Tăng thời gian kéo dài thêm 30s Giảm nồng độ DNA polymerase Tối ưu hóa nồng độ Mg2+ Tinh DNA template gel Hoặc thủy phân DNA số RE trước dùng làm template (hiệu băng sản phẩm phụ kích thước lớn >= 1kb) Giảm nồng độ primer Thiết kế cặp primer 5/5