Khảo sát phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin

Khảo sát tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF .... Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin đến lư n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG THỊ NGỌC

MÃ SINH VIÊN: 1101370

KHẢO SÁT PHẢN ỨNG HYDROXYETHYL HÓA QUERCETIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG THỊ NGỌC

MÃ SINH VIÊN: 1101370

KHẢO SÁT PHẢN ỨNG HYDROXYETHYL HÓA QUERCETIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Văn Hải, người

đã trực tiếp hướng dẫn tôi, luôn theo sát tôi trong quá trình thực nghiệm, cho tôi những bài học quý báu, cùng những lời động viên chân thành, tạo những điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

ôi xin chân thành cảm ơn các thầ cô trong ộ môn ông nghiệp ư c, đ c biệt

là PGS TS Nguyễn Đình Luyện, Th.S Nguyễn Văn Giang, và N Phan Ti n

Th nh c a t môn ng h p Hóa dư c đã nhiệt tình gi p đ và tạo điều kiện tốt

nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nà

rong quá trình thực nghiệm, tôi c ng đã ma mắn nhận đư c sự gi p đ c a các cán bộ c a ph ng Phân t ch ph - Khoa Hóa học - Đại học khoa học tự nhiên, cán

bộ c a Viện công nghệ dư c phẩm quốc gia, tập thể cán bộ giảng viên c a trường Đại học ư c Hà Nội đã nhiệt tình tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận

ôi c ng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến bạn bè, gia đình đã luôn động viên,

kh ch lệ tôi, để tôi có thể vư t qua mọi khó khăn, hoàn thành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngà 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Vương Thị Ngọc

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về quercetin 2

1.1.1 Công thức phân tử của quercetin 2

1.1.2 Tính chất vật lí của quercetin 2

1.1.3 Tính chất hóa học của quercetin 2

1.1.4 Một số phương pháp điều chế quercetin từ rutin 6

1.2 Tác dụng sinh học của quercetin 7

1.3 Tác dụng sinh học của một số dẫn chất alkyl hóa của quercetin 9

1.3.1 Dẫn chất 7-O-butylquercetin (BQ) và 7-O-geranylquercetin (GQ) 9

1.3.2 Dẫn chất 3’-O-methyl quercetin và 4’-O-methyl quercetin 10

1.3.3 Dẫn chất 3’-hydroxyethyl quercetin và dẫn chất 4’-hydroxyethyl quercetin 11

1.4 Một số phản ứng hydroxyethyl hóa 12

1.4.1 Phản ứng hydroxyethyl hóa rutin 12

1.4.2 Phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Tinh chế rutin và điều chế quercetin 19

3.1.1 Tinh chế rutin 19

3.1.2 Điều chế quercetin bằng phản ứng thủy phân rutin trong môi trường acid……… 19

3.2 Hydroxyethyl hóa quercetin bằng tác nhân 2-bromoethanol trong dung môi hữu cơ ………21

3.2.1 Tính chọn lọc của phản ứng trên các nhóm -OH phenol của quercetin .21

3.2.2 Khảo sát tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF 24

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ mol K2CO3 : quercetin cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF 25

3.2.4 Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF 28

3.2.5 Khảo sát thời gian thích hợp cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF 31

3.2.6 Khảo sát dung môi cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin 34

3.3 Hydroxyethyl hóa quercetin bằng tác nhân 2-cloroethanol trong dung môi kiềm nước 39

3.4 Xác định cấu trúc hóa học 44 3.4.1 Xác định cấu trúc của sản phẩm NV-1 (dẫn chất 2 nhóm thế hydroxyethyl

của quercetin) 47

3.5 Bàn luận 49

3.5.1 Bàn luận về cấu trúc của dẫn chất NV-1 49

3.5.2 Bàn luận về cấu trúc của dẫn chất NV-2 50

3.5.3 Bàn luận về phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

thế hydroxyethyl của quercetin)

giờ

Bảng 2 1 anh mục các ngu ên vật liệu sử dụng 15

Bảng 2 2 anh mục các dụng cụ, thiết bị 16

Bảng 3 1 Kết quả quá trình tinh chế rutin 19

Bảng 3 2 Kết quả phản ứng điều chế quercetin từ rutin 20

Bảng 3 3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin đến lư ng sản phẩm NV-1 và NV-2 tạo thành trong dung môi DMF 25

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol K 2 CO 3 : quercetin đến lư ng sản phẩm NV-1 tạo thành trong dung môi MF… 26

Bảng 3 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol K2CO3: quercetin đến lư ng sản phẩm NV -2 tạo thành trong dung môi DMF 28

Bảng 3 6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a nhiệt độ đến lư ng sản phẩm NV-1 tạo thành trong dung môi DMF 29

Bảng 3 7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a nhiệt độ đến lư ng sản phẩm NV-2 tạo thành trong dung môi DMF 31

Bảng 3 8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a thời gian đến lư ng sản phẩm NV-1 tạo thành trong dung môi DMF 32

Bảng 3 9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a thời gian đến lư ng sản phẩm NV-2 tạo thành trong dung môi DMF 33

Bảng 3 10 Khảo sát ảnh hưởng c a dung môi đến sản phẩm tạo thành 34

Bảng 3 11 Một số điều kiện cho phản ứng h drox eth l hóa quercetin trong dung môi hữu cơ 35

Bảng 3 12 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol 2-cloroethanol : quercetin đến lư ng sản phẩm NV -1 tạo thành trong dung môi kiềm nước 41

Bảng 3 13 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol NaOH : quercetin đến lư ng sản phẩm NV -1 tạo thành trong dung môi kiềm nước 42

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a nhiệt độ đến lư ng sản phẩm NV -1 tạo thành trong dung môi kiềm nước 43

Bảng 3 15 Một số điều kiện đư c lựa chọn cho phản ứng h drox eth l hóa quercetin trong dung môi kiềm nước 43

Bảng 3 16 Kết quả phân t ch ph ESI - MS (MeOH) c a NV- 1 44

Bảng 3 20 Kết quả phân t ch ph 1

H - NMR (500 MHz, methanol) c a NV - 2 47

Hình 1.2 Phản ứng ox hóa quercetin thành quinon 3 Hình 1.3 ơ đồ phản ứng mở vòng γ-pyron 4 Hình 1.4 Phản ứng th phân c a các isoflavon 4 Hình 1.5 Phản ứng khử quercetin bằng kim loại Mg trong môi trường HCl 5 Hình 1.6 Phản ứng điều chế quercetin từ rutin 6 Hình 1.7 ơ đồ phản ứng h drox eth l hóa rutin với tác nhân 2-cloroethanol

Hình 3.12 Phản ứng h drox eth l hóa quercetin tạo dẫn chất NV-2 trong dung môi

DMF 38

Hình 3.13 Phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi kiềm nước 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hòe hoa là nụ của cây Hòe (Sophara japonica L.), họ Đậu (Fabaceae) Thành phần chủ yếu của hòe hoa là rutin Tác dụng của rutin là tăng độ bền mao mạch, giảm tính thấm mao mạch và tăng sự bền vững của hồng cầu [1], [2],[11]

Trong cơ thể, tác dụng của rutin là do phần aglycon – quercetin, sản phẩm chuyển hóa tiếp theo của rutin [6] Quercetin là một flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học như chống viêm, chống dị ứng, hạ huyết áp, hạ cholesterol máu Tuy nhiên quercetin có sinh khả dụng thấp, do độ tan trong nước của quercetin thấp Nguyên nhân là do trong phân tử quercetin có sự hiện diện của nhiều nhóm -OH phenol, có khả năng hình thành các liên kết hydro nội, ngoại phân tử làm giảm độ tan của nó Như vậy nếu giảm số lượng nhóm OH phenol có thể làm tăng sinh khả dụng của quercetin [17]

Mặt khác, việc alkyl hóa quercetin tạo ra các sản phẩm có hoạt tính tốt hơn so với phân tử quercetin thông thường [15], [17], [19]

Hydroxyethyl là nhóm thế có khả năng gắn vào nhóm -OH phenol, có thể làm tăng

độ tan của hợp chất ban đầu Ví dụ troxerutin là dẫn chất hydroxyethyl hóa của rutin, có khả năng hòa tan trong nước lớn hơn rutin nhiều lần [8]

Chính vì vậy, việc nghiên cứu các dẫn chất hydroxyethyl hóa của quercetin là có

nhiều triển vọng trong nghiên cứu phát triển thuốc Đề tài “Nghiên cứu phản ứng

hydroxyethyl hóa quercetin” được thực hiện với mục tiêu sau:

1 Lựa chọn được các điều kiện phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin để thu được một số sản phẩm hydroxyethyl quercetin

2 Xác định được cấu trúc của một số sản phẩm tạo thành

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về quercetin

1.1.1 ông thức phân tử của quercetin

Hình 1.1 ông thức phân tử c a quercetin

Tên khoa học: 3,3’,4,5,7- pentahydroxy-flavon

1.1.3 Tính chất hóa học của quercetin

Do đặc điểm cấu tạo hóa học của flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn Tính chất hóa học của nhóm phenolic còn phụ thuộc vào vị trí nhóm OH, hệ nối đôi liên hợp và các nhóm thế

Phản ứng của nhóm hydroxy (-OH):

+ Tính oxi hoá: Dưới tác dụng của chất oxy hóa (bạc nitrat, ferricyanid, persulfat,

các gốc tự do,…) hay enzym polyphenoloxydase, flavonoid sẽ bị oxy hoá thành các gốc ArO* Các gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa với các gốc tự do khác tạo thành liên kết mới C-C, C-O hoặc O-O Sự tăng nhóm hydroxy trong phân

tử làm cho các chất phenol trở nên nhạy cảm hơn với sự oxy hóa và với các phản ứng bẻ gãy vòng

như trong hình 1.2 [13]:

Hình 1.2 Phản ứng ox hóa quercetin thành quinon

+ Tính acid: Các flavanoid có tính acid yếu nên dễ dàng phản ứng với dung dịch

kiềm để tạo thành muối tan trong nước, khi đun nóng cho màu vàng hay đỏ thắm tùy theo nồng độ và nhóm flavonoid Flavon và flavonol (quercetin) trong dung dịch amoniac cho màu vàng sáng, Chalcon và Auron cho màu đỏ da cam Anthocyan trong dung dịch amoniac hay natri carbonat cho màu xanh hoặc tím,…[1]

+ ự tạo thành liên kết h dro: Khi không có trở ngại gì về mặt cấu trúc không gian,

liên kết hydro được hình thành giữa các nhóm OH tự do trong cùng phân tử hoặc giữa các phân tử với nhau Đặc điểm này làm ảnh hưởng nhiều đến tính chất lí hóa học như: điểm sôi, điểm nóng chảy, độ hòa tan, đặc tính phổ tử ngoại, cấu trúc phân

tử và khả năng phản ứng

Dưới tác dụng của acid, O-hydroxyldibenzoylmethan lại được đóng vòng thành

flavon (hiệu suất 77%)

Tương tự các isoflavon cũng bị thủy phân thành dẫn chất ceton, phenol hoặc acid

Hình 1.4 Phản ứng th phân c a các isoflavon

Phản ứng ether hóa:

Ether thiên nhiên của phenol thường gặp trong thực vật, đặc biệt những ether

metylic Những nhóm -OH phenol dễ dàng tham gia phản ứng ether hóa

Phản ứng của vòng thơm:

+ Phản ứng thế: Các flavonoid tham gia phản ứng thế dễ hơn so với benzen và chịu

ảnh hưởng của nhóm khác

+ Phản ứng diazo và azo hóa: Phản ứng này sử dụng để phát hiện flavonoid trên sắc

kí đồ Thuốc thử thường là những amin thơm như p-nitroanilin, benzidin, acid

sulfanilic Màu đặc trưng của phản ứng này là đỏ hay da cam, nâu đỏ phụ thuộc vào

vị trí và số lượng nhóm -OH [9]

Phản ứng của nhóm carbonyl:

+ Phản ứng hinoda (ha c anidin): Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim

loại như sắt, kẽm, magie và HCl Sản phẩm có màu da cam, hồng, hoặc đỏ

Phản ứng này đặc trưng cho các chất flavonoid có nhóm carbonyl ở vị trí C4 và có nối đôi giữa C2=C3 điển hình là flavonol (quercetin) Flavon không có nhóm -OH ở C3 nên phản ứng khó hơn và cho màu nhạt nên đôi khi khó phát hiện

Năm 1914, Willsaetter đã tiến hành phản ứng khử quercetin bằng kim loại magie trong môi trường HCl thành dẫn chất màu cyanidin chlorid [18]

Hình 1.5 Phản ứng khử quercetin bằng kim loại Mg trong môi trường H l

Người ta dùng phản ứng này để định tính và định lượng quercetin bằng phương pháp so màu

+ Phản ứng tạo phức kim loại:

Khả năng tạo chelat với kim loại nặng là một trong những tính chất quan trọng của flavonoid, liên quan đên hoạt tính sinh học của chúng Các phức màu xanh đen với molipden và sắt Các flavonoid có nhóm chức carbonyl ở vị trí C4 và hydroxyl ở vị

trí C3 - C5 (flavonol) dễ tạo phức với kim loại, đặc biệt với nhôm cho màu vàng hoặc vàng xanh phát quang ở bước sóng 365 nm

Các flavonoid có nhóm -OH tự do ở vòng C (flavonol) khi lắc kĩ với dung dịch chì acetat trong rượu sẽ tạo thành kết tủa màu vàng đỏ, anthocyan tạo kết tủa màu đỏ hoặc xanh [9], [11]

+ Phản ứng Martini ettolo (phản ứng với dung dịch b l 5 trong CCl 4 )

Các chalcon cho màu đỏ đến đỏ tím Flavon, flavonol cho màu vàng đến vàng cam Thực chất của phản ứng này là sự tạo phức của các flavonoid có nối đôi liên hợp giữa nhóm carbonyl với vòng B Các flavonoid không có sự liên hợp này thì phản ứng đặc trưng không xảy ra [11], [17]

1.1.4 M t s phương ph p i u ch quercetin t rutin

Nguyên tắc: rutin là một flavonoid dễ bị thủy phân Trong môi trường acid, rutin sẽ

bị thủy phân thành quercetin, glucose và rhamnose theo sơ đồ sau:

Hình 1.6 Phản ứng i u ch quercetin t rutin

+ Theo tác giả Nguyễn Văn Đậu, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội: Rutin được thủy phân bằng cách đun hồi lưu với dung dịch HCl 5% trong thời gian 1 giờ, cho quercetin kết tủa màu vàng ở dạng hydrat

+ Theo tác giả Hoàng Thị Kim Dung và cộng sự, Viện Công nghệ Hóa học, Viện

2% ở nhiệt độ sôi của dung dịch trong 90 phút sử dụng máy khuấy từ có gia nhiệt, đem lọc, rửa nhiều lần bằng nước thu được [6]

1.1.5 Tổng quan về phổ 1H-NMR của quercetin [17]

Bảng 1 1 Kết quả phân t ch ph 1 H-NMR c a quercetin

Công thức cấu tạo

Độ dịch chuyển (ppm)

1.2 Tác dụng sinh học của quercetin

+ ác dụng tăng sức đề kháng, giảm t nh thẩm thấu mao mạch, phục hồi t nh đàn hồi c a mao mạch bị t n thương, bảo vệ các mạch máu và liên kết các mô trong cơ thể gi p làm giảm 2 ngu cơ mắc các bệnh tim mạch và đột qụ

Về cơ chế tác dụng: Adrenalin có tác dụng tăng cường sức đề kháng mao mạch Có tác giả cho rằng, quercetin tham gia vào quá trình oxy hóa - khử, làm giảm hiện

tượng oxy hóa adrenalin bằng cách ức chế cạnh tranh với enzym catecholamin-O-

methyltransferase, do đó lượng adrenalin bị phá huỷ trong tuần hoàn giảm, tính đề kháng của mao mạch tăng [2]

+ ác dụng chống viêm: Thí nghiệm trên chuột, quercetin có tác dụng ức chế phù

bàn chân do albumin, histamin, serotonin gây nên như sưng khớp khuỷu do enzym hyaluronidase

Về cơ chế tác dụng: Hiện có nhiều giả thuyết như kích thích tuyến thượng thận tiết adrenalin, làm tăng hàm lượng adrenalin trong máu bằng cách ức chế enzym

catecholamin-O-methytransferase hoặc monoamin, oxydase hoặc ức chế enzym

hyaluronidase

+ ác dụng hạ hu ết áp, hạ cholesterol máu: Một số thí nghiệm trên súc vật cho

thấy quercetin có tác dụng hạ huyết áp, hạ cholesterol máu, đồng thời có tác dụng điều trị và phòng bệnh xơ vữa động mạch

+ ác dụng chống kết tập tiểu cầu: quercetin có tác dụng tăng cao hàm lượng

cAMP trong tiểu cầu của người và ức chế kết tập tiểu cầu do ADP gây nên Cơ chế quercetin có tác dụng thay đổi chuyển hóa của cAMP ở tiểu cầu thông qua sự ức chế hoạt động của enzym phosphodiesterase, làm tăng cao hàm lượng cAMP quercetin có tác dụng ức chế cả 2 enzym cAMP và cGMP

+ Tác dụng trên tim: Quercetin có tác dụng làm giãn mạch vành, cải thiện tuần hoàn

tim Thí nghiệm cho thấy quercetin có tác dụng làm giảm thời gian xuất hiện rối loạn nhịp tim, hạ thấp hàm lượng MDA (malonil - dialdehyde) trong tổ chức cơ tim

và bảo vệ enzym SOD (superoxyd dismutase)

+ rên hệ cơ trơn c a ruột và kh phế quản : Quercetin có tác dụng làm giảm

trương lực cơ Tác dụng giải co thắt cơ trơn của quercetin lớn hơn nhiều so với rutin [2]

+ rên tế bào ung thư: Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng đã được tiêm truyền tế bào

u, quercetin có tác dụng kéo dài thời gian sống [7]

Quercetin có khả năng kìm hãm sự phát triển và thúc đẩy quá trình tự tiêu diệt tế bào ung thư trong cơ thể như ung thư gan, ung thư ruột kết, ung thư phổi Nó còn dùng phối hợp với cisplatin trong điều trị ung thư để làm giảm độc tính của thuốc

+ Gâ đột biến: Quercetin được phát hiện có tác dụng gây đột biến khi tiến hành thí nghiệm với Samionella typhimuricum Tuy nhiên một số thí nghiệm trên súc vật cho

kết quả không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa lô dùng quercetin và lô chứng Như vậy, quercetin đã được khẳng định là không chưá tác nhân gây ung thư

Mặt khác quercetin đã được chứng minh là có tác dụng ức chế khối u do 12-O-

tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA) gây nên [2]

+ c chế hoạt động c a enz m rosinase x c tác cho phản ứng ox hóa L-tyrosin thành dopaquinon Phản ứng này là giai đoạn quyết định của sinh tổng hợp chất

màu melanin trên da Do đó các chất có hoạt tính cao trong quá trình sinh tổng hợp melanin được xem như là những hợp chất quan trọng được sử dụng trong mỹ phẩm

và dược phẩm để chữa bệnh về da và làm đẹp da [7]

+ hống dị ứng: Do quercetin ức chế mạnh sự giải phóng histamin từ các tế bào ưa

kiềm Ngoài ra, quercetin có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm phổ rộng, trong đó kháng mạnh với vi nấm và vi khuẩn gram (+), ức chế virus HIV, bảo vệ cơ thể chống chiếu xạ Quercetin cũng được phát hiện có hoạt tính chống oxy hóa cao, rất mạnh tương đương với vitamin C [8], [9]

1.3 Tác dụng sinh học của một số dẫn chất alkyl hóa của quercetin

1.3.1 ẫn chất -O-butylquercetin ( Q v -O-geranylquercetin (GQ)

Điều tra hoạt động chống khối u của hai dẫn xuất mới alkyl hoá của quercetin, 7-O- butylquercetin (BQ) và 7-O-geranylquercetin (GQ), trên tế bào ung thư vú (MCF7),

các tác giả đã thấy rằng các dẫn xuất BQ và GQ ức chế sự gia tăng của tế bào MCF7 lớn hơn quercetin Nguyên nhân là do BQ và GQ được tích lũy trên tế bào MCF7 với nồng độ lớn hơn và nồng độ của các chất dẫn xuất giảm chậm hơn so với quercetin, diện tích dưới đường cong của BQ và GQ (AUC) lớn hơn so với quercetin [14]

1.3.2 ẫn chất -O-methyl quercetin v -O-methyl quercetin

Phân tích huyết tương của lợn được nuôi bằng chế độ ăn giàu quercetin hoàn toàn không thấy quercetin mà chỉ thấy chủ yếu là các chất chuyển hóa của quercetin như

dẫn chất methyl hóa 4'-O-methylquercetin (tamarixetin) và 3'-O-methylquercetin

(isorhamnetin), hoặc dạng liên hợp của quercetin như glucuronid hoặc sunfat Cả 2 dẫn chất này đều có khả năng chống oxy hóa kém hơn so với phân tử quercetin thông thường nhưng do có sinh khả dụng cao nên nó vẫn có những tác động có hiệu quả đối với tế bào Tuy nhiên các chất chuyển hóa này của quercetin lại không có sẵn trên thị trường [19] Do đó việc tổng hợp các dẫn chất methyl hóa của quercetin gần đây đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học

Các dẫn chất alkoxyquercetin có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư khác nhau Các dẫn chất 3-ethoxyquercetin, 3’-methoxyquercetin, 3’-ethoxyquercetin; 3,7-methoxyquercetin; 3,7-ethoxyquercetin đều có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư mạnh hơn phân tử quercetin thông thường Bên cạnh đó, khi thay thế nhóm -OH ở vị trí 3,7 bằng gốc propyloxy, hoạt động chống tăng sinh mạnh hơn so với

IC50 là 10 μM chống H157, 1792, H266, 1299, 292G, Calu1 và Hela Các dẫn chất dialkyl hóa tại vị trí 4, 7 và vị trí 4',7-OH, các dẫn chất trialkyl hóa tại vị trí 3,4’,7-

OH và các dẫn chất tetraalkyl hóa tại vị trí 3,3 ',4',7-OH đều giữ vị trí quan trọng trong việc ức chế các dòng tế bào ung thư [19]

1.3.3 ẫn chất -hydroxyethyl quercetin v dẫn chất -hydroxyethyl quercetin

Venoruton là dẫn chất hydroxyethyl của rutin (HR), đã được chứng minh là có tác dụng điều trị trong bệnh tắc tĩnh mạch trung tâm võng mạc, chống kết tập tiểu cầu, giảm độ quánh của máu, tăng tính bền của thành mao mạch Trong khi đó, 3’- hydroxyethyl quercetin (3’-HQ) và 4’-hydroxyethyl quercetin (4’-HQ) là 2 chất chuyển hóa chính của hydroxyethyl rutinose (HR) G Ponard và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu bằng các thí nghiệm trên chuột, sử dụng các hydroxyethylquercetin (HQ) bằng đường uống Kết quả là: Do các dẫn chất HQ không cần thời gian thủy

lần (từ 182 ng/mL đến 2165 ng/mL) khi so sánh với HR Diện tích dưới đường cong tăng gấp năm lần (từ 2899 ng.h/mL đến 13049 ng.h/mL) khi so sánh với HR [15]

Do đó các dẫn chất HQ có thời gian tác dụng ngắn hơn HR

1.4 Một số phản ứng hydroxyethyl hóa

1.4.1 Phản ứng hydroxyethyl hóa rutin

+ Phương ph p Stevens với t c nhân ethylenclorohydrin

Phương trình phản ứng:

Hình 1.7 ơ đồ phản ứng h drox eth l hóa rutin với tác nhân 2-cloroethanol

Cách tiến hành: Phản ứng được tiến hành trong dung môi nước, xúc tác là kiềm

rutin : 2-cloroethanol = 1: 4 Phản ứng tiến hành trong 2h, sản phẩm là troxerutin thu được với hiệu suất là 76,01% [8]

+ Phương ph p Pierre J courtbat F er arvahho với t c nhân ethylenoxyd

Phương trình phản ứng:

Hình 1.8 ơ đồ phản ứng h drox eth l hóa rutin với tác nhân eth lenox d

Cách tiến hành: Phản ứng được tiến hành trong dung môi nước, xúc tác là kiềm

với tỉ lệ rutin : ethylenoxyd = 1 : 7 Phản ứng tiến hành trong 6h, sản phẩm là troxerutin với hiệu suất 52,69% [8]

1.4.2 Phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin

Theo tài liệu [18] phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin được thực hiện với 2 tác nhân 2-cloroethanol và ethylencarbonat

1.4.2.1 Phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin với t c nhân ethylencarbonat

Hình 1.9 ng h p dẫn chất h drox eth l hóa c a quercetin với tác nhân

ethylencarbonat

Phản ứng được thực hiện trong môi trường chứa tác nhân ethylencarbonat, dung

[13]

Các sản phẩm hình thành:

+ 3,3’,5-trihydroxy-4',7-di-(hydroxyethoxy) flavon (I) (H = 15 - 20%)

dioxyethylen-3,7-di-(hydroxyethoxy)-5-hydroxy flavon (IV) (H = 5 - 10%)

+ 5-hydroxy-3,3’,4',7- tetra-(hydroxyethoxy) flavon (III) (H = 50 - 55%) và 3',4'-

dioxyethylen-3',5,7-tri-(hydroxyethoxy) flavon (V) (H = 3%)

1.4.2.2 Phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin với t c nhân 2-cloroethanol

Hình 1.10 ng h p dẫn chất h drox eth l hóa c a quercetin với tác nhân 2-

cloroethanol

Các sản phẩm tạo thành:

+ 5-hydroxy-3,3',4’,7-tetra-(hydroxyethoxy) flavon (VI)

Phản ứng đƣợc thực hiện trong dung môi DMF, tỉ lệ mol 2-cloroethanol : quercetin

khuấy đều trong vòng 8 phút Hiệu suất 30 - 40% [12]

+ 3,3',4',5,7-penta-(hydroxyethoxy) flavon (VII)

Phản ứng đƣợc thực hiện trong dung môi DMF, tỉ lệ mol 2-cloroethanol : quercetin

khuấy đều trong vòng 60 phút Hiệu suất 25 - 30% [12]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là bột rutin thô chiết xuất từ hoa hòe tại bộ môn Công nghiệp Dược - Đại Học Dược Hà Nội

Các hóa chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2 1 anh mục các ngu ên vật liệu sử dụng

STT Nguyên vật liệu Xuất xứ

Bảng 2 2 anh mục các dụng cụ, thiết bị

2.2 Nội dung nghiên cứu

+ Tinh chế rutin tinh khiết từ rutin thô

+ Điều chế quercetin từ rutin tinh khiết

+ Khảo sát một số điều kiện của phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin

+ Tổng hợp một số dẫn chất hydroxyethyl của quercetin

Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp

các chất dự kiến : O-alkyl hóa, thủy phân, trung hòa,…

Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) thực hiện trên bản mỏng silica gel 60 F254 Merck 70 - 230 mesh với các hệ dung môi khai triển khác nhau: cloroform:methanol (9:1), dicloromethan:methanol (20:1);

ethyl acetat:n-hexan (7:3) ; ethylacetat:methanol (8:2); n-butanol:ethylacetat: methanol (5: 4:1); n-butanol:methanol:nước (10:1:3); quan sát sắc ký đồ dưới bước

sóng 254 nm của đèn tử ngoại

Sử dụng phương pháp cất, kết tinh, để tinh chế sản phẩm

Sử dụng sắc kí điều chế để thu được sản phẩm tinh khiết

2.3.2 Ki m tra tinh hi t của c c chất tổng hợp ược

Sử dụng phương pháp SKLM với các điều kiện như đã trình bày ở mục 2.3.1

Dựa vào đặc điểm hình thức của sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

Phổ khối lượng (MS): Được ghi tại Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Tương đương sinh học, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia, trên máy LC-MS/MS Agilent 1290/6460 (Mỹ) với chế độ đo ESI

Phổ hồng ngoại (IR): Được ghi tại Bộ môn Hóa học vô cơ, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR): Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội,

chuẩn nội là tetramethylsilan

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tinh chế rutin và điều chế quercetin

Kết quả của 3 mẻ khác nhau được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3 1 Kết quả quá trình tinh chế rutin

STT

m rutin thô (g)

m rutin tinh chế (g)

Cách tiến hành:

Cân 6,0 g rutin tinh khiết cho vào bình cầu 500 mL Thêm 215 mL HCl 3% Đun hồi lưu, khuấy liên tục Dùng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi ethylacetat : methanol = 8 : 2 để theo dõi quá trình thủy phân Khi hết rutin thì dừng phản ứng (khoảng 3 h)

Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cho tới khi nước rửa đạt pH trung tính và cho phản

Kết quả của 3 mẻ khác nhau được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3 2 Kết quả phản ứng điều chế quercetin từ rutin

(g)

m quercetin (g)

lượt là 0,7 và 0,5 trên hại hệ A và B) Sản phẩm quercetin thu được có dạng bột

các hệ dung môi khác nhau Sản phẩm này được sử dụng để thực hiện phản ứng hydroxyethyl hóa

3.2 Hydroxyethyl hóa quercetin bằng tác nhân 2-bromoethanol trong dung môi hữu cơ

Theo tài liệu [12], tác giả đã thực hiện phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin với tác nhân 2-cloroethanol Trong khóa luận này chúng tôi thực hiện với tác nhân khác tương tự là 2-bromoethanol và khảo sát các điều kiện của phản ứng

Nguyên lí phản ứng:

Hình 3.2 H drox eth l hóa quercetin bằng tác nhân 2-bromoethanol

3.2.1 Tính chọn lọc của phản ứng trên c c nhóm -OH phenol của quercetin

Phân tử quercetin có 5 nhóm -OH phenol có thể tham gia phản ứng O-alkyl hóa (alkyl hóa Williamson) Theo tài liệu [17], phản ứng O- methyl hóa quercetin trong

môi trường base có tính chọn lọc trên các nhóm OH phenol theo thứ tự sau: 4’>7>3>3’>5 (xem hình 3.2)

Hình 3.3 hứ tự ưu tiên O-meth l hóa quercetin bằng meth l bromid

bromid : quercetin = 3:1), phản ứng vẫn cho sản phẩm là hỗn hợp gồm: quercetin

chưa phản ứng, mono-, di-, tri-, tetra-, penta- và một số sản phẩm phân hủy không xác định được Điều này làm cho quá trình tinh chế gặp rất nhiều khó khăn và hiệu suất phản ứng thấp

Về mặt lý thuyết, để thế tối đa 5 nhóm -OH trên quercetin tạo dẫn chất penta- alkylquercetin có thể sử dụng tỉ lệ mol 2-bromethanol : quercetin = 5:1 hoặc lớn hơn Chính vì vậy, ở các thí nghiệm chúng tôi sử dụng một lượng dư tác nhân 2- bromethanol so với lượng lí thuyết là 2-bromethanol : quercetin > 5:1 để quan sát được các sản phẩm có thể tạo thành cũng như bước đầu khảo sát điều kiện của phản ứng Sắc kí hỗn hợp phản ứng cho thấy hỗn hợp này chứa:

trên hệ 20:1

Hình 3.4 Hình ảnh sắc í hỗn hợp phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin b ng 2-

bromoethanol

Chính vì thế chúng tôi khảo sát các điều kiện phản ứng sau để thu đƣợc chọn lọc một số sản phẩm hydroxyethyl hóa Chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số sau: + Tỉ lệ tác nhân : quercetin

+ Tỉ lệ mol base : quercetin

+ Thời gian phản ứng

+ Dung môi phản ứng

+ Nhiệt độ phản ứng

3.2.2 Khảo sát tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin cho phản ứng

hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF

môi DMF (10mL) trong bình cầu một cổ Tiến hành phản ứng trong vòng 8 tiếng, ở

Đánh giá:

Pha loãng dịch phản ứng với cùng thể tích aceton, chạy sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi chloroform : methanol = 20:1

Tỉ lệ vết sản phẩm được tính tương đối dựa trên độ đậm nhạt của vết dưới đèn UV

254 nm so với tổng số vết trên bản mỏng Kết quả được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3 3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin đến lư ng sản phẩm NV- v NV-2 tạo thành trong dung môi MF

Tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin

Tỉ lệ vết sản

phẩm NV -1 phẩm NV -2 Tỉ lệ vết sản

2 8 h DMF 4:1 tăng lên tăng lên

6 8 h DMF 30:1 giảm xuống tăng lên

lên nữa

Nhận xét:

Từ bảng trên, chúng tôi chọn tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF tạo dẫn chất NV-1 là 4:1; tạo dẫn chất NV-2 là 30:1

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ mol K2 CO 3 : quercetin cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF

Đun hồi lưu hỗn hợp gồm quercetin (0,50 g; 1,65 mmol), 2-bromoethanol (0,40

mmol); (0,46 g; 3,30 mmol); (0,68 g; 4,95 mmol); (0,91 g; 6,60 mmol); dung môi DMF (10mL) trong bình cầu một cổ Tiến hành phản ứng trong vòng 8 tiếng, ở

Đánh giá: như mục 3.2.2 Kết quả được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol K 2 CO 3 : quercetin đến lư ng sản phẩm NV-1 tạo thành trong dung môi MF

phản ứng

Dung môi

Tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin

Tỉ lệ mol

K2CO3 : quercetin

Tỉ lệ vết sản phẩm NV -1

Nhận xét:

hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF tạo sản phẩm NV-1

Đun hồi lưu hỗn hợp gồm quercetin (0,50 g; 1,65 mmol), tác nhân 2-bromoethanol

4,95 mmol); (0,91 g; 6,60 mmol) ;(0,11g; 8,25 mmol); (1,56 g; 11,55 mmol); (1,82 g; 13,20 mmol); dung môi DMF (10mL) trong bình cầu một cổ Tiến hành phản ứng

Đánh giá : như mục 3.2.2 Kết quả được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng c a tỉ lệ mol K2 CO 3: quercetin đến lư ng

sản phẩm NV -2 tạo thành trong dung môi MF

phản ứng

Dung môi

Tỉ lệ mol 2-bromoethanol : quercetin

Tỉ lệ

quercetin

Tỉ lệ vết sản phẩm NV-2

Nhận xét: Từ bảng trên chúng tôi chọn tỉ lệ mol K 2 CO 3 : quercetin là 7:1 cho

phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong dung môi DMF tạo sản phẩm NV-2

3.2.4 Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho phản ứng hydroxyethyl hóa quercetin trong

Đun hồi lưu hỗn hợp gồm quercetin (0,5 g; 1,65 mmol); tác nhân 2-bromoethanol

trong bình cầu một cổ Tiến hành phản ứng trong vòng 8 tiếng, theo dõi phản ứng ở