NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG BỔ SUNG TẾ BÀO VÀ HORMONE LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI LỢN THỤ TINH ỐNG NGHIỆM

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––– LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thực Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày 30 tháng năm 2012 HỨA NGUYỆT MAI Tác giả Hứa Nguyệt Mai NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG BỔ SUNG TẾ BÀO VÀ HORMONE LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI LỢN THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Bùi Xuân Nguyên Thái Nguyên, 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii iii LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Bùi Xuân Nguyên - nguyên Trưởng phòng Công nghệ phôi - Viện công nghệ sinh học định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn dìu dắt suốt trình thực hoàn thành luận văn Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến tập thể cán phòng Công nghệ DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN vi phôi, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt TS Nguyễn Thị Ước nhiệt tình giúp DANH MỤC CÁC HÌNH vii đỡ, góp ý cho trình thực thí nghiệm liên quan đến luận MỞ ĐẦU văn Tôi xin chân thành cảm ơn tình cảm quý báu Đặt vấn đề Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô ban chủ nhiệm Mục tiêu đề tài Khoa, anh chị Khoa Khoa học Sự sống - trường Đại học Khoa học Nội dung nghiên cứu tạo điều kiện, quan tâm giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đồng thời xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân gia 1.1 Sự hình thành phát triển phôi in vivo đình, đồng nghiệp bạn bè có khích lệ tinh thần 1.1.1 Sự thụ tinh quan tâm sâu sắc suốt thời gian thực luận văn 1.1.2 Quá trình thụ tinh 1.1.3 Những yếu tố đảm bảo xảy thụ tinh Một lần xin chân thành cảm ơn! Tác giả 1.1.4 Sự phát triển phôi in vivo 1.1.5 Sự làm tổ phôi 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên phát triển phôi in vitro 1.2.1 Thụ tinh ống nghiệm Hứa Nguyệt Mai 1.2.2 Buồng trứng 10 1.2.3 Loại nang trứng 11 1.2.4 Quá trình nuôi thành thục trứng hormone bổ sung 12 1.2.5 Hệ thống nuôi phôi 13 1.3 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Vật liệu nghiên cứu 21 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv v 2.3.1 Dụng cụ, thiết bị 21 2.3.2 Hóa chất, môi trường 22 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium Môi trường DM 2.4.1 Phương pháp thu, bảo quản vận chuyển buồng trứng 23 FPP Fertilization promoting peptide Peptide thúc đẩy thụ tinh 2.4.1.2 Phương pháp phân loại phẩm chất trứng 23 FBS Fetal Bovine Serum Huyết bò 2.4.2 Phương pháp thu tế bào nguyên bào sợi phôi chuột (Mouse Embryonic FSH Follicle stimulating hormone Hormon kích thích nang phát triển IVC In Vitro Culture Nuôi cấy ống nghiệm IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh ống nghệm 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 30 IVP In Vitro Production Sản xuất ống nghiệm CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 IVM In Vitro Maturation Sự thành thục ống nghiệm 3.2 Nghiên cứu phân lập, nhân nuôi tế bào màng ống dẫn trứng 34 LH Luteinsing Stimulating Hormone Hormon tăng trưởng 3.2.1 Kết thu tế bào màng ống dẫn trứng 34 MAT Maturation Thành thục 3.2.2 So sánh ảnh hưởng thời gian quay cụm tế bào lên chất lượng NCSU - 23 North Carolina State University 23 Đại học phía Bắc bang Carolina 23 NCSU - 37 North california state university 37 Đại học phía Bắc bang Carolina 37 PBS Phosphate Buffer Saline Dung dịch đệm POSP Porcine oviductal secretory protein Ống dẫn trứng lợn tiết protêin PMSG Pregnant mare’s serum gonadotropin Huyết ngựa chửa TCM Tissue Culture Medium Môi trường nuôi cấy ZP Zone Pellucide Màng suốt Fibroblast- MEF) 25 2.4.3 Phương pháp thu cụm tế bào màng ống dẫn trứng 27 2.4.4 Phương pháp nuôi phôi đánh giá phát triển phôi 28 3.1 Kết nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột 31 cụm tế bào thu cụm tế bào sau giải đông 36 3.3 Kết bổ sung hormone lên tỷ lệ trứng thành thục 37 3.4 Kết nuôi phôi từ hệ thống môi trường 39 3.4.1 Hệ thống (HT1) 39 3.4.2 Hệ thống (HT2) 40 3.4.3 Hệ thống (HT3) 41 3.4.4 Hệ thống (HT4) 43 3.5 So sánh kết tạo phôi từ hệ thống 44 3.5.1 So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, hệ thống hệ thống 44 3.5.2 So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống hệ thống 45 3.5.3 So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, 2, hệ thống 46 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi vii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Tên bảng DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Tên hình Trang 2.1 Các dụng cụ, thiết bị dùng thí nghiệm 21 1.1 Sự phát triển hợp tử giai đoạn phôi bào đến giai đoạn phôi dâu 2.2 Nội dung chi tiết thí nghiệm 29 1.2 Cơ quan sinh sản lợn 3.1 Kết thu tế bào nguyên bào sợi thai chuột từ bào thai chuột 31 2.1 Buồng trứng lợn phân loại tế bào trứng 25 3.2 Kết tốc độ nhân nuôi tế bào tươi tế bào sau giải đông 32 2.2 Các bước thu cụm tế bào màng vòi trứng 28 3.1 Kết nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi thai chuột 33 3.2 Biểu đồ tỷ lệ cụm tế bào màng vòi trứng nhóm thí nghiệm 35 3.3 Kết nhân nuôi tế bào màng vòi trứng 37 3.3 3.4 Ảnh hưởng chất lượng vòi trứng đến tỷ lệ cụm tế bào màng vòi trứng thu Kết theo dõi thời gian quay cụm tế bào thu cụm tế bào sau giải đông 34 36 3.4 Trứng MAT II thể cực 39 3.5 Kết nuôi trứng thành thục 38 3.5 Biểu đồ so sánh tỷ lệ phôi phát triển từ HT1, HT2, HT3 44 3.6 Kết tạo phôi môi trường 40 3.6 Biểu đồ so sánh tỷ lệ phôi phát triển từ HT2 HT4 45 3.7 Biểu đồ so sánh tỷ lệ phôi phát triển từ HT1, HT2, HT3 HT4 46 3.8 Kết tạo phôi từ hệ thống nuôi phôi 48 3.7 3.8 3.9 Kết tạo phôi môi trường có bổ sung tế bào nguyên bào sợi thai chuột Kết tạo phôi môi trường có bổ sung tế bào màng vòi trứng Nuôi phôi môi trường bổ sung tế bào nguyên bào sợi thai chuột tế bào màng vòi trứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 42 43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU phát triển tốt cải thiện phần Ở Việt Nam, việc nuôi thành thục thụ tinh ống nghiệm trứng lợn thực từ năm đầu kỷ 21 Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung công nghệ sinh học sinh sản nói [3], [6] Một số nghiên cứu tiến hành đối tượng trứng phôi lợn in riêng phát triển đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại nhiều ý nghĩa vitro [4] [7], [9] Tuy nhiên tỷ lệ thành thục trứng tỷ lệ tạo phôi lợi ích thiết thực sống Một thành tựu bật công thấp so với tỷ lệ chung giới Nguyên nhân tượng chưa nghệ sinh học kiện nhân vô tính thành công (1997) với đời cừu làm sáng tỏ Việc nghiên cứu cải thiện hệ thống nuôi phôi in vitro cách Dolly Còn sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng tạo phôi ống bổ sung loại tế bào đệm nguyên bào sợi thai chuột hay tế bào màng nghiệm, phôi nguồn vật liệu quan trọng chuyển cấy phôi tạo nguồn động ống dẫn trứng nhằm nâng cao chất lượng phát triển cho phôi động vật nói vật đồng loạt, phục vụ cho thử nghiệm y học, nhằm mục đích nâng chung phôi lợn nói riêng cần thiết cho việc ứng dụng công nghệ cao suất vật nuôi chăn nuôi nghiên cứu sản xuất Nước ta nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển, song điểm Xuất phát từ lý tiến hành đề tài “Nghiên cứu nóng bảo vệ đa dạng sinh học nói chung nguồn gen giống lợn nói riêng ảnh hưởng bổ sung tế bào hormone lên phát triển phôi lợn thụ Trong vòng đời sinh sản vật, chu kỳ sống chúng có loài sinh tinh ống nghiệm’’ 4-5 thông qua sinh sản bình thường, thông qua thụ tinh ống Mục tiêu đề tài nghiệm tạo 50-80 chu kỳ sống chúng Vì thụ tinh - Đánh giá ảnh hưởng việc bổ sung hormone, bổ sung tế bào màng ống nghiệm giữ vai trò quan trọng việc tạo nhiều động vật với số lượng lớn ống dẫn trứng nguyên bào sợi thai chuột vào môi trường nuôi phôi lên kết đặc tính gen cải thiện đáng kể thụ tinh ống nghiệm lợn Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm động vật nói chung kỹ thuật thụ tinh - Thu nhận kết thí nghiệm cần thiết sản xuất bảo quản tế ống nghiệm lợn nói riêng có nhiều nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến bào, chế độ bổ sung tế bào nhằm góp phần nâng cao hiệu thụ tinh ống nghiệm phát triển phôi, vấn đề quan tâm nhiều việc nghiên cứu bổ lợn sung, thay chất khác vào môi trường ban đầu Đã có nhiều Nội dung nghiên cứu nghiên cứu chứng minh tác dụng có lợi đồng nuôi cấy đến phát triển phôi cải thiện chất lượng phôi, tăng tỷ lệ phát triển phôi vào giai đoạn - Thu trứng, nuôi thành thục trứng in vitro môi trường môi trường có bổ sung hormone phôi nang [32], [64] Bổ sung môi trường nuôi cấy với tế bào đệm tế bào - Thu nhân nuôi tế bào màng ống dẫn trứng từ ống dẫn trứng lợn màng ống dẫn trứng yếu tố tăng cường phát triển phôi lợn - Thu nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột ống nghiệm [14], [48] Các nguyên bào sợi phôi chuột sử dụng đồng - Nuôi phôi môi trường bản, môi trường có bổ sung tế bào màng nuôi cấy, nguyên bào sợi phôi chuột tiết yếu tố nhằm nâng cao phát triển vòi trứng nguyên bào sợi phôi chuột phôi, cho kết tốt phát triển phôi bò cừu [36], [47] Cho đến vấn đề việc nghiên cứu môi trường tối ưu để có chất lượng phôi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU chuyển động đường sinh dục với trợ giúp co thắt tầng 1.1 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN PHÔI IN VIVO Phôi lợn bắt đầu phát triển sau thụ thai - thời điểm tinh trùng lợn đực thâm nhập vào tường tế bào trứng lợn Trong thời gian từ 14 đến 16 giờ, tế bào thụ tinh bắt đầu chia tách vào tế bào nhỏ (blastomeres) nguyên phân Vào ngày thứ hai thứ ba thai kỳ, túi phôi nguyên thủy thông qua từ màng ống dẫn trứng vào hai vòi trứng lợn nái, nơi mà tiếp tục phát triển bắt đầu để gắn vào niêm mạc tử cung vào ngày 11 12 [1] *Sự tương tác trước kết hợp trứng tinh trùng: Nhiều chế phát cho thấy có đảm bảo để tế bào sinh dục gặp lúc vị trí điều kiện thuận lợi thụ tinh động vật Như vậy, có xếp hoàn hảo tương tác cá thể đực cá thể trứng tinh trùng Ở nhiều loài sinh vật, trứng tiết chất hóa học nhằm thu hút tinh trùng phía trứng Ở động vật có vú loài động vật khác, tinh trùng phải xảy loạt biến đổi sinh hóa trước thụ tinh với trứng Tinh trùng muốn xuyên thủng màng sáng trứng đòi hỏi phải trải qua trình biến đổi gọi 1.1.1 Sự thụ tinh Sự tạo cá thể bắt đầu thụ tinh Sự thụ tinh kết hợp noãn (giao tử cái) tinh trùng (giao tử đực) để tạo hợp tử Hợp tử cá thể phát sinh phát triển giai đoạn sớm Ở động vật, bình thường thụ tinh xảy 1/3 phần đầu vòi trứng [1] Noãn trước thụ tinh: Khi phóng thích khỏi buồng trứng, noãn bọc từ màng suốt lớp tế bào nang (tế bào vòng tia) gò noãn Lúc này, noãn kỳ đầu lần phân chia thứ trình giảm phân, tức noãn bào Nếu không gặp tinh trùng, thụ tinh không xảy ra, noãn bị thoái hóa bị thực bào đại thực bào Noãn bào không tự chuyển động được, di chuyển vòi trứng nhờ yếu tố: co bóp lớp vòi trứng, nhu động lớp vi lông lớp tế bào niêm mạc vòi trứng vận chuyển theo dòng dịch vòi trứng [5] Tinh trùng trước thụ tinh: Sau hình thành ống sinh tinh, lúc tinh trùng có hình dạng đặc trưng chưa có khả di động Từ ống sinh tinh, tinh trùng tới mào tinh Sự trưởng thành tinh trùng chủ yếu xảy mào tinh: loại bớt bào tương bào quan không cần thiết để giúp tinh trùng chuyển động nhanh, tốn lượng Ðầu tinh trùng thay đổi, đặc biệt hình dạng kích thước cực đầu Tinh trùng tăng dần khả di động di chuyển từ phần đầu đến phần đuôi mào tinh Nhờ có đuôi, tinh trùng tự Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên đường sinh dục http://www.lrc-tnu.edu.vn tiềm hóa (capacitation) [2], [5] 1.1.2 Quá trình thụ tinh Với cấu trúc noãn sau rụng trứng, muốn lọt vào bào tương noãn để kết hợp với noãn tạo hợp tử (cá thể mới), tinh trùng phải vượt qua chướng ngại vật, từ vào gồm: lớp tế bào nang, màng suốt, màng tế bào noãn [1] Sau tinh trùng dính chặt vào trứng, tinh trùng xuyên thủng vỏ trứng nhờ loại men phân giải vỏ trứng gọi enzym lytic nằm lớp vỏ thể đỉnh Màng sinh chất tinh trùng tiếp xúc với màng sinh chất trứng Sau màng sinh chất tiếp xúc xảy ra, trứng tinh trùng kết hợp tạo màng sinh chất hỗn hợp tượng thụ tinh * Tinh trùng vượt qua màng suốt: Một số tinh trùng tiếp xúc với màng suốt Khi tiếp xúc với thụ thể bề mặt màng suốt, phản ứng cực đầu xảy ra, enzym bên túi cực đầu tinh trùng phóng thích Các enzym làm tiêu hủy protein màng suốt chỗ tiếp xúc với tác động xuyên phá đầu tinh trùng giúp tinh trùng xuyên thủng màng suốt vào khoang quanh noãn tiếp xúc với màng noãn [5] *Tinh trùng lọt vào bào tương noãn: Khi tinh trùng vượt qua màng suốt tới tiếp xúc với màng noãn, màng tế bào bọc tinh trùng sáp nhập với Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn màng tế bào bọc noãn Ở nơi tiếp xúc, màng tế bào noãn tinh trùng bị tiêu - Số lượng tinh trùng lợn lần giao phối: đi, nhân bào tương tinh trùng lọt vào bào tương noãn để lại màng tế bào + Tối đa 680ml, tối thiểu 50ml nằm bên noãn[5] + 80 - 180 triệu tinh trùng tinh dịch bình thường Sự xâm nhập tinh trùng vào noãn kích thích hàng loạt phản ứng sinh học từ noãn gọi phản ứng vỏ noãn Noãn tiết vào khoang quanh noãn chất làm thay đổi cấu trúc màng suốt, ngăn cản xâm nhập tinh trùng khác, thay đổi gọi phản ứng màng suốt Những thay đổi màng suốt xem để tạo phóng bế thứ phát (sự phóng bế muộn) tượng đa thụ tinh Khi tinh trùng lọt vào bào tương + < 80 triệu tinh trùng tinh dịch xấu, khả thụ tinh cho noãn - Tỷ lệ tinh trùng bất thường tinh dịch: + Tinh dịch coi bình thường chứa không 20% tinh trùng bất thường + Tinh trùng bất thường chiếm 20 - 40%, khả thụ tinh >40%, khả thụ tinh noãn, noãn bào tiếp tục hoàn tất lần phân chia thứ hai trình giảm phân để Sức sống khả hoạt động tinh trùng: sức sống lực hoạt sinh noãn chín, gọi tiền nhân cực cầu Bào tương tinh trùng động tinh trùng biểu lộ chuyển động nhờ đuôi Ở người, hòa lẫn với bào tương noãn, nhân tinh trùng gọi tiền nhân đực Tiền nhân tinh trùng chuyển động 50 sau phóng thích vào âm đạo tinh trùng đực tiền nhân tiến lại gần nhau, lượng DNA tiền nhân tăng lên gấp khỏe, tinh trùng yếu thường chết sau 15 phút Tinh dịch tốt phải chứa 80% tinh đôi sau màng tiền nhân biến đi, thể nhiễm sắc xoắn lại, trùng chuyển động sau phóng thích vào âm đạo 50% sau 12 ngắn dày lên phóng thích vào bào tương Một thoi không màu xuất 25% sau 28 Nếu tỷ lệ % giảm nhiều, khả thụ tinh [1], [5] hiện, thể nhiễm sắc xếp thoi không màu [1], [2] Mỗi thể nhiễm sắc Những yếu tố ảnh hưởng đến sức sống lực tinh trùng: PH môi tiến cực tế bào, rãnh phân chia ngày sâu xuất mặt trường, nồng độ CO2 môi trường, nhiệt độ,… trứng Kết trứng thụ tinh phân làm phôi bào 1.1.4 Sự phát triển phôi in vivo Quá trình thụ tinh hoàn tất dẫn đến trình hình thành phôi dạng tế * Kết thụ tinh: - Sự kết hợp tế bào sinh dục đực biệt hóa cao độ tạo tế bào sinh dưỡng biệt hóa, có khả phân chia tích cực - Sự thụ tinh khôi phục lại tế bào sinh dưỡng thể nhiễm sắc lưỡng bào Sau đó, phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, 16 tế bào Các blastomer ngày phân chia nhiều hơn, nhỏ kết hợp lại thành khối rắn gọi phôi dâu (morula), lúc khó nhìn thấy tế bào phôi, khối tế bào chiếm gần hết không gian trứng Sau đó, phôi tiếp tục phát bội đặc trưng cho loài - Nhờ thụ tinh, cá thể sinh mang đặc tính di truyền cha lẫn mẹ triển hình thành dạng phôi nang (blastocyst) có tích lũy chất dịch bên - Sự thụ tinh khơi mào cho hàng loạt trình gián phân liên tiếp xảy tạo khối cầu rỗng Tiếp đó, blastocyst qua giai đoạn phôi nang trương nở, thoát khỏi màng suốt giai đoạn thoát nang bắt đầu làm tổ tử cung [1] 1.1.3 Những yếu tố đảm bảo xảy thụ tinh - Yếu tố thời gian: nói chung, loài động vật, noãn tinh trùng có đời Sự phân chia trứng thụ tinh: Khi hợp tử đạt tới giai đoạn phôi bào, khoảng sống ngắn Nếu không gặp trứng, tinh trùng tự thoái hóa Trứng vào vòi 30 sau thụ tinh, trứng thụ tinh tiến hành hàng loạt trình gián phân nối tiếp trứng thường có khả thụ tinh vòng 24 Nếu không gặp tinh trùng, liên tục làm cho số lượng phôi bào tăng lên nhanh chóng Qua lần gián trứng tự thoái hóa [5] phân, kích thước phôi bào sinh trở nên nhỏ Vào khoảng cuối ngày thứ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đầu ngày thứ sau thụ tinh, trứng thụ tinh gồm 12 - 16 phôi bào, mặt khoang phôi nang, trứng thụ tinh giai đoạn giống túi nên gọi xù xì giống dâu nên gọi phôi dâu Cấu tạo phôi dâu gồm: nhóm tế phôi nang giai đoạn phát triển trứng gọi giai đoạn phôi nang [2] bào nằm vị trí trung tâm có kích thước lớn gọi đại phôi bào, tế 1.1.5 Sự làm tổ phôi bào tạo thành lớp bao quanh phía có kích thước nhỏ gọi tiểu phôi Phôi lọt vào khoang tử cung vào khoảng ngày thứ sau thụ tinh phôi bào [1], [5] Những đại phôi bào sau tạo phôi số phận phụ vào giai đoạn cuối phôi dâu đầu phôi nang Khi phôi vào đến khoang tử cung, phôi màng ối, túi noãn hoàng, niệu nang Tiểu phôi bào tạo nuôi, sau phôi tiếp tục sống phân chia môi trường dịch tiết nội mạc tử cung vài phát triển thành rau thai màng bọc thai ngày trước làm tổ Màng suốt có tác dụng bảo vệ phôi giai đoạn đầu tự tiêu Phôi lọt vào nội mạc tử cung bám vào để phát triển, người ta nói trứng làm tổ nội mạc tử cung [1] Phôi làm tổ vào khoảng ngày thứ sau thụ tinh, lúc trứng giai đoạn phôi nang niêm mạc tử cung giai đoạn trước kinh tiếp tục phát (Nguồn: Drost, 1983) triển Ở cực phôi trứng, nuôi tạo từ tiểu phôi bào bám vào nội Hình 1.1 Sự phát triển hợp tử giai đoạn phôi bào mạc tử cung, vượt qua lớp biểu mô tử cung tiến vào lớp đệm, phá hủy mô tử cung đến giai đoạn phôi dâu xung quanh để toàn trứng lọt dần vào niêm mạc tử cung Sự phá hủy mô tử cung Sự phân chia trứng thụ tinh xảy trình trứng di chuyển từ vòi enzym tiêu protein tiết tế bào nuôi [5] trứng đến tử cung Các tế bào nang vây quanh noãn bị thoái hóa dần dần, màng suốt tồn thời gian phân chia trứng giai đoạn phôi dâu cuối biến Giai đoạn phôi nang: Ở động vật, vào khoảng ngày thứ sau thụ tinh, trứng (ở giai đoạn phôi dâu) lọt vào khoang tử cung bị vùi chất dịch nội mạc tử cung tiết Chất dịch thấm qua màng suốt vào khoảng gian bào đại phôi bào để nuôi trứng Dần dần khoảng gian bào hợp lại cuối tạo thành khoang xen lớp tiểu phôi bào khối đại phôi bào, khoang lớn lên gọi khoang phôi nang hay khoang mầm mầm phôi tạo nằm phía Màng suốt hoàn toàn biến mất, khối tế bào trung tâm phôi dâu, đại phôi bào bị khoang phôi nang đẩy dần cực trứng lồi vào khoang mầm gọi cực phôi Cực phôi mầm phôi cực gọi cực phôi phôi phát triển Còn cực đối lập gọi cực (Theo Wittingham, 1979) đối phôi Tiểu phôi bào lớp ngoại vi phôi dâu dẹt lại tạo nên thành Hình 1.2 Cơ quan sinh sản lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 Bình thường trứng làm tổ thành sau thành trước tử cung Trong người, lần lịch sử nhân loại bé gái Louise Brown đời trường hợp bất thường, trứng làm tổ gần lỗ ống tử cung công nghệ thụ tinh ống nghiệm bệnh viện Anh vào năm 1978 tử cung (chửa tử cung) như: khoang bụng (thường gặp túi [60] Năm 1982, bé gái thứ hai Amadine đời công nghệ Pháp, Douglas, mạc nối lớn, quai ruột), bề mặt buồng trứng, vòi trứng năm 80 kỷ XX, kỹ thuật IVF phát triển mạnh Singapore nơi thực Trứng làm tổ lạc chỗ phát triển tới kỳ hạn, phôi thường chết thành công thụ tinh ống nghiệm châu Á vào năm 1983 Kể từ đó, mẹ thường xuất huyết nghiêm trọng Trong trường hợp chửa tử cung, kỹ thuật IVF kỹ thuật phổ biến để điều trị vô sinh đối tượng người Người ta chửa vòi trứng hay gặp nhất, vòi trứng vỡ khoảng tháng thứ thời ước tính triệu trẻ em sinh cách sử dụng kỹ thuật thụ kỳ phôi gây xuất huyết nghiêm trọng cho mẹ [5] giới [16] Thời gian mang thai lợn 112- 115 ngày lợn nái đẻ lứa 7-12 Cũng phát triển loài động vật mang thai, phôi lợn phát triển thời gian dài, độ tuổi phôi tính gần theo chiều dài: 11mm - 21 ngày, 17mm - 35 ngày, 2,8cm - 49 ngày, 4.0cm - 56 Lợn động vật quan tâm đặc biệt buồng trứng chúng có chứa số lượng lớn (hơn 200.000) nang trứng sơ cấp Trong năm đầu thập kỷ 1980, người ta thu phôi in vitro từ lợn dạng “động vật cho” phôi nuôi phát triển từ giai ngày, 22 cm - 100 ngày, 30 cm - sinh [1] đoạn tế bào đến giai đoạn phôi nang Sau đó, hiểu biết đặc điểm phát 1.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO triển trứng lợn giúp hình thành loại môi trường nuôi trứng chín 1.2.1 Thụ tinh ống nghiệm điều kiện in vitro [26] Thụ tinh ống nghiệm trình người tiến hành kết hợp Năm 1986, Cheng đồng tác giả thành công việc tạo phôi cừu tinh trùng với trứng để tạo hợp tử, thực bên thể mẹ Sau đó, lợn kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm vào đầu năm 1986 [25] Trong hợp tử chuyển vào tử cung để phát triển thành cá thể năm 1990 phát triển có thành công điều kiện nuôi cấy Sau IVM thành công số loài nhà khoa học giới cải thiện phát triển phôi đến giai đoạn túi phôi Và sau số lượng phôi trâu, bò tiếp tục nghiên cứu kỹ thuật IVF IVF thành công nhiều loài động vật ống nghiệm tạo hàng loạt, đặc biệt lợn ngựa, có thành chó, lợn, bò, thỏ,… công nghiên cứu áp dụng hiệu [21] Thụ tinh ống nghiệm bắt đầu vào năm 1930 với tế bào trứng Đến nay, khả tạo động vật từ trình thụ tinh ống thỏ, nỗ lực để thụ tinh ống nghiệm không thành công, sau nghiệm trứng nuôi chín in vitro thành công Tuy nhiên, khả nuôi phôi nghiên cứu vào cuối năm 1950 thành công đời thỏ Năm 1959, Chang lần thành công việc cho thụ tinh tinh trùng trứng động vật có vú (thỏ) điều kiện phòng thí nghiệm Đây xem thành tựu quan trọng lịch sử phát triển thụ tinh ống nghiệm Nó chứng tỏ trứng tinh trùng động vật thụ tinh bên thể [24] Từ sau thí nghiệm thụ tinh ống nghiệm nghiên cứu nhiều loại động vật khác Trong cuối năm 1960, tế bào trứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn in vitro đến giai đoạn túi phôi phục vụ quy trình tạo phôi với số lượng nhiều chưa hoàn chỉnh Do đó, mục tiêu thập kỷ qua tập trung vào nghiên cứu nhiều loại môi trường nuôi phôi in vitro 1.2.2 Buồng trứng Nhìn chung, buồng trứng lợn trước thành thục tính thu lò mổ nguồn tế bào trứng cho kỹ thuật IVP Buồng trứng chuyển Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 12 phòng thí nghiệm 0,9% nước sinh lý hay PBS có bổ sung kháng sinh thời điểm phát triển noãn nang đạt bước Trong vài Nhiệt độ vận chuyển thời gian từ buồng trứng thu đến hút số tế bào trứng có mặt nang trứng, tế bào trứng phát triển tế bào trứng ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng Vì thế, trì khả đầy đủ phản ứng với kích thích gây chín gây thay đổi sống tế bào trứng trình quan trọng để đạt việc chức hình thái, bao gồm việc tiếp tục lại phân bào giảm nhiễm Một tỷ nuôi chín tế bào trứng thành công Walterss Graves (1998) kiểm tra nhiệt lệ thấp tế bào trứng lợn (62%) lấy từ nang trứng < 3mm đạt tới giai độ bảo quản buồng trứng khác (5, 16, 25, 37 C) thời gian bảo quản đoạn M [12] Tuy nhiên, 82 94% tế bào trứng lợn chín hoàn toàn lấy từ khác (2, 6, 10, 14 26 giờ) đến việc nuôi chín tế bào trứng sau Ở tất nang trứng từ 3-6mm >6mm tương ứng Có điều thú vị 16 38% mức nhiệt độ kiểm tra, tế bào trứng chín giảm đáng kể thời gian bảo tế bào trứng lấy từ nang trứng có đường kính 6mm có tế bào cumulus dãn nở Tế bào trứng bò từ nang trứng lớn khả chín hoàn toàn tế bào trứng dường có tác động xấu đến có khả phát triển tốt so với nang trứng nhỏ Những kết khả phát triển tế bào trứng Tế bào trứng bò thu từ buồng trứng gợi ý khả phân bào giảm nhiễm hoàn toàn khả phát bảo quản 37 C tạo số lượng phôi so với buồng trứng bảo quản triển sau đạt với phát triển nang trứng Tuy nhiên, không 250C sau IVM IVF [65] Vì thế, dường chấp nhận việc vận đồng tế bào trứng lấy từ nang trứng có kích thước khác chuyển buồng trứng 25 C thu tế bào trứng vòng có khả chín phạm trù kích thước trung bình ảnh hưởng đến trình hoàn toàn có khả phát triển sau thụ tinh phân bào giảm nhiễm, chín tế bào chất khả phát triển sau chúng 1.2.3 Loại nang trứng [41] Vì thế, thời gian nuôi cấy trước lúc chín cần thiết phép Buồng trứng lợn có nang trứng có đường kính khác với tế bào trứng từ nang trứng nhỏ đạt tới giai đoạn so sánh với dao động phân loại nhỏ (6mm) tế bào trứng từ nang trứng lớn Nhìn chung, tế bào trứng hút từ nang trứng có kích thước trung bình 1.2.4 Quá trình nuôi thành thục trứng hormone bổ sung cho kỹ thuật IVM Ở lợn, nang trứng biệt hoá hoàn toàn nang trứng có Sự thành thục ống nghiệm trứng lợn phụ thuộc vào nhiều yếu đường kính 0,5mm kèm với tế bào trứng đạt 3/4 kích thước cuối tố: kích thước nang trứng, chất lượng trứng đem nuôi, môi trương nuôi thành thục, [43] Những tế bào bị hạn chế nuôi chín nhân ống nghiệm Các tế điều kiện nuôi, thời gian nuôi, giống lợn khác nhau, mùa vụ…Trên giới có bào trứng đạt tới kích thước đầy đủ chúng nang trứng nhỏ có đường nhiều nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới thành thục trứng lợn kính 2-3mm Hầu hết tế bào trứng nang trứng bắt đầu chín ống nghiệm dừng lại pha I (metaphase 1-M 1) phân bào giảm nhiễm Khả Quá trình nuôi thành thục ống nghiệm đòi hỏi phải có môi trường nuôi hoàn thành chuyển tiếp M thành M đạt tế bào trứng thích hợp, giàu chất dinh dưỡng để trứng phát triển cách bình thường Môi đạt tới kích thước đầy đủ chúng chặt hạch nhân[44] Khả trường phổ biến thường dùng TCM - 199, có bổ xung protein, hormone tế bào trứng hồi phục lại hoàn thành phân bào giảm nhiễm không đạt tới (FSH, LH, Estrogen, HCG) cần thiết nhằm đảm bảo phát triển bình thường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 31 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN bỏ hết xương nên ảnh hưởng đến chất lượng số lượng tế bào thu Vì 3.1 KẾT QUẢ NHÂN NUÔI TẾ BÀO NGUYÊN BÀO SỢI TỪ BÀO THAI CHUỘT Mục đích thí nghiệm đánh giá thời gian nhân nuôi tế bào với số lượng bào thai khác Đây khâu cần khảo sát để qua kết nghiên cứu bảng 3.1 rút kết luận khoảng 3-5 ngày đánh giá chất lượng số lượng tế bào thu để có nguồn nguyên bào sợi phôi chuột phục vụ cho thí nghiệm nuôi phôi Bảng 3.2 Kết tốc độ nhân nuôi tế bào không đông lạnh đánh giá chất lượng số lượng nguồn tế bào thu được, thời gian nhân nuôi,… tế bào đông lạnh sau giải đông từ biết cần sử dụng chuột để thu đủ số lượng tế bào phục vụ cho nuôi phôi Lô TN Bảng 3.1 Kết thu tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột Lô TN Tuổi phôi Số bào thai/ Tổng diện tích nuôi Thời gian phủ Số tế bào thu Tế bào không đông lạnh Tế bào đông lạnh sau giải dông A B C A B C 3 3 4 4 4 3 3 chuột chuột ban đầu (cm2) đầy (ngày) đƣợc (triệu) 13 15 105 24 17 35 4 3 3 3 4 3,4 ± 0,11 3,2 ± 0,09 3,4 ± 0,11 12 11 88 20 14 16 123 28 TB ± 18 10 41 14 SEM 16 22 12 TN: Thí nghiệm 11 ± 0,65 69 ± 6,95 3,5 ± 0,12 17,67 ± 1,2 TB: Trung bình TB ± SEM 3,6 ± 0,11 3,2 ± 0,09 3,4 ± 0,11 SEM (Std error of the mean): Sai số chuẩn giá trị trung bình TN: Thí nghiệm TB: Trung bình SEM (Std error of the mean): Sai số chuẩn giá trị trung bình A: Ngày cấy chuyển nhân nuôi lần sang lần B: Ngày cấy chuyển nhân nuôi lần sang lần C: Ngày cấy chuyển nhân nuôi lần sang lần Qua bảng 3.1 có nhận xét số lượng thai tùy thuộc vào chuột Từ kết tốc độ nhân nuôi tế bào bảng 3.2 ta rút nhận xét tốc khác nhau, thu phôi từ chuột mẹ chửa 12-18 ngày, nhiên chuột độ ngày nhân nuôi loại tế bào khác nhau, loại tế bào cho số lượng phôi khác nhau, điều ảnh hưởng đến số diện tích nuôi số không đông lạnh tế bào đông lạnh trung bình ngày cấy chuyển lần 1, tế bào thu chuột khác Qua nghiên cứu nhận thấy 2,3, - ngày tế bào phủ kín bề mặt đĩa nuôi sau tiếp tục thu phôi chuột chuột chửa ngày 12-14 thu phôi với chất lượng tế cấy chuyển nhân nuôi lần Từ kết nghiên cứu nhận bào tốt, nhiều tế bào, chuột chửa 18 ngày số lượng phôi thu thấy thời gian nhân nuôi phủ kín bề mặt đĩa nuôi tương tự điều cho thấy thường ít, nuôi số tế bào bị chết nhiều vào giai đoạn phôi tốc độ phát triển loại tế bào Như sử dụng chuột hình thành nên xương cứng cáp hơn, trình thu nuôi phải lọc loại tế bào để nuôi phôi với chất lượng tương tự Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 33 34 3.2 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NHÂN NUÔI TẾ BÀO MÀNG TRONG ỐNG DẪN TRỨNG 3.2.1 Kết thu tế bào màng ống dẫn trứng Trong nghiên cứu này, thực khảo sát chất lượng vòi trứng ảnh hưởng đến số lượng cụm tế bào thu Chúng chia làm nhóm thí nghiệm: Nhóm 1: thu cụm tế bào từ vòi trứng to, đẹp, mạch máu A Bào thai chuột 14 ngày tuổi (X400) Nhóm 2: thu cụm tế bào từ vòi trứng nhỏ, đẹp, mạch máu B Mảng mô nuôi (X200) Nhóm 3: thu cụm tế bào từ vòi trứng có nhiều mạch máu Chất lượng cụm tế bào đánh giá sau 24h nuôi tủ nuôi nhiệt độ 37,50 C điều kiện 5% CO2 với độ ẩm bão hòa, kính hiển vi soi quan sát cụm tế bào hoạt động tốt, hoạt động yếu thoái hóa Kết trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng chất lƣợng vòi trứng đến tỷ lệ cụm tế bào màng ống dẫn trứng thu đƣợc C Tế bào bám đáy (X200) D Tế bào phủ kín đáy (X200) Nhóm Tỷ lệ (%) Tổng số cụm tế bào Cụm tế bào hoạt Cụm tế bào hoạt Cụm tế bào thu đƣợc động tốt động yếu thoái hóa 1860 65,3a± 5,1 25,81a± 8,87a ± 0,95 1135 55,1b ± 2,6 26.43b ±1,1 14,98b ± 1,28 650 30c ± 1,1 16,15c ±0,4 53,85c ± 1,51 LSDα 0,05 =31,06 LSD α 0,05 =13,22 LSD α 0,05 =12,14 TN LSD Các ký hiệu a, b, c khác có ý nghĩa P