NGHIÊN cứu TÁCH và xác ĐỊNH cấu TRÚC một số hợp CHẤT từ HOA cây bưởi (CITRUS MAXIMA (j BURMAL ) MERILL ) ở NGHỆ AN

1 Bộ giáo dục đào tạo Trờng Đại học vinh -*&* Nguyễn Thị Hoa Cúc Nghiên cứu tách xác định cấu trúc số hợp chất từ hoa b ởi ( Citrus maxima (J Burmal) Merill ) Nghệ An Luận văn thạc sỹ hoá học Vinh - 2007 Mục lục Lời cảm ơn Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình Bảng ký hiệu viết tắt Mở đầu .1 Chơng Tổng quan 1.1 Vài nét đặc điểm thực vật họ Rutaceae 1.2 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Citrus 1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Citrus .3 1.2.2 Phân loại phân bố chi Citrus họ Rutaceae 1.2.3 Đặc điểm (Citrus maxima (J Burmal) Merill) 1.3 Những nghiên cứu hoá học chi Citrus 1.3.1 Tinh dầu, hợp chất monotecpen 1.3.2 Các hợp chất Limonoit .10 1.3.3 Các hợp chất flavonoit .11 1.3.4 Thành phần hoá học tinh dầu chi Citrus 15 1.3.4.1 thành phần hoá học tinh dầu hoa cam .15 1.3.4.2 Thành phần hoá học tinh dầu hoa 15 1.3.4.3 Thành phần hoá học tinh dầu vỏ 19 1.3.4.4 Thành phần hoá học tinh dầu 23 1.3.4.5 Thành phần hoá học tinh dầu vỏ cam .26 1.3.4.6 Thành phần hoá học tinh dầu vỏ chanh 28 1.4 Các ứng dụng tinh dầu chi Citrus .30 1.4.1 ứng dụng công nghiệp nớc uống.7 30 1.4.2 ứng dụng công nghiệp thực phẩm 30 1.4.3 ứng dụng công nghiệp dợc phẩm 30 Chơng Phơng pháp nghiên cứu .33 2.1 Phơng pháp nghiên cứu .33 2.2 Phơng pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập chất 33 2.3 Phơng pháp khảo sát cấu trúc hợp chất 33 Chơng Thực nghiệm .34 3.1 Thiết bị phơng pháp phân lập, xác định cấu trúc số hợp chất từ hoa 34 3.1.1 Hoá chất 34 3.1.2 Các phơng pháp sắc ký .34 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 34 3.2 Nghiên cứu hợp chất từ hoa 35 3.2.1 Phân lập hợp chất 35 3.2.2.1 Phơng pháp tiến hành sắc ký cột cao n-Hexan .37 3.2.3 Phơng pháp sắc ký mỏng phân đoạn cao n-Hexan 37 Chơng 4: Kết thảo luận 39 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất A1 39 4.2 Xác định cấu trúc hợpc hất A2 .46 Kết luận 71 Tài liệu tham khảo 72 Lời cảm ơn Luận văn đợc thực phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá Hữu khoa Hoá Trờng Đại học Vinh, Viện Hoá Học Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn: PGS TS Hoàng Văn Lựu Phó chủ nhiệm khoa Hoá - Trờng Đại Học Vinh ngời thầy giao đề tài tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực luận văn PGS TS Lê Văn Hạc khoa Hoá - Trờng Đại học Vinh đóng góp nhiều ý kiến quý báu để luận văn đợc hoàn thiện TS Nguyễn Công Dinh đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận văn ThS NCS Trần Đình Thắng tạo điều kiện, bảo giúp đỡ thời gian học tập làm thí nghiệm Phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu - Trờng Đại học Vinh Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, cán khoa Hoá, khoa Sau đại học, bạn đồng nghiệp, gia đình bạn bè tạo điều kiện, động viên giúp đỡ hoàn thành luận văn Vinh, ngày tháng 12 năm 2007 Nguyễn Thị Hoa Cúc Mở đầu Lý chọn đề tài Các hợp chất thiên nhiên nói chung, hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học nói riêng đóng vai trò ngày quan trọng đời sống, nguồn cung cấp nguyên liệu phong phú cho ngành công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm, thực phẩm đặc biệt y học Hệ thực vật Việt Nam phong phú đa dạng Hiện có khoảng 10368 loài thực vật bậc cao dự đoán 12000 loài, làm thuốc khoảng 600 loài Họ Rutaceae (họ Cam quýt) họ thực vật lớn, có 150 giống, 2000 loài thuộc chi Evodia, Muraga, Clausena, Zanthoxilum, Citrus có 100 loài dùng làm thuốc chữa bệnh Ngoài thuộc họ đợc dùng nhiều nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm, dợc liệu, hơng liệu, mỹ phẩm nớc ta bởi, cam, quýt thuộc chi Citrus (họ Rutaceae) loại quen thuộc nh giới Quả loại chứa nhiều vitamin Hoa chúng có mùi thơm đặc trng Trớc ngời ta sử dụng múi loại để ăn Còn phận khác nh vỏ, hoa, cha đợc sử dụng nhiều Ngày trớc phát triển khoa học kỹ thuật, kinh tế phận bắt đầu đợc ý đa vào nghiên cứu số ngành nh dợc phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm để phục vụ cho đời sống nhân dân nớc ta có nhiều chủng loại nhng việc nghiên cứu thành phần hoá học vỏ, hoa, hạn chế Có số công trình nghiên cứu tinh dầu hoa, lá, vỏ Chính lựa chọn đề tài: Nghiên cứu tách xác định cấu trúc số hợp chất từ hoa (Citrus maxima (J Burmal.) Merill.) Nghệ An từ góp phần xác định thành phần hoá học hoa bởi, đồng thời phục vụ cho công tác điều tra định hớng sử dụng hợp chất hoá học từ hoa vào thực tiễn Nhiệm vụ nghiên cứu - Thu thập hoa - Ngâm hoa dung môi chọn lọc - Chng cất thu hồi dung môi thu phần cao đặc - Chiết phần cao đặc dung môi thích hợp để thu đợc hỗn hợp dịch chiết tơng ứng - Sử dụng phơng pháp sắc ký kết tinh phân đoạn để phân lập hợp chất từ dịch chiết - Sử dụng phơng pháp phổ để xác định cấu trúc hợp chất thu đợc Đối tợng nghiên cứu Đối tợng nghiên cứu hoa (Citrus maxima (J Burmal.) Merill.) thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) Nghệ An Chơng Tổng quan 1.1 Vài nét đặc điểm thực vật họ Rutaceae Họ Cam quýt (Rutaceae) Cây bụi gỗ, đơn kép (có có chét), mọc cách hay mọc đối, gần với họ Xoài (Anacardiaceae) họ Thanh thất (Simaroubaceae) Hoa thờng lỡng tính [3] Họ Cam quýt họ thực vật lớn giới với khoảng 160 chi 1650 loài, đợc phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới vùng khí hậu ôn hoà ấm áp, đặc biệt có nhiều Nam Phi, Australia, Malaixia, Nhật, Trung Quốc, ấn Độ [21] Việt Nam họ Rutaceae có gần 30 chi 110 loài [4] - Cam chanh (Citrus aurantium L) nớc ta cam Xã Đoài ngon tiếng - Cam sành (Citrus nobilis Lour.) Cam Bố Hạ - Cây quýt (Citrus delisiosa Tenora.), cam đờng - Cây (Citrus decumana L.) - Cây chanh (Citrus medica L.) - Phật thủ (Citrus medica L var digitata Riss) - Thanh yên (Citrus medica subsp bajoura Bonavia) - Cây quất (Citrus japonica Thunb) Họ thực vật họ thực vật lớn có chứa nhiều lớp chất có hoạt tính hữu ích mà đa dạng chắn loài khác có tầm quan trọng lớn việc sử dụng hợp chất làm dấu mốc để phân loại hoá học 1.2 Đặc điểm thực vật số loài thuộc chi Citrus 1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Citrus Chi Cam quýt (Citrus) gồm khoảng dới 20 loài Việc phân loài chi phức tạp Trớc Tanaka (1932) cho chi Citrus có 30 loài [42] Engler (1964) phân loại chi với loài Swingle (1967) xếp chúng vào 16 loài [40] Đến nay, ngời ta biết có nhiều phân loài, nhiều dạng trung gian loài nhiều giống lai tạo Thực vật thuộc chi Citrus Việt Nam theo Phạm Hoàng Hộ (2000) mô tả 20 loài [6], theo danh mục loài thực vật Việt Nam chi Citrus có 15 loài [9], phân bố khắp nơi nớc Là loại bụi gỗ nhỏ thờng có gai nhọn [11] Lá có tuyến mờ hay không rõ, mọc cách hay mọc đối, có cuống hay không có, hay không đều, có kèm hay kèm Cụm hoa hình chùm, kẽ hay ngọn, có hoa đơn độc Hoa thờng lỡng tính hay tập tính khác gốc, dài, rời hay liền, cánh hoa rời hay liền, gốc, nhiều nhị đính rời hay tụ thành bó liền thành ống, dính hay không dính với cánh hoa, bao phấn hớng trong, hai ô, nút dọc Bầu có nhiều noãn, nhiều rời nhau, đầu nhuỵ rời liền, giá noãn trung tâm, nhiều noãn hay noãn ô Quả hình cầu hình trứng nhọn, chín thờng có màu vàng vàng cam Quả khô tự mở, có nhiều mảnh vỏ có mảnh vỏ Hạch cứng nh xơng hay không cứng, cơm nhầy hay cấu tạo lông mọng nớc Hạt gần hình trứng nhọn, màu trắng ngà, chứa nhiều phôi màu trắng hay xanh [10] 1.2.2 Phân loại phân bố chi Citrus họ Rutaceae Họ Cam quýt (Rutaceae) gồm khoảng 120 chi 2000 loài phân bố khắp giới trừ vùng lạnh Việt Nam điều kiện khí hậu đất đai thuận lợi cho việc phát triển loại Citrus Các loại có Việt Nam.Trong loại cam sành, cam chanh, bởi, quýt đợc trồng nhiều Việt Nam suốt từ Bắc đến Nam Trong gia đình nông thôn Việt Nam hay nông trờng lớn thuộc vùng nh Bố Hạ (Hà Bắc), Hoà Bình, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh, Nha Trang Các loài hàng năm cho sản lợng lớn: chục ngàn tấn/năm dùng thực phẩm Bảng 1.1: Tóm tắt đặc điểm để phân loại loài Citrus Màu Tên khoa học Vàng nhạt Da cam Citrus decumana L Màu hoa Dạng cuống Hình dạng Bởi Trắng To, cành To, tròn Cam Trắng To, cành Cam đờng Trắng To, cành Cam sành Trắng To, cành Tròn Bẹp, bóc vỏ Da cam dễ Tròn, bóc Da cam Tên Citrus aurantium L Citrus deliciosa Tenore Citrus acbilis Lour vỏ dễ Phật thủ Quất Quýt Chanh Thanh yên Trên trắng To, cành dới đỏ Không Trắng có cành Không Trắng có cành Hồng tím Không có cành Có ngón Vàng Var nobilis Citrus medica var sareadactylis Nhỏ, bóc vỏ Da cam dễ Bẹp, bóc vỏ Xanh dễ Citrus Japonica L Tròn Citrus medica L Xanh Citrus Teara Citrus subsp Bovavia delicioa medica bajoura 1.2.3 Đặc điểm (Citrus maxima (J Burmal.) Merill.) Theo E Porot có loài Citrusdecumana Murr, mà có chủng loại ngon Pumelo Thái Lan Một loại khác Citrus paradisi L loài cam lai bởi, có chủng loại Ducan to đợc a chuộng, quanh năm Trong tài liệu trờng Đại học Dợc Nam Kinh (1976) có đề cập đến chủng loại Citrus grandis Ossbeck var tomentosa với non có nhiều lông nhung, chín lông rụng dần Còn chủng loại Citrus gradis Osbeck non lông nhung, chín không lông nhung Việt Nam đợc trồng khắp nơi Do nhân dân ta thờng gọi kèm theo tên địa phơng nh: Thanh Trà (Huế), Phúc Trạch (Hà Tĩnh), Biên Hoà (Đồng Nai), Đoan Hùng (Vĩnh Phúc), đào Đại Hoàng (Hà Nam Ninh), Nghệ (Vinh, Thanh Hoá), Trắng (Kiến An, Hải Phòng, Thái Bình), Tân Yên Có chủng loại: đờng, chua, Thanh Trà Tuy nhiên tài liệu nghiên cứu Việt Nam nhắc đến Citrus grandis L.Osbeck (Citrus decumana Murr) Citrus ossbeck đợc mô tả nh sau: Cây cao từ 10m.Vỏ thân tiết chất gôm Cành có gai nhỏ mọc đứng kẽ lá, có lông rời nhẵn Lá hình trái xoan, có đôi gân bên, gân nhỏ rõ lồi mặt dới cuống sống hoa mọc thành chùm từ 10 hoa, cuống có lông, bắc hình vạch có lông Hoa trắng to, thơm Đài 5, tròn có lông, tràng 5, màu trắng Có khoảng 24 nhị rời, ngắn nửa cánh hoa Đĩa dày Bầu hình cầu, có lông, vòi dài, đầu nhuỵ phình to Quả nhiều hình cầu, to đầu ngời, cùi dày, màu sắc thay đổi tuỳ loại bởi, thông thờng có 12 múi Cây mầm không màu Ra hoa khoảng tháng 1, 2, cho thu hoạch khoảng tháng 12 Gần W.Scora nghiên cứu thống gọi Citrus maxima (J Burmal.) Merill thay cho tên gọi từ trớc đến Cha có tài liệu đề cập đến việc phân loại Việt Nam cấp dới cách chặt chẽ * Trần Thế Tục nghiên cứu chi tiết loại số giống bởi: - Bởi Pumelo, trờng đại học Nông nghiệp I, Hà Nội - Bởi Đoan Hùng Nh Quỳnh (Hải Hng) - Bởi đờng thôn Quả Cẩm, Yên Phong, Hà Bắc - Bởi đỏ ruột - Bởi chua Phúc Thọ - Bởi chua Phúc Thọ - Bởi chua Phúc Thọ Tác giả chia nhóm theo tiêu chuẩn sau: - Căn vào độ chua chia làm nhóm: + Bởi Đoan Hùng +Bởi chua Phúc Thọ 1, 2, +Bởi rôn rốt chua Pumelo - Căn vào màu sắc cùi tép + Bởi đỏ ruột + Bởi trắng - Căn vào thời gian thu hoạch sớm hay muộn + Bởi chín sớm: chua + Bởi chín vừa: Pumelo + Bởi chín muộn: Bởi - Căn vào hình thái quả: 10 + Bởi hình tròn + Bởi hình trứng +Bởi hình lê Khi nghiên cứu chủng loại tác giả xoay quanh hình dạng, cấu tạo, tỷ lệ phần thành phần hoá học nh: + Cân trọng lợng, đo chiều cao đờng kính + Đếm số múi số hạt múi + Cân phần quả: Phần ăn đợc (tép), chất khô tép, vỏ xanh, cùi trắng, hạt, vỏ hoa + Phân tích thành phần sinh hoá nớc ép * Đỗ Việt Anh nghiên cứu giống số ngon tiếng gồm: - Bởi Đoan Hùng: nghiên cứu loại: chua - Bởi Phúc Thọ: nghiên cứu loại: chua, đào - Bởi Hơng Sơn: nghiên cứu loại: chua, đờng, đào phớt đào thắm - Bởi Phúc Trạch: nghiên cứu loại: chua, đào Hình 1.1: Cây 1.3 Những nghiên cứu hoá học chi Citrus 61 Hình 4.18: Phổ HMBC hợp chất A2 62 Hình 4.19: Phổ HMBC hợp chất A2 63 Hình 4.20: Phổ HMBC hợp chất A2 64 Hình 4.21: Phổ HSQC hợp chất A2 65 Hình 4.22: Phổ HSQC hợp chất A2 66 Hình 4.23: Phổ HSQC hợp chất A2 67 Hình 4.24: Phổ COSY hợp chất A2 68 Hình 4.25: Phổ COSY hợp chất A2 69 Hình 4.26: Phổ COSY hợp chất A2 70 Kết luận Tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học hoa (Citrus maxima (J Burmal.) Merill.) Nghệ An Chúng thu đợc số kết nh sau: 1) Bằng phơng pháp ngâm chiết với dung môi chọn lọc cất phân đoạn thu đợc cao đặc tơng ứng là: n-hexan (40g); etylaxetat (30g); nbutanol (200g) 2) Nghiên cứu cao n-hexan phơng pháp sắc ký kết tinh phân đoạn thu đợc chất A1 A2 3) Đã sử dụng phơng pháp phổ đại: tử ngoại, hồng ngoại, khối phổ, phổ cộng hởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR; 13C-NMR; DEPT), phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC; HMBC) để xác định cấu trúc hợp chất tách đợc Các kết phổ cho phép khẳng định cấu trúc hợp chất A1 là: sitosterol O D - - glucopyranozit; A2 Monolinolein 71 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Bùi Kim Anh (1998) Luận văn Thạc sĩ hoá học ĐHSP Hà Nội Bùi Kim Anh (2005) Luận án Tiến sĩ hoá học ĐHSP Hà Nội Nguyễn Tiến Bân (1997) Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín Việt Nam NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Văn Đậu Luận án tiến sĩ Trờng ĐHTH Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000).Cây cỏ Việt Nam, II NXB trẻ Nguyễn Thị Thanh Huế (2007) Khoá luận tốt nghiệp Trờng ĐH Vinh Lê Khả Kế (1962).Phân loại thực vật NXB Giáo Dục Trần Kim Liên (2003) Danh mục loài thực vật Việt Nam, tập II,mục 134.NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 10 Hoàng Văn Lựu (1998) Phơng pháp sắc ký khối phổ Giáo trình cao học hoá học.Trờng ĐH Vinh 11 Lã Đình Mới (2001) Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam, tập I NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Mạnh Pha (1991) Thành phần hoá học tinh dầu vỏ Tạp chí dợc học 5,9 13 Nguyễn Mạnh Pha (1993) Luận án phó tiến sĩ khoa học y dợc.Trờng ĐH Dợc, Hà Nội 14 Đỗ Đình Rãng (2003) Nghiên cứu tinh dầu vài phận Hội nghị hoá học toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, 290 15 Phan Thị Phơng Thảo (1999) Luận văn thạc sĩ hoá học Trờng ĐH Vinh 16 Nguyễn Thị Thảo Trân (2003) Khảo sát tinh dầu vỏ chanh Hội nghị hoá học toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, 332 72 17 Dơng Anh Tuấn cộng (1998) Nghiên cứu phân lập limonin từ hạt chanh, cam, quýt Việt Nam thăm dò tác dụng trừ sâu bệnh Tuyển tập báo cáo hội nghị hoá học toàn quốc lần thứ III, tập I, 52- 55 18 Phùng Bạch Yến Kết nghiên cứu tinh dầu chanh, quýt, KHKT Nông nghiệp số 318 19 Phùng Bạch Yến (1989) Thành phần chất thơm tinh dầu hoa Việt Nam Tạp chí KHKT quản lý T (40)4 Tiếng Anh 20 Dơng Anh Tuấn cộng (1998).Antifeedant effects of limonin isolated from Vietnamese lemon seeds against Blutella xylostela Abtracts from ASOMPSIX SO3b, P 100 21 Alford A R., and Murray K D (2000) Prospects for Citrus limonoids in insect pest management, In: (Berhow, M.A elal Eds Citrus limonoids Functional chemicals in Agriculture and Foods.ASC symbosium series 758 washington, DC, Ofort University press, 201- 211 22 Attaway, J A (1994) Citrus juice flavonoids with anticarcinogenic and antitumor propervises In food phytochemicals for cancer prevention I; Maple press: York, PA., 240 248 23 Benaventa Garcia, O., Castillo, J., Marin, F R., Ortuno, A., DelRio J A (1997) Use and Properties of Citrus flavonoids J Agric Food Chem., 45, 4506 4515 24 Bennett R D and Hasegawa S (1981) Limonoids of Calamondin seeds Tetrahedron, 37, 17 24 25 Bernays (1841) Limonin Liebigs Ann Chem 40 317 26 Chavalit N (1991) Citrus maxima (Burm) Merr Plants resources of South East Asian Edible funt and nuts, Pudoc wageningen, 128 27 ChemJ., MontanariA M, Widner, W W (1997) Two new polymethoxylated flavones, a class of compounds with potential anticancer activity, isolated from cold pressed Dancy Tangerine peel oil solids, J Agric Food chem., 45, 364 368 73 28 David L Dreyer (1966), Citrus bitter principle in Navel oranges, Food Technol., 3, 248 29 Francesco castelli, Natascia Giuffda, Corrado Tringali and Giusppe Ruberto (2000) Calorimetric evidence of diffrentiated transport of limonin and nomilin through biomembranes J Agric Food Chem., 48 (9),4123 4127 31 Haenen G R M M.,Paquary, T.B.G., Korthouwer, R E M., and Bast, A (1997) Peroxynitrite scavenging by flavonoids Biochem Biophys Res Commun., 236, 591 593 32 Hasegawa, S., Berhow, M A., Fong, C H (1996) Analysis of bitter principles in Citrus In Modern methods of plants analysis., Linskens, H F., Jackson, J F., Eds Springer Verlag, Berlin 18, 59 80 33 Hesegawa, S., Berhow M A., Manners, G.D (2000) Citrus limonoids research: an overview In Citus limonoids, Functional Chemicals in Agriculture and Foods; Berhow, M A., Hasegawa, S., Manner, G D , Eds ACS Symposium series 758; Washington, D C., 34 Hirano, T., Abe, K., Gotoh, M., Oka, K (1995) Citrus flavone tangeretin inhibits leukaemic HL 60 cell growth partially through induction of apoptosis with less cytotoxic on normalymphocytes Br., J Cancer., 21, 1184 1185 35 Ito, A., Ishiwa, J., Sato, T., Mimaki, Y., Shashida, Y (1999) The Citrus flavonoid nobiletin supresses the production and gene expression of matrix metalloproteinase / gelatinase B in rabbit synovial cell An, N Y Acal Sci., 878, 632 634 36 Maier, V P and Dreyer, D L (1995) Citrus bitter principles IV Occurrence of limonin in Grapefruit Juice J Fod Sci 30 874 37 Manners, G D., Jocob, R A., Andrew P., Breksa III,Thomask Schoch and Shin Hasegawa (2003) Bioavailability of Citrus limonoids in Humans J.Agric Foodchem., 51 (14), 4156 4161 38 Morguchi, J., kita, M., Hasegawa, s and Omura m (2003) Molecular approach to citrus flavonoid and limonoid biosynthesis Food, Agric.and Environment (1): 22 25 74 39 Satoru Kawaii, Yasuhiko Tomono, Eriko Katase, Kazunori Ogawa, Masanichi Yano, Meisaku Koizumi, Chihiro Ito and Hiroshi Furukawa (2000) Quantitative study of flavonoids in leaves of citrus plants J Agric Food Chem., 48 (9), 3865 3871 40 Swingle, W T & Reece, P C (1967) The botany of citrus and its wild relatives of orange subfamily In the citrus industry (Reuther, W., Webber, H I and Batchelor, L.D., Eds.) University of Califonia press I, 180 223 41 Takuji Tanaka, Meada, M., Kohno, H., Murakami, M Kagami, J Miyake, M and Wada K (2000) Ihigition of azoxymethane induced colon carcinogenesis in Male F _ 344 rats by the citrus limonoids obacunone and limonin Carcinogenesis, 22 (1), 193- 198 42 Taylor, D A H (1993) In chemistry and chemical taxonomy of the Rutales (Waterman, P G and Grundon, M F., Eds.), Academic Press,, Newyork, 353 43 Thomas K Schoch, Gary D Manners and Shin Hasegawa (2001) Analysis of limonoid glucosides from Citrus by electrospray ionization liquid hromatography mass spectrometry J Agric Food Chem., 49 (3) 1102 1108 44 Tian ShungWu, Shiow Chyn Huang and Jeng Shiow Lai (1994), stembark coumarins of Citrus grandis Phytochemistry, 36 (1), 217 219 45 Ernest Guenther The essential oils.Volum Newyork, 11- 1964 46 Lenone Rivista tral esenge profumi 28 (1946) Perfumery essential oil record 38 (19) 74-78 47 Nicholls (1974) Parfumery essential oil record 38, 241 48 K L Phar R K Thappa SG Agarwell Newer Trends in essential oils and Flavours 49 Hesse and Zeitschel Ibiol (2) 54 (1901), 245 (2) 66 (1902) 481 50 Shaw P E and Moshonas M G(1985), Mass spetra Rev 51 Ashoor S, H, M, Bernhtd R A S(1967) Agric Food Chem 15, 10441047 75 52 Kesterson J K and Hendrickson R (1964) Am Perfume Cosmet 79, 34 36 53 Kling and Florentin Ann fals 18 (1925) J Pharm Chim (8) a (1926) 265 54 Manuel G Moshonas M G(1971) Analysis of carbony flavor constituent from grape fruit oil J Agr Food Chem 19 55 Nguyen Xuan Dung, Vu Ngoc Lo, Nguyen Manh Pha, Nguyen Huu Thien and Piet A Lecletcq(1996) Chemiccal investigation of the fruit peel oil of Citrus medica L var sarcodactylics (noot) Swingle from Vietnam J Essential oil research, 8, 15 18 56 Mackold (1964) Sesquiterpenes, Nootkatone a new grape fruit flavor constituent J Food sci, 29 57 Moshonas M G and Lind D Fric (1969) Andehydes, Ketones and esters in Valencia orange peel oil, Journal of Food sciense Vol 34 58 Nelson and Mottern (1948) Florida Citrus oils University Florida Agric, N0 452