Đề cương nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tại sao các mô đã chuyên hóa của thực vật khi nuôi cấy invitro lại có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh? Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cảcác loại n

Câu 1: Thế nào là nuôi cấy mô tế bào thực vật? Tại sao các mô đã chuyên hóa của thực vật khi nuôi cấy invitro lại có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh?

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cảcác loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật , trên môi trườngdinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồmhàng loạt các kĩ thuật khác nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnhvực VD: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ứng dụng trong tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về

di truyền, làm sạch virus

 Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóađều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó, khigặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Vì vậycác mô đã chuyên hóa của thực vật khi được đưa vào môi trường nuôi cấy thích hợpchúng sẽ thể hiện tính toàn năng của mình và phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Nóimột cách rõ rang hơn khi các mô chuyên hóa được đưa vào môi trường nuôi cấy phù hợpchúng sẽ khôi phục khả năng phân chia, chuyển thành tế bào phân sinh và hình thành môsẹo Trong đó một bộ phận tế bào hình thành tế bào cảm ứng hình thái, Chúng cảm ứngcác tín hiệu kích thích phân tử và xác định đường hướng mới của sự sinh trưởng và pháttriển tế bào, các tế bào dơn cực phát triển thành rễ, tế bào lưỡng cực phát triển thànhnhóm tế bào phôi, rồi hình thành tế bào phôi soma

Câu 2: Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy invitro diễn ra như thế nào?

 Khái niệm về tính toàn năng của tế bào thực vật:

 Haberlandt (1902) lần đầu tiên quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một

cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiền tàng để phát triển thành một cáthể hoàn chỉnh

 Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào

 Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy invitro

 Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế bào thực vật

 Khả năng biểu hiện tính toàn năng của các tế bào, mô của cơ thể là khác nhau

 Tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy invitro biểu hiện qua ba giai đoạn:

 Tế bào phản phân hóa với sự phát sinh tế bào khả biến

 Sự định hướng phân hóa tế bào (hoặc tác dụng quyết định của tế bào)

 Sự phát sinh hình thái và phát triển cơ quan

1 Sự phản phân hóa tế bào và sự hình thành tế bào khả biến

 Sự phản phân hóa tế bào là quá trình mà tế bào đã phân hóa trong một điều kiện nhất định, khôi phục khả năng phân chia, chuyển thành tế bào phân sinh và hình thành mô sẹo

 Trong đó, có một bộ phận hình thành tế bào cảm ứng phát sinh hình thái, tức là tế bào có thể cảm thụ tín hiệu kích thích phân tử, từ đó xác định đường hướng mới của sự sinh trưởng và phát triển tế bào

 Chu kỳ tế bào với sự phản phân hóa: tế bào trưởng thành phản phân hóa thành ra tế bào mô phân sinh, bước vào chu kỳ tế bào ở thời kỳ G1 hoặc thời kỳ G2 Điều này được quyết định bởi khả năng phân hóa và trạng tháisinh lý ban đầu của nó

 Điều kiện và đặc trưng của sự phản phân hóa tế bào

 Có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng tới sự phân hóa của tế bào và mô tách rời, trong đó nhân tố chủ yếu là chất điều tiết sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin và cytokinin Tế bào và mô thực vật khác nhau thì điều kiện phản phânhóa của chúng là không giống nhau

 Trong quá trình phản phânhóa tế bào thực vật, cách phân bào, biểu hiện gen và sự chuyển hóa vật chất trong tế bào đều có đặc trưng rõ rệt: sự hòa nhập của hạch nhân và nhân, sự dung giải màng nhân, sự phân bào có tơ tạo tế bào đa nhân, sự biểu hiện của các kiểu gen đặc trưng

 Tế bào cảm biến:

 Tế bào cảm biến là chỉ trạng thái của tế bào được hình thành sau giai đoạn nuôi cấy khởi động và có khả năng cảm thụ tác nhân kích thích để phát sinh hình thái

 Thời gian và điều kiện mà tế bào thực vật biến đổi về mặt hình thái để tạo thành tế bào cảm biến có sự sai khác tương đối lớn: có trước khi tế bào diễn ra phản phân hóa nhưng cũng có thể trong hoặc sau thời kỳ tế bào phản phân hóa

 Tế bào cảm biến có đặc trưng về cấu trúc và sự biểu hiện gen ví dụ các tế bào huyền phù của cà rốt

 Ví dụ: ở 5 kiểu gen mía có xuất hiện 63 loại protein chuyên phản phân hóa, trong đó có 33 loại protein xuất hiện trong tất cả các kiểu gen, trong protein chuyên phản phân hóa thì có 3 loại đặc hiệu cho sự phát sinh hình thái và cảm ứng tạo mô sẹo và có 1 protein không có chức năng này

 Phát hiện sự cảm thụ hình thái phôi tế bào thực vật với gen enzyme thụ thểphát sinh phôi soma (somatic embryogenesis receptor kinase - SERK) có quan hệ với nhau, biểu hiện này được coi là dấu hiệu của tế bào thể phôi Trong cà rốt, SERK chỉ có trong tế bào thể phôi và biểu hiện ở thời kỳ đầuphát triển tế bào thể phôi, sau thời gian phôi hình cầu thì ngừng biểu hiện

2 Tác dụng quyết định của tế bào thực vật

 Sự “quyết định” (determination) của tế bào là sự định hướng phân hóa và trình tự phát triển của tế bào:

 Trong quá trình nuôi cấy mô, sự quyết định này biểu hiện ở 2 mặt:

 Sự định hướng sẵn có của tế bào mẫu cấy

 Cảm ứng sự định hướng của tế bào nuôi cấy

 Đặc trưng của tế bào quyết định

 Biến đổi quá trình trao đổi chất

 Biến đổi hình thái và cấu trúc tế bào, đặc biệt là màng tế bào

 Các tế bào khác nhau có thời gian hoàn thành tác dụng quyết định không giống nhau

 Ví dụ: biến đổi tế bào của mô lá sơn trà khi hình thành phôi soma

 Tín hiệu phân tử của sự quyết định tế bào

 Sự quyết định của tế bào là kết quả tác dụng của tín hiệu phân tử giữa tế bào với tế bào

 Trong một cá thể thực vật hoàn chỉnh, sự sinh trưởng phát triển của mỗi tếbào, mô hoặc cơ quan đều bị sự điều tiết bởi tín hiệu phân tử của tế bào,

mô và các cơ quan khác bên cạnh để duy trì sự sinh trưởng phát triển bình thường của cây

 Trong điều kiện nuôi cấy invitro, tế bào cũng biểu hiện sự điều tiết tín hiệuphân tử hoặc tác dụng truyền tin của nó

 Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh đều nêu trên Ví dụ:

 Tế bào biểu bì thuốc lá khi nuôi cấy đơn độc thì mẫu cấy chỉ có thể trương

to, không phân hóa cơ quan, nếu đưa tế bào biểu bì về vị trí cũ trong đoạn thân thì lập tức bị kích thích để hình thành chồi

 Đã phát hiện ra vai trò phân tử tín hiệu quyết định phát sinh phôi của arabinogalactan protein (AGP) và chito-oligosaccharide ở màng tế bào củacác cây cà rốt, cải dầu, sam vân (thông Nauy)…

3 Sự phân hóa tế bào và mô

 Tế bào đã trải qua cảm ứng quyết định, trong điều kiện nhất định thì có thểphân hóa thành mô, cơ quan và cây khác nhau, quá trình này gọi là sự tái phân hóa Sự phân hóa tế bào và mô là bước thứ nhất của sự phát sinh cơ quan và phôi

 Nghiên cứu sự phân hóa mạch dẫn được cọi là mô hình nghiên cứu sự phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô thực vật.

 Sự phân hóa mô là cơ sở của phát sinh hình thái, khác biệt cơ bản trong quá trình phát sinh hình thái thể hiện ở sự phân cực của tế bào

Câu 4: Sự suy thoái tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy invitro

Trong thời gian nuôi cấy dài,sự tăng lên của số lần cấy chuyển, tiềm năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy thực vật giảm đi hoặc bị mất, thậm chí sự phân chia và sinh trưởng

tế bào giảm dần đến chỗ ngừng hẳn

Có một số giả thuyết về nguyên nhân của sự suy thoái này

 Giả thuyết di truyền: do sự thay đổi trong độ bội tế bào mẫu nuôi cấy, xuất hiện thể không chỉnh bội, cấu trúc nhiễm sắc thể biến đổi và đột biến gen … dẫn đến suy thoái tiềm năng phát sinh hình thái

 Giả thuyết sinh lý : cho rằng sự biến đổi mức độ và sự cân bằng chất kích thích sinh trưởng nội sinh là nhân tố của sự suy thoái tiềm năng phát sinh hình thái

 Giả thuyết cạnh tranh: trong mô sẹo hoặc tế bào nuôi cấy, có sự kế tiếp và luân phiên sinh trưởng của các loại tế bào khác nhau Qua quá trình nuôi cấy lâu dài, các tế bào không có tiềm năng phát sinh sẽ chiếm ưu thế hơn

Câu 6: Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý(ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ khí CO2) đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro?

Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý(ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ khí CO2) đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro:

50 cm, đảm bảo sự khuyếch tán AS được đều khắp

 AS trong bình và ngoài bình khác nhau rất nhiều và sự phân bổ AS trong bình phụ thuộc vào diện tích nắp bình, loại bình và sự sắp xếp bình trên giá đặt bình nuôi

 Thông thường cường độ ánh sáng trong bình nuôi thấp hơn

10 lần so với AS tự nhiên ban ngày, giao động tỏng khoảng 40-140 mmol/m2/s ( tương đương 3000-10000 lux) Việc sử dụng cường độ chiếu sáng thấp trong nuôi cấy in vitronhằm tiết kiệm chi phí năng lượng, giảm hiệu ứng nhà kính và do mẫu cây chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng

 Tỷ lệ quang tử của vùng AS màu đỏ /gần đỏ và xanh/đỏ ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái Sự phát sinh hình thái xảy ra khi AS có bước sóng thuộc vùng AS màu xanh (400-460nm),đỏ (620 – 680nm), gần màu đỏ (700 – 800nm) và gần màu tím(300 – 4 nm)

 Quang chu kỳ trong buồng nuôi thường được duy trì ở chế

độ 16h chiếu sáng/ngày

 Nhiệt độ

 Nhiệt độ trong bình nuôi thường cao hơn nhiệt độ ngoài bình một vài độ và phần đáy bình thường sẽ ấm hơn so với phần nắp bình.

 Nhiệt độ trung bình của buồng nuôi cho nhiều loại cây thường là 250C (giao động từ 17 – 300C) các cây nhiệt đới cần nhiệt độ tủng bình của buồng nuôi ở mức cao hơn: 27,70

C (24 – 32)

 Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày (khi chiếu sáng) và ban đêm ( khi không chiếu sáng) thường được duy trì từ 4 – 8 0C , ví dụ : nhiệt độ ban ngày là 25, ban đêm là 20, hay 28 và 24…sự chênh lệch nhiệt độ như vậy hỗ trợ sự trao đổi khí của bình nuôi và cải thiện sự sinh trưởng của cây nuôi cấy

 Với mỗi loại cây khác nhau có khoảng nhiệt độ thích hợp riêng, VD: cây khoai tây s.tr rất nhanh ở t0 ngày/đêm là 22/18, khi nhiệt độ ngày/đêm là 27/22 cây s.tr chậm hẳn

 Tốc độ s.tr của mẫu cấy thường giảm dần khi nhiệt độ buồng nuôi thấp hơn nhiệt độ tối thích nhưng giảm xuồng rất nhanh khi t0 buồng nuôi cao hơn nhiệt độ tối thích

Câu 7: Thế nào là sự phát sinh hình thái của tế bào?

Sự phát sinh hình thái (morphogenesis) là sự xuất hiện cấu trúc và cơ quan theo 1 hướng nhất định của tế bào, mô nuôi cấy

Bao gồm phát sinh cơ quan (organogeneis) và phát sinh phôi soma (somatic

embryogenesis)

Sự phát sinh hình thái có thể tiến hành theo:

 Phương pháp trực tiếp: trong quá trình phản phân hóa, tái phân hóa tế bào mẫu nuôi cấy không xuất hiện mô sẹo (callus) 1 cách rõ rệt, mà trực tiếp tái sinh thành cây

 Phương thức gián tiếp: tế bào mẫu nuôi cấy phải trải qua cảm ứng tạo mô sẹo, sau

đó mới tái sinh cây Ví dụ như tạo cây đơn bội

 Sự phát sinh phôi soma:

Những tế bào trong phôi hợp tử biểu hiện được gen cần thiết cho chương trìnhphát triển phôi Giai đoạn trước khi hình thành tế bào phôi soma được gọi là tế bào tiềnphôi Tế bào tiền phôi phân chia để hệ thống tế bào phôi trực tiếp gọi là sự phát sinh tếbào phôi trực tiếp

Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích sinh trưởng, có nhiều tếbào cần Auxin để tiến hành phân bào trước khi phát sinh tế bào phôi Có nhiều tế bàohình thành phôi từ mô sẹo, trong trường hợp này có sự phát sinh phôi soma được tiếnhành gián tiếp

Hai danh từ tế bào tiền phôi PEDC ( Preembryogenic determined cell) và tế bào phát sinhphôi IEDC ( induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô, nhưng thựcchất là 1 quá trình tiếp nối nhau, kết thúc sự phát triển là sự hệ thống những tế bào phôi

(EC- Embryogenic cell)

Những tế bào ở những mô có quan hệ với sự sinh sản như hạt phấn, chồi mầm có khả năng

hệ thống tế bào phôi dễ dàng hơn những tế bào ở những mô trưởng thành Khi mô có chứa

tế bào phôi, kích thích sự phân chia tế bào trong giai đoạn này là cần thiết để duy trì tìnhtrạng phôi và hình thành tế bào phôi soma

Tế bào sinh phôi có thể hệ thống ở những tế bào bình thường được nuôi cấy trên môitrường có auxin và có thể không có cytokinin Lượng cytokinin có trong tế bào cao thườngphát sinh phôi thấp Khi một tế bào phôi được thu nhận, sự có mặt của auxin sẽ gây tổn hạiđến sự pt bt của phôi Những nhân tố khác ảnh hưởng đến sự pt của phôi như tỉ lệ đạmamonium và nitrate trong môi trường và pH thấp Hay sự lặp đi lặp lại chu kì phát sinhphôi có thể bị phá vỡ do sự giảm hay bỏ hẳn auxin ra khỏi môi trường

Sự hình thành phôi thông qua 2 con đưòng PEDC và IEDC Con đường PEDC là conđường phát sinh phôi không qua quá trình tạo mô sẹo và IDEC là con đường thông quaquá trình tạo mô sẹo

Có 2 bước dẫn đến sự hệ thống phôi:

1 Sự biệt hoá của tế bào có khả năng phát sinh phôi

2 sự phát triển của những tế bào phôi mới hệ thống

Như vậy có 2 môi trường cần thiết cho nuôi cấy phôi:

1 Môi trường cần cho sự phát sinh tế bào phôi

2 Môi trường cần cho sự phát triển những tế bào này thành những tế bào có khả năng phátsinh phôi

Bước 1 cần có mặt auxin và bước 2 phải giảm thấp hay không có mặt của auxin

Có hai yếu tố quan trọng trong phát sinh phôi: Auxin và nitrogen

Phát sinh phôi soma là kiểu mẫu của tính toàn thế, có thể khảo sát toàn bộ tiến trình biệt hoá của tế bào cũng như cơ chế thể hiện tính toàn năng của tế bào thực vật

 Sự phát sinh cơ quan:

Là quá trình phát triển các chồi, rễ bất định từ các khối tế bào callus Quá trình này xảy

ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo callus

Câu 8: Các đường hướng phát sinh hình thái của tế bào, mô thực vật nuôi cấy in vitro và những đặc trưng của hình thái này?

- Đặc trưng sự phát sinh cơ quan

Sự phát sinh hình thái tái sinh cây, có thể tổng hợp gồm 5 phương thức cơ bản:

+ Trước hết là hình thành rễ, trên rễ hình thành chồi, chẳng hạn nuôi cấy huyền phù tếbào cà

+ Trước hết hình thành chồi, sau đó hình thành rễ từ chồi, như sự tái sinh của đại đa số mô thực vật nuôi cấy

+ Trên mô sẹo sản sinh ra chồi và rễ, cấu trúc liên tiếp thành một trục thấp ví dụ như

cà rốt

+ Hình thành thể dinh dưỡng khác như thân củ, thân vảy và thân hình cầu, ví dụ: tạo

củ lily, lay ơn, protocrom hoa lan

+ Hình thành chồi hoa hoặc 1 bộ phận cơ quan sinh sản, như khi nuôi cấy tế bào trụ phôi cây phong thì tế bào nuôi cấy có thể phân hóa thành hạt phấn và noãn…

- Hai đường hướng phân hóa cơ quan của tế bào nuôi cấy:

+ Phân hóa gián tiếp: mẫu cấy trước hết hình thành cụm mô sẹo, từ mô sẹo phát sinh ra

mô tương tự như mô phân sinh, phân hóa hình thành trung tâm phân sinh Đặc điểm của

nó là tế bào nhỏ, đường kính tương đương nhau, màng mỏng, nhân lớn, bắt màu đậm Từ trung tâm phân sinh sau đó hình thành cơ quan chồi, rễ

+ Phân hóa trực tiếp: Không có giai đoạn tạo mô sẹo rõ rệt, từ mẫu cấy trực tiếp hình thành trung tâm phân sinh có thể có nguồn gốc từ 1 tế bào hoặc nhiều tế bào Các tế bào này bắt đầu phân chia, hình thành nên 2 – 3 tế bào ở gần nhau và tạo thành trung tâm phân chia liên tục với tốc độ nhanh Tế bào xung quanh chúng cũng phân chia nhưng với tốc độ chậm Từ trung tâm phân sinh hình thành cơ quan chồi, rễ

 Sự phát sinh phôi soma

Sự phát sinh phôi soma là sự cảm ứng tế bào soma hình thành phôi hoàn chỉnh

- Đặc trưng hình thành phôi soma

+ Sự hình thành phát triên phôi soma và phôi hợp tử giống nhau ở chỗ cần trải qua thời kỳ hình cầu, thời kỳ hình tim, thời kỳ kình ngư lôi và thời kỳ hình thành lá mầm Phôi soma có cấu trúc hình thái tương tự như phôi hợp tử Cuối cùng nảy maannm thành cây con

+ Nhưng phôi soma khác với phôi hợp tử là: không có sự phân hóa nội nhũ, sự phát triển cuống phôi bị ức chế hoặc nó bị tiêu biến, nói chung phôi soma không có quá trình khô phôi và ngủ nghỉ

+ Có 3 điểm sai khác rõ rệt giữa phát triển phôi soma Và sự phát triển chồi bất định:

1 Thể phôi có sự phân hóa thành 2 cực là mầm rễ và mầm chồi, nhưng chồi bất địnhchỉ có kết cấu đơn cực là mầm chồi

2 Các bó mạch của thể phôi tách rời khỏi bó mạch của mẫu nuôi cấy nhưng ở chồi bất định bó mạch của nó liên kết với mô bó mạch của mẫu nuôi cấy

3 Tế bào phôi nảy mầm thành cây trong ống nghiệm, thông thường không cần giai đoạn cảm ứng sinh rễ, nhưng chồi bất định cần phải chuyển sang môi trường nuôi cấy cảm ứng rễ mới hình thành cây hoàn chỉnh

- Con đường hình thành phôi soma

+ Phát sinh trực tiếp: là thể phôi phát triển từ mẫu nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy có thể là biểu bì, chu bì, tiền phôi hợp tử, tế bào nuôi cấy huyền phù và tế bào trần

Ví dụ: Tế bào biểu bì trụ phôi hướng dương và tế bào phôi tâm cây cam quýt…

có thể trực tiếp phát sinh phôi

Phương thức pháp sinh trực tiếp phôi soma là do tế bào trong mẫu nuôi cấy tồn tại

tế bào tiền phát sinh phôi, trong nuôi cấy thì tế bào này trực tiếp bước vào giai đoạn phát sinh phôi, hình thành thể phôi som

+ Phát sinh gián tiếp: là thể phôi phát triển từ mô sẹo hoặc huyền phù tế bào Thông qua phản phân hóa đồng thời do cảm ứng định hướng phát triển tạo tế bào quyết định cảm ứng phát sinh phôi và chúng phát triển hình thành phôi soma

Câu 10: Nhân giống vô tính in vitro là gì? Những ưu thế và hạn chế của kỹ thuật này?

Trả lời:

- Nhân giống vô tính in vitro là quả trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từcác bộ phận, cơ quan như: chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân, lá … của cây mẹ ban đầu thôngqua kỹ thuật nuôi cấy in vitro

- Ưu thế của kỹ thuật này:

+ Phương pháp cho hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt ditruyền

+ Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả những đối tượng khó nhân bằngcác phương pháp thông thường)

+ Chủ động kế hoạch trong sản xuất đặc biệt là về giống

+ Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh: nấm, vi khuẩn, đặc biệt là virus VD: khoai tây, dứa+ Các cây nhân sau in vitro có xu hướng được trẻ hóa  nâng cao hiệu quả nhân bằng cácphương pháp thong thường sau đó

- Nhược điểm của kỹ thuật này:

+ Chi phí cao hơn các phương pháp nhân giống khác nên giá thành không cạnh tranh

+ Nhân giống in vitro không thể áp dụng trên tất cả các đối tượng, đặc biệt là phương pháp

vi nhân giống

+ Một số loại cây trồng rát dẽ bị biến dị khi nhân giống vô tính in vitro

Câu 11 Nên ứng dụng kỹ thuật nhân nhanh bằng nuôi cấy mô trong những trường hợp nào? Vì sao?

• Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống

• Nhân nhanh các loại hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

• Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống câyrau, cây hoa và cây trồng khác

• Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus

• Bảo quản giống gen in vitro

• Dễ dàng tạo được cây sạch virus

• Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa giúp nâng cao hiệuquả nhân nhanh bằng các phương pháp thông thường sau đó

Câu 12: Các bước cụ thể của quy trình nhân nhanh bằng nuôi cấy mô? Nêu 1 vd cụ thể về một quy trình nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô để minh họa.

1 Các bước cụ thể của quy trình nhân nhanh bằng nuôi cấy mô

 Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

 Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc vàphòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăngkhả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

 Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro

 Yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

 Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ítchuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ, …)

 Cần xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp Thường dùng các chất: HgCl2 0.1%

xử lý trong 5 – 10 phút, NaClO, Ca(Ocl)2 5-7% xủ lý trong 15 – 20’ hoặc H2O2, nướcBrôm

 Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thôngqua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, và tạo phôi vô tính

 Chú ý xác định điều kiện môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu quả làcao nhất: Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi,nhiều auxin sẽ kích thích ra rễ Chế độ nuôi cấy thường là 25 – 27°C, 16h chiếusáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 – 4000lux

 Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo

rễ Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng nhỏ auxin Tuy nhiên có một số chồi cóthể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môitrường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

 Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo trên môi trường không có chất điều tiết sinhtrưởng hoặc môi trường có nồng độ cytokinin thấp để phôi phát triển thành cây hoànchỉnh

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm có tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảomột số yêu cầu:

 Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, chiều cao cây,

bộ rễ…)

 Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp (giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước)

 Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độdinh dưỡng phù hợp

2 Quy trình nhân giống hoa Lan bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro

2.1 Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy

 Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bênmang đỉnh sinh trưởng

 Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong 30giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút,việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần

 Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non.

 Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng

 Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng.Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trườngnhân giống ban đầu

 Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài

 Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi làthể chồi

 Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếngtuỳ kích thước của chồi

 Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi) Mỗi đỉnh sinhtrưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyềnsang môi trường mới

2.2 Nhân giống

 Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sungcác chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạođiều kiện cho quá trình nhân chồi

 Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyển sau đó.Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nướcchuối, nước khoai tây Nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyển và thể tíchcũng không quá 10% thể tích môi trường

2.3 Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro

 Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môitrường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ)

 Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con

2.4 Chuyển cây ra vườn ươm

 Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng cóbổ sung các chất dinh dưỡng

 Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu Sau khi chuyển chậukhoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật

 Như vậy, từ một mô hoa Lan được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá chuyển

ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng

 Với phương pháp nhân giống vô tính như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang đặc tínhgiống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễmbệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn

 Tuy nhiên, việc cấy mô phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng quytrình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt làđiều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt

 Cần chú ý thêm, đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá tạivùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy, có như vậy mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấytrong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm

Câu 13: Những vấn đề tồn tại của kỹ thật nhân giống vô tính in vitro và các khắc phục?

Các tồn tại của kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro và cách khắc phục:

1 Tính bất định về mặt di truyền.

- Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng rất lớn Tuy nhiên trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra những biến dị soma Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào

mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh

- Nguyên nhân gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ chủ yếu là do những biến đổi trong vật chất di truyền như đứt gãy, chuyển đoạn ADN hoặt đảo đoạn Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là:

+ Kiểu di truyền (genotype): Tần số biến dị ảnh hưởng bởi genotype của các loài cây trồng khác nhau Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biến dị

+ Số lần cấy chuyển: số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng cao Theo Amstrong và Phillips (1988): khi nuôi cấy lâu dài thường gây biến dị nhiễm sắc thể

+ Loại mô: Nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh in vitro ít bị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác

2 Sự nhiễm mẫu.

Các VSV như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mấu đưa vào nuôi

cấy Tuy nhiên một sô loại vi khuẩn như: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium,

Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây

tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1- 2 tuần nuôi cấy) Để khắc phục hiện tượng trên cần:

+ Trước hết cần phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn

+ Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng đến kiểu di truyền

do đó rất cẩn trọng khi sử dụng kháng sinh Chất kháng sinh thường gây ra bới những hủy hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất

3 Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy:

Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hóa nâu hay đen thẫm, mẫu này có thể khuếch tán trong môi trường Hiện tượng này là do mẫu cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol Thí dụ các chất phenol eucomicacid và tyramine đã làm hóa nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy

Các phương pháp loại trừ sự hóa nâu:

+ Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1 – 0,3%): phương pháp này đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác

+ Bổ sung Polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫu một số cây ăn quả (táo, hồng)

+ Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng

+ Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy

+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1 – 2 tuần).+ Cấy chuyển mẫu liên tục (1 – 2 ngày/ lần) sang môi trường tươ trong 1 – 2 tuần

4 Hiện tượng thủy tinh hóa

- Cây bị “thủy tinh hóa” – thân lá mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh.

- Thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp Đặc biệt thường xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền

và hoa cúc

- Cây bị thủy tinh hóa thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tửphân cực nên dễ hấp thụ nước Cây in vitro thường có mật độ khí khổng cao, khí khổng

có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi cấy

- Để tránh hiện tượng thủy tinh hóa có thể tiến hành 1 số giải pháp sau:

+ Giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy vàdùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổnghợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi

+ Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường

+ Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy

+ Xử lý axit absixic hoặc 1 số chất ức chế sinh trưởng

+ Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng

+ Chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị thủytinh thể

+Giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt + Tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

Câu 14 Các công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng (quang tự dưỡng, bioreactor) và khả năng ứng dụng của chúng?

Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng

 Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng

Nghiên cứu tập trung vào vấn đề nuôi cấy mô trên môi trường không có đường nhưngđược điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2

VD: Phòng công nghệ tế bào viện sinh học nhiệt đới đã tiến hành nuôi cấy môquang tự dưỡng thành công theo 2 phương pháp:

1 Trao đổi khí tự nhiên (khí trao đổi bằng cách khuếch tán qua màng millipore hoặc nútgiấy): cây hồng, dâu tây

2.Bơm khí trực tiếp (khí được bơm trực tiếp vào hộp nuôi cấy): tre tầm vông, nho khônghạt

• Ưu điểm:

- Tốc độ sinh trưởng, chất lượng và tỉ lệ sống của mô thực vật được nâng cao ở tất

cả các bước trong điều kiện tự dưỡng

- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do không sử dụng đường trong môitrường

- Tỉ lệ đột biến có thể được giảm vì cây được nuôi trong điều kiện môi trườnggiống tự nhiên

- Tự động hóa do đó giảm chi phí lao động

• Nhược điểm:

- Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2)

- Chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể

 Bioreactor

• Bioreactor là một hệ lên men hay nồi phản ứng sinh học.

• Là thiết bị mà trong đó sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi các tế bào sốnghoặc các thành phần tế bào invivo Thường dùng để lên men liên tục, bán liên tụchay gján đoạn

• Có thể dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối

• Cũng có thể dùng trong nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống cây

• Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhângiống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp

• Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bịbioreactor hoàn toàn tự động hóa

VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1l dịch huyền phù nếu như dungdịch đó được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần

Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loạibioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh

• Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt làkhâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy

• Ứng dụng:

- Tạo chồi: chuối, dứa, hoa lan

- Tạo củ invitro: khoai tây, lily

- Tạo phôi soma: cà phê, cao su

VD: Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Hàn Quốc

Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo

Các bioreactor ứng dụng trong công nghiệp

SC Bioreactor™, Pg166 bioreactor, cây gỗ nghiến, xoan, nuôi cấy vô tính dứa

Câu 15: Vì sao có thể tạo cây sạch virus bằng nuôi cấy meristem của cây bị nhiễm virus.

Như ta đã biết virus sống kí sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống Tuy nhiênnhững nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đãcho thấy những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn TheMathews, Wang et al Hu đã đưa ra giả thuyết về sự không tồn tại của virus ở meristem óthể do một số nguyên nhân sau:

- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống dẫn, tuy nhiên hệ thống này không cótrong mô phân sinh đỉnh

- Trong sự phân chia, các tế bào phân sinh đỉnh không cho phép sao chép cácthông tin di truyền của virus

- Hệ thống vô hiệu hoá ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây

- Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình saochép thông tin của virus

Chính vì khả năng này, khi tách lấy đỉnh sinh trưởng để đưa vào nuôi cấy, người

ta có thể hạn chế tối đa việc nhiễm virus của các tế bào nuôi cấy Bên cạnh đó, hiện nayviệc nuôi cấy meristem còn được kết hợp với xử lý nhiệt độ hay xử lý hóa chất Điều nàycàng làm tăng độ sạch cho các mô đỉnh sinh trưởng, làm cho tỉ lệ tạo ra các cây sạch bệnhtrở nên rất cao

Câu 16 Trình bày các kỹ thuật tạo cây sạch virus in vitro

Trong nuôi cấy mô có hai cách để chọn giống sạch bệnh virus:

 Cách 1: Dùng các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh trước khi đưa vào nuôi cấy, sử dụng nhân nhanh in vitro để nhân nhanh các mẫu sạch

 Cách 2: Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, sau khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục sửdụng biện pháp nhân nhanh invitro để nhân mẫu sạch

1 Dùng các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus( cách 1)

Các phương pháp chẩn đoán bệnh virus

• Chẩn đoán bằng mắt

• Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử

• Chẩn đoán bằng cây chỉ thị

• Phương pháp huyết thanh

• Phương pháp kính hiển vi điện tử

• Phương pháp ELISA

• Phương pháp phân tích DNA

1.1 Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt

Đây là các phương pháp chẩn đoán dựa trên các triệu chứng bệnh của cây

- Ưu điểm: Đơn giản, ít tốn kém

- Nhược điểm:

+ Phải có kinh nghiệm không dễ lẫn với các triệu chứng khác không phải là bệnh

+ Phương pháp này gặp khó khăn khi cây bị nhiễm tổ hợp virus

+ Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm của giống

- Ưu điểm: Nhạy và chính xác có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp

- Nhược điểm:

• Thời gian chẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh

• Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm

• Phương pháp lây nhiễm phức tạp

• Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh, chi phí đầu tư cao

• Một số bệnh virus không tiến hành được

1.3 Chuẩn đoán bằng kính hiển vi

Kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng loạt

- Ưu điểm: + Chính xác, tin cậy

+ Đơn giản, nhanh chóng

- Nhược điểm: + Chi phí cao số lượng mẫu hạn chế

+ Loại virus được chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi Nếu

virus tồn tại dạng cầu thì rất khó phát hiện vì nó khá giống các cơ quan tử của

tế bào thực vật bình thường

1.4 Phương pháp huyết thanh

- Ưu điểm : + Tính đặc hiệu cao xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng

Kết quả thu được chậm nhất là sau 48 giờ

+ Chi phí cho xét nghiệm thấp

+ Độ chính xác cao

- Nhược điểm:

+ Chưa sản xuất được kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết thanh

rồi cũng chưa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm

+ Không thể xác minh được đặc tính gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật chủ

Có nhiều phương pháp huyết thanh khác nhau đã được ứng dụng phương pháp kếttủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex,xét nghiệm miễn dịch hướng tâm

1.5 Phương pháp ELISA ( Enzymed linked immuno sorbent assay)

Nguyên lý chung:

Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhưng ở đây kháng thể được liên kết với một enzyme (enzymed linked) Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận biết màu do chính enzyme đó xúc tác

- Enzym thông dụng là phosphataza kiềm

- Cơ chất của phản ứng là 4- nitrophenylphophat Khi bị tách phosphat sẽ thành α-nitro phenol có màu vàng

- Ưu điểm:

+ Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu được khuếch đại rất rõ.+ Có thể định tính, định lượng

1.6 Phương pháp phân tích ADN

- Xác định trực tiếp sự có mặt lõi ARN (hoặc ADN) của virus

- Phương pháp này cho kết quả chính xác nhưng đắt tiền, yêu câu phải có trình độ kĩ thuậtcao

- Sơ đồ nguyên lý:

Chiết tách ARN virus  cDNA  Phản ứng lai với ARN virus Nhận biết khi cDNAgắn phản xạ hoặc enzyme

2 Dùng kĩ thuật làm sạch virus bằng nuôi cấy meristem(cách 2)

Các kĩ thuật làm sạch virus in vitro

• Nuôi cấy meristem

• Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt

• Nuối cấy meristem kết hợp xử lý hóa chất

• Vi ghép

Nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng meristem

Virus sống ký sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống, tuy nhiên những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đã cho thấy những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn

2.1 Nuôi cấy meristem

Tách chính xác meristem có kích thước nhỏ hơn 0,3 mm, nuôi cấy chúng trên môi trườngdinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khác nhau để thu nhận được cây sạch bệnh virus

2.2 Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt

- Cơ sở: Ở nhiệt độ cao 36 – 370C thì một số loài virus không có khả năng nhân lên

- Ưu điểm: Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5 – 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0,3 – 0,5mm

2.3 Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý hóa chất

- Có thể nuôi cấy meristem với kích thước lớn (0,5 – 1 mm) kết hợp với việc bổ sung vàomôi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo môi trường sạch bệnh

- Chất kháng virus như: 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus

- Phương pháp này có hiệu quả cao trong việc tạo cây sạch bệnh ở thuốc lá, khoai tây, loakèn

Câu 18 Cây đơn bội và ý nghĩa của nó trong nghiên cứu di truyền và công tác giống cây trồng

1 Khái niệm chung về thể đơn bội

- Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác nguồn

mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng NST của loài khởi đầu, trong mỗi cặp NST tương đồng nó chỉ có một NST(n)

- Các cách hình thành thể đơn bội:

+ Trinh sinh (gynogensis) và sinh sản đơn tính đực (androgensis)

+ Loại trừ nhiễm sắc thể và giảm nhiễm sắc thể soma

+ Nuôi cấy thể đơn bội in vitro

- Một số đặc điểm của thể đơn bội

+ Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội Nếu chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n)

+ Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen Vì vậy thể đơn bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng

2 Ý nghĩa của cây đơn bội trong nghiên cứu di truyền và công tác giống cây trồng

- Khó khăn của việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục

+ Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian

+ Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra được dòng thuần chủng Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở

Hyacinthus Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và

chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội

- Một số ưu điểm của đơn bội thể là: Sử dụng đơn bội thể có thể rút ngắn nhanh quá trình đồng hợp tử hóa bằng cách chuyển từ đơn bội sang đơn bội kép Cây đơn bội biểu hiện tất cả thông tin di truyền ra kiểu hình, dễ dàng nhận biết các alen ẩn, khả năng kháng các điều kiện bất lợi có thể nhận biết và chọn lọc

- Khả năng ứng dụng của cây đơn bội.

+ Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen

+ Tạo đột biến ở mức đơn bội

+ Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng

+ Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh

Câu 19: Trình bày nguyên lý, cách tiến hành, những nhân tố ảnh hưởng của các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro ( nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, noãn chưa thụ tinh) Nêu ví

dụ cụ thể để minh họa cho các phương pháp trên?

I Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn

1 Nguyên lý:

Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực, người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểubào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡngnhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội

Các phương thức sinh sản đơn tính đực in vitro:

+ Sinh sản đơn tính đực trực tiếp: Ví dụ : thuốc lá, cà độc dược

Hạt phấn đơn nhân Phôi in vitro Cây in vitro

+ Sinh sản đơn tính đực gián tiếp: Ví dụ: ở lúa, ngô…

Hạt phấn đơn nhân mô sẹo in vitro Chồi in vitroCây in vitro

+ Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tínhđực gián tiếp nhưng sự hình thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết Ví dụ ở cây cà chua

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bao phấn, hạt phấn

2.1 Kiểu gen

- Kiểu gen dóng vai trò chính quyết định sự thành công hay thất bại của thí ngiệm

- Sản xuấy cây đơn bội bằng con đường nuôi cấy hạt phấn k;à rất hạn chế và không áp dụngđược cho 1 số loài Ngoài ra, trong cùng 1 loài khả năng sản sinh cây đơn bội là cũng khácnhau thí dụ 1 số dòng ngô (Zea mays L.) là hoàn toàn không có khả năng nuôi cấy hạt phấntrong khi 1 số ít các cây đơn bội có thể thu được từ 1 số dòng khác

- Do tác dụng của kiểu gen, việc sử dụng càng nhiều sự đa dạng về di truyền sẽ càng tốt khitriển khai các quy trình để sản xuất cây đơn bội thông qua nuôi cấy hạt phấn

2.2 Tình trạng của cây mẹ

- Tuổi và sinh lý của cây mẹ ảnh hưởng đến kết quả của việc nuôi cấy hạt phấn

- Với hầu hết các loài, lượt thoa sản sinh đầu tiên thường cho kết quả tốt nhất Như 1 nguyêntắc chung, các hạt phấn cần được nuôi cáy từ nụ thu từ các lứa càng sớm càng tốt

- Các yếu tố môi trường khác nhau mà các cây mẹ đang trải qua cuãng có thể sẽ ảnh hưởngđến sự tạo cây đơn bội Cường độ ánh sáng, quang chu kì, và nhiệt độ đã được nghien cứu vàkết luận là có ảnh hưởng đến số lượng cây tái sinh từ nuôi cấy hạt phấn Các điều kiện sinhtrưởng đặc trưng là khác nhau tùy vào các loài khác nhau Nói chung, các kết quả tốt nhấtthường thu được từ các cây mẹ khỏe mạnh sinh trưởng tốt.

- Giai đoạn phát triển hạt phấn:

+ Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sản xuất cây đơn bội từ hạt phấn là giaiđoạn phát triển của hạt phấn

+ Đối với rất nhiều loài, hạt phấn trong giai đoạn đơn nhân cho phản ứng tạo cây đơnbội tốt nhất

+ Ngược lại, ở thuốc lá, phản ứng thích hợp cjir thu được khi nuôi cấy hạt phấn ở giaiđoạn ngay trước, trong và ngay sau khi quá trình phân bòa đầu tiên 9 giai đoạn tiểu bào tửchuyển từ trạng thái đơn nhân sang hai nhân)

2.3 Xử lý trước khi nuôi cấy

- Xử lý nhiệt độ cho các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tác bao phấn để cấy sẽ kíchthích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây đơn bội Đối với bất kì 1 loài, có thể có các tổhợp thích hợp giữa nhiệt độ và thời gian xử lý Thông thường nhiệt độ thấp yêu cầu thời gian

xử lý ngắn hơn và ngược lại Ví dụ:

+ Năng suất cây thuốc lá đơn bội thường tăng lên bằng việc xử lý nụ ở 7 – 80C trong

12 ngày hay ở 2 – 5 0C trong 2 – 3 ngày trước khi tách và nuôi cấy hạt phấn Đối với các loàikhác, nhiệt độ từ 4 – 10 0C trong 3 ngày đến 3 tuần đã đượ sử dụng

+ Nhiệt độ cao trước khi nuôi cấy có hiệu qủa cao ở một số loài, ví dụ sản xuất câyđơn bội đã tăng lên ở nho khi nuôi cấy hạt phấn ở nhiệt độ 35 0C từ 1 – 3 ngày trước khi nuôicấy ở 25 0C

2.4 Môi trường nuôi cấy

- Cây đơn bội có thể được cảm ứng tạo ra trên môi trường đơn giản như là môi trường Nitsch

và Nitsch (1969) cho thuốc lá và một số loài khác

- Với hầu hết các loài, môi trường phổ biến nhất dùng cho nuôi cấy hạt phấn là MS và N6 haycác dạng biến đổi từ 2 môi trường này

- Các hỗn hợp chất tự nhiên như: dịch nhiết khoai tây, nước dừa… tỏ ra có tác dụng tốt trongquá trình nuôi cấy bao phấn

- Nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng trong nuôi cấy bao phấn

- Hàm lượng dường cao giúp làm tăng tings thẩm thấu hơn là nhu cầu dinh dưỡng (áp suấtthẩm thấu trong môi trường bao phấn thường khá cao Các đường khác như ribose, maltose,

và glucose tỏ ra là tốt hơn so với saccarose ở 1 số loài

- Bô sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường: đa số yêu cầu bổ sung 1 lượng nhỏ cácauin Xytokinin đôi khi cũng cần thiết và được sử dụng kết hợp với auxin đặc biệt cho các loài

mà tạo calus là giai đoạn trung gian trong quá trình sản xuất cây đơn bội

- Agar có thể chứa các hợp chất ức chế đến quá trình sinh sản vô tính đực ở 1 số loài agarose

đã được xem là yếu tố làm đông môi trường ưu việt hơn

3 Cách tiến hành

*Nuôi cấy bao phấn:

Quy trình chung tạo cây đơn bội từ bao phấn:

- Chọn bao phấn: tốt nhất là chọn bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào nguyênnhiễm lần 1 Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn

- Xử lý nụ hoa: Xử lý lạnh sẽ kích thích nhân dinh dưỡng phân chia Chế độ xử lý nhiệt độ

phụ thuộc vào loại cây Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10 0C trong 2 – 3 tuần, lúa Indica xử lý ở 7

0C trong 1 tuần, ngô xử lý ở 4 0C trong 1 tuần…

- Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy khác nhau mà sử dụngmôi trường tương ứng Tuy nhiên có một số quy luật chung:

+ Các cây hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D ở nồng độ cao để khơi động sựphân chia đầu tiên

+ Hàm lượng đường cao

+ Bổ sung các hỗn hợp chất tự nhiên: nước dừa, pepton…

* Nuôi cấy hạt phấn

- Kỹ thuật tách rời tiểu bào tử:

+ Các bao phấn vô trùng được nghiền hoặc ép trong môi trường lỏng để giải phónghạt phấn ra ngoài bao phấn Tách hạt phấn ra khỏi bã túi phấn bằng cách rót dung dịch trênqua lưới lọc có kích thước phù hợp

+ Dung dịch sau lọc được li tâm 800 – 1000 rpm trong 3 – 5 phút để tách và làm sạchhạt phấn Thành phần nhẹ nổi lên trên được gạn đi trong khi hạt phấn lắng dưới đáy được rửasạch bằng môi trường mới và được ly tâm thêm 2 lần nữa để loại bỏ các chất ức chế trong túiphấn

+ Tạo huyền phù hạt phấn với mật độ 10 4 – 10 5 tế bào/ml

- Một số chú ý khi nuôi cấy hạt phấn:

+ Các hạt phấn nuôi cấy tách rời thường phát sinh phôi trực tiếp

+ Để kích thích sự phát sinh phôi thường sử dụng phương pháp nuôi “ trợ dưỡng”:nuôi kèm với bao phấn hay loại mô khác của cây mẹ

+ Môi trường nuôi cấy hạt phấn cần bổ sung các axit amin (glutamin, serin…) vớinồng độ cao (100 – 1000 ppm) và có trường hợp không cần dùng chất điều tiết sinh trưởng(thuốc lá, cải dầu,…)

* Tồn tại trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn:

+ Việc tạo cây đơn bội theo con đường nuôi cấy bao phấn và hạt phấn thường có tỷ lệbạch tạng cao Do sự mất cân bằng giữa di truyền nhân và di truyền bào chất nên ở cây bạchtạng thể tiền lạp không có ribosom nên không thể chuyển thành lục lạp

+ Chưa loại trừ một số cây nhị bội tái sinh từ vỏ bao phấn

+ Hiện tượng không ổn định về mặt di truyền ở cây tái sinh

II Tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh

1 Nguyên lý

- Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái haytrinh nữ sinh Cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh được hình thành do kích thích tế bàotrứng hay các tế bào cực, tế bào đối cực, tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh tạo thểđơn bội

- Những năm 70 các nhà nghiên cứu đã tập trung giải quyết vấn đề tạo cây đơn bội bằng nuôicấy noãn chưa thụ tinh và đã thu được 1 số thành tựu trên các đối tượng: hành, củ cải đường,hướng dương, ngô…

2 Một số nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

- Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách noãn rấtkhó khăn và dễ gây tổ thương

+ Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này, người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố nhưkiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôicấy…

- Kiểu gen của cây mẹ: là 1 trong nhân tố quan trọng nhất đối với sự cảm ứng tạo cây đơn bộitừ noãn chưa thụ tinh.

+ Ảnh hưởng của sự sai khác kiểu gen đến kết quả nuôi cấy đã được nghiên cứu trênnhiều đối tượng khác nhau: lúa, hoa đồng tiền, láu mì, củ cải đường…

+ Người ta nhận thấy mỗi 1 kiểu gen khác nhau có phản ứng khác nhau trong sinh sảnđơn tính cái in vitro nên cần phải xác định quy trình tối ưu riêng cho từng kiểu gen

- Giai đoạn phát triển của noãn: giai đoạn phát triển của noãn khi đưa nuôi cấy có ý nghĩa đặcbiệt đối với việc tạo thể đơn bội

+ Nhiều tác giả xác nhận rằng giai đoạn túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp chohiệu quả cao trong nuôi cấy noãn

+ Tuy nhiên, việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử rất phức tạp vì túi phôinằm sâu trong bầu quả Do khó có thể quan sát trực tiếp, để xác định giai đoạn phát triển củanoãn thường phải sử dụng các phương pháp tế bào học: tách túi phôi, nhuộm màu lát cắtmỏng…

- Môi trường nuôi cấy:

+ Các môi trường nuôi cấy như: MS,B5,MF…thường sử dụng trong nuôi cấy noãnchưa thụ tinh

+ Dạng môi trường chủ yếu là môi trường đặc

+ Để cảm ứng được sự trịnh sinh cần thiết phải bổ sung vào môi trường các chất điềutiết sinh trưởng thực vật

+ Nồng độ đường của môi trường nuôi cấy là 1 yếu tố phải quan tâm Nồng độ đườnggiao động tùy thuộc đối tượng nuôi cấy, ví dụ: đối với lúa nồng độ đường thường phù hợp là3-6%, đối với cây hành là 10%

+ Trong nhiều trường hợp, việc bổ sung nước dừa vào môi trường lam tăng khả năngtạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây

- Điều kiện nuôi cấy

+ Quá trình nuôi cấy thường duy trì ở nhiệt độ ổn định: 25-280C

+Đối với đa số loài, thường giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy( tạo callus) tiến hànhtrong điều kiện tối, giai đoạn tái sinh cây tiếp theo sau yêu cầu chiếu sáng: 2000-3000lux

- Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng con đường trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau Đốivới hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ỏ lúa 1,5- 12 %; ở dâu tằm 3-6%

- Một lợi thế của con đường này là các cây tái sinh rát ít bị bạch tạng Ngay cả với các loài hòathảo, hầu như các cây tái sinh khi nuôi cấy noãn chưa thụ tinh đều là cây xanh Trong khi trêncác đối tượng này các cây tái sinh từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn có tỷ lệ cây bạch tạngchiếm tới 60-90%

- Bằng phương pháp này đã tạo được trực tiếp các hạt ngô đơn bội in vitro với tỉ lệ 4-5%

- Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn giản vàthu được nhiều thành công hơn cả Phương pháp nuôi cấy cùng 1 lúc nhiều noãn chưa thụ tinhtrên 1 phần lõi bắp ngô đã được thực hiện thành công ở Trung Quốc và Việt Nam

Ví dụ: Viện di truyền nông nghiệp đã thành công trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh của câyngô theo 2 phương pháp: tái sinh cây từ noãn chưa thụ tinh tách rời và tái sinh cây từ noãnchưa thụ tinh trên mô nuôi

Câu 20: Tế bào trần là gì? Khả năng ứng dụng của tế bào trần trong công tác chọn giống cây trồng ? cho ví dụ cụ thể để làm rõ các ứng dụng đã nêu

Trả lời