Đề cương nuôi cấy mô tế bào thực vật

CôngBùi w3tricong053w@gmail.com Câu 1: Thế nuôi cấy mô tế bào thực vật? Tại mô chuyên hóa thực vật nuôi cấy invitro lại tái sinh thành hoàn chỉnh?  Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật , môi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm hàng loạt kĩ thuật khác có khả ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực VD: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ứng dụng tạo nhân nhanh dòng đồng di truyền, làm virus  Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ phân hóa mang toàn lượng thông tin di truyền cần thiết đủ thể sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Vì mô chuyên hóa thực vật đưa vào môi trường nuôi cấy thích hợp chúng thể tính toàn phát triển thành thể hoàn chỉnh Nói cách rõ rang mô chuyên hóa đưa vào môi trường nuôi cấy phù hợp chúng khôi phục khả phân chia, chuyển thành tế bào phân sinh hình thành mô sẹo Trong phận tế bào hình thành tế bào cảm ứng hình thái, Chúng cảm ứng tín hiệu kích thích phân tử xác định đường hướng sinh trưởng phát triển tế bào, tế bào dơn cực phát triển thành rễ, tế bào lưỡng cực phát triển thành nhóm tế bào phôi, hình thành tế bào phôi soma Câu 2: Sự biểu hiện tính toàn tế bào thực vật nuôi cấy invitro diễn nào? • Khái niệm tính toàn tế bào thực vật: • Haberlandt (1902) lần quan niệm rằng tế bào bất kỳ thể sinh vật đa bào có khả tiền tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại tế bào riêng rẽ phân hóa mang toàn lượng thông tin di truyền cần thiết đầy đủ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Đó tính toàn tế bào • Sự biểu tính toàn tế bào nuôi cấy invitro • Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu tế bào mô thực vật nuôi cấy phân hóa thành hoàn chỉnh gọi biểu tính toàn tế bào thực vật Khả biểu tính toàn tế bào, mô thể khác Tính toàn tế bào nuôi cấy invitro biểu qua ba giai đoạn: • • • CôngBùi w3tricong053w@gmail.com • Tế bào phản phân hóa với phát sinh tế bào khả biến • • Sự định hướng phân hóa tế bào (hoặc tác dụng định tế bào) Sự phát sinh hình thái phát triển quan Sự phản phân hóa tế bào hình thành tế bào khả biến • • Sự phản phân hóa tế bào trình mà tế bào phân hóa điều kiện định, khôi phục khả phân chia, chuyển thành tế bào phân sinh hình thành mô sẹo Trong đó, có phận hình thành tế bào cảm ứng phát sinh hình thái, tức tế bào cảm thụ tín hiệu kích thích phân tử, từ xác định đường hướng sinh trưởng phát triển tế bào • Chu kỳ tế bào với phản phân hóa: tế bào trưởng thành phản phân hóa thành tế bào mô phân sinh, bước vào chu kỳ tế bào thời kỳ G1 thời kỳ G2 Điều định khả phân hóa trạng thái sinh lý ban đầu • Điều kiện đặc trưng phản phân hóa tế bào • Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới phân hóa tế bào mô tách rời, nhân tố chủ yếu chất điều tiết sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin cytokinin Tế bào mô thực vật khác điều kiện phản phânhóa chúng không giống Trong trình phản phânhóa tế bào thực vật, cách phân bào, biểu gen chuyển hóa vật chất tế bào có đặc trưng rõ rệt: hòa nhập hạch nhân nhân, dung giải màng nhân, phân bào có tơ tạo tế bào đa nhân, biểu kiểu gen đặc trưng • • Tế bào cảm biến: • Tế bào cảm biến trạng thái tế bào hình thành sau giai đoạn nuôi cấy khởi động có khả cảm thụ tác nhân kích thích để phát sinh hình thái Thời gian điều kiện mà tế bào thực vật biến đổi mặt hình thái để tạo thành tế bào cảm biến có sai khác tương đối lớn: có trước tế bào diễn phản phân hóa cũng sau thời kỳ tế bào phản phân hóa Tế bào cảm biến có đặc trưng cấu trúc biểu gen ví dụ tế bào huyền phù cà rốt Ví dụ: kiểu gen mía có xuất 63 loại protein chuyên phản phân hóa, có 33 loại protein xuất tất kiểu gen, protein chuyên phản phân hóa có loại đặc hiệu cho phát sinh hình thái cảm ứng tạo mô sẹo có protein chức • • • CôngBùi w3tricong053w@gmail.com • Phát cảm thụ hình thái phôi tế bào thực vật với gen enzyme thụ thể phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis receptor kinase - SERK) có quan hệ với nhau, biểu coi dấu hiệu tế bào thể phôi Trong cà rốt, SERK có tế bào thể phôi biểu thời kỳ đầu phát triển tế bào thể phôi, sau thời gian phôi hình cầu ngừng biểu Tác dụng định tế bào thực vật • • • • • • • • • • Sự “quyết định” (determination) tế bào định hướng phân hóa trình tự phát triển tế bào: Trong trình nuôi cấy mô, định biểu mặt: Sự định hướng sẵn có tế bào mẫu cấy Cảm ứng định hướng tế bào nuôi cấy Đặc trưng tế bào định Biến đổi trình trao đổi chất Biến đổi hình thái cấu trúc tế bào, đặc biệt màng tế bào Các tế bào khác có thời gian hoàn thành tác dụng định không giống Ví dụ: biến đổi tế bào mô sơn trà hình thành phôi soma Tín hiệu phân tử định tế bào • Sự định tế bào kết tác dụng tín hiệu phân tử giữa tế bào với tế bào • Trong cá thể thực vật hoàn chỉnh, sinh trưởng phát triển tế bào, mô quan bị điều tiết tín hiệu phân tử tế bào, mô quan khác bên cạnh để trì sinh trưởng phát triển bình thường Trong điều kiện nuôi cấy invitro, tế bào cũng biểu điều tiết tín hiệu phân tử tác dụng truyền tin Có nhiều nghiên cứu chứng minh nêu Ví dụ: • • • • Tế bào biểu bì thuốc nuôi cấy đơn độc mẫu cấy trương to, không phân hóa quan, đưa tế bào biểu bì vị trí cũ đoạn thân bị kích thích để hình thành chồi Đã phát vai trò phân tử tín hiệu định phát sinh phôi arabinogalactan protein (AGP) chito-oligosaccharide màng tế bào cà rốt, cải dầu, sam vân (thông Nauy)… Sự phân hóa tế bào mô • Tế bào trải qua cảm ứng định, điều kiện định phân hóa thành mô, quan khác nhau, trình gọi tái phân hóa Sự phân hóa tế bào mô bước thứ phát sinh quan phôi CôngBùi w3tricong053w@gmail.com • • Nghiên cứu phân hóa mạch dẫn cọi mô hình nghiên cứu phân hóa tế bào nuôi cấy mô thực vật Sự phân hóa mô sở phát sinh hình thái, khác biệt trình phát sinh hình thái thể phân cực tế bào Câu 4: Sự suy thoái tính toàn tế bào thực vật nuôi cấy invitro Trong thời gian nuôi cấy dài,sự tăng lên số lần cấy chuyển, tiềm phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy thực vật giảm bị mất, chí phân chia sinh trưởng tế bào giảm dần đến chỗ ngừng hẳn Có số giả thuyết nguyên nhân suy thoái • Giả thuyết di truyền: thay đổi độ bội tế bào mẫu nuôi cấy, xuất thể không chỉnh bội, cấu trúc nhiễm sắc thể biến đổi đột biến gen … dẫn đến suy thoái tiềm phát sinh hình thái • Giả thuyết sinh lý : cho rằng biến đổi mức độ cân bằng chất kích thích sinh trưởng nội sinh nhân tố suy thoái tiềm phát sinh hình thái • Giả thuyết cạnh tranh: mô sẹo tế bào nuôi cấy, có luân phiên sinh trưởng loại tế bào khác Qua trình nuôi cấy lâu dài, tế bào tiềm phát sinh chiếm ưu Câu 6: Ảnh hưởng nhân tố vật lý(ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ khí CO2) đến trình nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro? Ảnh hưởng nhân tố vật lý(ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ khí CO2) đến trình nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro:  Ánh sáng: • Quá trình nuôi cấy mô TB diễn ánh sáng nhân tạo buồng nuôi có nhiệt độ kiểm soát • Nguồn ánh sử dụng đèn huỳnh quang Thông thường giá đặt bình nuôi cấy, khoảng cách từ đèn chiếu sáng đến nắp bình nuôi cấy 45 – 50 cm, đảm bảo khuyếch tán AS khắp • AS bình bình khác nhiều phân bổ AS bình phụ thuộc vào diện tích nắp bình, loại bình xếp bình giá đặt bình nuôi • Thông thường cường độ ánh sáng bình nuôi thấp 10 lần so với AS tự nhiên ban ngày, giao động tỏng khoảng 40-140 mmol/m2/s ( tương đương 3000-10000 lux) Việc sử dụng cường độ chiếu sáng thấp nuôi cấy in vitro nhằm tiết kiệm chi phí lượng, giảm hiệu ứng nhà kính mẫu chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng • Tỷ lệ quang tử vùng AS màu đỏ /gần đỏ xanh/đỏ ảnh hưởng đến phát sinh hình thái Sự phát sinh hình thái xảy AS có bước sóng thuộc vùng AS màu xanh (400-460nm),đỏ (620 – 680nm), gần màu đỏ (700 – 800 nm) gần màu tím(300 – nm) • Quang chu kỳ buồng nuôi thường trì chế độ 16h chiếu sáng/ngày  Nhiệt độ CôngBùi w3tricong053w@gmail.com • Nhiệt độ bình nuôi thường cao nhiệt độ bình vài độ phần đáy bình thường ấm so với phần nắp bình • Nhiệt độ trung bình buồng nuôi cho nhiều loại thường 250C (giao động từ 17 – 300C) nhiệt đới cần nhiệt độ tủng bình buồng nuôi mức cao hơn: 27,70 C (24 – 32) • Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày (khi chiếu sáng) ban đêm ( không chiếu sáng) thường trì từ – 0C , ví dụ : nhiệt độ ban ngày 25, ban đêm 20, hay 28 24…sự chênh lệch nhiệt độ hỗ trợ trao đổi khí bình nuôi cải thiện sinh trưởng nuôi cấy • Với loại khác có khoảng nhiệt độ thích hợp riêng, VD: khoai tây s.tr nhanh t0 ngày/đêm 22/18, nhiệt độ ngày/đêm 27/22 s.tr chậm hẳn • Tốc độ s.tr mẫu cấy thường giảm dần nhiệt độ buồng nuôi thấp nhiệt độ tối thích giảm xuồng nhanh t0 buồng nuôi cao nhiệt độ tối thích  Nồng độ khí CO2 • Nồng độ CO2 bình nuôi cáy có diệp lục thường giảm thấp điểm bù CO2 (50 – 100 mmol/mol) hầu hết chế độ quang chu kỳ • Nồng độ CO2 gia tăng giai đoạn tối (510mmol/mol) giảm sau thời gian chiếu sáng (100 mmol/mol) vài giờ, đưa lại vào tối nồng độ CO2 lại gia tăng trở lại Ngay trường hợp thay nắp đậy cso khả trao đổi khí, nồng độ CO2 giảm xuống 100 – 200 mmol/mol thời gian có chiếu sáng in vitro sống dị dưỡng ( Kozai & Sekimoto, 1988) Câu 7: Thế phát sinh hình thái tế bào? Sự phát sinh hình thái (morphogenesis) xuất cấu trúc quan theo hướng định tế bào, mô nuôi cấy Bao gồm phát sinh quan (organogeneis) phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis) Sự phát sinh hình thái tiến hành theo:  Phương pháp trực tiếp: trình phản phân hóa, tái phân hóa tế bào mẫu nuôi cấy không xuất mô sẹo (callus) cách rõ rệt, mà trực tiếp tái sinh thành  Phương thức gián tiếp: tế bào mẫu nuôi cấy phải trải qua cảm ứng tạo mô sẹo, sau tái sinh Ví dụ tạo đơn bội  Sự phát sinh phôi soma: Những tế bào phôi hợp tử biểu gen cần thiết cho chương trình phát triển phôi Giai đoạn trước hình thành tế bào phôi soma gọi tế bào tiền phôi Tế bào tiền phôi phân chia để hệ thống tế bào phôi trực tiếp gọi phát sinh tế bào phôi trực tiếp Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích sinh trưởng, có nhiều tế bào cần Auxin để tiến hành phân bào trước phát sinh tế bào phôi Có nhiều tế bào hình thành phôi từ mô sẹo, trường hợp có phát sinh phôi soma tiến hành gián tiếp Hai danh từ tế bào tiền phôi PEDC ( Preembryogenic determined cell) tế bào phát sinh phôi IEDC ( induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô, thực CôngBùi w3tricong053w@gmail.com chất trình tiếp nối nhau, kết thúc phát triển hệ thống những tế bào phôi (EC- Embryogenic cell) Những tế bào những mô có quan hệ với sinh sản hạt phấn, chồi mầm có khả hệ thống tế bào phôi dễ dàng những tế bào những mô trưởng thành Khi mô có chứa tế bào phôi, kích thích phân chia tế bào giai đoạn cần thiết để trì tình trạng phôi hình thành tế bào phôi soma Tế bào sinh phôi hệ thống những tế bào bình thường nuôi cấy môi trường có auxin cytokinin Lượng cytokinin có tế bào cao thường phát sinh phôi thấp Khi tế bào phôi thu nhận, có mặt auxin gây tổn hại đến pt bt phôi Những nhân tố khác ảnh hưởng đến pt phôi tỉ lệ đạm amonium nitrate môi trường pH thấp Hay lặp lặp lại chu kì phát sinh phôi bị phá vỡ giảm hay bỏ hẳn auxin khỏi môi trường Sự hình thành phôi thông qua đưòng PEDC IEDC Con đường PEDC đường phát sinh phôi không qua trình tạo mô sẹo IDEC đường thông qua trình tạo mô sẹo Có bước dẫn đến hệ thống phôi: Sự biệt hoá tế bào có khả phát sinh phôi phát triển những tế bào phôi hệ thống Như có môi trường cần thiết cho nuôi cấy phôi: Môi trường cần cho phát sinh tế bào phôi Môi trường cần cho phát triển những tế bào thành những tế bào có khả phát sinh phôi Bước cần có mặt auxin bước phải giảm thấp hay mặt auxin Có hai yếu tố quan trọng phát sinh phôi: Auxin nitrogen Phát sinh phôi soma kiểu mẫu tính toàn thế, khảo sát toàn tiến trình biệt hoá tế bào cũng chế thể tính toàn tế bào thực vật  Sự phát sinh quan: Là trình phát triển chồi, rễ bất định từ khối tế bào callus Quá trình xảy sau thời điểm mà mẫu vật đặt vào môi trường nuôi cấy bắt đầu cảm ứng tạo callus Câu 8: Các đường hướng phát sinh hình thái tế bào, mô thực vật nuôi cấy in vitro đặc trưng hình thái này? Trả lời: Sự phát sinh hình thái xuất cấu trúc quan theo hướng định tế bào, mô nuôi cấy Bao gồm phát sinh quan phát sinh phôi soma Có thể tiến hành theo + Phương thức trực tiếp: trình phản phân hóa, tái phân hóa tế bào mẫu nuôi cấy không xuất mô sẹo cách rõ rệt, mà trực tiếp tái sinh thành + Phương thức gián tiếp: tế bào mẫu nuôi cấy phải trải qua cảm ứng mô sẹo, sau tái sinh  Sự phát sinh quan: trình tế bào nuôi cấy cảm ứng điều kiện nuôi dưỡng thích hợp tạo quan chồi bất định rễ bất định… từ hình thành hoàn chỉnh CôngBùi w3tricong053w@gmail.com - Đặc trưng phát sinh quan Sự phát sinh hình thái tái sinh cây, tổng hợp gồm phương thức bản: + Trước hết hình thành rễ, rễ hình thành chồi, chẳng hạn nuôi cấy huyền phù tế bào cà + Trước hết hình thành chồi, sau hình thành rễ từ chồi, tái sinh đại đa số mô thực vật nuôi cấy + Trên mô sẹo sản sinh chồi rễ, cấu trúc liên tiếp thành trục thấp ví dụ cà rốt + Hình thành thể dinh dưỡng khác thân củ, thân vảy thân hình cầu, ví dụ: tạo củ lily, lay ơn, protocrom hoa lan + Hình thành chồi hoa phận quan sinh sản, nuôi cấy tế bào trụ phôi phong tế bào nuôi cấy phân hóa thành hạt phấn noãn… - Hai đường hướng phân hóa quan tế bào nuôi cấy: + Phân hóa gián tiếp: mẫu cấy trước hết hình thành cụm mô sẹo, từ mô sẹo phát sinh mô tương tự mô phân sinh, phân hóa hình thành trung tâm phân sinh Đặc điểm tế bào nhỏ, đường kính tương đương nhau, màng mỏng, nhân lớn, bắt màu đậm Từ trung tâm phân sinh sau hình thành quan chồi, rễ + Phân hóa trực tiếp: Không có giai đoạn tạo mô sẹo rõ rệt, từ mẫu cấy trực tiếp hình thành trung tâm phân sinh có nguồn gốc từ tế bào nhiều tế bào Các tế bào bắt đầu phân chia, hình thành nên – tế bào gần tạo thành trung tâm phân chia liên tục với tốc độ nhanh Tế bào xung quanh chúng cũng phân chia với tốc độ chậm Từ trung tâm phân sinh hình thành quan chồi, rễ  Sự phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi soma cảm ứng tế bào soma hình thành phôi hoàn chỉnh - Đặc trưng hình thành phôi soma + Sự hình thành phát triên phôi soma phôi hợp tử giống chỗ cần trải qua thời kỳ hình cầu, thời kỳ hình tim, thời kỳ kình ngư lôi thời kỳ hình thành mầm Phôi soma có cấu trúc hình thái tương tự phôi hợp tử Cuối nảy maannm thành + Nhưng phôi soma khác với phôi hợp tử là: phân hóa nội nhũ, phát triển cuống phôi bị ức chế bị tiêu biến, nói chung phôi soma trình khô phôi ngủ nghỉ + Có điểm sai khác rõ rệt giữa phát triển phôi soma Và phát triển chồi bất định: Thể phôi có phân hóa thành cực mầm rễ mầm chồi, chồi bất định có kết cấu đơn cực mầm chồi Các bó mạch thể phôi tách rời khỏi bó mạch mẫu nuôi cấy chồi bất định bó mạch liên kết với mô bó mạch mẫu nuôi cấy Tế bào phôi nảy mầm thành ống nghiệm, thông thường không cần giai đoạn cảm ứng sinh rễ, chồi bất định cần phải chuyển sang môi trường nuôi cấy cảm ứng rễ hình thành hoàn chỉnh - Con đường hình thành phôi soma + Phát sinh trực tiếp: thể phôi phát triển từ mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy biểu bì, chu bì, tiền phôi hợp tử, tế bào nuôi cấy huyền phù tế bào trần Ví dụ: Tế bào biểu bì trụ phôi hướng dương tế bào phôi tâm cam quýt… trực tiếp phát sinh phôi CôngBùi w3tricong053w@gmail.com Phương thức pháp sinh trực tiếp phôi soma tế bào mẫu nuôi cấy tồn tế bào tiền phát sinh phôi, nuôi cấy tế bào trực tiếp bước vào giai đoạn phát sinh phôi, hình thành thể phôi som + Phát sinh gián tiếp: thể phôi phát triển từ mô sẹo huyền phù tế bào Thông qua phản phân hóa đồng thời cảm ứng định hướng phát triển tạo tế bào định cảm ứng phát sinh phôi chúng phát triển hình thành phôi soma Câu 10: Nhân giống vô tính in vitro gì? Những ưu hạn chế kỹ thuật này? Trả lời: Nhân giống vô tính in vitro trình sản xuất lượng lớn hoàn chỉnh, từ phận, quan như: chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân, … mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro Ưu kỹ thuật này: + Phương pháp cho hệ số nhân cao cho cá thể tương đối đồng mặt di truyền + Có thể nhân giống trồng quy mô công nghiệp (kể những đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường) + Chủ động kế hoạch sản xuất đặc biệt giống + Tạo giống trồng bệnh: nấm, vi khuẩn, đặc biệt virus VD: khoai tây, dứa + Các nhân sau in vitro có xu hướng trẻ hóa  nâng cao hiệu nhân bằng phương pháp thong thường sau Nhược điểm kỹ thuật này: + Chi phí cao phương pháp nhân giống khác nên giá thành không cạnh tranh + Nhân giống in vitro áp dụng tất đối tượng, đặc biệt phương pháp vi nhân giống + Một số loại trồng rát dẽ bị biến dị nhân giống vô tính in vitro Câu 11 Nên ứng dụng kỹ thuật nhân nhanh nuôi cấy mô trường hợp nào? Vì sao? • Duy trì nhân nhanh kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống • Nhân nhanh loại hoa, cảnh khó trồng bằng hạt • Duy trì nhân nhanh dòng bố mẹ dòng lai để tạo hạt giống rau, hoa trồng khác • Nhân nhanh kết hợp với làm virus • Bảo quản giống gen in vitro Vì • Phương pháp có hệ số nhân cao cho cá thể tương đối đồng mặt di truyền • Có thể nhân giống trồng quy mô công nghiệp (kể đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường) • Chủ động kế hoạch sản xuất • Dễ dàng tạo virus • Các sau nhân in vitro có xu hướng trẻ hóa giúp nâng cao hiệu nhân nhanh bằng phương pháp thông thường sau CôngBùi w3tricong053w@gmail.com Câu 12: Các bước cụ thể quy trình nhân nhanh nuôi cấy mô? Nêu vd cụ thể quy trình nhân giống trồng nuôi cấy mô để minh họa Các bước cụ thể quy trình nhân nhanh nuôi cấy mô  Bước 0: chọn lọc chuẩn bị mẹ  Cây mẹ phải bệnh, đặc biệt bệnh virus giai đoạn sinh trưởng mạnh  Việc trồng mẹ điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc phòng trừ sâu bệnh hiệu trước lấy mẫu cấy làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả sống, sinh trưởng mẫu nuôi cấy  Bước 1: nuôi cấy khởi động  Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro  Yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt  Khi lấy mẫu cần chọn loại mô, giai đoạn phát triển cây: mô non, chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, non, vảy củ, …)  Cần xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp Thường dùng chất: HgCl 0.1% xử lý – 10 phút, NaClO, Ca(Ocl) 5-7% xủ lý 15 – 20’ H2O2, nước Brôm  Bước 2: nhân nhanh  Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái tăng nhanh số lượng thông qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phôi vô tính  Chú ý xác định điều kiện môi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu cao nhất: Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin kích thích tạo chồi, nhiều auxin kích thích rễ Chế độ nuôi cấy thường 25 – 27°C, 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 – 4000lux  Bước 3: tạo in vitro hoàn chỉnh  Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường rễ thường bổ sung lượng nhỏ auxin Tuy nhiên có số chồi phát sinh rễ sau chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng  Đối với cac phôi vô tính thường gieo môi trường chất điều tiết sinh trưởng môi trường có nồng độ cytokinin thấp để phôi phát triển thành hoàn chỉnh  Bước 4: thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên Để đưa từ ống nghiệm vườn ươm có tỷ lệ sống cao, sinh trưởng tốt cần đảm bảo số yêu cầu:  Cây ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn hình thái định (số lá, chiều cao cây, rễ…)  Có giá thể tiếp nhận in vitro thích hợp (giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước)  Phải chủ động điều chỉnh ẩm độ, chiếu sáng vườn ươm cũng có chế độ dinh dưỡng phù hợp Quy trình nhân giống hoa Lan phương pháp nuôi cấy in-vitro 2.1 Chọn mẫu khử trùng mẫu cấy  Tách vảy hành từ cây, bóc lần già xuất mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng  Cắt bỏ gốc mầm, sau khử trùng bằng cách ngâm cồn 70% 30 giây, rửa bằng nước cất vô trùng ngâm dung dịch Ca(OCl)2 2% 25 phút, việc khử trùng tiến hành tủ cấy Mô rửa lại với nước cất vô trùng - lần CôngBùi        w3tricong053w@gmail.com Mỗi mầm đặt đĩa petri vô trùng cẩn thận tách non Sau lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 giây rửa với nước cất vô trùng Chuyển sang đĩa petri vô trùng khác, tách mầm bằng dao nhọn vô trùng Dùng kìm nhọn tách lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng khỏi mô cấy vào môi trường nhân giống ban đầu Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan 220C - 260C tuỳ vào loài Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục tạo khối tròn gọi thể chồi Thể chồi lấy khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước chồi Lát cắt chuyển vào môi trường trì (môi trường phát triển chồi) Mỗi đỉnh sinh trưởng phát triển thể chồi sau khoảng tuần, cắt tiếp cấy chuyền sang môi trường 2.2 Nhân giống  Môi trường nhân giống thường môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho trình nhân chồi  Nồng độ chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần lần cấy chuyển sau Các chất chiết trái cũng đề nghị dùng nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây Nhưng chúng có hiệu lần cấy chuyển thể tích cũng không 10% thể tích môi trường 2.3 Tái sinh hoàn chỉnh in-vitro  Khi đạt đến số giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích rễ)  Sau -5 tháng, thể chồi phát triển thành 2.4 Chuyển vườn ươm  Cây cao 5-7 cm có từ 3-4 chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung chất dinh dưỡng  Sau thời gian phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu Sau chuyển chậu khoảng tuần bón phân, lúc có đủ sức chống chọi với bệnh tật  Như vậy, từ mô hoa Lan chọn nuôi cấy có 3-4 chuyển vườn trồng thời gian khoảng từ đến 11 tháng  Với phương pháp nhân giống vô tính đảm bảo tạo mang đặc tính giống hoàn toàn với cha mẹ (cây ổn định mặt di truyền), không nhiễm bệnh tạo số lượng lớn thời gian ngắn  Tuy nhiên, việc cấy mô phải thực thật nghiêm túc tỉ mỉ theo quy trình, phải có điều kiện trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt điều kiện vô trùng phải đảm bảo nghiêm ngặt  Cần ý thêm, đối với loài địa, phải hoá vùng chọn mẫu đem nuôi cấy, có đảm bảo hiệu từ khâu nuôi cấy phòng thí nghiệm đến trồng vườn ươm 10 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com Giống có Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào R1 Thử nghiệm đồng ruộng(lặp lại) Quần thể R2 Chọn lọc Dòng vô tính cải tiến Lai thuạn nghịch Thử nghiệm đồng ruộng Xác định tính ổn định Thử nghiệm đồng ruộng nhiều địa điểm Dòng lai tạo Tiếp tục thử nghiệm đồng ruộng tăng số lượng giống Giống Vi dụ: quy trình chọn lọc đột biến soma có ích cà chua - Cây tái sinh R1 từ đĩa lá, chuyển đất, trồng đến thu - Tự thụ phấn thu hệ R2 Thu hoạch gieo hạt sau xử lý nước nóng để phá ngủ 26 CôngBùi - - w3tricong053w@gmail.com Theo dõi tiêu hình thái R2 nhà kính Trồng chuyển ruộng sản xuất theo từng lô thí nghiệm Theo dõi tiêu hình thái quả, thu hạt từ những lô thí nghiệm co xuất những biến dị có ích Lọc từng từ R2, trồng tạo quần thể R3, xác định kiểu di truyền đặc tính có ích Lai có tính trạng có ích với mang đột biến biết để xác định xem đột biến có với biến dị có alen hay không Nếu đột biến biết biến dị không bổ sung, chúng allelic, biến dị xuất đánh dấu đồ Nếu chúng bổ sung, tức không alen điều khiển gen riêng rẽ Các biến dị m;ới lai với dòng khác để xác định vị trí locus đồ Các tính trạng đột biến tế bào chất đánh giá tính di truyền theo dòng mẹ bằng việc lai thuận nghịch giữa biến dị dòng bood mẹ Các chọn lọc với đặc tính có ích tự thụ phấn đánh giá thu dòng Hạt dòng chọn lọc tập hợp để công bố giống Câu 26: Thế nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật? Các hướng ứng dụng kỹ thuật này? Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay nhiều cụm tế bào (cell aggregate) trạng thái lơ lửng trông môi trường lỏng Dịch huyền phù tạo nuoioi cấy loại mô sẹo khả biệt hóa, môi trường lỏng chuyển động suốt thời gian nuôi cấy Các tế bào tách khỏi mô sẹo phân tán môi trường lỏng Sau thời gian dịch huyền phù tế bào đơn, cụm tế bào, mảnh lại mẫu cấy tế bào chết Các hướng ứng dụng kỹ thuật a Sản xuất sinh khối tế bào hợp chất thứ cấp - Sản phẩm đặc trưng nuôi cấy huyền phù tế bào những chất cóchất lượng cao cần lượng nhỏ Các nhóm nuôi cấy chủ yếu tạo sản phẩm thứ cấp y học, hóa mỹ phẩm công nghiệp - Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo sinh khối: + Chống lại tàn phá môi trường + Cung cấp nguồn nguyên liệu đặn, vững chắc, chất lượng ổn định + Không bị nhiễm bẩn thuốc trừ sâu, chất phóng xạ, bệnh hại hay kim loại nặng … + Sản xuất cách có định hướng với quy mô công nghiệp,khôi lượng sản phẩm lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ + Tỷ lệ % khối lượng khô hợp chất thứ cấp cao so với nguyên liệu thực vật thu hái tự nhiên + Không tốn nhiều diện tích gieo trồng + Thu sinh khối tế bào lớn thời gian ngắn Một số hợp chất thứ cấp sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật: 27 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com  Diosgenin: Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp khớp, đau lưng, đau dây thần kinh Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ nâu) bioreactor thu suất diosgenin cao nhiều lần so với hiệu suất có từ nguyên liệu tự nhiên  Codein morphin: Giảm đau giảm ho, thu nhận từ việc nuôi cấy huyền phù tế bào Papaver somniferu  Steviol chất tạo vị biết đến rộng rãi, thu nhận từ Stevia rebaudiana (hiệu suất đạt tới 36.4 %)  Taxol nhóm chất hóa trị liệu ung thư thu nuôi cấy tế bào loài Taxus xem phương pháp ưu để cung cấp ổn định nguồn taxol dẫn xuất taxane (T cuspidata, T baccata, T mairei)  Scopolamine hyoscyamine loại tropane alkaloid sử dụng để trị co thắt gây mê thu nuôi cấy huyền phù tế bào Scopolia japonica (họ solanacae) có bổ sung tropic acid (như tiền chất) tăng hàm lượng alkaloid lên 15 lần  Saponin sapogenin dược phẩm quý giá, có nhiều rễ nhân sâm (Panax ginseng thu nuôi cấy huyền phù tế bào P ginseng tiến hanh quy mô công nghiệp (đối tượng nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất)  Betalaine nhóm chất nhuộm màu thực phẩm, thu nhận bằng cách nuôi cấy quan Beta vulgaris (cải đỏ), nuôi cấy callus huyền phù Portulaca americana b Trong công tác chọn giống trồng: - Sử dụng để chọn lọc dòng tế bào mong muốn qua test lọc - Sau tái sinh tế bào chọn lọc thành hoàn chỉnh - Cây hoàn chỉnh trở thành vật liệu khởi đầu quan trọng công tác giống - Ngoài ra, tách protoplast nguồn để sản xuất phôi vô tính Câu 27: Trình bày đặc điểm nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật?  Chu kỳ sinh trưởng tế bào huyền phù: Chu kỳ sinh trưởng tế bào huyền phù có dạng đường cong chữ S với pha sinh trưởng sau: • Pha tiềm sinh (Lag-phase): pha không xảy tăng khối lượng số lượng tế bào (A) • Pha số mũ (Exponential phase): pha phân chia tăng khối lượng tế bào diễn với tốc độ lớn Ngoài sinh trưởng tế bào cũng tăng nhanh (B) • Pha tuyến tính (Linear log-phase): đặc trưng sinh trưởng tế bào diễn ổn định liên tục (C) • Pha ổn định: pha hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng khối lượng tế bào ổn định (Stationary phase-D) • Pha suy thoái (Dead phase): sinh trưởng tế bào khỏi đỉnh cao, giảm xuống dần đến ngừng sinh trưởng không cấy chuyển (E) 28 CôngBùi - - w3tricong053w@gmail.com Giai đoạn sinh trưởng log-phase (pha số mũ) bị kéo dài mật độ tế bào khởi đầu nuôi cấy thấp Mật độ ban đầu huyền phù tế bào nuôi cấy thường 0,5-2,5x105 tế bào/ml Sơ đồ chu kỳ sinh trưởng tế bào huyền phù  Môi trường nuôi cấy Về chất tế bào huyền phù loại tế bào callus, môi trường nuôi cấy callus sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào với việc cải tiến hàm lượng tỷ lệ auxin/xytokinin cho phù hợp để có tế bào phân tán tốt môi trường lỏng lắc Huyền phù tế bào trì bằng cấy chuyển liên tục đầu pha ổn định thời điểm kết tập tế bào lớn  Các tiêu sinh trưởng Tổng số tế bào (mật độ tế bào) Khối lượng tươi tế bào Khối lượng khô tế bào Tổng số tế bào phân bào x 100 Chỉ số phân bào (%) = Tổng số tế bào kiểm tra Khả sống tế bào: nhuộm bằng flurescein diacetate (0.01%) quan sát thấy màu xanh chiếu sáng tử ngoại 29 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com Câu 28 : Lợi đặc trưng việc sản xuất hợp chất thứ cấp nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật bioreactor? Nêu số hợp chất thứ cấp sản xuất phương pháp Lợi : có lợi - Hệ thống nuôi cấy thông khí trao đổi khí Vì tees bào thực vật nhạy cảm với strewss vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật yêu cầu thường xuyên cải thiện hệ thống thông khí hệ thống trộn môi trường - Môi trường nuôi cấy dễ dàng thay từng thời kì Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có liên kết giữa bioreactor với hệ thống chiếu sáng Đặc trưng: - Nuôi cấy huyền phù tế bào cần lượng mô sẹo lớn, xấp xỉ – g/100ml dung dịch môi trường (Helgeson, 1979) - Sau thời gian, dịch huyền phù hỗn hợp tế bào đơn, cụm tế bào, mảnh lại mẫu cấy tế bào chết - Mức độ tách rời tế bào phụ thuộc vào đặc tính khối tế bào xốp điều chỉnh thành phần môi trường VD: nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sản sinh nhiều khối tế bào xốp - Theo King Street (1977), quy trình chuẩn cho nuôi cấy huyền phù tế bào - Sinh trưởng phát triển tế bào nuôi cấy: Pha lag: bắt đầu đưa mô sẹo vào môi trường, kéo dài lần phân bào Pha tăng tốc: tế bào bắt đầu phân chia số lượng tế bào tăng dần Pha hàm số mũ: số lượng tế bào tăng theo hàm số mũ Pha ổn định: số lượng tế bào đạt cực đại không đổi theo thời gian, số tế bào sinh (do phân bào) xấp xỉ số tế bào chết Một số hợp chất thứ cấp sản xuất phương pháp - Diosgenin: Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp khớp, đau lưng, đau dây thần kinh + Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ nâu) bioreactor thu suất diosgenin cao so với hiệu suất có từ nguyên liệu tự nhiên + Trong nuôi cấy tế bào, diosgenin chiếm 7.8 % khối lượng khô, chiếm % với nguyên liệu thực vật thu hái tự nhiên - Codein: Giảm đau giảm ho + Papaver somniferum nguồn hợp chất quan trọng y học morphine codein 30 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com + Sản xuất morphin thực bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào tế bào Papaver somniferum - Steviol: + Chất tạo vị biết đến rộng rãi, thu nhận từ Stevia rebaudiana + Nuôi cấy callus giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào tích lũy steviol + Trong nuôi cấy callus - Taxol: + Là nhóm chất hóa trị liệu ung thư, điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, khối u ác tính, dạng u bướu khác + Nuôi cấy tế bào loài Taxus xem phương pháp ưu để cung cấp ổn định nguồn taxol dẫn xuất taxane (T cuspidata, T baccata, T mairei) - Scopolamine hyoscyamine: + Là loại tropane alkaloid sử dụng để trị co thắt gây mê + Có nhiều thuộc họ Solanaceae + Nuôi cấy huyền phù tế bào Scopolia japonica có bổ sung tropic acid (như tiền chất) tăng hàm lượng alkaloid lên 15 lần - Saponin sapogenin: + Là dược phẩm quý giá, có nhiều rễ nhân sâm (Panax ginseng), có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, chống suy nhược thể, tăng cường sinh lực + Nuôi cấy huyền phù tế bào P ginseng tiến hanh quy mô công nghiệp + Đây đối tượng nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu nhiều Câu 29: Những đặc điểm ưu kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật invitro? Đặc điểm  Các mô, tế bào trạng thái ức chế sinh trưởng hoàn toàn ngừng sinh trưởng thời gian  Đây giải pháp công nghệ có triển vọng việc bảo quản nguồn gen thực vật, với nhân giống vô tính hạt khó bảo quản có nhiệt độ độ ẩm thấp  Đối tượng bảo quản rộng: non hoàn chỉnh, chồi mầm, phôi, đỉnh ngọn, tế bào huyền phù, đỉnh ngọn…  Vật liệu bảo quản điều kiện invitro gồm dòng độc nguyên liệu làm bệnh  Điều kiện bảo quản khắc nghiệt: nhiệt độ thấp, giảm nồng độ oxy, giảm cường độ chiếu sáng, tăng chất ức chế sinh trưởng Ưu  Đảm bảo độ an toàn bệnh cao, có khả tạo quần thể đồng với số lượng lớn  Bảo quản lâu dài nguồn gen thực vật điều kiện môi trường bên không cho phép nhằm phục vụ cho công tác chọn giống 31 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com  Sử dụng phận nhỏ hạt, chồi, mô, nên tiết kiệm không gian bảo quản  Hạn chế khả nguồn gen, nguồn gen có nguy xói mòn cao, loài có nguy bị tuyệt chủng  Với phương pháp bảo quản siêu lạnh bảo quản lâu dài với số lượng lớn ổn định  Khả tái tạo, phục hồi nguồn gen biến tự nhiên Câu 30: Trình bày nguyên lý cách tiến hành kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro? - Nguyên lý bảo quản nguồn gen thực vật in vitro: - Cách tiến hành kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật invitro Bảo quản nguồn gen in vitro giải pháp công nghệ có triển vọng việc bảo quản nguồn gen thực vật với nhân giống vô tính có hạt sức nảy mầm nhiệt độ ẩm độ thấp Trong vòng 20 năm gần công nghệ phát triển rộng áp dụng với 1000 loài thực vật khác (F Engelmann, 1997) Quá trình chuẩn bị mẫu bảo quản sau:  Thu thập nguồn gen tự nhiên thông qua trình trao đổi giống  Chẩn đoán bệnh, khử bệnh  Nuôi cấy in vitro nhân nhanh cho đủ số lượng mẫu để bảo quản Sau tùy thuộc vào đối tượng mục đích mà lựa chọn cách bảo quản in vitro thích hợp Có cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro là: Bảo quản sinh trưởng chậm Bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời 23 Nuôi cấy phôi in vitro gì? Khả ứng dụng công nghệ này? Ví dụ minh họa? ** khái niệm nuôi cấy phôi in vitro: Nuôi cấy phôi (cứu phôi) tách rời nuôi cấy invitro phôi hợp tử thành thục chưa thành thục thành hoàn chỉnh * Mục đích: Khắc phục bất hợp sau thụ tinh Khắc phục bất hợp giữa nội nhũ phôi lai xa Tạo đơn bội (lúa mì x ngô, lúa mỳ x yến mạch dẫn đến loại bỏ nhiễm sắc thể) Ngăn ngừa thui chột phôi những loại hạch chín (đào, mận, mơ…) Phá ngủ nghỉ, rút ngắn chu kỳ tạo giống… • Nuôi cấy phôi hữu tính +Sự phát sinh phôi hữu tính: -Xảy trình thụ tinh giữa hạt phấn noãn hình thành hợp tử -Hợp tử trải qua trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi +Nuôi cấy phôi hữu tính gồm 32 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com -Tách phôi -Nuôi cấy phôi để tạo -Phôi hữu tính hình thành môi trường vô trùng noãn mô bầu hoa -Ở số loài phôi có kích thước lớn, thuận tiện cho trình tách phôi (cây họ đậu), số loài hoa khó tách phôi (hoa lan_hạt có kích thước nhỏ, vỏ hạt tiêu giảm thiếu nội nhũ) -Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thường xếp đỉnh chùm hoa - Trong trình thu nhận phôi cần hạn chế tổn thương dây treo phôi Dây treo phôi có kích thước nhỏ cấu trúc mỏng manh nên khó tách nguyên vẹn với phôi để đưa vào nuôi cấy Không có dây treo phôi làm giảm đáng kể tỉ lệ hình thành từ nuôi cấy phôi non Thành phần môi trường nuôi cấy Sau tách từ hạt phôi nuôi cấy môi trường chứa:  Muối khoáng  Chất điều hoà sinh trưởng  Nguồn carbon  Aminoaxit thành phần hữu phức hợp Các yếu tố ảnh hưởng  pH môi trường  Nhiệt độ  Ánh sáng ** Ứng dụng nuôi cấy phôi hữu tính     Thu nhận thể đơn bội Kiểm tra nhanh sức nảy mầm hạt Nhân giống Thụ phấn ống nghiệm Thu nhận thể đơn bội Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận thể đơn bội thông qua trình loại bỏ trực tiếp NST sau lai xa Tổ hợp giữa hai loài khác xa đào thải hoàn toàn NST đơn bội loài dễ xảy Kiểm tra nhanh sức nảy mầm hạt Nuôi cấy phôi hữu tính dùng để kiểm tra nhanh khả nảy mầm hạt, đặc biệt hạt giống có sức sống hạt sau thời gian bảo quản dài Phương pháp cho độ xác cao Nhân giống Hạt số khó nảy mầm điều kiện tự nhiên, làm giảm khả sinh sản hữu tính chúng Bằng cách nuôi cấy phôi tách rời thu nhiều Áp dụng với loài mà hạt có sức sống kém, hạt nội nhũ nội nhũ 33 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com VD: đối với loài phong lan hạt chúng nhỏ nội nhũ khả mần hạt thấp bằng phương pháp nuôi cấy phôi ta làm tăng tỉ lệ nảy mầm phong lan Thụ phấn ống nghiệm  Một số rào cản đối với trình thụ tinh:  Hạt phấn khả nảy mầm núm nhụy loài khác  Ống phấn không tiếp cận noãn vào thời điểm thích hợp  Vỡ ống phấn vòi nhụy  Những rào cản vượt qua bằng kĩ thuật thụ phấn ống nghiệm Nuôi cấy phôi vô tính (phôi soma)  nhân giống vô tính xem phương pháp hiệu để tạo số lượng lớn giống đạt chất lượng  tạo phôi vô tính; tạo củ siêu nhỏ (micro), hạt nhân tạo; công nghệ hóa trình nhân giống, vườn ươm xây dựng mô hình trồng thử  Sự đời hạt nhân tạo đem lại ý nghĩa to lớn ** Ví dụ cụ thể: Thí nghiệm cứu phôi hữu tính khoai tây Thu hái khoai tây trưởng thành, màu xanh, khoảng 21 đến 28 ngày sau thụ phấn Khử trùng bề mặt bằng etanol 90% 30s Ngâm hỗn hợp dung dịch hypoclorit canxi 5% nước cất vô trùng 15 phút Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành tách hạt từ chuyển sang đĩa petri Bóc vỏ hạt tách rời phôi Cấy phôi vào đĩa petri chứa sẵn môi trường dinh dưỡng nuôi nhiệt độ từ 18-22ºC với ánh sáng yếu Các phôi tách tốt từ hạt phát triển dần thành khoai tây sau chuyển trồng vườn ươm Câu 17 ý nghĩa việc trì độ bệnh trồng biện pháp ngăn chặn tái lây nhiễm chúng? Ý nghĩa việc trì bệnh cho trồng  Việc trì tình trạng bệnh virus cho trồng có ý nghĩa quan trọng sản xuất virus lây lan nhanh nhiễm bệnh chúng lan truyền gây hại diện tích rộng lớn giống trồng bị nhiễm virus di truyền qua hệ sau qua hạt giống tồn sẵn môi trường làm giảm suất đáng kể thoái hóa giống việc trì bệnh cho trồng có ý nghĩa quan trọng  Các biện pháp ngăn chặn trình tái lây nhiễm ∗ Cây trồng nên trồng nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) không chứa nguồn bệnh vector truyền bệnh (rệp) hay nơi tự nhiên mang virus 34 CôngBùi ∗ ∗ ∗ ∗ w3tricong053w@gmail.com Cần loại trừ thường xuyên nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ vật mang bệnh (côn trùng, tuyến trùng…) Phòng tránh lây nhiễm giới trình chăm sóc trồng Thường xuyên chọn lọc, bằng mắt qua phân tích chẩn đoán Để hoàn toàn chắn, nên trì vật liệu bệnh invitro Câu 21: Thế lai soma? Trình bày kỹ thật tách, nuôi cấy dung hợp tb trần Lai tế bào soma Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với hợp thành Quá trình gọi dung hợp tế bào trần hay dung hợp protoplast  Nếu tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc giống, loài, chi khác dung hợp với gọi tượng dung hợp tế bào soma hay lai soma  2.Các kỹ thuật tách nuôi cấy dung hợp tb trần Phương pháp tách tế bào trần * Nguyên tắc:  Sử dụng hỗn hợp enzym: cellulolase, hemicellulolase pectinase để phân giải thành tế bào giải phóng tế bào trần  Một nguyên tắc sau thành tế bào tách ra, tế bào trần phải phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào gây vỡ tế bào chất, bằng việc bổ sung chất tạo áp suất thẩm thấu saccarose, mannitol, sorbitol, Ca2+…  Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho thích hợp với từng đối tượng trồng  Đây phương pháp dùng phổ biến có hiệu từ 1g tươi thu nhận từ 6-12 triệu tế bào trần * Các bước tiến hành:  Chọn nguyên liệu: ex vitro: mô non (cần phải khử trùng), invitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù  Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2, đường mannitol 0,5-0,7M)  Xử lý hỗn hợp enzyme (cellulolase, hemicellulolase, pectinase)  Tách làm protoplast: lọc, ly tâm  Kiểm tra khả sống (fluorescein diacetate) tạo huyền phù protoplast có mật độ phù hợp (104-107/ml) * Ví dụ kỹ thuật tách tế bào trần  Ở thuốc lá: − Nguyên liệu thực vật thứ ba từ xuống − Hỗn hợp enzyme: cellulolase 1%, macerozyme 0,02%, driselase 0,05% − Thời gian ngâm ủ 16 ngâm qua đêm 35 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com  Ở ngô − Nguyên liệu thực vật tế bào hạt phấn − Hỗn hợp enzyme: cellulolase 2%, macerozyme 0,1%, pectolyase 0,05% − Thời gian ủ: 4-12 ngâm qua đêm  Các tế bào trần sau tách thành tế bào lọc qua rây có kích thước 50-80 µm, rửa bằng dung dịch enzyme bằng ly tâm Nuôi cấy protoplast  Thường chia làm hai giai đoạn:  Giai đoạn 1: nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào phân chia tạo cụm nhỏ tế bào (4-10 tế bào) nuôi cấy tối hay điều kiện ánh sáng yếu, môi trường lỏng có lắc hay môi trường bán lỏng Môi trường cần giàu dinh dưỡng áp suất thẩm thấu phù hợp Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ dưỡng  Giai đoạn 2: nuôi cấy tạo mô sẹo ổn định tái sinh hoàn chỉnh: nuôi cấy điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, môi trường đặc Cần ý đến hàm lượng tỷ lệ auxin cytokinin để tái sinh từ callus  Có hai đường phát sinh hình thái trình hình thành hoàn chỉnh đối với tế bào có nguồn gốc protoplast  Thông qua trình phát sinh quan (organogenesis): ví dụ tế bào protoplast có nguồn gốc từ mô thịt thuốc  Thông qua đường phát sinh phôi (somatic embryogenesis): ví dụ tế bào protoplast có nguồn gốc từ tế bào phôi nuôi cấy dạng huyền phù số loài thuộc họ hòa thảo  Nếu đảm bảo môi trường nuôi cấy phù hợp, phôi mô phân sinh hình thành sau khoảng 3-5 tuần lễ Nhưng điều kiện nuôi cấy không tối ưu, biến đổi di truyền xảy Ví dụ: số nghiên cứu nuôi cấy protoplast từ khoai tây, tần số 2n tái sinh khoảng 10%, lại chủ yếu 4n Phương pháp dung hợp tế bào trần Phương pháp dùng hóa chất  Năm 1972, Carlson tái sinh thành công thuốc từ tế bào trần protoplast dung hợp môi trường bổ sung NaNO3  Năm 1974, Melchers phát triển môi trường dung hợp tế bào trần gồm 50mM Ca2+, 0,4M mannitol, pH 10,5 tỏ thích hợp cho việc dung hợp tế bào trần nhiều loài trồng khác  Năm 1974, Kao phát PEG (polyethylene glycol) có tác dụng làm tăng hiệu dung hợp protoplast Khi ngâm vào dung dịch PEG (20-40% w/v), protoplast kết dính lại với Sau đó, PEG rửa bằng dung dịch Ca2+ có độ pH cao, màng nguyên sinh chất chỗ tiếp xúc vỡ protoplast dung hợp với Do PEG độc đối với tế bào, nồng độ PEG thường giảm bổ sung thêm vào DMSO (dimethyl sulfuside) Phương pháp dùng xung điện  Zimmerman (1982) người đề xuất phương pháp dung hợp tế bào trần bằng xung điện (electrofusion) 36 CôngBùi       w3tricong053w@gmail.com Trong phương pháp này, dung hợp xảy tế bào trần đưa vào điện trường có điện cao (500-1000V/cm) thời gian phát xung cực ngắn (5-6/1000 giây) Nguyên tắc: protoplast tích điện nên dịch chuyển điện trường tạo thành chuỗi giữa hai điện cực, dùng xung điện để làm thủng màng hai protoplast sát cạnh khiến chúng hòa trộn vào Thiết bị: máy tạo xung điện, kính hiển vi đảo pha, buồng dung hợp Tạo điện trường: đặt buồng dung hợp điện cực platin có khoảng cách 0,2-1,0mm nối với nguồn điện có hiệu điện 200V/cm Tạo xung: hiệu điện thế: 500-1000V/cm, thời gian cực ngắn 1-200 milisecond Hiệu dung hợp cao thiết bị đầu tư lớn Khả xảy dung hợp  Về lý thuyết, tiến hành dung hợp protoplast hai khác nhau, ta thu kiểu tế bào dị nhân (heterokaryocyte), có trộn lẫn nhân tế bào chất (bao gồm quant tử ty thể, lạp thể)  Song thực tế, dạng dung hợp có dạng dung hợp khác, bao gồm: − Nhân hai tế bào dung hợp, hai tế bào chất bị thải loại (ít xảy ra) − Chỉ phần hệ gen nhân tế bào bố/mẹ dung hợp với hệ gen nhân tế bào thể nhận (dạng dung hợp nhân lệch – asymetric hybrid) − Chỉ có dung hợp quan tử tế bào chất, dung hợp nhân (dạng dung hợp tế bào chất cybrid) Câu 5: Tác dụng thành phần môi trường đến sinh trưởng phát sinh hình thái tế bào mô nuôi cấy?  ∗ ∗ Môi trường nuôi cấy điều kiện tối cần thiết, yếu tố định cho phân hóa tế bào quan nuôi cấy Có nhiều loại môi trường nuôi cấy cho loại thực vật khác mục đihcs nuôi cấy khác Môi trường thường bao gồm thành phần sau đây: - Nguyên tố đa lượng - Nguyên tố vi lượng - Nguồn cácbon hữu - Các vitamin - Chất điều tiết sinh trưởng - Chất làm đông môi trường Các nguyên tố đa lượng - Các nguyên tố khoáng chất mà thực vật cần thiết nồng độ lớn 0.5 mM/l gọi nguyên tố đa lượng - Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca cần thiết thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy Nói chung, nồng độ nguyên tố nói môi trường lớn 30ppm Chúng nguyên liệu để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúc Các nguyên tố vi lượng 37 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com - Các nguyên tố khoáng mà thực vật cần thiết có nồng độ nhỏ 0.5 mM/l gọi nguyên tố vi lượng - Fe, Cu, Zn, Mo, Bo, I, Co nguyên tố vi lượng thường dùng môi trường nuôi cấy invitro Các nguyên tố đóng vai trò quan trọng hoạt động enzyme Chúng dùng với nồng độ nguyên tố nhỏ 30ppm tùy thuộc vào loại môi trường mà hàm lượng tỷ lệ chúng thay đổi - Trong môi trường nuôi cấy, Fe thường dùng dạng muối phức chelat Fe-EDTA, Fe-citrate ∗ Nguồn cácbon hữu cơ: - Khi nuôi cấy initro tế bào, mô thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng Vì vậy, cần nguồn cacbon hữu thường dùng đường saccaroza với liều lượng 20-30 g/l Trong số trường hợp đặc biệt, sử dụng nguồn đường khác glucoza, maltoza, galactoza lactoza ∗ Các vitamin - Mô, tế bào nuôi cấy invitro tự tổng hợp vitamin không đủ cho hoạt động sống chúng nên cần bổ sung thêm vitamin vào môi trường nuôi cấy - Đáng ý vitamin: thiamin, axit nicotinic, pyridoxin riboflavin Nồng độ thường dùng khoảng 1mg/l Các vitamin đóng vai trò quan trọng tế bào chúng coenzyme enzyme - Myo-inositol cần bổ sung vào lượng lớn 50-100mg/l, chất tỏ có tác dụng rõ đến phân chia tế bào * Các chất điều tiết sinh trưởng - Các chất điều tiết sinh trưởng yếu tố quan trọng môi trường định đến kết nuôi cấy - Auxin cytokinin sử dụng nhiều nuôi cấy invitro - Auxin kích thích hình thành mô sẹo, tạo rễ bất định kích thích dãn tế bào Các auxin thường sử dụng là: 2,4 D, α-NAA (α-naphtylaxetic acid), IAA Nồng độ sử dụng 10-5-10-7M - Cytokinin kích thích phân chia tế bào định phân hóa chồi Các cytokinin thường sử dụng BA (benzyl adenin), kinetin, isopentenyladenin zeatin (một cytokinin tự nhiên) Nồng độ sử dụng 10 -10-7M - Tỷ lệ auxin/cytokinin định phân hóa mẫu cấy theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Các hỗn hợp hợp chất tự nhiên - Là thành phần thường sử dụng thành phần bắt buộc Chúng làm gia tăng thành phần dinh dưỡng chất có hoạt tính sinh học cho môi trường nên kích thích sinh trưởng phân hóa mẫu cấy Thường bao gồm: - Nước dừa: thường chứa axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN, ADN Đặc biệt nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy invitro là: myo-inositol, hợp chất có hoạt tính auxin, glucosit cytokinin 38 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com - Dịch nghiền số rau, tươi (khoai tây, cà rốt, chuối, táo…) thành phần hóa học có đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng… - Dịch thủy phân casein (casein hydrolysat) hay pepton chủ yếu sử dụng làm nguồn bổ sung axit amin  Chất làm đông cứng môi trường - agar - Agar loại polysaccarit tảo Ở 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái sol 400C trở trạng thái gel Khả ngậm nước thạch cao 6-12 g/l nước Thạch trạng thái gel vẫn ion vận chuyển dễ dàng có độ thoáng khí cao Nồng độ trung bình 6-8 g/l  Độ pH môi trường - Độ pH môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số loại dao động từ 5,56,0 - Trường hợp pH thấp thạch không đông sau khử trùng môi trường, pH cao làm cứng môi trường - Khi pH < pH làm kết tủa số muối vô phân giải số chất hữu dẫn đến làm chết mẫu cấy Ảnh hưởng nhân tố vật lý?  Ảnh hưởng ánh sáng - Quá trình nuôi cấy mô tế bào diễn ánh sáng nhân tạo buồng nuôi có nhiệt độ kiểm soát - Nguồn ánh sáng sử dụng đèn huỳnh quang Thông thường giá đặt bình nuôi cấy, khoảng cách từ đèn nắp bình nuôi cấy 45-50 cm, đảm bỏa khuếch tán ánh sáng khắp - Ánh sáng bình bình khác nhiều phân bố ánh sáng bình phụ thuộc vào diện tích nắp bình, loại bình xếp bình giá đặt bình nuôi - Thông thường cường độ ánh sáng buồi nuôi thấp 10 lần so với ánh sáng tự nhiên ban ngày, dao động khoảng 40-140 mmol/m 2/s (tương đương với 3000-10000 lux) Việc sử dụng cường độ chiếu sáng thấp nuôi cấy invitro nhằm tiết kiệm chi phí lượng, giảm hiệu ứng nhà kính mẫu cấy chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng - Tỷ lệ quang tử vùng ánh sáng màu đỏ/gần đỏ/và xanh/đỏ ảnh hưởng đến phát sinh hình thái Sự phát sinh hình thái xảy ánh sáng có bước sóng thuộc ánh sáng màu xanh (400-460 mm), màu đỏ (620-680 mm), gần màu đỏ (700-800 mm) màu tím (300-400 mm) - Quang chu kỳ buồng nuôi thường trì chế độ 16 chiếu sáng ngày Ảnh hưởng nhiệt độ - Nhiệt độ bình nuôi thường cao nhiệt độ bình vài độ phần đáy thường ấm so với nắp bình - Nhiệt độ trung bình buồng nuôi cho nhiều loại thường 25 0C (dao động từ 17-300C) Các nhiệt đới cần có nhiệt độ trung bình buồng mức cao 27,70C (dao động 24-320C) - Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày (khi chiếu sáng) ban đêm (khi chiếu sáng) thường trì từ 4-80C Ví dụ nhiệt độ ban ngày 280C ban đêm 200C hay nhiệt độ ban ngày 280C nhiệt độ ban đêm 240C…sự 39 CôngBùi w3tricong053w@gmail.com chênh lệch nhiệt độ hỗ trợ trao đổi khí bình nuôi cải thiện sinh trưởng nuôi cấy - Với loại khác có khoảng nhiệt độ thích hợp riêng Ví dụ khoai tây sinh trưởng nhanh nhiệt độ ngày đêm 22 0C/180C, nhiệt độ ngày đêm 270C/220C sinh trưởng chậm hẳn - Tốc độ sinh trưởng mẫu cấy thường giảm hẳn dần nhiệt độ buồng nuôi thấp nhiệt độ tối thích giảm xuống nhanh nhiệt độ buồng nuôi cao nhiệt độ tối thích Nồng độ khí CO2 - Nồng độ khí CO2 bình nuôi cấy có diệp lục thường giảm thấp điểm bù CO2 (50-100 mmol/mol) hầu hết chế độ quang chu kỳ - Nồng độ CO2 gia tăng giai đoạn tối (510 mmol/mol) giảm sau thời gian chiếu sáng (100mmol/mol) vài giờ, đưa lại tối nồng độ CO2 lại gia tăng trở lại Ngay trường hợp thay nắp đậy có khả trao đổi khí, nồng độ CO giảm xuống 100-200 mmol/mol thời gian có chiếu sáng invitro sống dị dưỡng (Kozai & Seikimoto, 1988) 40 [...]... số mũ) sẽ bị kéo dài nếu mật độ tế bào khi khởi đầu sự nuôi cấy là thấp Mật độ ban đầu của huyền phù tế bào khi nuôi cấy thường là 0,5-2,5x105 tế bào/ ml Sơ đồ chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù  Môi trường nuôi cấy Về bản chất các tế bào huyền phù là loại tế bào callus, do đó môi trường nuôi cấy callus có thể sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào với việc cải tiến hàm lượng và... 1 Tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần chất nguyên sinh, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên trong và bên ngoài tế bào trần Tế bào trần được tách ra từ các mô hoặc các cơ quan khác nhau ở cây như lá, rễ, mô sẹo nuôi cấy in vitro Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế bào. .. các tế bào phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc Huyền phù tế bào được duy trì bằng sự cấy chuyển liên tục ở đầu pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất  Các chỉ tiêu sinh trưởng Tổng số tế bào (mật độ tế bào) Khối lượng tươi của tế bào Khối lượng khô của tế bào Tổng số tế bào phân bào x 100 Chỉ số phân bào (%) = Tổng số tế bào kiểm tra Khả năng sống của tế bào: ... Chọn dòng tế bào + Tế bào thực vật có vách xenlulose thường có kích thước lớn Do vậy việc xử lý chọn dòng tế bào với số lượng lớn là khó thực hiện hơn nhieeuf so với chọn lọc các vi sinh vật có kích thước nhỏ hơn + Khi loại bỏ vách xenlulose để tạo thành tế bào trần thì các tế bào riêng rẽ này có kích thước nhỏ tương đương với tế bào vi sinh vật Do vậy có thể sử dụng phương pháp chọn dòng tế bào như... bằng nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật trong bioreactor? Nêu 1 số hợp chất thứ cấp đã được sản xuất bằng phương pháp này 1 Lợi thế : có 2 lợi thế là - Hệ thống nuôi cấy được thông khí hoặc trao đổi khí Vì tees bào thực vật nhạy cảm với strewss hơn vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật yêu cầu thường xuyên cải thiện hệ thống thông khí và hệ thống trộn môi trường - Môi trường... các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết Các hướng ứng dụng của kỹ thuật này a Sản xuất sinh khối tế bào và các hợp chất thứ cấp - Sản phẩm đặc trưng của nuôi cấy huyền phù tế bào là những chất cóchất lượng cao và cần ở lượng nhỏ Các nhóm nuôi cấy chủ yếu là tạo ra các sản phẩm thứ cấp trong y học, trong hóa mỹ phẩm và trong công nghiệp - Nuôi cấy huyền phù tế. .. dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh • Thuận lợi; - Thể tích nuôi cấy tăng, thường là ít nhất 1l Điều này cho phép sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kĩ thuật cao cấp - Hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi khí để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng - Khi thao tác nuôi cấy liên... Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay nhiều cụm tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trông môi trường lỏng Dịch huyền phù tạo ra khi nuoioi cấy một loại mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng Sau... trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới từng thời kì Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có sự liên kết giữa bioreactor với hệ thống chiếu sáng 2 Đặc trưng: - Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ 2 – 3 g/100ml dung dịch môi trường (Helgeson, 1979) - Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy. .. mẫu cấy và các tế bào chết - Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được điều chỉnh bởi thành phần môi trường VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế bào xốp - Theo King và Street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào - Sinh trưởng và phát triển của tế bào nuôi cấy: Pha lag: